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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale


Avril-Mai 200
INTRODUCTION
!e" micro-or#ani"me" $%actrie"& c'ampi#non"& levure"() *ouent un r+le important dan"
l,-uili%re de" co"."t/me" "ur notre immen"e plan/te0
!e" %actrie" e1i"tant dan" le tu%e di#e"ti2 2acilitent la di#e"tion en "ecrtant de" en3.me" et
de" "u%"tance" -ui participent dan" la d#radation de" li-uide"& de" protide" et de" #lucide"0
Et dan" l,environnement& elle" provo-uent la 2ertili"ation de la terre en d#radant la mati/re
or#ani-ue0
Actuellement& l,utili"ation de" microor#ani"me" dan" l,indu"trie de %io".nt'/"e et de
2ermentation e"t au#mente "elon le" demande"0
Depui" lon#temp"& l,'omme "avait 2a%ri-uer de" produit" au""i vari" -ue la %i/re& le vin&
le 2roma#e ou le pain& dont la prparation impli-ue l,intervention plu" moin" importante
de" micro-or#ani"me"& m4me "i ce n,e"t -u,au 565/me "i/cle -ue l,on a montr le r+le de
ce" 4tre" micro"copi-ue" dan" le" 2ermentation"0
Depui" le" pro#r/" de la micro%iolo#ie& de la %ioc'imie de la #nti-ue et de ",acclrer&
"i %ien -u,au*ourd,'ui l,e1ploitation de" micro-or#ani"me" 7 l,c'elle indu"trielle permet de
rpondre 7 %on nom%re de %e"oin" de l,'umanit tant en mati/re d,alimentation& de "ant ou
d,ner#ie -u,en mati/re d,environnement0
Avec la mi"e au point de tec'ni-ue" moderne" de recom%inai"on #nti-ue& on e"t m4me
capa%le& depui" de" anne" d*7& de tran"2rer 7 de" %actrie" de" caract/re" #nti-ue"
'umain" ou animau1& et de leur 2aire produire au""i& 7 une vite""e leve et 7 #rand
rendement& de" "u%"tance" d,un intr4t immen"e pour l,'omme comme l,in"uline ou
le" inter2ron"0
Au""i le" micro-or#ani"me" "ont la meilleure "ource de protine"& le" protine" elle"-m4me"
ric'e" en acide" amin" e""entiel" pour la nutrition et de" vitamine"0
On peut au""i a*outer -ue le or#ani"me *oue un r+le dan" la d#radation de la mati/re
or#ani-ue -ui e1i"tent dan" le" eau1 u"e" de" unit" indu"trielle"& c,e"t pour-uoi on calcule
la D8O9 $demande %iolo#i-ue en o1.#/ne en 9 *our") et la A:O $demande c'imi-ue en
o1.#/ne)& et #ra""e 7 ce" valeur" on peut envi"a#er de" traitement" -ui peuvent 4tre :
de" traitement" c'imi-ue"0
De" traitement" p'."i-ue"
De" traitement" %iolo#i-ue" ; intervention de" or#ani"me"
<n traitement com%in0
Au""i -ue la culture indu"trielle de" or#ani"me" e"t appli-ue dan" la valori"ation de" "ou"
produit" et de" dc'et"0
Mai" mal#r tou" ce" avanta#e" -u,on a cit ultrieurement& ce or#ani"me& -uand
il" dpa""ent le" point" criti-ue"& peut *ouer un r+le n2a"te "ur la "ant du con"ommateur c,e"t
pour-uoi dan" l,indu"trie alimentaire& le micro%iolo#i"te et le" '.#ini"te" ",accordent 7
pen"er -ue le ri"-ue micro%iolo#i-ue doit 4tre ma=tri"er pour #arantir la "curit
du con"ommateur& c,e"t pour-uoi pour c'a-ue microor#ani"me& il" ont mentionn de" crit/re"
-u,on doit pa" le" dpa""er "i non nou" nou" retrouveron" dan" l,em%arra"0
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Avril-Mai 200
Partie I : Rle de la qualit et la scurit alimentaire dans la lutte contre
toxi-infections alimentaires
I. La qualit et la scurit dans lindustrie alimentaire.
!,indu"trie alimentaire ",e22orce de rpondre au1 attente" du con"ommateur -ui "ou'aite
de" aliment" "ain"& naturel"& nutriti2"& prati-ue"& a#ra%le"& di"poni%le" dan" une lar#e varit
et %on marc'0
1. La qualit alimentaire :
!a -ualit micro %iolo#i-ue de" aliment" con"titue un lment primordial de leur aptitude 7
"ati"2aire le" %e"oin" de" con"ommateur"& -uel" -ue "oient le" produit" concern"&
le" condition" de leur production et celle" de leur tran"2ormation ou de leur di"tri%ution&
l,volution de" e1i#ence" et le" 2luctuation" de" #o>t" et de" mode"0
!e concept de la -ualit micro %iolo#i-ue "e re2era en e22et 7 deu1 a"pect" e""entiel" :
!a "curit : elle "e r2/re 7 ? l,a%"ence de ri"-ue @ pour la "ant pu%li-ue& pouvant
r"ulter de la pr"ence dan" le" aliment" de microor#ani"me" pat'o#/ne" etAou de
to1ine" d,ori#ine micro%ienne0
!a valeur d,u"a#e : ",entend de ? l,a%"ence de ri"-ue @ pour le" utili"ateur" ou pour
le" con"ommateur" pouvant r"ulter de la pr"ence dan" le" aliment" de micro-
or#ani"me" re"pon"a%le" de leur altration0
2. La scurit alimentaire :
!a con2iance du con"ommateur enver" la "curit de l,aliment e"t vitale pour l,indu"trie
alimentaire0 !a con2iance e"t l,un& de" lment" cl" dan" la con"truction de l,ima#e de
mar-ue d,un produit -ui 7 "on tour dtermine le "ucc/" et le" pro2it" de" compa#nie"
intre""e"& la "curit d,un aliment tran"2orm impli-ue l,limination etAou la prvention de
la multiplication de" micro%e" -ui e1i"tent dan" tou" le" aliment" et -ui en#endrent
de" into1ication" alimentaire"0
3. Les diffrentes mthodes ala!les "our lassurance de la qualit :
!e" indu"triel" du "ecteur alimentaire "e %a"ent "ur le" r#lementation" #ouvernementale" et
"ur de" "."t/me" de contr+le moderne" de la -ualit pour a""urer la -ualit et la "curit
de" produit" -u,il" 2a%ri-uent0 :ertain" de" "."t/me" emplo." "ont :
3.1. Les #uides de !onne conduite de fa!rication :
:eu1 ci prci"ent le" condition" et le" procdure" -ui ont prouv& par une lon#ue e1prience&
-u,elle" #aranti""aient la -ualit et la "curit de" produit"0
3.2. La mthode $%&&P :
$Ba"ard Anal."i" critical control Point) : c,e"t l,anal."e de" dan#er"-point" criti-ue" pour leur
ma=tri"er0
Donc le BA::P e"t une mt'ode permettant :
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D,identi2ier et d,anal."er le" dan#er" a""oci" au1 di22rent" "tade" du proce""u" de
production d,une denre alimentaire0
De d2inir le" mo.en" nce""aire" 7 leur ma=tri"e0
De ",a""urer -ue ce" mo.en" "ont mi" en Cuvre de 2aDon e22ective et e22icace0
!e BA::P doit 4tre con"idr comme une approc'e or#ani"e et "."tmati-ue permettant de
con"truire& de mettre en Cuvre et d,amliorer l,a""urance de la -ualit micro %iolo#i-ue
de" denre" alimentaire"0
3.3. Les standards de qualit :
!,ad'"ion 7 de" "tandard" ta%li" par l,or#ani"ation internationale de" "tandard" $6"o 000)
ou 7 "on 'omolo#ue europenne $E" 2000) #arantit -ue l,indu"triel& le" collectivit" ou le"
"ocit" a""ocie" au "ecteur "e con2orme 7 de" procdure" recommande" et %ien
documente"0 !,e22icacit de ce" pro#ramme" e"t r#uli/rement value par de" e1pert"
indpendant"& de mani/re 7 maintenir la con2iance du con"ommateur dan" le" procdure" de
contr+le" de la -ualit0
'. Rle de la conseration des "roduits utiliss "our laccom"lir
Avant de pouvoir 4tre con"omm"& l,indu"trie alimentaire cre une lar#e #amme de denre"&
-ue ce "oit de" l#ume" en %o=te ou "ur#el"& de" plat" complet" prpar"& de" pain" prcuit"&
de" 2roma#e"& du lait& de" %arre" c'ocolate"& de" %i"cuit"& de" viande" prpare" et une #rande
varit d,autre" produit"0
!e" principale" mt'ode" emplo.e" 7 cet e22et "ont :
'.1. La cuisson :
!a pa"teuri"ation impli-ue ain"i le c'au22a#e 7 une temprature d,au moin" E2F: pendant 19
"econde" a2in de tuer le" micro-or#ani"me" pat'o#/ne" et elle e"t "uivie d,un re2roidi""ement
rapide 7 9Fc0 :ependant& l,aliment pa"teuri" n,e"t pa" totalement "trile0 !a r2ri#ration e"t
re-ui"e et "a dure de vie e"t limite0 !a "trili"ation comporte un c'au22a#e 7
une temprature d,au moin" 120F: pendant 2 7 G "econde" et elle e"t #alement "uivie
d,un re2roidi""ement rapide0
Elle tue la plupart de" micro-or#ani"me" et inactive le" en3.me"& la dure de vie du produit e"t
au#mente "i#ni2icativement et celui-ci ne devra pa" 4tre r2ri#r tant -ue "on em%alla#e
re"te "cell0
'.2. Le refroidissement :
!a r2ri#ration et la "ur#lation maintiennent l,aliment 7 de" 2ai%le" temprature" de mani/re
7 #arder le" en3.me" inactive" et 7 in'i%er la croi""ance de" micro%e"& pour demeurer
e22icace & la c'a=ne du 2roid doit 4tre entretenue durant le tran"port& la vente au dtail et
le "tocHa#e dome"ti-ue avant la prparation et la con"ommation& le 2ait -ue l,aliment pui""ent
rapidement "e dtriorer 7 temprature am%iante rend criti-ue le contr+le de ce param/tre0
'.3. Le rechar#e :
:elui-ci produit de" aliment" "ta%le"& en rdui"ant leur contenu en eau& un 2acteur
indi"pen"a%le au dveloppement de" %actrie" et de" moi"i""ure"& on peut citer& 7 titre
d,e1emple& le lait et le" "oupe" en poudre& le" pIte"& la viande& le poi""on& le" crale"(etc0
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'.'. La fumaison :
:ette mt'ode "/c'e l,aliment et lui procure 7 la 2oi" une 2aveur "upplmentaire0
'.(. La fermentation :
!e procd impli-ue l,action de micro-or#ani"me" -ui ".nt'ti"ent de l,alcool ou de" acide"&
-ui a#i""ent en tant -u,a#ent" con"ervateur"& cette activit cellulaire 2ait intervenir
de" en3.me" -ui a#i""ent dan" de" condition" pr2rentielle" de temprature& de P' et en
pr"ence de "u%"trat plu" ou moin" a%ondant& le .aourt& la %i/re& le vin& le 2roma#e& le "alami
et certain" produit" laitier" en "ont de %on" e1emple"0
'.). La additifs alimentaires :
!e" additi2" alimentaire" *ouent #alement un r+le cl dan" la tran"2ormation de" aliment"& par
e1emple& certain" additi2" peuvent rendre l,aliment acide et donc le prot#er contre
le" dtrioration"& mai" l,acidit du produit ne le rend pa" "trile& car il e1i"te
de" c'ampi#non" -ui pou""e en milieu acide donc un ri"-ue d,altration au cour" de
la prparation etAou du "tocHa#e& donc on doit 2aire appel en plu" de cette mt'ode 7 d,autre"
mt'ode" de con"ervation0
Plu"ieur" compo"ant" de l,aliment "ont le" ci%le" privil#ie" de l,o1.#/ne de l,air& -ui
provo-ue leur ranci""ement ou l,apparition d,un #o>t d"a#ra%le c,e"t pour-uoi on a*oute
de" antio1.dant" -ui emp4c'ent le ranci""ement de" #rai""e" et de" 'uile"0
!e" mul"i2iant" et le" "ta%ili"ant" aident 7 produire de" mlan#e" "ta%le" d,in#rdient"&
comme l,'uile et le vinai#re d,une ma.onnai"e -ui autrement "e "eraient "par"0
Et ce" a#ent" "ta%ili"ant" "ont au""i utili"" dan" le" produit" p'armaceuti-ue" et co"mti-ue"0
II. *cision + "rendre quand lalarme de dan#er sonne.
Tou" le" partenaire" de la 2ili/re a#roalimentaire doivent veiller 7 la -ualit micro %iolo#i-ue
de" denre" alimentaire" tout au lon# de la c'a=ne de production0
:ommenDant par le" mati/re" premi/re" *u"-u,au produit 2ini& avant de le livrer au
con"ommateur0
Juand le produit "oit mi" "ur le marc'& tout dpa""ement de" crit/re" peut a%outir 7
de" into1ication" alimentaire" -ui mettent en dan#er la "ant 7 vrai dire la vie
du con"ommateur0 :,e"t pour-uoi& on doit 2aire de" anal."e" micro %iolo#i-ue& p'."ico-
c'imi-ue" et to1icolo#i-ue" pour une ma=tri"e de la -ualit de" produit" a#roalimentaire& et
une ma=tri"e de" point" criti-ue" dan" le" "ecteur" de l,indu"trie et celui de la re"tauration
collective& et "i on trouve un dpa""ement de" crit/re" 7 la di"tri%ution et cela peut "e traduire
par de" 2luctuation" de la temprature lor" de tran"port et de "tocHa#e0
Toute" di"po"ition" "eront pri"e" pour -ue le produit ne "oit pa" mi" "ur le marc' en l,tat ou
-u,il en "oit retir car dan" ce domaine& l,erreur ne pardonne pa" et conduit 7 de" into1ication"
alimentaire"0
III. Les toxi-infections alimentaires :
Elle" r"ultent #nralement de la con"ommation d,aliment" contamin" par de" micro-
or#ani"me" tel" -ue le" %actrie"& viru" para"ite" ou leur" to1ine"0
On appelle ? a#ent" pat'o#/ne" @ le" micro-or#ani"me" -ui provo-uent ce" maladie"0
Dan" l,tude de" di22rent" ca" de to1i-in2ection" alimentaire"& on rencontre le" in2ection"
alimentaire" et le" into1ication" alimentaire"0
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1. Infection alimentaire :
:,e"t maladie cau"e par l,entre et le dveloppement de micro-or#ani"me" pat'o#/ne" dan"
l,or#ani"me apr/" avoir con"omm de" aliment" contamin" par de" %actrie"0
:e" micro-or#ani"me" in#r" par l,4tre 'umain trouvent dan" l,inte"tin un terrain 2avora%le
pour "e proli2rer et in2ecter l,or#ani"me mal#r la d2en"e de ce dernier0
2. Intoxication alimentaire :
:,e"t une in2ection di#e"tive due 7 l,in#e"tion d,aliment" contamin" par de" %actrie" et plu"
"pcialement par leur" to1ine" -ui "eront le" "eule" re"pon"a%le" de la maladie0
!,into1ication peut 4tre ai#uK ou c'roni-ue :
!,into1ication ai#uK : corre"pond 7 l,a%"orption en une "eule 2oi" d,une do"e importante de
la to1ine0
!,into1ication c'roni-ue : corre"pond 7 l,in#e"tion de" do"e" moin" importante" mai"
rpte" "ur une lon#ue priode0
Les toxi-infections alimentaires au ,aroc :
!e" into1ication" alimentaire" "ont %eaucoup plu" 2r-uente" -ue lLon pourrait le croire0
!Linto1ication& en avril dernier& de M9 l/ve" dan" une cole primaire "itue au -uartier Se'%
El Ouard dan" la mdina de N/" ne 2ait -ue con2irmer ce con"tat0 <ne into1ication -ui "erait
due 7 la con"ommation de 2riandi"e" produite" de 2aDon arti"anale et commerciali"e" dan" de
mauvai"e" condition" dL'.#i/ne par un marc'and am%ulant0
Selon lLunit de to1icovi#ilance du :entre antipoi"on et de p'armacovi#ilance& 1O ca"
dLinto1ication" alimentaire" ont t dclar" au terme du premier trime"tre 2000 Durant
lLanne 200P& lLunit a reDu M0G1G 2ic'e" de dclaration de ca" dLinto1ication0 Pour leur part&
le" into1ication" alimentaire" ont con"titu 2PQ de" ca" dLinto1ication" "oit 101O0 ca"0 A noter
-ue ce #enre dLinto1ication" "urvient dan" la ma*orit de" ca" 7 domicile $PE&OQ) contre
10&OQ dan" un lieu pu%lic et 1&PQ en milieu de travail0 Pour ce -ui e"t de" to1i-in2ection"
alimentaire" collective" $T6A:)& 9PQ de" ca" ont lieu 7 domicile& 2OQ dan" un lieu pu%lic et
2Q dan" le lieu de travail avec une prdominance dan" le milieu ur%ain $OQ)0 !e" adulte"
repr"entent 9GQ de" ca" et le" en2ant" MGQ0Parmi le" produit" incrimin"& le" produit" laitier"
et driv" arrivent en t4te $G0&OQ) "uivi de" pIti""erie" $&M0Q) et de la viande $&G0Q)0
!a volaille& le" %oi""on" et le poi""on dtiennent de" tau1 moin" important" avec
re"pectivement G&P9Q& 2&9Q et 2&19Q0
Dan" de" ca" tr/" rare"& lLinto1ication alimentaire peut provo-uer la paral."ie ou entra=ner
la mort0 :'a-ue anne& nou" enre#i"tron" 1 7 2 dc/"0
!e :entre antipoi"on m/nera proc'ainement une campa#ne dLin2ormation et de "en"i%ili"ation
"ur le" into1ication" alimentaire"0
2.1. Les causes dune intoxication alimentaire :
!a plupart de" aliment" ren2erment de" %actrie"0 !or"-ue le" aliment" ne "ont pa" con"erv"
de 2aDon approprie& le" %actrie" "e multiplient et le" contaminent0 Pre"-ue tou" le" aliment"
peuvent cau"er une into1ication alimentaire0 En e22et& ",il" "ont prpar"& tran"port"&
entrepo"" ou con"erv" dan" de" condition" non ad-uate"0
2.2. Les "roduits "ouant -tre incrimins :
!e" produit" laitier" : le lait cru ou 2erment& le" 2roma#e"& le %eurre et la cr/me0
!e" Cu2" et le" ovo produit"
!e" #lace" et le" cr/me" #lace"
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!a viande de %ouc'erie en l,tat ou 'ac'e& le" a%at"& le" volaille"& le lapin et
le #i%ier et le produit tran"2orm" 7 %a"e de viande0
!e" poi""on"& le" cru"tac"& le" co-uilla#e" et le" cp'alopode"0
!e" 2ruit" et le" l#ume"
!e" *u" de 2ruit" ou le" "oupe" de l#ume"
!e" crale" et le" produit" driv"& le pain& le" pIte"& le" "emoule"& le" 2arine"0
!e" "ucre"& le cacao
!e" con"erve" et le" "emi-con"erve"
!e" "ur#el"
!e" aliment" d"'.drat" ou l.op'ili""
!e" plat" cui"in"0
!,eau de"tine 7 la con"ommation 'umaine0
3. ,odes de contamination :
!a proli2ration de" %actrie" e"t 2avori"e par de" temprature" "e "ituant entre M et O de#r"
:el"iu"& ce -ui e1pli-ue pour-uoi le" ca" d,into1ication" alimentaire" "ont plu" 2r-uent" en
t -u,en 'iver0 !a plupart de" contamination" "urviennent lor"-ue le" aliment" "ont lai""" 7
ce" temprature" pendant plu" de -uatre 'eure"& il 2aut donc redou%ler de vi#ilance durant
la "ai"on c'aude en vri2iant plu" "ouvent le t'ermo"tat du r2ri#rateur et du con#lateur& en
limitant au minimum l,e1po"ition de" produit" pri""a%le" 7 la temprature am%iante et en
2ai"ant particuli/rement attention 7 la volaille et au %Cu2 'ac'e0
!,'.#i/ne e"t un 2acteur dterminant dan" la contamination de" aliment"0
!e" per"onne" -ui manipulent le" aliment" "ont porteu"e" de #erme"& c,e"t pour-uoi
elle" doivent tou*our" "e laver "oi#neu"ement le" main" 7 l,eau c'aude et au "avon& et viter
de "e mouc'er ou de tou""er en pr"ence d,aliment"0 le" animau1 dome"ti-ue" "ont #alement
porteur" de %actrie" et par con"-uent& il" ne devraient pa" ",approc'er de la ta%le ou
de" comptoir" oR "e trouvent le" aliment" ou "e droule leur" prparation"0
'. Les "rinci"aux risques alimentaires :
'.1. Les salmonelloses
!e" "almonelle" "ont une de" principale" cau"e" de maladie %actrienne d,ori#ine alimentaire&
dan" le" pa." dvelopp" il en e1i"te plu" de 2000 t.pe" di22rent"0 !a maladie touc'e plu"
2r-uemment le" en2ant"& le" per"onne" I#e" et le" per"onne" immunodprime"0
!a tran"mi""ion "e 2ait par la con"ommation d,aliment" d,ori#ine animale contamine" et
con"omm" cru" ou peu cuit" $viande"& Cu2 ou lait) et plu" rarement par celle de 2ruit" 2rai" ou
de l#ume" cru" contamin" par de" d*ection" animale"0
Ri"-ue" : nau"e"& diarr'e"0
'.2. Les sta"h.locoques + coa#ulase "ositie.
