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PATOLOGA MOLECULAR
PATOLOGA MOLECULAR
CAPTULO 3
CAPTULO 3
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CONTENIDO
CONTENIDO
Introduccin.
Introduccin.
Estructura gentica.
Estructura gentica.
ase de !a tecno!og"a de! ADN
ase de !a tecno!og"a de! ADN
reco#$inante.
reco#$inante.
Ais!a#iento % o$tencin de! ADN de
Ais!a#iento % o$tencin de! ADN de
te&idos.
te&idos.
PCR o reaccin en cadena de !a
PCR o reaccin en cadena de !a
'o!i#erasa.
'o!i#erasa.
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CONTENIDO
CONTENIDO
PCR (in situ).
PCR (in situ).
PCR **CP.
PCR **CP.
Otros #todos 'ara detectar
Otros #todos 'ara detectar
#utaciones.
#utaciones.
Tcnicas de +i$ridacin.
Tcnicas de +i$ridacin.
Tcnicas 'ara 'rote"nas.
Tcnicas 'ara 'rote"nas.
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CONTENIDO
CONTENIDO
A'!icaciones de !a $io!og"a #o!ecu!ar en
A'!icaciones de !a $io!og"a #o!ecu!ar en
'ato!og"a.
'ato!og"a.
Diagnstico #o!ecu!ar en 'ato!og"a
Diagnstico #o!ecu!ar en 'ato!og"a
tu#ora!.
tu#ora!.
Diagnstico #o!ecu!ar en 'ato!og"a
Diagnstico #o!ecu!ar en 'ato!og"a
in,ecciosa.
in,ecciosa.
Otras a'!icaciones de !a 'ato!og"a
Otras a'!icaciones de !a 'ato!og"a
#o!ecu!ar.
#o!ecu!ar.
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CONTENIDO
CONTENIDO
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
Southern blot y Northern blot.
Southern blot y Northern blot.
Hibridacin in situ.
Hibridacin in situ.
!"SH #t$cnica de hibridacin in situ
!"SH #t$cnica de hibridacin in situ
con %luorescencia.
con %luorescencia.
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CONTENIDO
CONTENIDO
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGA TUMORAL
PATOLOGA TUMORAL
An&lisis cito'en$tico.
An&lisis cito'en$tico.
T$cnicas (oleculares es)ec*%icas.
T$cnicas (oleculares es)ec*%icas.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

La informacin gentica radica en dos

hebras de polinucletidos que constituyen
el ADN.

El ADN consta de dos largas cadenas de

nucletidos enrolladas entre s! con un
cdigo de 4 bases"

Las bases p#ricas Adenina y guanina.

Las bases pirimid!nicas citosinas y timina.

Dichas bases est$n ligadas a una pentosa

%deso&irribosa' y a un grupo fosfato.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA
+structura del A,N
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

En la s!ntesis de ADN tienen que separarse

ambas hebras del mismo y cada una de
ellas sir(e de molde para que la nue(a
cadena de ADN sea complementaria de la
anterior.

En el n#cleo las molculas de ADN est$n

pegadas y compactas constituyendo los
cromosomas.

La totalidad de la secuencias del ADN y

cromosomas se denomina )enoma.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

La unidad funcional del ADN es el gen que

es la parte de ADN que (a a dar origen a una
prote!na.

El primer paso es la transcripcin o s!ntesis

de A*N.

La molcula de A*N consta de la base

uracilo en lugar de timina y de la a+#car
ribosa en (e+ de deso&irribosa.

El siguiente paso es la traduccin o s!ntesis

de las proteinas a ni(el de los ribosomas.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

El lengua,e molecular con toda la

informacin gentica se reduce a un cdigo
donde cada amino$cido est$ representado
por tres bases de A*N que se llama codn.

Los amino$cidos que est$n en el citoplasma

son guiados hasta los ribosomas por el
llamado A*N de transferencia que tiene una
secuencia de nucletidos complementaria
%anticodn' a la de los codones del A*Nm.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

E&isten dos secuencias en el ADN que

controlan el inicio de la transcripcin y son"

Los promotores.

Los facilitadores o -enhancers..

Los promotores son secuencias del ADN

adyacentes al gen que se (a a transcribir y es
donde se unen las en+imas responsables de la
s!ntesis del A*N la A*N polimera+a y otros
cofactores.

Los facilitadores son secuencias del ADN

situadas a distancia del gen a transcribir y que
pueden regular la e&presin de dicho gen.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA
Transcri)cin y traduccin
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

/e distingue un ADN"

0odificante consta de e&ones.

