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Mtodos de ensino em Biologia Celular e dos Tecidos:

estudo das estruturas e processos celulares;


Microscopias de luz (ML) e eletrnica (ME) permitem o
reconhecimento da clula como um componente dinmico e
participante do metabolismo corporal;
Ferramentas utilizadas:
lminas com coloraes histolgicas e histoqumicas -
ML;
Telas de cobre contrastadas por metais pesados - ME
(de transmisso, de varredura, etc.)
Tcnicas de preparao e estudo de
lminas citolgicas
Tcnicas de preparao e estudo de
lminas citolgicas
Microscpio de Luz e Microscpio Eletrnico de
Transmisso

Unidades de medida usadas:
O aumento total do objeto observado calculado
multiplicando-se os valores do aumento da objetiva e da ocular.
Portanto:
Preparo de lminas ----- lquidos de montagem;
Geralmente contm elementos ou substncias que conferem
as propriedades de:
- Colorir esporos e outras estruturas do patgeno e/ou clulas
e estruturas do tecido do hospedeiro = melhor clareza na
visualizao ao microscpio.
- Fixar a pea ou estrutura a ser observada.
- Impedir o dessecamento da preparao e preservar
integridade estrutural, por tempo mais ou menos longo.
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Preparao Tecidual
1. Coleta do tecido
do animal
2. Corte do tecido
em pedaos
3. Fixao
4. Desidratao
5. Incluso
a.em parafina para
Microscopia ptica (MO).
b. em resinas para
Microscopia Eletrnica de
Transmisso (MET).
6. Obteno de cortes
a.com navalha metlica para MO.
b. com lmina de vidro ou de
diamante para MET.
7. Montagem
a. em lminas de vidro para MO.
b. em grades metlicas para MET.
Tcnicas de Preparao de Lminas
Preparao do material que se deseja observar microscopia =
etapas de confeco:

1 - Coleta do Material
-Partes dos rgos ou tecidos so retiradas bisturi, pina ou
lmina de barbear extremamente finos (mx. 4 mm)

2 - Fixao

objetivo: insolubilizar as protenas dos tecidos;
procedimentos fsicos (congelamento) ou qumicos (+
utilizados)
agentes fixadores + comuns:
formol 10%
lquido de Bouin: formaldedo, cido actico, cido
pcrico)
ambos fixam as protenas evitando sua degradao
1. Coleta do espcime
2. Fixao:

Evita a destruio
das clulas por suas
prprias enzimas,
ou por bactrias.
Insolubiliza as
protenas dos
tecidos.
Formaldedo 4-10%
em soluo
tamponada (pH 7,4).
2. Fixao:
Fragmentos com 5 mm
de espessura
Tempo de fixao
varivel dependendo do
tamanho do fragmento
e do fixador.
Tcnicas de Preparao de Lminas
3 - Processamento

objetivo: preparar o material para ser analisado em microscpio
tico.
etapas rigorosamente seqenciais e obrigatrias, na grande maioria
das tcnicas, e uma etapa mal executada acarretar em material de
m qualidade para anlise.

3.1 - Desidratao

Objetivo: retirada de gua da pea --- substncias inclusoras so
insolveis em gua;
Utilizao de alcois etlicos graduados em tempos adequados:
(70 - 80 - 90 - 100%) - evitar a retrao pronunciada do tecido
ocasionando leses estruturais da clula de carter irreversvel. O
volume de lcool dever ser 10 a 20 vezes maior que o volume da pea.
2 min em cada graduao.
3. Desidratao
Tem como
finalidade retirar
gua dos tecidos.
Consiste em
banhos de
concentraes
crescentes de
etanol: 70%, 80%,
90%, 2x 100%.
4. Diafanizao ou Clareamento
Objetivo: retirada do lcool da
pea (as substncias
inclusoras dissolvem-se mal
no lcool) --- torn-la
transparente;
O etanol substitudo por um
lquido miscvel com o meio
de incluso (xilol).
Os tecidos embebidos em
xilol tornam-se translcidos,
razo porque essa etapa
denominada diafanizao ou
clareamento.
3.3 - Incluso (Impregnao)

Objetivo: eliminar completamente o xilol contido no material e a total
penetrao da parafina nos vazios deixados pela gua e gordura, antes
existentes no tecido.
preparar o material para os cortes, removendo o clarificante (xilol) e
endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistncia adequada
para que possa ser cortado.