Et plu" prci"ment la "tap'.lococcie aureu"& la croi""ance de ce micro-or#ani"me dan"
le" aliment" contamin" pr"ente un ri"-ue pour la "ant pu%li-ue& car certaine" "ouc'e"
produi"ent de" entroto1ine" -ui cau"ent de" into1ication" alimentaire" "i in#re"0
!e" produit" "ont contamin" par le" "tap'.loco-ue" 7 coa#ula"e po"itive -ui "e trouve "ur
la peau et le" mu-ueu"e" de l,'omme et de" animau1 "ain"& et pr"ente" en #rand nom%re au
niveau de" plaie" et lor" d,in2ection de" voie" re"piratoire" "uprieure"0
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Si ce" aliment" "ont e1po"" 7 de" temprature" 2avori"ant la multiplication
de" "tap'.loco-ue"& ce" dernier" produi"ent de" to1ine" non dtruite" par la cui""on
provo-uant de" malai"e"0
Ri"-ue" : nau"e"& diarr'e"0
'.3. Les coliformes totaux /+ 301&23 les coliformes fcaux ou les coliformes
thermotolrants /+ ''1&2 :
:e "ont de" %actrie" pr"ente" dan" le tu%e di#e"ti2 de l,'omme et de" animau1& mai"
#alement dan" le milieu e1trieur $"ol& eau& v#tau1& poil"& plume"()0 !e" coli2orme"
2cau1 ou t'ermotolrant" "ont con"titu" par de" #erme" de contamination 2cale0
!e #roupe de" coli2orme" a tou*our" t utili" pour mettre en vidence le man-ue d,'.#i/ne
parce -u,il e"t 2r-uemment a""oci au contenu inte"tinal de" vert%r" 7 "an# c'aud0
6l" "ervent principalement d,indicateur" de la contamination d,ori#ine 2cale et ain"i de
la pr"ence po""i%le d,or#ani"me" entro-pat'o#/ne"0
Ri"-ue : nau"e"& diarr'e"0
'.'. 4scherichia coli :
:,e"t le principal mem%re du #roupe de" coli2orme" 2cau1 pui"-u,on le retrouve pre"-ue
tou*our" dan" le" mati/re" 2cale" 'umaine"& il peut alor" 4tre con"idr comme un indicateur
de la pollution d,ori#ine 2cale0
!e" "ouc'e" pat'o#/ne" d,E"c'eric'ia coli entro'morra#i-ue" -ui provo-uent
de" 'morra#ie" inte"tinale"& comme E col 019E -ui produit" une to1ine pui""ante& entra=nent
de" in2ection" 'morra#i-ue" du colon donnant de" diarr'e" "an#lante" et de" complication"
pouvant 4tre mortelle"& comme l,in"u22i"ance rnale0
'.(. La listriose :
:ette maladie in2ectieu"e de" animau1 et de" 'omme" e"t due 7 une %actrie& la li"tria
monoc.to#/ne& elle a t de plu"ieur" "ource" environnementale" comme le" "ol"& le" 2/ce" et
le" dc'et"0 Elle e"t omnipr"ente dan" la nature et 7 t trouve en a""ociation avec
une #rande varit de poi""on"& d,oi"eau1 et de mammi2/re"0 Elle ",atta-ue "urtout au1
con"ommateur" d,aliment" pr4t" 7 man#er cru"& in"u22i"amment cuit" ou non rc'au22"0
!e" 2emme" enceinte"& le" nouveau1 n" et le" per"onne" dont le "."t/me immunitaire e"t
a22ai%li "ont le" plu" 7 ri"-ue d,4tre atteint de li"trio"e0
Ri"-ue" : avortement"& 2au""e" couc'e"& mnin#o-encp'alite" c'e3 l,'omme et le" animau1
'.). Les anaro!ies sulfito-rducteurs :
:e" #erme" pr"ent" dan" l,environnement& contaminent la viande& le" volaille"& le" poi""on"
et le" "auce" prpare"0
'.).1. &lostridium "erfrin#ens :
:ette %actrie 2r-uente dan" la nature "e trouve dan" la pou""i/re et dan" le" inte"tin"
de" animau1 7 "an# c'aud $donc dan" leur" "elle"& elle peut "e tran"mettre 7 traver"
de" aliment" non cuit" ou mal rc'au22" en produi"ant une entro-to1ine)0
Ri"-ue" : Diarr'e& douleur" a%dominale"0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
'.).2. &lostridium !otulinum :
:ette %actrie e"t re"pon"a%le& d,une to1i in2ection alimentaire provo-uant une maladie appel
? %otuli"me @ cette %actrie e"t 2ort dan#ereu1 "e propa#e dan" le" l#ume"& le" viande" et
le" poi""on" en con"erve mal "trili""0
Ri"-ue : Trou%le" de la vue& paral."ie de l,en"em%le de" mu"cle"& di22icult d,locution0
'.5. La cam".lo!actriose :
:,e"t une in2ection rpandue provo-ue par certaine" e"p/ce" de %actrie" du #enre
? camp.lo%acter @0 !e" aliment" incrimin" "ont principalement le lait cru& la volaille crue ou
mal cuite et l,eau de %oi""on0
Ri"-ue : diarr'e& nau"e"& douleur" a%dominale" 2i/vre& art'rite ractionnelle& trou%le
neurolo#i-ue0
'.6. Le cholra :
Elle repr"ente une menace importante pour la "ant pu%li-ue dan" le" pa." en dveloppent et
entra=ne de" perte" conomi-ue" con"idra%le"& l,a#ent re"pon"a%le e"t une %actrie& Si%rio
c'olerae0 Ri"-ue : diarr'e& d"'.dratation "rieu"e0
(. Les s.m"tmes dune toxi-infection alimentaire :
En #nral& le" ".mpt+me" le" plu" courant" "ont : nau"e"& diarr'e& vomi""ement& crampe"
a%dominale"& le" mau1 de t4te& de" douleur" mu"culaire" et de lLpui"ement&(il" peuvent
au""i ",accompa#ner de 2i/vre& de 2ri""on"& de perte d,apptit et de mau1 de t4te0 :'e3 le"
"u*et" 7 ri"-ue& 2emme" enceinte"& nourri""on"& per"onne" I#e"& et le" per"onne"
immunodprime" certaine" into1ication" peuvent ",avrer mortelle"0 Ain"i -ue le ri"-ue de
d"'.dratation "urtout c'e3 le" en2ant"0
:e" ".mpt+me" "e mani2e"tent le plu" "ouvent 1 7 MP ' apr/" a%"orption de" aliment"0
!a dure de #uri"on dpend du t.pe dLin2ection& de lLI#e et de lLtat de "ant de la per"onne0
). Les mauaises "ratiques conduisant + des maladies dori#ine alimentaires :
!e re2roidi""ement inad-uat de" aliment" T
!e dlai trop lon# entre la prparation et le "ervice T
!a temprature inad-uate de" aliment" maintenu" c'aud" T
!e man-ue d,'.#i/ne per"onnelle T
!e mauvai" rc'au22a#e de" aliment" T
!e netto.a#e d2icient de l,-uipement et de" u"ten"ile" T
!a con"ommation de re"te" mal con"erv" T
!e" contamination" croi"e" T
!a cui""on inad-uate T
!e" aliment" cru" contamin"0
5. Les "rinci"ales "rcautions + faire "our lutter contre la contamination !actrienne
des aliments :
!e" aliment" comportant un ri"-ue lev de contamination %actrienne "ont le" Cu2"&
la volaille& le %Cu2 'ac'& le" produit" laitier"& le" 2ruit"& le" l#ume"& le" 2ruit" de mer et tou"
le" produit" -ui en contiennent0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
!e" Cu2" doivent tou*our" 4tre man#" cuit"& 7 demi cuit"& il" repr"entent un dan#er pour
le" 2emme" enceinte"& le" tr/" *eune" en2ant"& le" per"onne" I#e" et le" malade"0
!e" Cu2" cru" incitent la proli2ration de la "almonelle -ui "e dveloppe #alement dan"
le" met" contenant de" Cu2" cru" $ma.onnai"e& "auce& mou"e) plu" rapidement encore ",il" ne
"ont pa" r2ri#r"0
!a volaille ne doit *amai" 4tre dcon#ele 7 la temprature am%iante& e1po"e 7 la c'aleur&
cette viande 2ra#ile peut 4tre 2acilement in2e"te de" micro%e"0 6l 2aut prendre le temp" de
la dcon#eler au r2ri#rateur ou dan" l,eau 2roide et de la 2aire curie *u"-u,7 ce -ue l,intrieur
de la volaille attei#ne au moin" P9 de#r" :el"iu" tel -ue la c'aire ne "oit plu" ro"e0
!e %Cu2 'ac' e"t tr/" vulnra%le 2ace au1 %actrie" de "ur2ace car elle" peuvent ",introduire
2acilement "ur toute la ma""e de viande& la viande 'ac'e doit tou*our" 4tre %ien cuite et
con"omme dan" le" 2M 'eure" "uivant l,ac'at& "inon& il e"t plu" prudent de la con#eler
immdiatement& la viande 'ac'e ne doit *amai" 4tre dcon#el 7 la temprature de la pi/ce0
!e" produit" laitier"& notamment le lait cru et le" 2roma#e" c'arcuterie "ont "u"cepti%le" de
contenir la %actrie& li"teria monoc.to#/ne"& re"pon"a%le de la li"trio"e -ue "oit tr/"
dan#ereu"e pour le 2Ctu"& ain"i -ue pour le" per"onne" I#e" et le" per"onne" vulnra%le" tel
-ue le" malade" et le" %%"0
:ette %actrie e"t particuli/re car elle "e dveloppe au""i 7 la temprature de la r2ri#ration
donc il e"t important de tou*our" re"pecter le" date" de premption in"crite" "ur le" produit"
pri""a%le"0
!e" crale" cuite"& la cr/me 2ouette& le" 2ruit" de mer $particuli/rement le" moule"&
le" 'u=tre" et le" crevette") le" l#umineu"e" cuite"& le" "auce"& la ma.onnai"e et le" viande" 7
tartiner "ont de" proie" pour le" %actrie" "i elle" ne "ont pa" con"erve" 7 une temprature
in2rieure ou #ale 7 M de#r" :el"iu"0
Avant dLenvi"a#er la rec'erc'e& il e"t indi"pen"a%le dLc'antillonner& convena%lement
lLaliment 7 anal."er0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
P%R7I4 II : Les "remiers "as conduisant + une !onne anal.se qualitatie
ou quantitatie
I. 4chantillonna#e
6l 2aut -ue le plan d,c'antillonna#e "oit tec'ni-uement et conomi-uement rali"a%le0
!e nom%re d,unit" 7 prlever e"t en 2onction du niveau de "curit -ue l,on veut atteindre0
Deu1 param/tre" important" doivent 4tre con"idr" :
- !a "vrit de ri"-ue pour la "ant du con"ommateur T
- !,'omo#nit de" produit" : prenant en con"idration l,'tro#nit de la rpartition
de" micro-or#ani"me" et la varia%ilit de" mt'ode" anal.ti-ue"& il 2aut -ue le produit
prlev "oit 'omo#/ne0
Sac'ant -ue l,'omo#nit e"t plu" #rande "ur le" produit" li-uide" -ue "ur le" produit"
"olide"& alor" pour rali"er un %on prl/vement& il 2aut travailler comme "uit :
Pour un produit li-uide : la pri"e d,e""ai doit 4tre prcde d,une a#itation convena%le0
Pour un produit "olide : l,c'antillonna#e "era plu" important et intre""era di22rente"
3one" de 2aDon 7 dceler la pr"ence ventuelle de nid" micro%ien"0
Ain"i -ue le plan d,c'antillonna#e& comporte nce""airement deu1 #roupe" d,lment" :
!e nom%re d,c'antillon" 7 prlever 7 partir de c'a-ue lot $indice n)& taille de
c'a-ue c'antillon& tec'ni-ue de prl/vement& indication du moment et du lieu de
prl/vement& t.pe d,em%alla#e0
!,indication du nom%re d,c'antillon" doit 4tre con2orme au1 limite" indi-ue"
$indice :)& pour le"-uel" un dpa""ement du crit/re m e"t tolr0 :e dpa""ement
e"t limit 7 une valeur M ou "euil d,accepta%ilit0
!e plan d,c'antillonna#e concerne le" produit" pour le"-uel"& le ri"-ue e"t tr/"
2ai%le& ain"i -ue le" produit" pour le"-uel" le ri"-ue e"t ma1imum0
!e niveau de ri"-ue pour le con"ommateur e"t 2onction du produit lui m4me& de "e" condition"
de con"ervation et de prparation et de la "en"i%ilit particuli/re du con"ommateur $*eune"
en2ant& per"onne" I#e"& malade")0
II. 7echniques *e Prl8ements
!e prl/vement doit "e 2aire a"epti-uement0
!e" v4tement" et le" main" de prleveur doivent 4tre propre"0
Eviter le" courant" d,air0
Re"pecter le" prcaution" d,a"ep"ie par2aite0 $<tili"ation d,une lampe 7 "ouder 7 #a3 portative
permettant de d"in2ecter par 2lam%a#e le" in"trument" ou Ro%inet" de prl/vement)0
:'oi1 convena%le de" in"trument" et rcipient" de"tin" 7 rali"er le" prl/vement" et 7
le" tran"porter0
!e netto.a#e et la "trili"ation du matriel doit 4tre 2acile0
!e t.pe d,in"trument 7 utili"er e"t 2onction du produit 7 prlever :
- Pour le" prl/vement" de li-uide" : de" pipette"& de" louc'e"
- Pour le" prl/vement" de "olide" : de" "patule"& de" "onde"0
- Pour le" produit" con#el" : perceu"e& "cie& ci"eau(
!e prl/vement doit 4tre e22ectu au 'a"ard0
!e" tec'ni-ue" de prl/vement "ont tr/" diver"e" et variante" en 2onction du produit 7
anal."er0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
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III. 7rans"ort *e Lchantillon
Si le produit e"t 2rai"& la temprature de l,c'antillon doit 4tre ramene entre 0 et GF:0
!,anal."e ",e22ectuera dan" le" 2M 'eure"& "i l,anal."e ne pourra pa" "e 2aire dan" le dlai
limit& l,c'antillon "era donc con#el et con"erv 7 une temprature -1PF:0
!e" "emi Ucon"erve" "eront tran"porte" entre 0 et VGF:& le dlai ma1imal de la rali"ation de
l,anal."e e"t de G *our"0
!e" produit" con#el" ou "ur#el"& tran"port" 7 cet tat 7 une temprature -1PF:0 !e dlai
de l,e1amen micro %iolo#i-ue ne doit pa" dpa""er 1 moi"0
I9. &onseration *es :nits *chantillonna#e
Avant l,anal."e au la%oratoire& le" produit" 7 anal."er doivent 4tre con"erv au r2ri#rateur
$0-9F:) ou au con#lateur 7 lLe1ception de" aliment" "ta%le" 7 la temprature de la pi/ce "elon
la nature du produit0
Pour 2aire le" anal."e"& le" c'antillon" en -ue"tion doivent 4tre dcon#el" dan"
un r2ri#rateur ou pendant une priode et 7 une temprature -ui emp4c'ent la croi""ance ou
la mort de" micro-or#ani"me"0
W08 : le" c'antillon" doivent 4tre anal."" le plu" t+t po""i%le apr/" leur rception au
la%oratoire0
9. Pr"aration de lunit danal.se
1. Pr"aration *e Lunit *chantillonna#e
- Wetto.a#e de la "ur2ace de travail avec un d"in2ectant appropri0
- RinDa#e de" main" avec le "avon
- !e travail doit "e 2aire "ou" une 'otte alimente en air "trile $'otte 7 2lu1 laminaire)0
- !e" manipulation" doivent 4tre e22ectue" 7 cot d,un %ec %un"en allum pour a""urer
le" condition" d,a"ep"ie locale indi"pen"a%le0
- Avoir 7 "a di"po"ition le li-uide de dilution" "trile en 2lacon et en tu%e -ui peut 4tre
l,eau peptone tamponne ou tr.ptone "el0
- !e" in"trument" nce""aire" au travail $pipette" "trile"& de" %oite" de ptri "trile"&
l,taloire& le couteau& le" ci"eau1& de" pot" "trile"& le" "ac'et" "trile")0
- !e" milieu1 de culture re2ondu" au %ain Marie mi" 7 l,tuve 90F:0
2. Pr"aration de lchantillon
Pour -ue l,unit d,anal."e "oit vraiment repr"entative0
2.1. Pr"aration de la sus"ension m8re
A#iter le" li-uide" ou le" "olide" 2luide" *u"-u,7 ce -ue le contenu "oit 'omo#/ne
Dan" le ca" d,un "olide& prlever de" portion" 7 di22rent" endroit" de l,unit
d,c'antillonna#e0
2.1.1. Pour les "roduits liquides
Prparer une dilution 1A10 de l,aliment en mlan#eant de 2aDon a"epti-ue 29 # ou ml
du produit 7 anal."er 7 229 du diluant0
Si la taille ou le volume de l,c'antillon di22/re de 29 # ou ml& il 2aut maintenir 7 1A10
la relation c'antillonAdilution tel -ue 10 # de l,unit d,anal."e dan" 0 ml de diluant ou 11 #
du produit 7 anal."er dan" ml de diluant0
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!Limportant e"t& de rali"er la 2ormule $M 1 ) pour "avoir la -uantit du diluant nce""aire0
2.1.2. Pour les "roduits solides :
Dan" le ca" de" produit" -u,il 2aut mlan#er& utili"er le mlan#eur ou le ? "tomac'er @ pendant
le temp" minimal nce""aire pour produire une "u"pen"ion 'omo#/ne0
Pour viter de "urc'au22er l,c'antillon& ne pa" mlan#er pendant plu" de 2&9 minute"0
On lai""e l,'omo#nat d,aliment" "ec" $dilution 1A10) c,e"t 7 dire la "u"pen"ion m/re& repo"er
7 la temprature de la pi/ce pendant 19 min& dan" tou" le" autre" ca" pour"uivre l,anal."e "an"
tarder0
Dan" le ca" de" aliment" -ui ont tendance 7 mou""er& r#ler le mlan#eur 7 %a""e vite""e et
prlever une part ali-uote "ou" l,inter2ace li-uideAmou""e0
2.2. Pr"aration des dilutions dcimales :