No codificante o silente consta de

intrones y largas secuencias repetiti(as.
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A*E DE LA TECNOLOGA DEL
A*E DE LA TECNOLOGA DEL
ADN RECOMINANTE
ADN RECOMINANTE

0on la tecnolog!a del ADN recombinante se

puede manipular genes y obtener grandes
cantidades de ADN.

La base de dicha tecnolog!a fue el

descubrimiento de en+imas bacterianas
llamadas en+imas de restriccin que rompe
el ADN en sitios espec!ficos produciendo
fragmentos de restriccin.
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0ada en+ima reconoce una secuencia #nica

de nucletidos y corta la cadena del ADN de
forma simtrica o de forma asimtrica.

La tecnolog!a del ADN recombinante

permite ligar ADN en pl$smidos y csmidos
donde tras romper el ADN con las mismas
en+imas se puede integrar la secuencia
gnica en los mismos.
A*E DE LA TECNOLOGA DEL
A*E DE LA TECNOLOGA DEL
ADN RECOMINANTE
ADN RECOMINANTE
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A*E DE LA TECNOLOGA DEL
A*E DE LA TECNOLOGA DEL
ADN RECOMINANTE
ADN RECOMINANTE
+s-ue(a de la tecnolo'*a del A,N reco(binante
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La tcnica resumida es as!"

*eali+ar (arias secciones de parafina en el

microtomo.

Desparafinacin en &ilol.

La(ar las secciones con alcohol de 123 se

secan y luego se incuban con proteinasa 4 en un
tampn con un detergente.

5osteriormente se separa el ADN por e&traccin

org$nica con fenol y croroformo que separa las
prote!nas del ADN y se precipita en ADN en
etanol.
AI*LAMIENTO 0 OTENCI/N
AI*LAMIENTO 0 OTENCI/N
DEL ADN DE TE1IDO*
DEL ADN DE TE1IDO*
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5ara que se produ+ca la s!ntesis de ADN es

necesario que se separe primero las hebras del
mismo lo que se consigue calentando las
muestras a 1260.

/e a7ade un cebador o secuencia gnica

complementaria al ADN hibridacin que se
produce a temperatura espec!fica %28 9 :860'.

La ADN polimerasa tiene que ir a7adiendo

nucletidos de forma complementaria a las
hebras de ADN separadas.
PCR O REACCI/N EN CADENA
PCR O REACCI/N EN CADENA
DE LA POLIMERA*A
DE LA POLIMERA*A
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T$cnica de PC.
PCR O REACCI/N EN CADENA
PCR O REACCI/N EN CADENA
DE LA POLIMERA*A
DE LA POLIMERA*A
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La tcnica de 50* se puede usar para"

Detectar inserciones gnicas.

Delecciones.

;raslocaciones.

<utaciones puntuales.

/e puede reali+ar a partir de te,ido fresco o

incluido en parafina.

La principal (enta,a y des(enta,a de la 50*

es su e&tremada sensibilidad.
PCR O REACCI/N EN CADENA
PCR O REACCI/N EN CADENA
DE LA POLIMERA*A
DE LA POLIMERA*A
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/e parte de secciones de congelacin o

parafina y tras la preparacin tisular
adecuada se procede a reali+ar los pasos
de amplificacin en cadena de la
polimerasa a7adiendo los cebadores los
nucletidos y la ADN polimerasa a los
portas.
PCR (in situ)
PCR (in situ)
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Este mtodo se basa en que las cadenas

sencillas de ADN con mutaciones puntuales
tienen diferente mo(ilidad electrofortica en
geles de poliacridamida no
desnaturali+antes.

Las des(enta,as de este mtodo son los

falsos negati(o
PCR **CP
PCR **CP
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+s-ue(a de la t$cnica de SSCP
PCR **CP
PCR **CP
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;enemos"

;cnica D))E %Electroforesis en gel de gradiente

desnaturali+ante.

Electroforesis en gel de poliacridamida para

heteroduple&.

A/= %Allele>/pecif oligonucleotide hybridi+ation'.

5olimorfismo de longitud de fragmentos de

restriccin.

50*>alelo>espec!fico %<is><atch'.
OTRO* M-TODO* PARA
OTRO* M-TODO* PARA
DETECTAR MUTACIONE*
DETECTAR MUTACIONE*
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SOUTH+.N /LOT 0 NO.TH+.N1/LOT
SOUTH+.N /LOT 0 NO.TH+.N1/LOT

Ambas tcnicas se usan en el an$lisis del

ADN o de A*N mediante separacin de los
mismos por electroforesis y posterior
hibridacin con sondas espec!ficas.