Procedimento para Incluso
Tecido: passado em duas trocas de parafina para assegurar a
substituio de todo o agente clarificador pela parafina;
Parafina: temperatura de 56 a 60 C (parafina fundida) --- bloco de
tecido: imerso na parafina fundida (em estufa) durante o tempo
necessrio para a completa impregnao.
Blocos retirados da estufa e deixados temperatura ambiente ---
parafina endurea;
Bloco de parafina com o tecido: retirado da frma e conduzido ao
corte.
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5. Incluso ou Impregnao:
Estufa a 60C:
parafina ocupa os
espaos antes
ocupados pelo xilol.

Obteno dos blocos
de parafina.
4 - Microtomia

obteno de cortes de material includo em parafina o mais
delgado possvel --- observao aos microscpios ticos;
Utiliza-se o micrtomo: aparelho cuja regulagem medida em
micrmetros (MO) --- obteno do corte na espessura desejada;
duas peas principais: o suporte ou mandril (onde fixada a pea a
cortar) e a navalha;
espessura mais utilizada em microscopia ptica de 4 a 6
micrmetros
Aps esta etapa = cortes coletados em lminas de vidro.
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6. Microtomia:
Cortes de 5 m de
espessura.
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Micrtomo
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Cortes Histolgicos
5 - Colagem do Corte Lmina

Na superfcie de uma lmina --- um ponto de aderncia
(normalmente com albumina de ovo) --- corte parafinado se
adere;
Antes --- corte colocado em banho-maria --- dobras provocadas
pelo corte no tecido desapaream

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Cortes em Banho-Maria:
Colocao dos
cortes em
lminas de
vidro.
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Lmina contendo cortes sem
colorao:
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7. Colorao:
Colorao rotineira H-E.
Hematoxilina (bsica).
Eosina (cida).
Ncleo cido e o
citoplasma relativamente
bsico.
Hidratao, Colorao,
Desidratao e
Clarificao.
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Coloraes
Corantes que diferenciam cidos de bases.
- formam ligaes salinas com radicais ionizveis presentes nos tecidos.
Corantes que diferenciam componentes
fibrosos da matriz extracelular.
Sais metlicos que precipitam nos tecidos
formando depsitos de metal (ex: tecido
nervoso).
As coloraes foram desenvolvidas para visualizar componentes
das clulas e dos tecidos que na maioria so incolores
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Coloraes
Baseadas no princpio cido-base

A hematoxilina uma base, cora
componentes cidos da clula em uma cor
azulada ncleo (DNA e RNA)
A eosina um cido que cora
componentes bsicos (protenas
citoplasmticas) da clula em rseo.
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Reao e corantes histolgicos comuns

REAGENTES

RESULTADOS
Hematoxilina (base) Azul: ncleo; regies cidas do citoplasma:
matriz da cartilagem.
Eosina (cido) Rosa: regies bsicas do citoplasma; fibras de
colgeno.
Tricrmico de Masson Azul-escuro: ncleos.
Vermelho: msculo; queratina; citoplasma.
Azul-claro: mucingeno, colgeno.
Orcena, corante para fibras elsticas Castanho: fibras elsticas.
Weigert, corante para fibras elsticas Azul: fibras elsticas.
Colorao com prata Preto: fibras reticulares.
Hematoxilina frrica Preto: estrias dos msculos, ncleos e hemcias.
cido peridico de Schiff Magenta: glicognio e molculas ricas em
carboidratos.
Corantes Wright e Giemsa Usados para a colorao diferencial das clulas
do sangue.
Rosa: hemcias, grnulos dos eosinfilos.
Prpura: ncleos dos leuccitos, grnulos dos
basfilos.
Azul: citoplasma dos moncitos e linfcitos.
C
O
L
O
R
A


E
S
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Hematoxilina-Eosina
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Tricrmico de Masson
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Resorcina-Fucsina de Weigert
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8. Montagem:
Uso de lamnulas.
Meio de montagem:
resinas (Entellan) ou
blsamo do Canad.

7 - Montagem

Aps corte corado ---- novamente desidratado (a retirada da gua
objetiva aumentar a sobrevida do preparado);
concentraes crescentes de lcool etlico.
Corte banhado em xilol;
Montado em um meio solvel em xilol = meio de montagem ((para
os cortes de parafina usado o Blsamo de Canad)
Coloca-se uma gota do meio de montagem em cima do corte j
fixado;
coloca-se a lamnula sobre o corte imerso no meio de montagem ---
comprime-se com firmeza evitando formao de bolhas de ar;

Lmina Pronta para observao!!!!!