Tran"va"er 1 ml de la "u"pen"ion m/re dan" ml de diluant0
We pa" introduire la pipette #radue "trile de plu" de 1 cm dan" le diluant "trile de la
"olution "uivante0
Mlan#er "ur a#itateur t.pe vorte1 pendant 9 7 10 "econde"0
!e diluant peut 4tre "oit tr.ptone "el ou eau peptone tamponne0
2.3. *ure des o"rations :
!e temp" -ui ",coule entre la 2in de la prparation de la "u"pen"ion m/re et le moment ou
l,inoculum entre en contact avec le milieu de culture ne doit pa" dpa""er M9 min "au2
indication" particuli/re" de la norme0
9I. 4nsemencement et *nom!rements :
1. 4nsemencement :
1.1. 4n milieu solide :
7echnique "ar incor"oration /ensemencement en "rofondeur2
;i#ure : "rotocole de la "r"aration des dlutions dcimales
1ml 1ml 1ml 1ml
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!a tec'ni-ue con"i"te 7 placer au 2ond de %oite" de ptri vide" "trile" 1 ml de" di22rente"
dilution"& une ou plu"ieur" %oite" "ont utili"e" par dilution& dan" le" minute" -ui "uivent&
ver" dan" c'a-ue %o=te le milieu de culture pre"crit $prala%lement 2ondu et re2roidi 7
la temprature de MF: X 2F:)0
Mlan#er "oi#neu"ement et lai""er "olidi2ier "ur une "ur2ace 2roide et 'ori3ontale0
!e temp" de "olidi2ication de la #lo"e ne doit pa" dpa""er 10 min0
Apr/" "olidi2ication compl/te& une deu1i/me couc'e de milieu peut 4tre coule0
!,utili"ation de cette tec'ni-ue e"t re"treinte 7 -uel-ue" ca" :
- Dnom%rement particuli/re" $ASR) : deu1i/me couc'e du m4me milieu pour
emp4c'er le contact de la culture %actrienne avec l,o1.#/ne -ui cau"e l,a"p'.1ie de"
%actrie"0
- !e produit e"t "u"cepti%le de contenir de" micro-or#ani"me" enva'i""ant" :
la deu1i/me couc'e e"t de #lo"e non nutritive0
!e" %oite" "ont incu%e" retourne"& la temprature et le temp" de l,incu%ation varient "uivant
le #erme rec'erc'0
7echnique "ar talement /ensemencement en surface2
On travaille avec de" milieu1 #lo"" prcoul" en %oite" de ptri $19-20 mlA%oite)0
!a tec'ni-ue con"i"te 7 placer 7 la "ur2ace de la #lo"e 0&1 ml de la "u"pen"ion m/re et 0&1 ml
de" di22rente" dilution"0
!,inoculum e"t tal 7 l,aide d,un taleur ou de" pipette" pa"teur0
!e" %oite" "ont incu%e" retourne"& la temprature et le temp" d,incu%ation varient "uivant
le #erme rec'erc'0
1.2. 4n milieu liquide :
:on"i"te 7 placer l,inoculum dan" le milieu li-uide "uivi d,une 'omo#ni"ation avec vorte10
2. 7em"rature et dure dincu!ation :
Ta%leau1 repr"entant" la temprature et la dure d,incu%ation de" micro-or#ani"me"
rec'erc'" dan" l,eau et le" aliment" :
Pour les aliments :
,icroor#anismes
recherchs
7em"rature dincu!ation *ure dincu!ation
Germe" aro%ie" m"op'ile" G0F E2 'eure"
:oli2orme" G0F: 2M 'eure"
:oli2orme" t'ermotolrant" MMF: 2M 'eure"
Stap'.lococcu" aureu" GEF: MP 'eure"
Anaro%ie" "ul2ito-rducteur" MMF: MP 'eure"
Salmonelle GEF: 2M 'eure" pour c'a-ue tape
d,anal."e du "uivie
!evure" G0F: E2 'eure"
Moi"i""ure" G0 F: E2 'eure"

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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Pour les eaux :
,icroor#anismes
recherchs
7em"rature dincu!ation *ure dincu!ation
Microor#ani"me"
revivi2ial%e" 7 20F:
20Fc E2 'eure"
Microor#ani"me"
revivi2ia%le" 7 GEFc
GEF: 2M 'eure"
:oli2orme" GEF: 2M 'eure"
:oli2orme" t'ermotolrant" MMF: 2M BE<RES
Stap'.lococcu" aureu" GEF: MP 'eure"
Anaro%ie" "ul2it"reducteur" GEF: MP 'eure"
Streptoco-ue" 2cau1 GEF: MP 'eure"
P"eudomona" aeru#ino"a GEF: MP 'eure"
Salmonelle GEF: 2M 'eure" pour c'a-ue tape
de "uivie
3. Lecture et dnom!rement :
3.1. 4n milieu solide :
<ans identification
On ne doit retenir -ue le" %oite" contenant au minimum G0 colonie" et au ma1imum G00
colonie" alor" le nom%re de micro-or#ani"me" pr"ent" dan" l,c'antillon $1) e"t calcul par
le 2ormule :
e
S$n1 V 0&1 n2) d
e : "omme de" colonie" "ur le" %o=te" compte"0
S : volume de l,inoculum dpo" dan" la %o=te de ptri
W1 : nom%re de %o=te dan" la 1
/re
dilution compte
D : dilution 7 partir de la-uelle le" premier" dnom%rement" "ont o%tenu"0
E1emple : pour ce dnom%rement on a :
- 1 %o=te par dilution ; n1 ; n2 ; 1
- - 1 ml inocul en pro2ondeur : S ; 1 ml
- 10-2 ; 200:
- 10-G ; M0F:
Si le" %oite" 7 identi2ier contiennent plu" de G00 colonie" le" r"ultat" "ont in2rieur" 7
la ralit& car %eaucoup de #erme" n,ont pa" eu la po""i%ilit de "e dvelopper 7 cau"e de
l,in"u22i"ance de "u%"tance" nutritive" di"poni%le"0
Si le" %oite" contiennent moin" de 19 colonie" l,'omo#nit in"u22i"ante au cour"
de" dilution" e1pli-ue le" irr#ularit" invita%le"
%"r8s identifications :
W ;
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
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Si la mt'ode utili" nce""ite une identi2ication& on repi-ue un nom%re dtermin A de
colonie" "ur c'a-ue %oite" retenue" pour le compta#e de" colonie"& on calcule pour c'a-ue
%oite un nom%re ? a @ tel -ue :


% ; nom%re de colonie" rpondant au1 crit/re" d,identi2ication $caractri"ti-ue") T
c ; nom%re total de colonie" dnom%re" "ur la %oite T
d; nom%re de colonie" repi-ue"0
On calcule donc le nom%re W de micro-or#ani"me" identi2i" pr"ent" dan" l,c'antillon pour
e""ai en tant -ue mo.enne pondre par la 2ormule :
a
S$n1 V 0&1 n2) d
E1emple
Soit un produit& dnom%rement direct :
Dilution 10-M : P0 colonie"0
Dilution 10-P : colonie"
Pour P0 colonie"& on a repi-u G colonie" dont 2 rpondent au1 crit/re" d,oR :
a1 ; $2AG) 1 P0 ; 1O0AG; 9G
Pour colonie"& on a repi-u G colonie" dont 1 rpond au1 crit/re" d,oR a2 ; $1AG) 1 ;AG ;G
a1Va2 9GVG
S $n1V0&1n2) d 1 $1V0&1) 10
-M


!e nom%re de micro or#ani"me" dnom%r" dan" l,c'antillon pour e""ai e"t de 900 10
M
uAml0
3.2. *nom!rement en milieu liquide :
Pour le dnom%rement en milieu li-uide& il e"t recommand d,utili"er la tec'ni-ue du WPP
$tec'ni-ue du nom%re le plu" pro%a%le)0
!a tec'ni-ue con"i"te 7 placer 1 ml de la "u"pen"ion m/re et 1 ml de" di22rente" dilution"
dan" de" tu%e" de milieu li-uide"0
G tu%e" par dilution l tec'ni-ue du WPP 7 G tu%e"
9 tu%e" par dilution : tec'ni-ue du WPP 7 9 tu%e"
!,incu%ation 7 une TF et pendant une dure variante "uivant le #erme rec'erc'0
9II. ;acteurs influen=ant la croissance !actrienne
1. %ction de leau
!,eau con"titue le principal 2acteur pour la croi""ance %actrienne& du -uel dpend tou"
le" autre" 2acteur"0 6l e"t utili" de deu1 mani/re" complmentaire" :
:omme "olvant dan" le" nutriment"& ce -ui a""ure leur tran"port et leur di"poni%ilit
dan" le c.topla"me0
:omme a#ent c'imi-ue de" raction" d,'.drol."e"& de" raction" #nratrice"
de" monom/re" $acide" amin"& "ucre"& acide" #ra")& Wce""aire" 7 la ".nt'/"e
micro%ienne et de" raction" ner#ti-ue"0
Or l,indice de di"poni%ilit en eau dan" un milieu pour de" raction" c'imi-ue" et
%ioc'imi-ue" a une valeur -ui varie de 0 7 10 :ependant une diminution de cet indice entra=ne
un p'nom/ne de pla"mol."e de la cellule& par e1emple Staphylococcus aureus perd 90Q de
W ;
; ; 9000
W ;
% 1 c
a ;
d
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"on eau intracellulaire -uand cet indice pa""e de 009 7 00900 :e p'nom/ne diminue ou
arr4te la croi""ance ou l,activit en3.mati-ue0 $Troller& Y0A0& 1P0)0
2. %ction du "$
!e pB donne une ide "ur la concentration de" ion" '.dro#/ne d,une "olution& donc il in2lue
"ur le" raction" c'imi-ue" et %ioc'imi-ue" et par con"-uent "ur le" micro-or#ani"me"0
!e" micro-or#ani"me" "e dveloppent "ur de" milieu1 dont le pB varie de M09 7 mai" avec
un optimum de O09 7 E09& "an" ou%lier -u,il . a tou*our" de" e1ception" $Ya.& Y0M0& 1PO)
Parmi le" %actrie" pat'o#/ne"& Clostridium e"t plu" "en"i%le au1 variation" de pB -ue
la plupart de" %actrie" alor" -u,E"c'eric'ia coli, Salmonella et Staphylococus "ont plu"
r"i"tante"& noton" par e1emple -ue Staphylococcus aureus e"t r"i"tante 7 pB M&9& mai"
pr"ente une 2orte rduction de la croi""ance en diminuant ce param/tre de O 7 9&M $Ma#rini&
R0:0 et al& 1PG).
Ain"i certaine" tude" montrent #alement de" di"parit" importante" entre le" "ouc'e" de
m4me e"p/ce dan" l,adapta%ilit au di22rent" pB $8loc'er& Y0:0 et al& 1P2)0
:ependant le pB de" aliment" *oue un r+le tr/" important dan" la croi""ance de" %actrie"0
:e param/tre dpend de" -uantit" de "u%"tance acide" ou %a"i-ue" pr"ente" $8anZart& G0Y0&
1PO)0
3. %ction de l>x.#8ne
!e" micro-or#ani"me" "ont cla""" en 2onction de leur" e1i#ence" en O
2
0 On di"tin#ue
#nralement G principau1 #roupe" :
3.1. Les aro!ies stricts
!e" aro%ie" "trict" e1i#ent l,o1.#/ne comme accepteur 2inal d,lectron"& il" n,ont pa"
la po""i%ilit d,utili"er une voi1 2ermentaire& et di"po"ent de la catala"e pour liminer
le pero1.de d,'.dro#/ne $8O<RGEO6S& :0M0& 1PP)0
3.2. Les anaro!ies facultatifs
!e" anaro%ie" 2acultati2" peuvent "e dvelopper en pr"ence ou en a%"ence d,o1.#/ne0
6l" po""/dent une c'a=ne re"piratoire& de" en3.me" nce""aire" 7 la 2ermentation et
une catala"e $8our#eoi"& :0M0 et al& 1PP)0
3.3. Les anaro!ies stricts
!e" anaro%ie" "trict" ont un mta%oli"me 2ermentaire o%li#atoire il" "ont catala"e n#ati2" et
inactive par la pr"ence d,o1.#/ne de 2aDon varia%le en 2onction de la pre""ion partielle de ce
#a3 $8our#eoi"& :0M0 et al& 1PP).
'. %ction de la tem"rature
En 2onction de la temprature on di"tin#ue M principau1 #roupe" :
'.1. Les "s.chrotro"hes et les "s.chro"hiles
!e" p".c'rop'ile" adapt" au 2roid "ont rencontr" peu en milieu alimentaire mai" plut+t dan"
le" r#ion" polaire"0 6l" "e dveloppent 7 0F:& mai" avec un optimum de 19F: 7 20F:0
!e" p".c'rotrop'e" "ont capa%le" de ",adapter et "e dvelopper au1 temprature" proc'e" de
0F: mai" il" ont un optimum de 29 7 G0F:& ce -ui le" approc'e de" m"op'ile"0 6l" "ont peu
comptiti2" avec le" autre" #erme" lor"-ue la temprature au#mente0
!e" p".c'rotrop'e" "ont dominant" dan" le" denre" r2ri#re" : le" viande"& le" poi""on"&
le lait& le" l#ume"0 Par e1emple : Pseudomonas, Lactobacillus et au""i le" levure" et
le" moi"i""ure" $Ya.& Y0M0 1PO)0
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'.2. Les mso"hiles
!e" m"op'ile" "e multiplient 7 de" temprature" allant de 20F: 7 VM9F: avec un optimum 7
GEF:0 !eur tau1 de croi""ance e"t lev et la dure de leur proli2ration e"t relativement courte
$1 7 -uel-ue" *our" pour atteindre la p'a"e "tationnaire de leur croi""ance)0 On le" trouve dan"
le" aliment" con"erv" 7 de" temprature" am%iante"0 6l" re#roupent le" principau1 #enre" et
e"p/ce" %actrien" et le" e"p/ce" pat'o#/ne" pour l,Bomme et le" animau1 $Ya.& Y0M0& 1PO)0
'.3. Les thermo"hiles
!e" t'ermop'ile" "ont capa%le" de proli2rer 7 de" 'aute" temprature" allant de M9F: 7 O9F:
avec un optimum 7 99F:0 6l" "ont tr/" rpondu" dan" la nature& repr"ent" "urtout par
le" #enre" %actrien" Bacillus et Clostridium et par le" moi"i""ure" en milieu alimentaire $Ya.&
Y0M0 1PO)0
9II. &onclusion
On "ait -ue l,anal."e micro %iolo#i-ue ",intre""e 7 mettre en vidence le" #erme"
re"pon"a%le" d,altration de la -ualit marc'ande et '.#ini-ue de" produit" de"tin" 7
la con"ommation 'umaine& c,e"t pour-uoi tou" le" tape" -ui "ervent 7 rali"er ce" anal."e"
doivent "e 2aire a"epti-uement et avec "oin car la 2ia%ilit de" r"ultat" donne un %on
*u#ement "ur la -ualit et la "curit du produit 2ini avant de le mettre "ur le marc' et 7
la porte de" con"ommateur0
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P%R7I4 III : %nal.se des aliments et des eaux
- Analyse des aliments
I. Les diffrents microor#anismes recherchs dans les "roduits alimentaires
Dan" ce t.pe d,anal."e& plu"ieur" t.pe" de %actrie" "ont rec'erc'"0
1. Les #ermes ca"a!les daltrer la qualit marchande de laliment :
1.1. La flore totale mso"hile :
:,e"t l,en"em%le de tr/" nom%reu1 microor#ani"me" peuvent 4tre 7 l,ori#ine de ce t.pe
d,altration& leur pr"ence dan" le" produit" alimentaire" e"t apprci en dnom%rant
le" #erme" aro%ie" m"op'ile" dit" ? totau1 @& le compta#e de ce" colonie" e"t 2acilit par
la culture "ur une #lo"e de dnom%rement incu% 7 une temprature de G0F: pendant G *our"&
il donne de" ren"ei#nement" "ur la "alu%rit du produit et l,'.#i/ne du per"onnel et du local0
En e22et& ce dnom%rement ne met en vidence -ue le" #erme" capa%le" de "e multiplier dan"
ce" condition" c'oi"ie"& c070d0 G0Fc AE2 '0
Sur P:A& ce" derni/re" devront 4tre modi2ie"& de" rec'erc'e" "lective" "ont utile" :
- 8actrie" anaro%ie" "tricte"
- 8actrie" p".c'orotrop'e" ou p".c'rop'ile"
- 8actrie" t'ermop'ile"
- dan" le" aliment" "u"pect" d,4tre re"pon"a%le d,into1ication" alimentaire"&
le nom%re de" #erme" aro%ie" m"op'ile" e"t #nralement lev et il peut
atteindre 10O ou 10EA#0
1.2. Leures et moisissures :
!e" levure" : elle" "ont de" microor#ani"me"& aro%ie"& m"op'ile" donnant 7 29Fc
de" colonie" met" ou %rillante"& 7 contour r#ulier et 7 "ur2ace conver"e $en "ur2ace de milieu)&
de" colonie" ronde"& et lenticulaire" $en culture en pro2ondeur du milieu)0
!e" moi"i""ure" : "ont de" micro-or#ani"me" aro%ie"& m"op'ile" 2ilamenteu"e"& donnant
la "ur2ace du milieu de" colonie" tendue"& plate" ou duveteu"e" avec 2ructi2ication"0
!e dnom%rement de" levure" n,a pa" de "i#ni2ication '.#ini-ue mai" le tau1 lev "i#ne
un ri"-ue d,altration de l,aliment menant 7 la dtrioration de la -ualit or#anolepti-ue
de" produit"0
Par contre le" moi"i""ure" peuvent cau"er de" into1ication" alimentaire" par "crtion
de" m.coto1ine" et donnent de" in2ormation" "ur la "alu%rit de" locau10
1.3. Pseudomonas :
Se "ont de" %acille"& #ram- non "porul non cap"ul mo%ile par une ciliature monotric'e&
o1.da"e& catala"e V& aro%ie "tricte0
Elle" "ont de" #erme" u%i-uitaire" et "e trouvent dan" l,environnement : "ol& eau1& terrain"
'umide"0
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:'e3 l,'omme et le" animau1& c,e"t un #erme commen"al de" t#ument" et de" mu-ueu"e"&
c,e"t une %actrie pat'o#/ne opportuni"te0
:e" #erme" "ont caractri"" par la pr"ence de "lime ou #l.cocal.1 et il" "ont peu e1i#eant&
c'imio or#anotrop'e& leur mta%oli"me e"t re"piratoire et non 2ermentaire et il" "ecr/tent
de" pi#ment" :
- P.overdine $vert 2luo) produit par p"eudomona" aeru#ino"a
- P 2luore"cence et P putida0
- P.oc.amine $vert %leu) produit par p"uedomona" u#ino"a0