En el />? el ADN genmico se corta con

en+imas de restriccin en (arios fragmentos
y luego se separa en electroforesis en gel de
agarosa.
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
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SOUTH+.N /LOT 0 NO.TH+.N1/LOT
SOUTH+.N /LOT 0 NO.TH+.N1/LOT

En en N>? el A*N celular se aisla y se

separa seg#n el tama7o por electroforesis
en gel los $cidos nucleicos son
transferidos desde el gel a un filtro de papel
de nailon o nitrocelulosa al que se quedan
fi,amente unido posteriormente el filtro de
papel se hibrida con las sondas espec!ficas
para el ADN o A*N.
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
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T$cnica de Southern1/lottin'
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
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T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
H"/.",AC"2N in situ
H"/.",AC"2N in situ

;cnica histoqu!mica que permite (isuali+ar

al microscpio fragmentos de ADN o A*N.

;iene dos grandes (enta,as"

La positi(idad se detecta en secciones

tisulares.

La tcnica se puede reali+ar a partir de

secciones de hasta 2 micras.
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T$cnica de hibridacin in situ
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
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T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
!"SH
!"SH

/e basa en la utili+acin de sondas

espec!ficas para determiandos cromosomas
o secuencias de los mismos.

5ermite estudiar alteraciones genticas

concomitantemente con la (isuali+acin de
las clulas y en el conte&to tisular de las
lesin.
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T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
!"SH
!"SH

/e puede utili+ar en cromosomas en

metafase como en interfase.

La tcnica consiste en desnaturali+ar el ADN

con calor incubar las clulas con
formamida y tampn salino y
posteriormente hibridarlas con las sondas
espec!ficas.
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Entre los mtodos utili+ados en patolog!a

tenemos"

0itometr!a de flu,o para el estudio de

marcadores linfoides de ant!genos de
diferenciacin.

@estern>blot o inmunoblot en el cual las

muestras tisulares se aislan de las prote!nas y se
corren en un gel de poliacrilamida
desnaturali+ante y se hace una transferencia de
las mismas a un papel donde se reali+an la
detencin mediante anticuerpos espec!ficos.
T-CNICA* PARA PROTENA*
T-CNICA* PARA PROTENA*
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T$cnica de 3estern /lot
T-CNICA* PARA PROTENA*
T-CNICA* PARA PROTENA*
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/e pueden aplicar en"

*eordenamiento gentico en procesos

linfoproliferati(os.

Estudios de alteraciones oncognicas.

Adentificacin de agentes infecciosos.

Estudio de alteraciones genticas

hereditarias.

Adentificacin de muestra.

Estudio de metabolopat!as.
APLICACIONE* DE LA
APLICACIONE* DE LA
IOLOGA MOLECULAR
IOLOGA MOLECULAR
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DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGA TUMORAL
PATOLOGA TUMORAL
AN4L"S"S C"TO5+N6T"CO
AN4L"S"S C"TO5+N6T"CO

Los incon(enientes que tiene esta tcnica

en el estudio de tumores son"

Dificultad de culti(ar clulas de tumores

slidos.

/olo detecta las alteraciones genticas que

conlle(en a cambios morfolgicos de los
cromosomas.
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An&lisis cito'en$tico y (olecular de c$lulas tu(orales
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGA TUMORAL
PATOLOGA TUMORAL
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DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGA TUMORAL
PATOLOGA TUMORAL
T6CN"CAS 7OL+CULA.+S +SP+C!"CAS
T6CN"CAS 7OL+CULA.+S +SP+C!"CAS

/outhern ?lot.

50*.

Estudio de predisposicin gentica del

c$ncer.
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En la (aloracin de las tcnicas de biolog!a

molecular en patolog!a infecciosa hay dos
puntos importantes"

La posibilidad de falsos positi(os.

/e detecta al agente infeccioso pero no

puede concluirse que est causando la
enfermedad.
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGA IN2ECCIO*A
PATOLOGA IN2ECCIO*A
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En patolog!a molecular tanto en las biopsias

como en las autopsias se pueden utili+ar
para detectar microorganismos las tcnicas
de"

Bibridacin de $cidos nucleicos.

Amplificacin en cadena de la polimerasa

DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGA IN2ECCIO*A
PATOLOGA IN2ECCIO*A
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E&isten di(ersas tcnicas que se utili+an en los

siguientes grupos de enfermedades"

Las enfermedades neurodegenerati(as.

Enfermedades cardio(asculares.

Enfermedades metablicas.
OTRA* APLICACIONE* DE LA
OTRA* APLICACIONE* DE LA
PATOLOGA MOLECULAR
PATOLOGA MOLECULAR