Pour mettre en vidence ce" pi#ment" on utili"e le" milieu1 :
Hin# A pour la rvlation de" p.oc.anine T
[in# 8 pour la mi"e en vidence de la p.overdine
:e" %actrie"& i"ole" de" eau1& l#ume"& "alade& 2ruit" ou 2leur"& po""/dent une tr/" #rande
r"i"tance vi" 7 vi" le" anti%ioti-ue"0
2. Les #ermes "otentiellement "atho#8nes "our le consommateur
2.1. <almonelles :
!e #enre "almonella appartient 7 la 2amille de" entro%actriaceae& c,e"t donc de" %acille"&
#ram n#ati2& aroanaro%ie" 2acultati2"& mo%ile" par une ciliature pritric'e& elle" pou""ent
"ur un milieu ordinaire& o1.da"e n#ati2& catala"e po"iti2& #luco"e po"iti2 $8actrie"
2ermentaire") lacto"e n#ati2& nitrate rducta"e po"iti2& B2" X 0
6l e1i"te plu" de 2000 e"p/ce"& -ui peuvent 4tre l,'+te normal ou pat'o#/ne du tu%e di#e"ti2
de l,'omme oR de" animau1 condui"ant ain"i 7 de" "almonello"e"0
!e #enre "almonella po""/de de" caract/re" anti#ni-ue" : l,anti#/ne "omati-ue A#o&
l,anti#/ne de virulence A#vi et l,anti#/ne 2la#ellaire ? A#' @0 et #rIce 7 de nom%reu1
"rot.pe"& on peut 2aire de" "eroa##lutination" pour dterminer le" e"p/ce" re"pon"a%le"
de" in2ection"0
2.2. <ta"h.locoques :
6l" 2ont partie de la 2amille de" micrococcaceae& on di"tin#ue deu1 t.pe" de "tap'.loco-ue" :
- "tap'.loco-ue" 7 coa#ula"e n#ati20
- "tap'.loco-ue" 7 coa#ula"e po"iti2 et plu" prci"ament "tap'.lococcu" aureu"0
Se "ont de" #erme" u%i-uitaire& commen"al et opportuni"te0 le #enre "tap'.lococcu" e"t
un #erme cocci& #ram V& immo%ile"& aro-anaro%ie 2acultati2& non "porule"& non cap"ule"&
produi"ent une catala"e0
Pour l,e"p/ce "tap'.lococcu" aureu"& on peut a*outer la production de la coa#ula"e&
la rduction du mannitol et au""i elle "e caractri"e par la pr"ence de la protine NA et de"
rcepteur du 2i%rino#/ne& on peut au""i a*outer -ue "e "ont de" %actrie" 'alop'ile" et peu
e1i#eant et elle" "ont caractri"e" par la pr"ence d,un pi#ment *aune dor lor"-u,on l,i"ole
"ur le milieu :'apman ric'e en Wacl0
Et elle" "ont capa%le" de "ecrter de" entroto1ine" a#ent" re"pon"a%le" de" to1i-in2ection"
alimentaire"0
2.3. %naro!ies sulfito-rducteurs :
6l ",a#it d,un en"em%le tr/" comple1e de %actrie"& "e trouvent dan" le tu%e di#e"ti2& l,eau&
le "ol et l,environnement0
Se "ont de" %actrie" anaro%ie" "tricte"& -ui ne peuvent "e cultiver -u,en l,a%"ence de l,air
am%iant ou de l,o1.#/ne& c,e"t pour-uoi le travail ",e22ectuer en utili"ant de" tec'ni-ue"
veillant "ur l,a%"ence par2aite de l,O2 lor" du prl/vement& tran"port& culture et i"olement0
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On di"tin#ue deu1 t.pe" de" %actrie" anaro%ie" :
- !e" %actrie" anaro%ie" telluri-ue" : "ont de" "aprop'.te" "e trouve dan" la terre&
le "ol et l,environnement& anaro%ie" "tricte" "porule"& r"i"tante" dan"
l,environnement0 !,anal."e micro"copi-ue a montr -ue "e "ont de" %acille"& #ram
n#ati2 ou po"iti2& volumineu"e"& mo%ile" ou immo%ile"0
- !e" %actrie" anaro%ie" non telluri-ue" : 2lore de veillon"& "e "ont #erme"
commen"au1 de" voie" "uprieure" di#e"tive"& #nitale" de l,'omme et de" animau10
2.3.1. &lostridium "erfrin#ens
:,e"t un %acille& #ram po"iti2& anaro%ie "tricte& immo%ile et elle rdui"e le" "ul2ite" en
"ul2ure0 :ette %actrie e"t tr/" rpondue dan" le "ol et elle e"t di""mine dan"
l,environnement par la pou""i/re& en e22et elle produit di22rent" t.pe" d,entroto1ine" -ui
cau"ent le" to1i-in2ection" alimentaire"0
2.3.2. &lostridium !otulinum :
:,e"t un %acille& #ram n#ati2& "porul& mo%ile non cap"ul& anaro%ie "tricte0
Elle ne peut pa" re"ter 7 l,tat normal lon#temp"& -uand le" condition" deviennent
d2avora%le"& il . aura "porulation& ce -ui la rend plu" r"i"tante et en "ecrtant de" to1ine"
elle e"t re"pon"a%le de %otuli"me0
2.'. Listeria monoc.to#8nes
Elle e"t %acille& #ram po"iti2& "porul aro-anaro%ie p".c'rop'ile& "e dveloppe en pr"ence
d,une ten"ion rduite en O20 !a temprature optimale de croi""ance e"t entre G0F: et GEF:
mai" elle peut tolrer un intervalle de 1Fc 7 M9F:0
:ette %actrie "e trouve dan" le "ol& la v#tation& le 2ourra#e et le" e1crment" de" 'umain" et
de" animau1 et par de mauvai"e" manipulation" li"teria pa""e dan" le" produit" laiti/r"&
le" l#ume"& le poi""on ou la viande& et "e multiplie car elle trouve le" condition" 2avora%le 7
"a croi""ance et en in#rant ce" produit" contamin"& le" #en" "ou22rent d,une li"trio"e0
2.(. <hi#ele
!e #erme Si#'ele e"t un %acille& #ram n#ati2 immo%ile"& non "porul& non cap"ul&
aroanro%ie 2acultati2& appartenant 7 la 2amille de" entro%actrie"& il 2ermente le #luco"e&
la catala"e po"iti2& l,o1.da"e e"t n#ati2& le lacto"e e"t n#ati2& pa" de" production" d,B2S ni
de #a3 et il ne po""/de -ue le" A#O et A#vi0
!e tu%e di#e"ti2 in2ect e"t le r"ervoir e""entiel de la %actrie et la contamination peut 4tre
- directe par contact avec le" malade"
- indirecte par le" eau1& le" %oue" et l,alimentation0
!e" deu1 e"p/ce" importante" "ont : "c'i#ella d."entenriae re"pon"a%le de la d."enterie
%acillaire& et "c'i#ella 2le1neri re"pon"a%le" de diarr'e"0
6l n,e1i"te pa" de vaccin pour ce" in2ection"& mai" on doit appli-uer l,'.#i/ne0
3. Les #ermes tmoins de la contamination fcale
3.1. &oliformes totaux :
Se "ont de" %acille"& #ram n#ati2& non "porul"& o1.da"e n#ati2& aro-anaro%ie" 2acultati2"&
capa%le" de "e multiplier en pr"ence de "el" %iliaire" ou d,autre" a#ent" de "ur2ace a.ant
de" proprit" -uivalente" et capa%le" de 2ermenter en plu" de #luco"e& le lacto"e avec
production d,acide et de #a3 en MP 'eure" 7 une temprature de GO-GEF: $X 0&9F:)0
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3.2. &oliformes fcaux
Appel" au""i& coli2orme" t'ermotolrant" e1i#eant une temprature de MMF: pour leur
culture& il" po""/dent le" m4me" caractri"ti-ue" de coli2orme" totau10
!e" coli2orme" t'ermotolrant 7 MMF: comprennent -uel-ue" #enre" en plu" d,E"c'eric'ia on
a Hle%"iella& entro%actrie citro%acter& "almonella& .er"inia
3.3. 4scherichia coli
Elle appartient 7 la 2amille de" entro%actrie"& c,e"t un %acille& #ram n#ati2& aro-anaro%ie
2acultati2& mo%ile par une ciliature pritric'e& non "porul& elle 2ermente le lacto"e& le #luco"e
et produit la catala"e& l,o1.da"e n#ati2 la nitrate rducta"e n#ati2& elle pr"ente une tr/"
#rande diver"it anti#ni-ue $A#O& A#B et A#Si) d,ou la diver"it de" "rot.pe"0
En e22et E"c'eric'ia coli e"t l,'+te normal du tu%e di#e"ti2 de l,'omme et de" animau1& elle
*oue un r+le important dan" la d#radation de" aliment"& dan" la 2ermentation et la r#ulation
de la coloni"ation %actrienne0
6l e1i"te de" "ouc'e" virulente" "e "ont de" "ouc'e" pat'o#/ne" ou entro'morra#i-ue" et
de" "ouc'e" "aprop'.te" de" tu%e" di#e"ti2" -ui peuvent devenir pat'o#/ne" dan"
de" condition" particuli/re" $opportuni"te")0
On peut au""i trouver E"c'eric'ia coli dan" l,environnement $eau1& "ol) "uite 7
une contamination 2cale& il e"t tr/" "en"i%le 7 la c'aleur0
&%R%&7?R4< R@%&7I>A<
Oxydase
-
:atala"e V
Gluco"e V
Production de l,6ndole V
Witrate rducta"e
-
Milieu de Kligler
Gluco"e V
!acto"e V
Ga3 V
B
2
S V
3.'. <tre"tocoques
:e" %actrie" appartiennent 7 la 2amille de" "treptococcaceae #enre "treptococcu"& "e "ont
de" #erme" u%i-uitaire"& commen"al de" t#ument" et de" mu-ueu"e" et pat'o#/ne0 Se "ont
de" cocci& #ram V& immo%ile& arrondi ou ovo\de& non cap"ul& en c'ainette" plu" ou moin"
lon#ue" 0Elle" "ont aroanaro%ie" 2acultati2& 2ra#ile" et e1i#eante"& catala"e n#ati2& o1.da"e
n#ati2 2ermentation de l,e"culine0 Elle" la%orent de" to1ine" et de" en3.me" -ui condui"ent 7
de" in2ection" no"ocomiale" et de" in2ection" cutan-mu-ueu"e" c'e3 le" immunodprim" et
elle" pr"entent une tr/" #rande r"i"tante vi" 7 vi" le" anti%ioti-ue"0
'. Les #ermes considrs comme indicateurs technolo#iques
'.1. Les entro!actries :
Tableau : Caractres biochimiques des E.coli (Le Minor, 1989)
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Se "ont de" %acille"& #ram n#ati2& immo%ile" ou mo%ile" par ciliature pritric'e"& non
"porul"& elle" "e cultivent "ur un milieu ordinaire& aro-anaro%ie 2acultati2& #luco"e po"iti2&
o1.da"e n#ati2& catala"e po"iti2& nitrate po"iti2 elle" "ont caractri"e" par la pr"ence
de" anti#/ne" :
- Sur la paroi au niveau de" lipopol."ac'aride" : A#OSur la "ur2ace au niveau de
l,enveloppe ; A#Si
- Au niveau de la cap"ule A#[0
- Sur le" 2la#elle" : A# 2la#ellaire ; A#B0
Elle" "ont compo"e" par 1M #enre" dont : E"c'eric'ia& "almonella& "'i#ella& Hle%"iella&
"erratia& proteu"& .er"inia entro%actrie0
En e22et& le dnom%rement de" entro%actrie" a pour %ut d,valuer la -ualit d,un traitement
de "ta%ili"ation ou de "u"pecter une recontamination0
'.2. Les coliformes
$Soir le" #erme" tmoin" de contamination 2cale)
'.3. Les lacto!acilles
!e" lacto%acille" "ont tr/" 'tro#/ne" et le" diver"e" e"p/ce" pr"entent de" caract/re"
p'not.pi-ue"& %ioc'imi-ue" et p'."iolo#i-ue" vari"0
!e" "ouc'e" de lacto%acille" "ont con"titue" de %acille" 7 #ram po"iti2& lon#" et 2in" $par2oi"
incurv") ou de cocco%acille" dont la 2orme vo-ue une cor.n%actrie0 6l" "ont non "porul"
#nralement immo%ile" $pour le" "ouc'e" mo%ile"& la ciliature e"t pritric'e)& micro-
arop'ile" $mai" certaine" "ouc'e" "ont anaro%ie" "tricte" 7 l,i"olement)& catala"e n#ative&
#nralement nitrate rducta"e n#ative& po""dant un mta%oli"me 2ermentati2 $l,acide
lacti-ue repr"ente au moin" 90Q de" produit" de 2ermentation) et pr"entant de" e1i#ence"
nutritionnelle" comple1e"0
Selon le" caractri"ti-ue" de la 2ermentation on di"tin#ue :
- !e" lacto%acille" 'omo2ermentaire" "trict" -ui d#radent le" 'e1o"e" en acide
lacti-ue et ne d#radent pa" le" pento"e" et ne produi"ent pa" de :O2 lor" de
la 2ermentation du #luco"e ou de #luconate0
- !e" lacto%acille" 'tro2ermentaire" "trict" : il" 2ermentent le" 'e1o"e" en acide
lacti-ue& acide acti-ue et en t'anol et :O2 et d#radent le" pento"e" en acide
lacti-ue et en acide lacti-ue0 :e" %actrie" produi"ent du :O2 lor" de
la 2ermentation du #luco"e et du #luconate
- le" lacto%acille" 'tro2ermentaire" 2acultati2" : -ui mta%oli"ent le" 'e1o"e" en
acide lacti-ue par la voie 'omo2ermentaire il" ne produi"ent pa" de :O2 lor"
de la 2ermentation du #luco"e mai" il" en produi"ent lor" de la 2ermentation
du #luconate0
(. Les #ermes recherchs selon les aliments :
Type
dchantillon
Nb de boite et
types de milieux
prpars
Types de
bactries
recherches
Dilutions
utilises
Volume de
lchantillon
ensemenc
dans chaque
boite
T et dure
dincubation
PLATS !A"DS 5 boites de PCA
1 boite de BP
2 boites de VRBL
2 boites de VRBL
1 boite de TSC
FMAT
STAPH.
C
C.TH
ASR
SM 10-4
SM
SM 10-1
SM 10-1
SM
1 ml
0.1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
30!"2#
3"!4$#
30!24#
44!24#
44!4$#
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
SALAD#S$
%"D&T##S.
5 boites de PCA
1 boite de BP
2 boites de VRBL
1 boite de TSC
FMAT
STAPH.
C.TH
ASR
SM 10-4
SM
SM 10-1
SM
1 ml
0.1 ml
1 ml
1 ml
30!"2#
3"!4$#
44!24#
44!4$#
SA"#S
T'(AT#S$
SALAD#
)%"&TS$ *"S
5 boites de PCA
1 boite de BP
2 boites de VRBL
2 boites de VRBL
1 boite de TSC
5 boites de MRS
FMAT
STAPH.
C
C.TH
ASR
LACT%BAC&L
SM 10-4
SM
SM 10-1
SM 10-1
SM
SM 10-4
1 ml
0.1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
30!"2#
3"!4$#
30!24#
44!24#
44!4$#
30!"2#
PAT&SS#%&#S 5 boites de PCA
1 boite de BP
2 boites de VRBL
3 boites VRBL
1 boite de TSC
2 boites de S'b
FMAT
STAPH.
C
C.TH
ASR
Le()*e+ moisis
SM 10-4
SM
SM 10-1
SM 10-1
SM
SM 10-1
1 ml
0.1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
30!"2#
3"!4$#
30!24#
44!24#
44!4$#
30!"2#
Aliments sucrs
comme les
+iscuits$
bonbons$ les
boissons
sucres,etc
+eure et les
conser-es
5 boites de PCA
1 boite de BP
2 boites de VRBL
3 boites VRBL
1 boite de TSC
2 boites de VRB,
2 boites de S'b
2 boites -ALL.
FMAT
STAPH.
C
C.TH
ASR
/0te*o
Le()*e+ moisis
Le()*e+ moisis %s
SM 10-4
SM
SM 10-1
SM 10-1
SM
SM 10-1
SM 10-1
SM 10-1
1 ml
0.1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1ml
1ml
1ml
30!"2#
3"!4$#
30!24#
44!24#
44!4$#
3"!24#
30!"2#
30!"2#
Les crudits 5 boites de PCA
1 boite de BP
2 boites de VRBL
2 boites de VRBL
1 boite de TSC
5 boites de MRS
2 boites d1%23o*d
o) P'l'm
FMAT
STAPH.
C
C.TH
ASR
LACT%BAC&L
Liste*i'
SM 10-4
SM
SM 10-1
SM 10-1
SM
SM 10-4
SM 10-1
1 ml
0.1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
30!"2#
3"!4$#
30!24#
44!24#
44!4$#
30!"2#
30!24#
II. %nal.se *es %liments
1. *nom!rement des #ermes aro!ies mso"hiles :
Milieu de culture : on emploie le milieu de culture PCA $plat count A#ar)& c,e"t un milieu -ui
2avori"e le dnom%rement de" aro%ie" totau1 dan" le" eau1& le lait& le" viande" et produit" 7
%a"e de viande et autre" denre" alimentaire"0
temprature d,incu%ation : G0F:
Dure d,incu%ation : E2 'eure" c070d0 G *our"
A"pect de" colonie" : 'tro#/ne
1.1. Pr"aration de la sus"ension m8re et dilution :
Pe"er une ma""e m ; 10# dan" un pot "trile
!a mettre dan" un "ac'et "trile en pla"ti-ue car on utili"e un 'omo#ni"ateur
pri"talti-ue t.pe "tomac'er0
A*outer le diluant 7 rai"on de $ 1 m)
Bomo#ni"er pendant un temp" "u22i"ant 1 7 2 min0
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!ai""er dcanter le" #ro""e" particule" 19 min au ma1imum "i le "ac'et ne contient pa"
de 2iltre "i non on utili"e la 2iltration $"ac'et V 2iltre)0
Prendre une -uantit "u22i"ante dan" un pot "trile numrot pour e22ectuer
le" anal."e"0
Prendre cin- %oite" de ptri "trile" et vide" SM-1-2-G-M
<tili"er le" pipette" "trile" #radue"0
Prendre 2 ml de la "u"pen"ion m/re& on inocule 1 ml au 2ond de la premi/re %oite
mentionne $SM)& et on tran"va"e le 1 ml re"tant dan" le tu%e contenant ml de
diluant0
Mlan#er "ur a#itateur vorte1 9 7 10 "econde"& c,e"t la premi/re dilution dcimale0
Pour le" autre" dilution"& on proc/de la m4me c'o"e& 1 ml de cette dilution dcimale
dan" la %oite -1 et un autre 1 ml dan" un tu%e contenant ml de diluant& ain"i de "uite
pour le" dilution" -ui "uivent0
!e diluant peut 4tre "oit tr.ptone "el ou eau peptone tamponne0
1.2. 4nsemencement
Pour le" #erme" aro%ie" m"op'ile" $Gam)& on utili"e le" deu1 tec'ni-ue" de
dnom%rement :
1.2.1. 7echnique "ar incor"oration : 4nsemencement en "rofondeur.
!a tec'ni-ue con"i"te 7 placer au 2ond de %o=te" de ptri vide" "trile" 1 ml de
la "u"pen"ion m/re et 1 ml de" di22rente" dilution" dcimale"0
Dan" le" minute" -ui "uivent& ver"er dan" c'a-ue %o=te le milieu de culture P:A
$prala%lement 2ondu et re2roidi en le" ramenant 7 une temprature de MEF: X2F:)0
Mlan#er "oi#neu"ement et lai""er "olidi2ier "ur une "ur2ace 2roide et 'ori3ontale oR le temp"
de "olidi2ication de la #lo"e ne doit pa" dpa""er 10 min0
Apr/" "olidi2ication compl/te& le" %oite" doit incu%e" retourn" 7 une temprature de G0F:
pendant E2 'eure"0
1.2.2. 7echnique "ar talement : 4nsemencement en surface.
:ette tec'ni-ue e"t utili"e pour le" couvillonna#e" de" mai"on"& de" ta""e"& de" a""iette" et
le" plan" de travail c070d0 planc'e 7 dcouper l#ume" ou viande" ou le" plan" de travail c'aud
ou 2roid0
On travaille avec de" milieu1 #lo"" $P:A) prcoul" en %oite" de ptri $19 7 20 mlA%o=te)
!a mt'ode con"i"te 7 mouiller l,couvillon par un peu de diluant et on le 2ait pa""er "ur
le milieu #lo"0
!e" %oite" "ont incu%e" retourne" 7 une temprature de G0F: durant E2 'eure"0
1.3. Lecture :
!e" colonie" "ont de 2orme et de couleur varie"& on ne compte -ue le" %o=te" -ui ont au
minimum G0 colonie" et au ma1imum G00 colonie"0
!e nom%re de micro-or#ani"me" dnom%r" dan" l,c'antillon pour e""ai e"t e1prim par
<N:Aml0
1.'. Inter"rtation
:e" micro-or#ani"me" 2ourni""ent une in2ormation "ur la contamination de l,aliment& leur
dnom%rement pr"ente un intr4t tec'nolo#i-ue dan" la me"ure oR une pr"ence importante
peut 4tre le re2let de condition" de 2a%rication ou de con"ervation d2ectueu"e" capa%le"
d,altrer la -ualit marc'ande" de" aliment" en c'an#eant "e" -ualit" or#anolepti-ue"0
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Avril-Mai 200
Pour le" produit" r2ri#r" et con#el"& la r2ri#ration et la con#lation dtrui"ent la ma*orit
de la 2lore aro%ie m"op'ile d,oR leur nom%re rduit0
Pour le" produit" con"idr" "trile"& le nom%re de la 2lore e"t peu "i#ni2iant0
En e22et le dnom%rement de ce" micro-or#ani"me" totau1 ne doit pa" 4tre appli-u 7 toute"
le" varit" d,aliment"& il e"t inapplica%le au1 produit" -ui r"ultent d,une 2ermentation
%iolo#i-ue : "auci""on" "ec"& lait" 2erment"& 2roma#e"(00
2. *nom!rement des coliformes et des coliformes thermotolrants
Milieu de culture : VRBL #lo"e lacto" %ile cri"tal violet et rou#e neutre T
:,e"t un milieu "lecti2 contenant du lacto"e pour l,i"olement et la numration de" coli2orme"
dan" l,eau& le" produit" alimentaire" et laitier"0
6l e"t utili" pour dtecter le" %actrie" #ram n#ati2 -ui 2ermentent le lacto"e ric'e en cri"tal
violet -ui in'i%e le" %actrie" #ram V0
Temprature d,incu%ation :
Pour le" coli2orme" ; G0Fc
Pour le" coli2orme" t'ermotolrant" : MMFc
Dure d,incu%ation : 1P 7 2M 'eure"
A"pect de" colonie" : colonie" rou#e"
2.1. Pr"aration de lchantillon
Si on c'erc'e le" coli2orme" "eulement& on prend 10 # du produit 7 anal."er dan" 0 ml
du diluant pre"crit et on procd comme pour la prparation de la "u"pen"ion m/re pour
la rec'erc'e de" micro-or#ani"me" aro%ie" m"op'ile"0
Sac'ant -ue pour un "eul c'antillon& le dnom%rement concerne di22rent" micro-
or#ani"me"& on utili"e la prparation prcdente pour accomplir le travail0
On prl/ve 1 ml de la "u"pen"ion m/re 7 l,aide d,une pipette #radue "trile et on le place au
2ond d,une %oite de ptri vide "trile0
Et au""i 1 ml de la premi/re dilution dcimale dan" une autre %o=te de ptri vide et "trile0
On ver"e le milieu de culture SR8! $2ondu et re2roidi) 7 une temprature de MEF:X 2F:0
Mlan#er "oi#neu"ement et lai""er "olidi2ier "ur une "ur2ace 2roide et 'ori3ontale0
Apr/" on "e %a"e "ur le te"t con2irmati2 d,indole -ui doit 4tre po"iti2& la production d,indol e"t
2aite 7 partir de tr.ptop'ane0 :,e"t un te"t important pour l,identi2ication de" E"c'eric'ia coli0
Inter"rtation
!e" coli2orme" cultivant 7 MM&9Fc dit" coli2orme" 2cau1& "ont utili"" comme #erme" traceur"
de la contamination 2cale directe ou indirecte0
!,o%*ecti2 de la rec'erc'e de tel" traceur" de la contamination 2cale e"t le "uivi de
l,application de %onne" prati-ue" '.#ini-ue" de 2a%rication dan" le cadre de l,'.#i/ne du
per"onnel0
On note -ue la teneur en acidit de" produit" 2avori"e la de"truction de" %actrie" #ram n#ati2
dont E"c'eric'ia coli& donc on ne peut pa" "e %a"er "ur le r"ultat de cette culture pour dduire
un %on *u#ement0
Au""i le traitement t'ermi-ue conduit 7 la di"parition par2aire d,E"c'eric'ia coli& %actrie
"en"i%le 7 la c'aleur0
2.2. 4scherichia coli :
Pour lLidenti2ication et le dnom%rement d,E. Coli& 9 colonie" i""ue" de" %oite" de coli2orme"
t'rmotolrant" et 9 colonie" i""ue" de coli2orme" totau1 "ont mi"e" c'acune en "u"pen"ion
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dan" un tu%e contenant 10ml dLeau peptone e1empte dLindole $EPE6)0 Apr/" une incu%ation
de" tu%e" 7 GEF: pendant 2M'& l,ad*onction de -uel-ue" #outte" du racti2 de [ovac" par tu%e
permet la lecture de raction0 !a 2ormation dLun anneau ro"e 7 la "ur2ace du milieu e"t
le tmoin d,une raction po"itive -ui "e traduit par production de tr.ptop'ana"e par E.coli -ui
d#rade le tr.ptop'ane pr"ent dan" lLEPE6 en indole "elon la reaction "uivante :





Pour le dnom%rement d,E.coli "e 2ait de la 2aDon "uivante :

Wom%re 1 V Wom%re 2
S$n1 V 0&1 n2) d
3. *nom!rement des sta"h.lococcus aureus
Milieu de culture : Baird Parer ! "aune d#$u% & la tellurite
:,e"t une #lo"e "lective utili"e pour l,i"olement et le dnom%rement de" "tap'.lococcu"
coa#ula"e po"iti2" et particuli/rement le" "tap'.lococcu" aureu" 7 partir de" denre"
alimentaire"0
!a pr"ence du p.ruvate de "odium a pour %ut de prot#er le" #erme" "tre""" et 2avori"e leur
rcupration0 !,a*out de l,mul"ion de *aune" d,Cu2" pour l,identi2ication0
!e" a#ent" "lecti2"& #l.cocolle& lit'ium et tellurite on t "oi#neu"ement proportionn" pour
"upprimer la croi""ance de la plupart de" %actrie" pr"ente" dan" le" produit" alimentaire"
"an" in'i%er "tap'.lococcu" aureu"0
Temprature d,incu%ation : GEF:
Dure d,incu%ation : 2M 7 MP 'eure"0
A"pect de" colonie" : on a apparition de deu1 t.pe" de colonie" :
:olonie" caractri"ti-ue" : colonie" noire" avec un 'alo d,clairci""ement0
!e" S aureu" rduit le tellurite en tellure noir donnant de" colonie" #ri" noir& %rillante"
entoure" d,une 3one claire due 7 une raction protol.ti-ue #ra""e 7 la pr"ence de"
lipoprotina"e" et de" lcit'ina"e"0
Si on prolon#e l,incu%ation& l,apparition de" 3one" opa-ue" dan" l,'alo clair e"t due 7 l,action
de" lipa"e" c,e"t une caractri"ti-ue "pci2i-ue de" "tap'.loco-ue" pat'o#/ne"0
&>>$
A$
&$2 B &$
&>>$
A$
2
Tryptophane
C
NH3
CH3- CO-COOH
C
Indole
Tryptophanase
Wom%re de tu%e" po"iti2 pour :0 T
(
]
Wom%re total compt par %oite $u2c)
:oli2orme" totau1
Wom%re 1 d,E.coli
$u2c)
;
Wom%re 2 d,E.coli
$u2c)
;
(
]
Wom%re total compt par %oite $u2c)
:oli2orme" t'rmotolrant"
Wom%re de tu%e" po"iti2 pour :0 T'
Wom%re d,E.coli $u2c) ;
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:olonie" non caractri"ti-ue : "e "ont de" colonie" noire" "an" 'alo d,clairci""ement
car elle" ne pr"entent pa" de raction avec l,mul"ion de *aune" d,Cu2"0
3.1. Pr"aration de lchantillon :
A l,aide d,une pipette #radue "trile& on prl/ve 0&1 ml de la "u"pen"ion m/re du produit 7
anal."e et on la place 7 la "ur2ace de la #lo"e 8aird ParHer coule en %oite de ptri pui"
"c'e 7 l,tuve0 Et on l,tale 7 la "ur2ace de la #lo"e 7 l,aide d,un taleur "pci2i-ue ou de"
pipette" pa"teur coude" "trile"0
Dan" ce ca"& il e"t en e22et indi"pen"a%le -ue le" "ur2ace" de #lo"e "oient "u22i"amment
"c'e" de 2aDon 7 permettre une %onne pntration de l,inoculum et viter le" p'nom/ne"
d,enva'i""ement0
!e" %o=te" "ont incu%e" retourne" 7 une temprature de GEFc durant MP '0
3.2. Lecture
On compte le" deu1 t.pe" de colonie" caractri"ti-ue" ou non caractri"ti-ue"& mai" Da ne
"i#ni2ie pa" -u,il" "ont de" "tap'.loco-ue" coa#ula"e po"iti2 et pour identi2ier l,e"p/ce
"tap'.lococcu" aureu"& on e"t o%li# de 2aire un te"t con2irmati20
3.3. 7est de confirmation : Recherche de la coa#ulase.
Naire le repi-ua#e d,une colonie cultive "ur le milieu de culture ? 8aird ParHer @ pui"
l,en"emencer dan" un %ouillon cCur cervelle $8B6)& c,e"t un milieu tr/" nutriti2 pour
la culture de" %actrie" et autre #erme" e1i#eant"& il e"t adapte 7 la croi""ance de" micro-
or#ani"me" -uel -ue "oit leur mode re"piratoire aro%io"e ou anaro%io"e& il e"t "pcialement
utile pour la rec'erc'e de la coa#ula"e de" "tap'.loco-ue"0
!e milieu de revivi2ication contenant la colonie en -ue"tion e"t incu%e 7 une temprature
GEF: durant 2M 'eure"0
Juand la culture %actrienne e"t "u22i"ante& on prend par e1emple 0&1 ml de cette culture V 0&1
ml de pla"ma de lapin& et on le" met dan" un tu%e 7 'mol."e "trile& l,important c,e"t -ue
le" volume" de" deu1 prparation" doivent 4tre #ale"0
!e" tu%e" "ont incu%" 7 GEF: durant M 7 1P 'eure"0
!ecture :
S,il . a coa#ulation c070d0 le culot e"t coll au 2ond du tu%e coa#ula"e po"iti2 pr"ence
de" "tap'.loco-ue" coa#ula"e po"iti2 pr"ence de "tap'.lococcu" aureu"0
S,il n,. a pa" coa#ulation pr"ence de" "tap'.lococcu" coa#ula"e n#ati20
3.'. *nom!rement :
A l,aide du te"t de coa#ula"e& on e22ectue un repi-ua#e de 9 colonie" caractri"ti-ue" et 9
colonie" non caractri"ti-ue" %ien i"ole" 7 l,aide de pipette Pa"teur0 :'a-ue colonie e"t mi"e
en "u"pen"ion dan" un tu%e contenant 9ml %ouillon cerveau-cCur $8B6) -ui e"t un milieu
nutriti2 dLenric'i""ement& le" tu%e" "ont incu%" 2M' 7 GEF:0
S,il . a apparition de trou%le 'omo#/ne dan" le milieu 8B6& un volume -uivalent de pla"ma
de lapin et de la culture en %ouillon e"t mi" 7 l,aide d,une pipette "trile dan" un tu%e 7
'mol."e0 Apr/" M 'eure" dLincu%ation 7 GEF: "Lil .La coa#ulation du pla"ma& il "La#it de
S.aureus.
&alcule :
!e calcul du nom%re de S. aureus "e 2ait comme "uit :
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
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Wom%re 1 V Wom%re 2
S$n1 V 0&1 n2) d
3.(. Les tests !iochimiques "our lidentification de les"8ce de sta"h.lococcus :
Apr/" la dtermination de la 2orme $co-ue) la coloration& #ram $#ram V)& la capacit de
d#rader l,eau o1.#ne en eau et o1.#/ne $catala"e V)& le t.pe re"piratoire $aro-anaro%ie")
et la voie d,atta-ue du #luco"e $2ermentati2 du #luco"e) on a pu dterminer l,appartenance de
microor#ani"me "u"pect 7 la 2amille de" "tap'.lococcaceae #enre "tap'.lococcu"0
Alor" -ue l,identi2ication de l,e"p/ce de "tap'.lococcu" peut "e 2aire par :
!a pr"ence de pi#ment *aune d,or $i"ol "ur :'apman) T
!a rec'erc'e de la coa#ula"e li%re T
!a rec'erc'e d,une DWA"e ou d,une DWA"e t'ermor"i"tante T
!a rec'erc'e de la protine A par con#lutination d,'matie" porteu"e" de" 6#000 T
!a rec'erc'e du rcepteur au 2i%rino#/ne $c'umpin# 2actor& coa#ula"e lie) par
con#lutination d,'matie" porteu"e" de 2i%rino#/ne T
!a rec'erc'e d,une cap"ule pol."idi-ue de SARM& cap"ule pouvant ma"-uer
le" autre" 2acteur" par con#lutination de particule" recouverte" d,anticorp"
anticap"ulaire" 2i1" par leur 2ra#ment N: T
!a rec'erc'e com%ine par con#lutination de la protine A et du rcepteur au
2i%rino#/ne ou par coa#lutination de la protine A de cap"ule de SARM et
du rcepteur au 2i%rino#/ne T
Nermentation du mannitol T
<ne #alerie AP6 20 "tap'0
!e" 2acteur" caractri"ti-ue" de "tap'.lococcu" aureu" $protine ^& rcepteur au 2i%rono#/ne
pol.o"ide& cap"ulaire de SARM& coa#ula"e& DWA"e t'ermor"i"tante0
!a pr"ence d,un de" 2acteur" "tap'.lococcu" aureu"
!,a%"ence de tou" ce" 2acteur" "tap'.lococcu" coa#ula"e n#ati20
3.). Inter"rtation.
!a contamination par le #erme pat'o#/ne "tap'.lococcu" aureu" e"t d,ori#ine 'umaine et 7
lieu lor" de la manipulation de" produit" par de" porteur" de #erme" "ain" ou malade"& ou elle
peut r"ulter de la contamination de" mati/re" premi/re" utili"e" pour la 2a%rication de
ce" produit"0
Alor" le dnom%rement de ce #erme a pour %ut de mettre en vidence la -ualit du travail et
de" mati/re" premi/re" et la "alu%rit de" -ualit" locale" de 2a%rication et de "tocHa#e0
'. Recherche et dnom!rement des s"ores des anaro!ies sulfito-rducteurs
Wom%re de tu%e" po"iti2
(
]
Wom%re total de" colonie" caractri"ti-ue"
compt par %oite $u2c)
Wom%re 1 de S. aureus
caractri"ti-ue" $u2c)
;
Wom%re 2 de S. aureus
non caractri"ti-ue" $u2c)
;
Wom%re de tu%e" po"iti2
(
]
Wom%re total de" colonie" non
caractri"ti-ue" compt par %oite $u2c)
Wom%re de S. aureus $u2c) ;
11
RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Milieu de culture : 'SC ! d(cyclos(rine0 ; tr.ptone "ul2ite c.clo"rine
:e milieu e"t utili" pour le dnom%rement de" anaro%ie" "ul2ito rducteur" $ASR) et tout
particuli/rement pour celui de clo"tridium per2rin#en" dan" le" produit" alimentaire"0
Si on a 100 ml de milieu de %a"e& il 2aut a*outer 1 ml d,une "olution 7 MQ de Dc.clo"rine
"trili"e par 2iltration& cette "u%"tance a*oute a pour %ut d,in'i%er la croi""ance de" %actrie"
aro%io"e0
Temprature d,incu%ation : MMF:AMP 'eure" en anaro%io"e on peut incu%er 7 GEF: mai"
la temprature MMF: ren2orce la "lectivit du milieu vi" 7 vi" de clo"tridium per2rin#en"0
A"pect de" colonie" : le" colonie" d,anaro%ie" "ul2ito rducteur" "ont entoure" d,aurole"
noire"0
'.1. Pr"aration de lchantillon :
On prend 10 # du produit 7 anal."er V 0 ml du diluant pre"crit V %ro.a#e0
Placer 1 ml de la "u"pen"ion m/re du produit 7 anal."er dan" une %o=te de ptri
"trile vide0
:ouler le milieu de culture ? TS:VD c.clo"erine @ 2ondu et ramen 7
la temprature de M9F: X 2F:0
Apr/" 'omo#ni"ation et "olidi2ication& on a*oute une deu1i/me couc'e du milieu
de culture pour crer une anaro%io"e0
Placer le" %oite" de ptri normale" dan" de" *arre" 'umide et ric'e en :O20
!,incu%ation "e 2ait 7 MMF: durant MP 'eure"0
'.2. Lecture :
On compte le nom%re de" colonie" -ui apparai""ent dan" le milieu #lo"e0
'.3. 7est de confirmation :
On 2ait de" te"t" d,identi2ication pour "avoir ",il ",a#it de clo"tridium per2rin#en" oR
d,une autre e"p/ce de clo"tridie0
- Repi-uer au 'a"ard 9 de ce" colonie" noire" "u"pecte"0
- En"emencer dan" un tu%e contenant le milieu de t'io#lucolate avec r"a3urine
r#nr0
- !e t'io#lucolate e"t un a#ent rducteur contenant de" #roupement" t'iol& ce
dernier prot/#e le" #erme" anaro%ie" et il permet d,viter la to1icit de l,o1.#/ne
produite %iolo#i-uement par le" #erme" ou c'imi-uement dan" le milieu0
- !a r#nration "e 2ait 7 l,tuve 7 100F: durant 1 'eure : celui ci e"t mar-u
par l,apparition de deu1 couc'e"0
- :ouc'er un peu d,'uile de para22ine dan" le tu%e 7 e""ai pour in'i%er tout
contact avec l,air c 7 d avec l,o1.#/ne et crer une atmo"p'/re ric'e en :O
2
0
- 6ncu%er 7 MMF: durant 2M 'eure"0
- !a pou""e %actrienne e"t mar-ue par l,apparition d,une partie trou%le -ui "e
locali"e dan" la partie in2rieure du tu%e 7 e""ai0
- Prendre -uel-ue" #outte" 7 peu pr/" 9 #outte" de la partie trou%le du milieu
prcdent 7 l,aide d,une pipette "trile0
- 6noculer la pri"e d,e""ai dan" un tu%e contenant le %ouillon lacto"e "ul2ite
$8!S) mar-u par la pr"ence d,une cloc'e de dur'am -ui e"t pour r+le de pi#er le #a3
li%r par le" %actrie" "u"pecte"0
- 6ncu%er le tu%e 7 MMF: durant 2M 'eure"0
thio#l.colate
aec rsaDurine
r#nr
( colonies ensemences
C %Eout de lhuile
de "araffine
6ncu%ation 7 MMF: pd 2M'
t'io#l.colate avec
r"a3urine r#nr
:loc'e de Dur'am
8ouillon lacto"e "ul2ite
$8S!)
6ncu%ation 7 MMF: pondant 2M 'eure"
Procdure de test de confirmation de Clostridium perfrinens
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Remarque
1ml
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Avant de travailler avec le 8!S& il 2aut a*outer de" additi2" :
- Sul2ite de "odium 1&2 Q : 0&9 ml Atu%e de milieu 8!S0
- Solution de citrate de 2er ammoniacal 7 1Q : 0&9 ml par tu%e de milieu 8!S0
Lecture :
Si le" %actrie" "u"pecte"& en milieu lacto"e "ul2ite& produi"ent du #a3 $1AG au moin" de
la cloc'e du dur'am) et 2orment un prcipit noir de "ul2ure de 2er& dan" ce ca"& elle" peuvent
4tre con"idre" comme tant de" clo"trodium per2rin#en"
S,il n,. a pa" noirci""ement du tim%e et la production de #a3 e"t in"i#ni2iante& dan" ce ca"&
le" %actrie" ne "ont pa" de" clo"trium per2rin#en" mai" autre" e"p/ce" d,anaro%ie" "ul2ito-
rducteur" 7 identi2ier0
'.'. Inter"rtation :
!a pr"ence de -uel-ue" 2orme" cultiva%le" dan" le" produit" anal."" peut 4tre le re2let de
la contamination de la mati/re premi/re ou de certain" in#rdient" lor" de leur prparation
tran"2ormation0
!e" "pore" de clo"tridium "ont pr"ente" en -uantit importante dan" le milieu e1trieur $terre&
pou""i/re& e1crment"&) donc leur dnom%rement a pour %ut le contr+le d,'.#i/ne de" locau1
et du per"onnel0
Bor" de" po""i%ilit" de multiplication& une 2ai%le contamination ne peut entra=ner d,accident"
c'e3 le con"ommateur car une to1i-in2ection alimentaire ne peut appara=tre -ue lor"-ue
le nom%re de %actrie" atteint 109 7 10O <N: pour #ramme0
!e" "pore" "ont t'ermor"i"tante" c,e"t pour-uoi il 2aut maintenir une %onne cui""on pour
"trili"er le produit0
Si ce n,e"t pa" le ca"& le" "pore" n,ont pa" t dtruite" par la cui""on& elle" peuvent #ermer
lor" du re2roidi""ement0
Pour clo"tridium per2rin#en"& la temprature $19-90F:)& le PB $9&9 ;;;;P&0)& l,anaro%io"e
$%oite 7 con"erve& pera2ilm) "ont tou" de" condition" -ui 2avori"ent la croi""ance de ce micro-
or#ani"me"0
En e22et& le" #erme" ne "e multiplient pa" lor"-ue le" r/#le" de" %onne" prati-ue" d,'.#i/ne
"ont re"pecte"0
(. Recherche des salmonelles :
(.1. Les ta"es de recherche :
Pour la rec'erc'e de" "almonelle" dan" le" aliment" on doit "uivre de" tape" "uivante" :
Four 0 : Pr enrichissement :
!a prparation de la "u"pen"ion m/re ",e22ectue le plu" "ouvent 7 l,aide d,eau peptone
tamponne $EPT)
- 29 # du produit 7 anal."er
- la mettre a"epti-uement dan" de" "ac'et" "trile" car on utili"e un 'omo#ni"ateur
pri"talti-ue t.pe "tomac'er0
- A*outer "trilement 229 ml de l,eau peptone tamponne0
- 8ien %ro.er& car l,'omo#ni"ation doit 4tre "ati"2ai"ante pour -ue le" cellule" %actrienne"
a##lutine" le" une" au1 autre" "eront %ien "pare"
- 6ncu%er le" "ac'et" 2erm" 7 GEF: de O 7 1P 'eure"0
:ette p'a"e vi"e 7 permettre au1 %actrie" l"e" $"tre""e") de rcuprer leur "ta%ilit0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Four 1 : 4nrichissement :
Sac'ant -ue le" "almonelle" "ont tr/" "en"i%le et elle" ne "ont pa" de %on" comptiteur"& on e"t
o%li# d,au#menter le" c'ance" de trouver de" "almonelle"& c,e"t pour-uoi on utili"e
de" milieu1 d,enric'i""ement "lecti2"0
!e milieu li-uide : rappaport va"iliadi" ; %ouillon
!e milieu li-uide : "lnite c."tine ou tetrationate0
<us"ension m8re

031 ml 1 ml
Ra""a"ort 9asiliadis <lnite &.stine
''1& 2' h 351& 2' h
Four 3 : Isolement sur milieu solide
Prlever une #outte de la culture& 7 l,aide de l,an"e de platine ou pipette pa"teur et on 2ait
l,i"olement "ur de" milieu1 "lecti2" "olide" coul" prcdemment et "c'" 7 l,tuve0
:e" milieu1 contiennent e""entiellement de" a#ent" "lecti2" $"el" permettant de rvler
la production d,B
2
S et de" indicateur" de P'& le" "el" %iliaire" in'i%ent #alement le" 2lore"
d,accompa#nement et 2avori"ent le" "almonelle")0
!e" principau1 milieu1 utili"a%le" "ont : la #lo"e SS $"almonella-"'i#ella)& la #lo"e BeHtoen&
la #lo"e Mac :onHe.& la #lo"e E[M $Edel et [ampel Mac'er)& la #lo"e 5!DA0
,ilieu de "r-
enrichichement
,ilieu
*enrichissement
,ilieu disolement %s"ect des colonies
sus"ectes
EPT Slnite-c."tine Mac conHe. :olonie" incolore"
EPT Slnite c."tine BeHtoen :olonie" noire" 7
contour verdItre0
EPT Rappaport va"iliadi" E[M :olonie" ro""
EPT 80 Ttrat'ionate SS colonie" rou#e" :
lacto"e V
colonie" incolore" :
lacto"e U
colonie" 7 centre
noir : B2S V
EPT 80 Ttrat'ionate 5!DA colonie rou#e 7 centre
noir _ Salmonella T
colonie rou#e _
S'i#ella T
colonie *aune _
E"c'eric'ia&
[le%"iella ou Serratia0
Four '. &onfirmation
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
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On 2ait le ri"olement de" colonie" "u"pecte" "ur #lo"e nutritive pour revivi2ier le" colonie" et
avoir de" %actrie" *eune"0
(.2. &onfirmation !iochimique
(.2.1. Gl.#ler :
:,e"t un milieu d,identi2ication de" entro%actrie" %a" "ur une 2ermentation de #luco"e ou
de lacto"e et "ur la production d,'.dro#/ne "ul2ur $B
2
S)
!a mt'ode con"i"te 7 en"emencer la pente par "trie" et le culot par pi->re 7 partir
d,une colonie "u"pecte prleve "ur un milieu "olide0
!e" "almonelle" "ont de" %actrie" 2ermentative" de #luco"e et productrice" d,B
2
S mar-u par
un noirci""ement partiel ou total du culot et par la production ou non de #a30
6l donne troi" rpon"e":
!a 2ermentation du lacto"e a lieu au niveau de la pente& une raction po"itive
"e mani2e"te par un vira#e de la couleur de la pente au *aune0
!a 2ermentation du #luco"e "e produit dan" le culot& un vira#e de la couleur au
*aune indi-ue une raction po"itive0
!a production du #a3 et mar-ue par une poc'e #a3eu"e -ui dcolle compl/tement
le milieu du 2ond du tu%e0
!a production de "ul2ure dL'.dro#/ne $B
2
S) "e traduit par un noirci""ement
du milieu *oi#nant le culot 7 la perte0
Lecture salmonella : !acto"e -
Gluco"e V
Ga3 V ou U
B
2
S V
Coloration )ram
8acille& #ram n#ati2& "ou" 2orme de %Itonnet" de couleur ro"e avec une paroi mince 7 l,tat
2rai"& on dduit -ue le" "almonelle" "ont mo%ile" par une ciliature pritric'e0
Si le milieu de Hli#ler rv/le un te"t po"iti2& on pa""e 7 la con2irmation par une #alerie 20E0
(.2.2. Halerie miniaturise :
Pour le" "almonelle"& on utili"e l,AP6 20 E0
*ode op(ratoire :
Prparation de la #alerie :
Runir 2ond et couvercle d,une %o=te d,incu%ation T
Rpartir environ 9 ml d,eau di"tille ou dminrali"e dan" le" alvole" pour crer
une atmo"p'/re 'umide T
6n"crire la r2rence de la "ouc'e "ur la lan#uette latrale de la %oite et non pa" "ur
le couvercle T
Sortir la #alerie de "on em%alla#e et la placer dan" la %oite d,incu%ation0
Prparation de l,inoculum :
<tili"er un tu%e contenant 9 ml d,eau di"tille "trile
A l,aide d,une pipette& prlever une "eule colonie %ien i"ole "ur milieu #lo"e& utili"er
pr2rentiellement de" culture" *eune" $1P-2M 'eure")0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Rali"er une "u"pen"ion %actrienne en 'omo#ni"ant "oi#neu"ement le" %actrie" dan"
le milieu0
6noculation de la #alerie
Remplir tu%e" et cupule" de" te"t" cit& vp et GE! avec la "u"pen"ion %actrienne en utili"ant
la pipette a.ant "ervi au prl/vement T
Remplir uni-uement le" tu%e" de" autre" te"t" T
Grer une anaro%io"e dan" le" te"t" ADB& !D:& OD:& B2S& <RE en rempli""ant leur cupule
d,'uile de para22ine T
Re2ermer la %o=te d,incu%ation T
6ncu%er 7 GOF: X 2F: pendant 1P-2M 'eure"0
Lecture
Apr/" incu%ation& la lecture de la #alerie doit "e 2aire en "e r2rant au ta%leau de lecture0
6l 2aut -ue troi" te"t" ou plu" "oient po"iti2"& "i non rincu%er la #alerie 2M 'eure" $X2 'eure")
de plu" "an" a*outer le" racti2"0
A*outer le" racti2" de rvlation
- Te"t TDA : 1 #outte de racti2 TDA
- Te"t 6WD : 1 #outte de racti2 Yame"
- Te"t SP : 1 #outte de" racti2" SP1 et SP2
Pour complter l,identi2ication ; rali"er de" te"t" complmentaire"
+nterpr(tation
!,identi2ication e"t o%tenue 7 partir du pro2il numri-ue
Dtermination du pro2il numri-ue
0 Sur la 2ic'e de r"ultat"& le" te"t" "ont "par" par #roupe" de troi" et une valeur 1&2 ou M e"t
indi-ue pour c'acun0
0 !a #alerie 20 E comporte 20 te"t"& en plu" du te"t o1.da"e con"tituant le 21
/me
te"t
0 On additionne 7 l,intrieur de c'a-ue #roupe le" valeur" corre"pondant 7 de" raction"
po"itive" pour o%tenir 7) la 2in E c'i22re"0
+denti%ication
A l,aide du catalo#ue Anal.ti-ue& on rec'erc'e le pro2il numri-ue dan" la li"te de" pro2il"0
Si le pro2il de E c'i22re" ne donne pa" une %onne identi2ication& on doit rali"er de" te"t"
complmentaire" pour arriver 7 la %onne identi2ication :
- Rduction de" nitrate" en nitrite" Wa et a3ote $W2) :1 #outte de W!T1 et W!T de G!<0
- Rduction de" nitrate" en nitrite" par le 3inc
- Mo%ilit0
- :ulture "ur #lo"e nutritive Mac conHe.
- O1.dation du #luco"e0
- Nermentation du #luco"e0
Juand on arrive 7 une identi2ication de "almonella en utili"ant la #alerie AP6 20E& on doit
e22ectuer une identi2ication "rolo#i-ue pour con2irmer l,identi2ication %actrienne0
(.3. &onfirmation srolo#ique :
!e "rot.pa#e "e 2ait par a##lutination "ur la lame 7 l,aide d,1 culture "ur un milieu #lo"
$milieu #luco"e lacto"e B
2
S) o%tenue apr/" une incu%ation en 1P 7 2M ' 7 GEFc et de "rum"
appropri"0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
6l e"t nce""aire de vri2ier tout d,a%ord -ue la "ouc'e tudie n,e"t pa" en p'a"e R& p'a"e
auto-a##lutina%le& pour ce 2aire& on contr+le -u,aucune a##lutination n,appara=t dan"
une #outte d,eau p'."iolo#i-ue0
!e" "almonelle" "e "ont de" entro%actrie" pat'o#/ne"0
Elle" ont une ciliature pritric'e et elle" ont G t.pe" d,anti#/ne" -ui "e locali"ent dan" troi"
di22rente" partie" de cette minu"cule 8actrie
!e" anti#/ne" -ui "e locali"ent "ur la mem%rane %actrienne O
!e" anti#/ne" 2la#ellaire" -ui "e "ituent "ur le" 2la#elle" B
!e" anti#/ne" -ui "e "ituent 7 l,intrieur de la %actrie anti#/ne de virulence Si
!a vite""e d,a##lutination di22/re "elon le milieu de culture utili" :
- Si la %actrie e"t prleve d,un milieu #lo" $"emi-"olide)& cette %actrie perd
"e" 2la#elle" donc "e" anti#/ne" 2la#ellaire" $') d,ou l,a##lutination e"t 2ai%le0
- Si la %actrie e"t prleve d,un milieu $#luco"e lacto"e B
2
S) la %actrie "era en
pleine 2orme c070d0 elle #arde "e" 2la#elle" d,ou l,a##lutination e"t importante0
!e" anti#/ne" B de" "almonella "ont :
- "oit monop'a"i-ue" : le" 2la#elle" de" %actrie" compo"ant la culture ont tou"
la m4me "pci2icit0 E1emple : S t.p'i &12 $vi) d
- Soit dip'a"i-ue" : le" %actrie" peuvent e1primer alternativement deu1
"pci2icit& le" c'an#ement" de "pci2icit "e produi"ent 'a%ituellement avec
une 2r-uence de l,ordre de 10-90 E1emple : S0 parat.p'i 8 10M09012 : % : 1&2
Pour dterminer le "rot.pe d,une "almonelle& on rec'erc'e le" 2acteur" anti#ni-ue" O et B&
l,identi2ication de ce" dernier" "e 2era le plu" ai"ment par a##lutination "ur lame d,1 culture
prleve "ur un milieu #lo"e& par e1emple 7 la partie in2rieure et la plu" 'umide de la pente
d,un milieu $#luco"e lacto"e B
2
S) ; Hli#ler Ba*na& ou mieu1 "ur une #lo"e molle -ui permet
de "lectionner le" %actrie" le" plu" mo%ile"& celle" dont l,anti#/ne B e"t le mieu1 dvelopp0
Si une culture d,une "ouc'e de "almonella a.ant un anti#/ne B dip'a"i-ue e"t compo"e
d,une population en proportion" appro1imativement #ale" de 8actrie" dont le" anti#/ne" B
"ont le" un en p'a"e 1& le" autre" en p'a"e 2& elle "era a##lutina%le par le" "rum" antiB p'a"e
1 et anti B p'a"e 2& le dia#no"tic pourra 4tre ta%li immdiatement0
Si au contraire& l,une de" deu1 p'a"e" e"t nettement ma*oritaire par rapport 7 l,autre& "eule
la p'a"e ? ma*oritaire @ pourra 4tre identi2ie0
Et "i l,on en"emence en un point de cette #lo"e toute" le" %actrie" a.ant un anti#/ne
2la#ellaire& corre"pondant 7 la "pci2icit du "rum a*out "eront immo%ili"e" & le" autre" au
contraire pourront enva'ir la #lo"e et on pourra identi2ier le" 2acteur" B corre"pondant 7 l
a "econde "pci2icit0
Inter"rtation
!a rec'erc'e de "almonelle e"t -ualitative& il "u22it de dire a%"ence ou pr"ence dan" 29 #0
!a pr"ence de "almonelle e"t une cau"e de to1i-in2ection alimentaire0
Pour certain" produit"& la rec'erc'e de "almonelle "e rv/le n#ative dan" la -ua"i-totalit
de" ca"& mai" elle re"te "ou'aita%le de mani/re priodi-ue a2in de "urveiller le" ri"-ue" de
coloni"ation de" lieu1 de production et de contamination de" produit" par l,environnement de
l,atelier et par le" manipulation" 2aite" par le per"onnel ou par le" appareil" mal netto."0
Par contre la pr"ence de "almonella dan" le produit 2ini doit "e traduire par la rec'erc'e
immdiate de" cau"e" et "elon le" r"ultat"& de" modi2ication" de" option" de ma=tri"e et de
"urveillance mi"e" en cau"e& notamment l,accent "era mi" "ur l,application de" %onne"
prati-ue" de manipulation et "ur la rec'erc'e du #erme dan" l,environnement0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
En e22et& toute" di"po"ition" "eront pri"e" pour -ue le produit ne "oit pa" mi" "ur le marc' en
l,tat ou -u,il en "oit retir0
). Les couillonna#es
Pour l,anal."e de" couvillonna#e" de" main"& de" ta""e"& de" a""iette" et le" plan" de travail
c070d0 planc'e 7 dcouper l#ume" ou viande" ou plan de travail c'aud oR 2roid& on utili"e
la tec'ni-ue par talement& c070d0 en"emencement en "ur2ace "ur de" milieu1 #lo"" prcoul"
en %oite" de ptri "trile" $19 7 20 mlA%oite)
!a mt'ode con"i"te 7 mouiller& l,couvillon par un peu de diluant et on le 2ait pa""er
a"epti-uement "ur le milieu #lo"& le" %oite" "ont incu%e" retourne"0 !a temprature et
le temp" d,incu%ation "ont dtermin" "elon le #erme rec'erc'0
Pour le" couvillon"& on c'erc'e le" #erme" aro%ie" m"op'ile"& le" coli2orme"
t'ermotolrant"& le" "tap'.lococcu" aureu"& le" levure" et le" moi"i""ure"0
&ondition de
culture I #ermes
,ilieu de culture 7em"rature
dincu!ation
*ure
dincu!ation
%s"ect des
colonies
Germe" aro%ie"
m"op'ile"
P:A 20F: E2 'eure" Btro#/ne
2orme et couleur
vari
:oli2orme"
t'ermotolrant"
SR8! MMF: 2M 'eure" Rou#e"
Stap'.lococcu"
aureu"
8aird ParHer GEFc MP 'eure" Woire 7 'alo clair
:W: noire "an"
'aloc'air
!evure" Sa%ouraud V
c'loramp'nicol
G0F: E2 'eure" :olonie" mate"
ou %rillante" 7
contour r#ulier
et 7 "ur2ace
conve1e de
couleur vari
Moi"i""ure" Sa%ouraud V
c'loramp'nicol
G0F: E2 'eure" :olonie"
tendue" plate"
ou dureteu"e"
avec
2ructi2ication"0
Inter"rtation
:e" anal."e" a pour %ut de mi"e en vidence la "alu%rit de" locau1 et l,'.#i/ne du per"onnel0
5. Recherche des entro!actries
Milieu de culture : VRB,
:,e"t un milieu "lecti2 contenant du #luco"e -ui remplace le lacto"e pour l,i"olement et
la numration de" entro%actrie" dan" le" produit" alimentaire"0
!a #lo"e SR8G e"t devenue le milieu de c'oi1 pour toute" le" rec'erc'e" "ur le" mati/re"
premi/re"& le" aliment" tran"2orm" et l,'.#i/ne de" in"tallation"0 :e milieu SR8G peut
incu%er 7 diver"e" temprature" pour di22rencier le" #erme" p".c'rop'ile"& m"op'ile" ou
t'ermop'ile"0
0 Temprature d,incu%ation MMF:& G2F: ou MF:0
0 Priode d,incu%ation : 1P 'eure"& 2M ' 7 MP 'eure" ou 10 *our"
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
!a temprature et le temp" d,incu%ation varient "elon le" #roupe" d,entro%actrie" 7 i"oler0
0 A"pect de" colonie" : :olonie" ronde" pourpre"& violace" clairement vi"i%le" de 1 7 2 m de
diam/tre& entoure" d,un 'alo pourpre0
5 .1. 1
8re
mthode.
0 Prendre 10 # du produit 7 anal."er V M0 ml de l,eau pptone tamponne "an" la %ro.er T
0 A l,aide d,une pipette #radue "trile& prendre 9 ml de mlan#e T
0 Dan" G %oite" de ptri vide" et "trile"& on place 1 ml& 2 ml& 2ml& pour au#menter le" c'ance"
de dtecter de" entro%actriaceae0
0 A*outer 19 ml de milieu re2roidi 7 MEF: X 2F:
0 Mlan#er par rotation et lai""er "olidi2ier0
0 Apr/" "olidi2ication du milieu& recouvrir avec une petite -uantit du milieu et lai""er
"olidi2ier
0 Retourner le" %oite" et incu%er 7 GEF: pendant 2M 7 MP 'eure"0
W8 : !a #lo"e en dou%le couc'e a""ure de" condition" anaro%ie" -ui "uppriment la pou""e
de" %actrie" #ram- non 2ermentante"0 Elle 2acilite #alement la 2ermentation du #luco"e -ui
2avori"e la 2ormation de" colonie" pourpre" violace" clairement vi"i%le" entoure" d,un 'alo
pourpre0
5.2. Lecture
On a l,apparition de" colonie" ronde" de couleur pourpre violace de 1 7 2 mm de diam/tre&
entoure" d,un 'alo pourpre0
On 2ait la 1
/re
lecture apr/" 2M 'eure" et la 2
/me
lecture apr/" MP 'eure"0
5.3. 2
8me
mthode
Four 0 : Pr-enrichissement :
On prend 29 # du produit 7 anal."er $8i"cuit"& %on%on"&00) et on lui a*oute 229 ml de diluant
en"uite on met le mlan#e dan" un "ac "trile "an" le %ro.er et on l,incu%e 7 la temprature
GEFc durant 2M 'eure"0
Four 1 : enrichissement :
A partir du mlan#e prpar prcdemment& on prend 10 ml de cette prparation et on
l,inocule dan" un 2lacon de 100 ml contenant le %ouillon mo""el rali" pour l,enric'i""ement
de" entro%actrie"0
!,incu%ation "e 2ait 7 GEFc durant 2M 'eure"0
Four 2 : Lisolement :
On 2ait l,i"olement "ur le milieu de culture SR8G coul et "olidi2i dan" de" %oite" de ptri
"trile"0
!,incu%ation "e 2ait 7 GEFc durant 2M 'eure"0
Four 3 : Lecture
Sur le milieu SR8G& le" colonie" de" entro%actrie" apparai""ent "ou" l,a"pect de" colonie"
"onde" pourpre" ou rou#e" de 1 72 mm de diam/tre entoure" d,un 'alo pourpre rou#e0
&onfirmation
De" te"t" "upplmentaire" doivent 4tre 2ait" pour con2irmer l,identit de ce" colonie"0
En e22et& la rec'erc'e de" entro%actrie" e"t -ualitative pui"-ue "e "ont de" indicateur"
tec'nolo#i-ue" d,ou le" r"ultat" "ont mentionne" par a%"ence ou pr"ence0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
5.'. Inter"rtation
!a rec'erc'e de" entro%actriaceae permet d,valuer la -ualit d,un traitement de
"ta%ili"ation d,un produit alimentaire ou de "u"pecter une recontamination par e1emple :
contamination par l,atelier& lor" du "tocHa#e& tran"port0
Alor" l,a%"ence de" entro%actriaceae" e"t un "i#ne de %onne" prati-ue" d2a%rication0
Et leur pr"ence nce""ite une intervention rapide et e22icace pour trouver la cau"e de
contamination0
6. Recherche des leures et moisissures
Milieu de culture : "a%ouraud V c'loramp'nicol c,e"t un milieu nutriti2 additionn au
c'loramp'nicol -ui in'i%e la croi""ance de" %actrie"0 Et pour le" levure" et moi"i""ure"
o"mop'ile" on utili"e le milieu de culture `all.
Temprature d,incu%ation : 29 F:
0 Dure d,incu%ation : E2 'eure" et on peut prolon#er l,incu%ation *u"-u,au1 9 *our"
0 A"pect de" colonie" :
!evure" : colonie" mate" ou %rillante"& 7 contour r#ulier et 7 "ur2ace conve1e
Moi"i""ure" : colonie" tendue"& plate" ou duveteu"e" avec 2ructi2ication
6.1. Princi"e de la mthode
En"emencement en "ur2ace par talement
6.2. ,ode o"ratoire :
0 Prendre 10 # du produit 7 anal."er V 0 ml du diluant T
0 8ro.er %ien et 'omo#ni"er T
0 Sur un milieu de "a%oraud V c'loramp'nicol coul en %oite de ptri "trile& placer 0&1 ml de
la "u"pen"ion m/re0 Avec un taleur "trile ou de" pipette" pa"teur code" "trile"& on tale la
prparation "ur le milieu #lo"0
!e" %oite" "ont incu%e" renver"" 7 29F: durant E2 'eure"0
!e travail doit ",e22ectuer dan" une a"ep"ie par2aite car le" levure" et le" moi"i""ure" "ont
di""imil" par l,air0
6.3. Lecture
!e" colonie" de levure apparai""ent "ou" de" 2orme" et de" couleur" varie"& ronde"& %om%e"&
matte"& %rillante" de contour r#ulier0
!e" colonie" de moi"i""ure" "ont plate"& tendue" ou duveteu"e" avec 2ructi2ication"0
6.'. Inter"rtation
!,a%"ence de" levure" et moi"i""ure" indi-ue le" %onne" conduite" '.#ini-ue"0
Pour le" levure"& le" tau1 lev de ce" derni/re" n,a pa" de "i#ni2ication '.#ini-ue
mai" donne un "i#ne de ri"-ue ma*eur d,altration de l,aliment0
Pour le" moi"i""ure"& leur pr"ence en -uantit importante e"t un "i#ne de :
- Ri"-ue d,into1ication par production de m.coto1ine"
- Ri"-ue d,altration au cour" de la prparation etAou du "tocHa#e0
- !a rec'erc'e de ce" #erme" au niveau de" mati/re" premi/re"& de" atmo"p'/re"
et de" "ur2ace" e"t un tmoin de "alu%rit de" locau10
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
J. *nom!rement des lacto!acilles
0 Milieu de culture : *RS
0 Temprature d,incu%ation : G0Fc
0 Dure d,incu%ation : E2 'eure"
0 A"pect de" colonie" : le" colonie" "ont %ei#e"& "/c'e"& 2ria%le"& li""e" et leur diam/tre e"t
dLenviron 1 7 2 mm apr/" MP 'eure" dLincu%ation0
J.1. Princi"e
En"emencement en pro2ondeur d,un milieu "lecti2 "olide $MRS) coul en %o=te de ptri avec
une -uantit dtermine de la "u"pen"ion m/re0
Dan" le" m4me" condition"& en"emencement de" dilution" dcimale" o%tenue" 7 partir de
la "u"pen"ion m/re0
6ncu%ation de" %o=te" 7 G0Fc pendant G *our"
A partir du nom%re de colonie" o%tenue" dan" le" %o=te" de ptri retenue"& calcul du nom%re
d,unit 2ormant colonie par #ramme d,c'antillon0
J.2. ,ode o"ratoire :
J.2.1. Pr"aration de lchantillon "our essai :
- pe"er "trilement 29 # du produit 7 anal."er T
- la mettre dan" un "ac'et "trile T
- A*outer 229 du diluant utili" T
- %ien 'omo#ni"er T
- Pour le ca" oR il "erait nce""aire de recommencer le" opration"& con"erver
une partie de l,c'antillon pour e""ai dan" de" condition" ad-uate"0
J.2.2. 4nsemencement :
- Prendre :in-ue %oite" de ptri "trile" et vide" SM& 10
-1
& 10
-2
& 10
-G
& 10
-M
T
- <tili"er de" pipette" #radue" "trile" T
- A l,aide d,une pipette "trile& placer 1 ml de la "u"pen"ion m/re au 2ond d,une
%o=te de ptri $SM) et tran"2rer 1 ml dan" un tu%e contenant ml de diluant la
dilution 10
-1
T
- A l,aide d,une nouvelle pipette "trile& prendre 2 ml de la dilution 10
-1
& incu%er
1 ml au 2ond d,une %o=te "trile $-1) et tran"va"er le 1 ml re"tant dan" un autre tu%e
contenant ml de diluant la dilution 10
-2
T
- Pour le" dilution" dcimale" 10
-G
et 10
-M
& on proc/de comme pour le" p/re"
dilution" T
- <ne 2oi"& toute" le" %oite" "ont en"emence"& couler dan" c'a-ue %o=te& de
ptri environ 12 ml du milieu MRS d*7 2ondu au %ain marie et re2roidi 7 MEFc X2F: T
- Mlan#er "oi#neu"ement l,inoculum au milieu de culture et lai""er "olidi2ier
en po"ant le" %oite" de ptri "ur une "ur2ace 2ra=c'e et 'ori3ontale T
- Apr/" "olidi2ication compl/te& couler 7 la "ur2ace du milieu en"emenc environ M ml
du milieu MRS 7 MEF: X 2F:0 !ai""er "olidi2ier comme ci-de""u" T
- !e temp" -ui ",coule entre la 2in de la prparation de la "u"pen"ion m/re et
le moment oR le" dilution" "ont en contact avec le milieu de culture ne doit pa" dpa""er
19 min0
Incu!ation :
Naire incu%er le" %oite" ain"i prpar" et retourne"& 7 l,tuve 7 G0F: pendant G *our"0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Lecture
Apr/" la priode d,incu%ation "pci2ie& procder au compta#e de" colonie" pour c'a-ue %oite
contenant au minimum G0 colonie" et au ma1imum G00 colonie"0
Inter"rtation
!e" lacto%acille" "ont de" :
- 8actrie" non pat'o#/ne" d,intr4t tec'nolo#i-ue T
- 8actrie" 'omo2ermentaire" -ui 2orment de l,acide lacti-ue 7 partir de" "ucre" T
!e dnom%rement de ce" %actrie" donne de" in2ormation" "ur la -ualit '.#ini-ue et
marc'ande du produit 2ini T
!a propret de l,-uipement et de" manipulation" 2a%rication in2luencent de me"ure" pi"e"
pour amliorer l,'.#i/ne de la 2a%rication du produit T
En r"um "e "ont de" %actrie" :
- indicateur de la %onne con"ervation de" produit" T
- 6ndicateur de %onne" prati-ue" '.#ini-ue" $Manipulation"& "alu%rit de l,-uipement&
de" locau1)0
10. Isolement et identification de listeria monoc.to#8nes
10.1. Hnralits
!a dtection et l,i"olement de li"teria doivent prendre en compte :
- la comple1it de" di22rente" matrice" alimentaire" T
- la pr"ence ventuelle d,un 2ai%le nom%re de li"teria parmi une 2lore micro%ienne a""ocie
par2oi" tr/" important" dan" ce" aliment" T
- la nce""it d,avoir un certain nom%re de milieu1 d,enric'i""ement et d,i"olement "lecti2"
ain"i -ue la rec'erc'e de milieu1 permettant la revivi2ication de %actrie" "tre""e" T
- la rec'erc'e de li"teria monoc.to#ene" dan" de" aliment" incrimin" lor" d,pidmie ou lor"
de" autocontr+le" en production a#roalimentaire T
- la mt'ode de rec'erc'e de ! monoc.to#/ne" "e 2ait en plu"ieur" tape" avec enric'i""ement
primaire et "econdaire en %ouillon de Na3er et i"olement" "ur milieu1 "lecti2" Palcam et
o12ord apr/" c'a-ue tape d,enric'i""ement T
- Durant le" tape" d,enric'i""ement& li"teria inocula devenant la population dominante et
pouvait ma"-uer la pr"ence de li"teria monoc.to#/ne" apr/" i"olement "ur milieu1 "lecti2" T
- !a con2irmation de l,appartenance au #enre li"teria "e 2ait 7 partir de" colonie" a.ant
un a"pect caractri"ti-ue "ur le" milieu1 d,i"olement "lecti2 par :
- !a mi"e en vidence de la catala"e
- !a vri2ication de la mo%ilit au micro"cope 7 partir d,un %ouillon incu% 7 29Fc ou en
#lo"e mo%ilit0
10.2. ,ode o"ratoire
Four 0 : "r-enrichissement
Pe"er 29 # du produit 7 anal."er& la mettre dan" un "ac de "tomc'er T
A*outer 229 ml du %ouillon Nra3er 66 T
6ncu%ation 2M ' 7 GEF:0
Four 1 : 4nrichissement
Avant de travailler avec le milieu li-uide Nra3er 6& il 2aut lui a*outer 0&1 ml de
citrate de 2er ammoniacal T
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Prendre 1 ml de la prparation prcdente et la mettre dan" un tu%e contenant
le milieu li-uide Nra3er 6 T
!,incu%ation "e 2ait 7 une temprature de GEF: pendant 2M 'eure"0
Four 2 : Isolement :
!a croi""ance %actrienne e"t mar-ue par le c'an#ement de coloration de" tu%e"
-ui varie du *aune au %run 2once r"ultat de l,'.drol."e de l,e"culine T
!,i"olement "e 2ait "ur #lo"e O12ord ou #lo"e Palcam0
Four 3 : Lecture
!,apparition de" colonie" noire" caractri"ti-ue" de li"teria monoc.to#/ne" "ur le milieu
d,O12ord& et "ou" 2orme de colonie" #ri"-vert avec 'alo %run-noir "ur Palcam& "i le" colonie"
"ur ce milieu "ont tr/" den"e"& l,en"em%le du milieu de culture peut "e colorer en %run-noir0
Confirmation !
:oloration de #ram T
Galerie AP6 li"teria Monoc.to#/ne"0
10.3. Inter"rtation
!,interprtation d,un r"ultat 2inale de dtection ou dnom%rement dpend :
De" 2acteur" relati2" au prl/vement : c'antillonna#e& pri"e d,e""ai( T
De" 2acteur" relati2" 7 l,tat du microor#ani"me : "tre""& altration"& traitement"
p'."ico-c'imi-ue et t'ermi-ue"0
Pour l,c'antillonna#e& il 2aut tenir compte de l,'tro#nit de" produit" anal."" au "ein
d,une unit con"omma%le et au "ein d,un lot de 2a%rication0 Pour le" micro-or#ani"me" de
l,environnement ce" variation" "ont capa%le" d,a22ecter leur "urvie 7 court et 7 lon# terme0
!,e1i"tence de "ouc'e" de li"teria monoc.to#ne" "tre""e"& altre" par le traitement -u,elle"
ont "u%i" $t'ermi"ation& con#lation& "ala#e)& ce" derni/re" devienne "en"i%le" 7 certain"
in'i%iteur" utili"" dan" le" milieu1 "lecti2"0 :,e"t pour-uoi& il e"t recommand de 2aire
l,i"olement "ur le" deu1 milieu1 #lo"" o12ord et Palcam0
!,tat p'."iolo#i-ue de" %actrie" rec'erc'e" conditionne lar#ement le "ucc/" ou l,c'ec de
la dtection ou l,e1actitude du dnom%rement0
III2- Inter"rtation des rsultats :
Pour le contr+le de la -ualit et la "curit de" denre" alimentaire"& le" "pciali"te" ont po"
de" crit/re" "ur le"-uel" e"t 2ond un *u#ement ou une dci"ion0
Alor" un crit/re micro%iolo#i-ue e"t un en"em%le d,lment" -ualitati2" et -uantitati2"
d2ini""ant le" caractri"ti-ue" micro%iolo#i-ue" e""entielle" attendue" d,un produit donn et
-u,il e"t po""i%le d,atteindre par le" intervention" approprie"0
!e crit/re 7 la production corre"pond 7 l,anal."e de" produit" 7 la "ortie de la c'a=ne de
2a%rication0
!e crit/re 7 la con"ommation corre"pond 7 l,anal."e du produit au moment de la di"tri%ution
-uel-ue "oit "a dure de vie& il ne devrait pa" 4tre dpa"" *u"-u,au moment oR la date limite
de con"ommation e"t atteinte0
Tout dpa""ement de" crit/re" 7 la production doit "e traduire par la rec'erc'e immdiate
de" cau"e" et "elon le" r"ultat" par la modi2ication de" option" de ma=tri"e et de "urveillance
mi"e en cau"e0 Et tout dpa""ement du crit/re 7 la con"ommation doit inclure dan" cette
rec'erc'e& le" p'a"e" de tran"port et "tocHa#e& notamment en ce -ui concerne le" condition"
de temprature0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
!a ma*orit de" crit/re" "ont -uantitati2" pour le" #erme" aro%ie" m"op'ile"& coli2orme"&
"treptoco-ue"& clo"tridium& levure" "tap'.lococcu" aureu"& moi"i""ure")0
m ; crit/re micro%iolo#i-ue T
M ; :,e"t le "euil d,accepta%ilit& il tol/re de G ;;> 10 2oi" le crit/re micro%iolo#i-ue
$G 1 m ;;;;>10 1 m)0
Dan" ce ca"& il ",a#it d,un plan 7 G cla""e" :
!or"-ue le r"ultat en <N:A# e"t in2rieur 7 m& l,c'antillon anal." e"t de -ualit
%actriolo#i-ue "ati"2ai"ante T
!or"-ue le r"ultat en <N:A# e"t "uprieur 7 m et in2rieur ou #ale M $G1G;;;101m)
l,c'antillon anal." e"t de -ualit %actriolo#i-ue accepta%le T
Et -uand le r"ultat en <N:A# e"t "uprieur 7 M& l,c'antillon anal." e"t de -ualit
%actriolo#i-ue non "ati"2ai"ant0
Pour certain" #erme"& le" crit/re" apparai""ent "ou" 2orme ? a%"ence dan" 1# ou ml tan" dan"
ce ca" m ; 0 et c ; 0
Pour le" "almonella dont la pr"ence n,e"t en #nral pa" tolre dan" 29 # dan" la plupart
de" produit"& il ",a#it donc d,un plan d,c'antillonna#e 7 deu1 cla""e" $pr"ence a%"ence)
"#emple pour une p$tisserie % tarte au chocolat &
,icro or#anismes
recherchs
Rsultat &rit8res
:;&I#
Germe" aro%ie" m"op'ile" _ 10
P
G010
9
:oli2orme" 2&O 10
G
10
G
:oli2orme" p'ermotolrant" a 1 1
Stap'.lococcu" aureu" _ 90 10
2
Anaro%ie" "ul2ito rducteur" a 9 10
Salmonelle" dan" 29 # A%"ence a%"ence
<N: ; <nit 2ormant colonie
:Ac : l,c'antillon e"t de -ualit %actriolo#i-ue non "ati"2ai"ante
"#emple ! corne fla'es
Micro or#ani"me" rec'erc'" R"ultat :rit/re"
<N:A#
Germe" aro%ie" m"op'ile" O0 G010
9
:oli2orme" _ 9 10
G
:oli2orme" T'ermotolrant" _ 1 1
Stap'.lococcu" aureu" _ 90 10
2
Anaro%ie" "ul2ito rducteur" _ 9 10
Salmonelle" dan" 29 # A%"ence a%"ence
:Ac : !,c'antillon e"t de -ualit %actriolo#i-ue "ati"2ai"ante0

()UC" D"*I +,)C" *)-ONN)I("
GAM 10G GAM 10G
E0 coli 1 E0 coli 1
Stap' aureu" 10 Stap' aureu" 10
!evure" 10 !evure" 10
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Moi"i""ure" 10 Moi"i""ure" 10
!acto%acille" 10G !evure" 10
Entro%actrie" 10 Salmonelle" A%"enceA29 #
<%L%*4 ;R:I7 PL%A *4 7R%9%IL
E0 :oli 10 GAM A%"ence
!evure" 10M :t' A%"ence
Moi"i""ure" 10M S aureu" A%"ence
!acto%acille" 10M !evure" A%"ence
Moi"i""ure" A%"ence
*"R+U".CRU / ()UCI((ON( CR"*" 0R)ICH"
:t' 102 Gam G10M
Stap' aureu" 90102 : 102
ASR 90 :t' 1
Salmonelle d" 29P # A%"ence St aureu" 10
Sal A%"ence
P,)T CH)UD P,)T 0ROID 1(),)D"2
GAM G109 GAM G0109
: 10G :TB 10
:TB 10 Stap' aureu" 102
ASR G0 ASR G0
Sal dan" 29 # A%"ence SalA29 # A%"ence
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
- Analyse de lEau -
Introduction
Dan" le domaine d,'.#i/ne& le" anal."e" %actriolo#i-ue" le" plu" 2r-uemment e22ectue"
concernant le" %actrie" *ouant un r+le d,indicateur" "an" -ue leur pr"ence con"titue
un ri"-ue pour la "ant de" utili"ateur" de l,eau0
On a pu di"tin#uer deu1 t.pe" principau1 d,indicateur" :
- !e" indicateur" de pollution permettent d,apprcier avec plu" ou moin" de
">ret ou de prcocit le ri"-ue d,une contamination ventuelle par de" micro"
or#ani"me" pat'o#/ne"0
- !e" indicateur" d,e22icacit de traitement permettent d,valuer la -ualit
d,un traitement vi"-7-vi" d,un micro or#ani"me ou de plu"ieur" micro-
or#ani"me" pat'o#/ne" dont la pr"ence peut 4tre redoute dan" l,eau %rute
utili"e0
En #nral& dan" le" deu1 "ituation" on ",intre""e 7 l,tude de" rec'erc'e" et
de" dnom%rement" de l,en"em%le de" %actrie" revivi2ia%le" en culture" aro%ie"&
de" coli2orme" $parmi eu1 de" coli2orme" 2cau1 et de" E0 coli)& de" "treptoco-ue" 2cau1 et
de" %actrie" "porule" "ul2ito rductrice"0
A cot de ce" #erme" indicateur" de pollution ou d,e22icacit de traitement on trouve
de" #erme" pat'o#/ne" comme le" "almonelle" et au""i opportuni"te" tel -ue E0 coli et
c'0 per2rin#en"0
E0 coli e"t un #erme indicateur de contamination 2cale& et clo"tridium per2rin#en" e"t
un #erme indicateur d,e22icacit de traitement mai" -uand il" "ont a%"or%" en #rande
-uantit& il" deviennent pat'o#/ne"0
!a plupart de ce" micro or#ani"me" a#i""ent apr/" ad"orption par voie orale mai" il . a
de" e"p/ce" -ui "e locali"ent dan" le" t#ument" et donnent de" "uppuration"& en particulier
dan" la "p'/re otor'im alar.n#olo#i-ue& c,e"t le ca" de "tap'.lococcu" aureu" et de
p"eudomona" aeru#ino"a0 :ette derni/re e"p/ce e"t rec'erc'e comme tmoi#ne de
contamination de certaine" eau1 "outerraine" -ui doivent 4tre "pcialement %ien prot#e"
telle" -ue le" eau1 dite" ? minrale" @ et au""i dan" le" pi"cine"& en plu" de" "tap'.loco-ue"&
et la rec'erc'e de" "almonelle" pour la "urveillance de la -ualit '.#ini-ue de l,eau0
Si l,action pat'o#/ne de ce" #erme" "e mani2e"te 7 la "uite d,in2ection par voie orale& d,autre"
voie" de contamination peuvent 4tre e1i"t tel -ue le" le#ionelle& l,in2e"tation "e produi"e par
l,air& cependant elle" "ont rec'erc'e" dan" l,eau& notamment dan" le" climati"eur"0
I. %nal.se des eaux
1. Recherche ,icro or#anismes reiifia!les + 35 1& et + 201&
0 Milieu de culture : PCA $plant count a#ar)
0 Temprature d,incu%ation : GEFc U20F:
0 Dure d,incu%ation : 2M 'eure" U E2 'eure"
0 A"pect de" colonie" : colonie" 'tro#/ne"0
1.1. Princi"e :
On prati-ue la mt'ode par incorporation en milieu #lo" :
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
!,eau e"t inocule par incorporation dan" un milieu "trictement d2ini et non "lecti20
!a lecture e"t 2aite apr/" 2M 'eure" d,incu%ation 7 GEF: et apr/" E2 'eure" d,incu%ation 7
20F:0
:ette mt'ode e"t la plu" emplo.e pour le" anal."e" 7 %ut "anitaire0
1.2. ,ode o"ratoire
1.2.1. Pr"aration des dilutions
0 A#iter "oi#neu"ement et de 2aDon prolon#e l,c'antillon pour remettre en "u"pen"ion
d,une 2aDon 'omo#/ne le" %actrie"0
0 Prlever 2 2oi" 1 ml de cette eau0
0Dpo"er c'a-ue prl/vement dan" une %o=te de ptri "trile $#rande) SM0
Pour rali"er la dilution 10
-1
& prlever 1 ml de l,eau 7 anal."er et l,introduire dan" un tu%e
"trile contenant ml de l,eau di"tille "trile& %ien 'omo#ni"er "ur un a#itateur mcani-ue
de t.pe ? vorte1 @
0 Prlever a"epti-uement 2 2oi" 1 ml de cette dilution et le" inoculer c'acune dan" une %oite de
ptri "trile A10
1.2.2. 4nsemencement :
0 Re2roidir la #lo"e P:A 7 MM X 2F: T
0 :ouler a"epti-uement dan" c'a-ue %oite la #lo"e 2ondue T
0 A#iter doucement par un mouvement circulaire pour a""urer un mlan#e 'omo#/ne de l,eau
et de la #lo"e "an" 2aire de %ulle" et "an" mouiller le" %ord" de la %oite T
0 !e milieu doit 4tre coul 10 minute" au plu" tard apr/" rparation de l,eau 7 anal."er0
0 !ai""e re2roidir "ur une "ur2ace par2aitement 'ori3ontale et 2ra=c'e0
1.2.3. Incu!ation
0 2M 'eure" d,incu%ation pour le" MOR GEF: et E2 'eure" d,incu%ation pour le" MOR 20F:0
1.2.'. Lecture
:ompta#e de" colonie" -ui apparai""ent dan" le milieu #lo"0
We retenir pour le compta#e -ue le" %oite" contenant" au minimum G0 colonie" et au1 G00
colonie"0
!e dnom%rement e"t valu 7 la mo.enne de" deu1 r"ultat"0
1.3. 4x"ression des rsultats0
W ; !e nom%re de #erme" e"t e1prim par le nom%re d,unit" 2ormant colonie par 1 ml0
1.'. Inter"rtation
:e dnom%rement de" micro" or#ani"me" vi"e 7 dmontrer le plu" #rand nom%re de micro
or#ani"me" en particulier le" %actrie" "e dveloppant dan" le" condition" aro%ie" 'a%ituelle"
de culture0
6l e"t utili" comme indicateur de pollution :
- Soit dan" le" milieu1 naturel"& le plu" "ouvent dan" le" eau1 de tr/" %onne -ualit
micro%iolo#i-ue dont on veut prouver la protection vi" 7 vi" de toute contamination comme
par e1emple le" eau1 "outerraine"& de nappe" pro2onde" ou alluviale" -ui "ont "oumi"e" 7 cet
e1amen mai" au""i le" eau1 de "ur2ace0
- Soit dan" le" r"eau1 : une au#mentation de la concentration %actrienne en aval de la "tation
de pompa#e ou de traitement doit 4tre interprte "oit par une multiplication interne de
%actrie" e1i"tant 7 l,entre du r"eau& "oit comme une intru"ion de l,e1trieur dan" celui ci au
niveau de" r"ervoir" ou de" canali"ation"0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Au""i ce dnom%rement peut 4tre con"idr comme indicateur d,e22icacit de traitement -ui
devrait a%outir 7 une tr/" 2orte diminution de la concentration %actrienne par rapport 7
l,entre voire m4me une a%"ence de %actrie"0
Pour le" eau1 d,alimentation dlivre" "ou" 2orme conditionne le dnom%rement de" MOR a
pour %ut de donner de" in2ormation" "ur le" %onne" prati-ue" '.#ini-ue" de production et "ur
la "alu%rit de" locau1 et de" -uipement"0
!e nom%re de %actrie" o%tenu" 7 20F: e"t le plu" pr2ra%le pour e22ectuer un inventaire
#lo%al de la population %actrienne dan" le" milieu1 naturel"0
2. *nom!rement des coliformes3 coliformes fcaux ou 7hermotolrants
Milieu de culture : #lo"e lacto"e ''C ter)itol0
Temprature et dure d,incu%ation :
GEF: X 1F: pour le" coli2orme" pendant 2M ' T
MMF: X 009F: pour le" coli2orme" t'ermotolrant" pendant MP '0
A"pect de" colonie" : colonie" *aune" avec 'alo" pro2ond" *aune"& cette coloration
*aune e"t due 7 l,a%"ence de rduction du TT:0
2.1. ,thode de dnom!rement "ar filtration sur mem!rane
2.1.2. Princi"e
Apr/" 2iltration de l,eau 7 tudier& la mem%rane e"t place "ur un "upport appropri& un milieu
#lo"& ceci permet au1 colonie" de coli2orme" de "e dvelopper au cour" d,une incu%ation de
1P 7 2M 'eure"0
2.1.2. *omaine da""lication :
:ette mt'ode de dnom%rement par 2iltration e"t intre""ante -uand une #rande "en"i%ilit et
une #rande prci"ion "ont e1i#e"0
- Son domaine d,application privil#ie e"t l,eau d,alimentation T
- Pour le" eau1 7 anal."er contenant de" "u%"tance" ou micro or#ani"me"
"u"cepti%le" de colmater le" pore" de" mem%rane" cette mt'ode donne
de" r"ultat" erron"0
,ode o"ratoire :
pour le" eau1 de"tine" 7 l,alimentation 'umaine& on 2iltre 100 ml0
pour une eau minrale on 2iltre 290 ml
2.1.3. *nom!rement direct sur mem!rane :
Placer deu1 mem%rane" di22rente" "ur le "."t/me de 2iltration T
Niltrer deu1 pri"e" d,e""ai de l,eau 7 anal."er "oi#neu"ement 'omo#ni"e par a#itation T
Placer c'acune de" deu1 mem%rane" "ur une %oite de #lo"e lacto"e au TT: et ter#itol T
Mettre l,une de ce" %o=te" 7 incu%er durant 2M 'eure" 7 GEF: l,autre de 1P 7 2M 'eure" 7 MM X
009Fc)0
W% : l,tuve 7 MMF: doit avoir une temprature 'omo#/ne et "on atmo"p'/re doit 4tre c'ar#e
de vapeur d,eau0
Lecture :
!a lecture de" %oite" apr/" incu%ation 7 GEFc permet de reconna=tre la pr"ence de coli2orme"
par le" caractri"ti-ue" "uivante" :
:oloration *aune de" colonie"& r"ultat de l,a%"ence de rduction du TT:0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Balo *aune dan" le milieu lui m4me& "ou" la mem%rane autour de" colonie"
prcdente"& corre"pondance 7 une 2ermentation du lacto"e par le" #erme" de
ce" colonie"0
!a lecture de" %oite" incu%e" 7 MMFc permet de mettre en vidence le" coli2orme"
t'ermotolrant" de la m4me mani/re -ue "ur le" %o=te" incu%e" 7 GEF:0
!a 2lore %actrienne a""ocie e"t #nralement %eaucoup moin" a%ondante 7 MMFc -ue dan"
la %o=te incu%e 7 GEF:0
2.2. 4xamens et re"iqua#es des colonies sur des milieux de confirmation :
:ette tape e"t "urtout intre""ante pour le" eau1 d,alimentation& le dnom%rement
de" colonie" de" coli2orme" "era valu pour 100 ml d,eau apr/" con2irmation de l,identit de
ce" coli2orme" -ui "era identi2i comme "uit :
a)- coloration par la mt'ode de Gram et e1amen micro"copi-ue T
%)- rec'erc'e de l,o1.da"e :
O1.da"e po"itive ; a%"ence de coli2orme"
O1.da"e n#ative ; pr"ence de coli2orme"
c)- repi-ua#e d,une colonie "u"pecte "ur de" milieu1 con2irmati2" "olide" : milieu lacto"e-
#luco"e B
2
S $Hli#ler Ba*na) par pi->re au 2ond et de" "trie" 7 la pente0
0 !a pr"ence de" coli2orme" e"t mar-ue par une 2ermentation du #luco"e et du lacto"e avec
production de #a3 B
2
S peut 4tre pr"ent mai" en 2ai%le -uantit0
2.3. Inter"rtation
Pour le compta#e de" coli2orme"& retenir le" mem%rane" contenant moin" de 100 colonie"0
!a rec'erc'e de" coli2orme" a un intr4t '.#ini-ue T !e" coli2orme" "ont intre""ant" car
un tr/" #rand nom%re d,entre eu1 vivent en a%ondance dan" le" mati/re" 2cale" de" animau1
7 "an# c'aud et de ce 2ait& con"tituent de" indicateur" 2cau1 de la premi/re importance0
Par ailleur"& leur r"i"tance au1 a#ent" anti"epti-ue"& et notamment au c'lore et 7 "e" driv"&
e"t voi"ine de la r"i"tance de" %actrie" pat'o#/ne" vi" 7 vi" de"-uelle" ce t.pe e"t in"atur&
il" con"tituent donc de" indicateur" d,e22icacit de traitement0
Donc il" "ont de" indicateur" de contamination 2cale& et de" indicateur" d,e22icacit de
traitement
0 !,a%"ence de coli2orme" totau1 ne "i#ni2ie pa" nce""airement -ue l,eau ne pr"ente pa" de
ri"-ue pat'o#/ne0
0 Dan" une eau pota%le& l,a%"ence de" coli2orme" e"t o%li#atoire
3. *nom!rements des stre"tocoques fcaux
0 Milieu de culture : Slanet- et Barthey
:,e"t un milieu "lecti2 contenant de l,a3oture de "odium et du c'lorure de TT:0
6l permet la rec'erc'e et le dnom%rement de" "treptoco-ue" 2cau1 dan" le" eau1 par
utili"ation de" mem%rane" 2iltrante"0
0 Temprature d,incu%ation : GEF: X1F:
0 Dure d,incu%ation e"t MP 'eure"
0 A"pect de" colonie" : colonie" rou#e" violace" ou marron avec ou "an" aurole %lanc'e0
3.1. ,thode :
Mt'ode par 2iltration "ur mem%rane
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Avril-Mai 200
3.2. Princi"e :
Apr/" 2iltration "ur mem%rane de cellulo"e de poro"it 0&M9 um& celle ci e"t appli-ue "ur
un "upport nutriti2 contenant de" "u%"tance" in'i%itrice" -ui ne lai""ent "e dvelopper -ue
le" colonie" de "treptoco-ue" 2cau10
3.3. ,ode o"ratoire :
0A#iter "oi#neu"ement l,c'antillon d,eau 7 anal."er T
0Niltrer la pri"e d,e""ai de 100 ml "ur une mem%rane 2iltrante T
0A l,aide d,un pince "trile& placer la mem%rane "ur une %o=te de milieu de Slanet3 et 8artle.
"olide0
Avant de travailler avec le milieu de culture de %a"e tr p'n.ltra3olium 7 002 Q $TT:) on
proc/de comme "uit :
0 Nonder le milieu de %a"e dan" un %ain marie %ouillant et en le ramenant 7 une temprature
voi"ine de 90F:0
A*outer 7 ce milieu de %a"e 9 ml pour 100 ml de la "olution "trile de c'lorure
20G09trip'n.lttra3olium 7 0&2Q0
0En"uite couler en %oite de ptri "trile" et lai""er re2roidir "ur un plan 'ori3ontale0
Incu!ation :
!e" %oite" ain"i prpare" "ont incu%e" 7 GEF: pendant M9 'eure"0
Lecture :
!e" colonie" apparai""ent "ou" 2orme de colonie" rou#e"& violette" ou ro"e"0
!e compta#e de toute" le" colonie" rou#e"& violette" ou ro"e"& car toute" le" colonie" "ont
prati-uement de" "treptoco-ue" 2cau10 On ne retient -ue le" %oite" contenant moin" de 100
colonie"0
3.'. &onfirmation
Pour 2aire un te"t de con2irmation de" colonie" "u"pecte" on utili"e la #lo"e 8ile E1uline
A#ar $8EA)& ce milieu e"t utili" pour di22rencier le" "treptoco-ue"& ce" dernier" '.drol."ent
l,e"culine en e"cultine et #luco"e& l,e"cultine "e lie au citrate 2erri-ue pr"ent dan" le milieu
pour 2ormer un comple1e %run& 2onc ou noir indi-uant une raction po"itive0
!e" "el" %iliaire" in'i%ent la pou""e de" %actrie" #ramV autre" -ue le" "treptoco-ue"0
Donc il 2aut tran"2rer la mem%rane renver"e "ur le milieu #lo" 7 la #lo"e 8EA& et
l,incu%ation "e 2ait 7 une temprature de GEF: X1F: durant 2M 'eure"0
Apr/" 2M 'eure"& on a lLapparition de" colonie" 2once" 7 noire"& ce noirci""ement e"t d> 7
l,'.drol."e de l e"culine0
Apr/" avoir con2irm le" colonie" t.pi-ue" de" "treptoco-ue" dan" ce ca"& on peut 2aire
le compta#e par l,application de la 2ormule "uivante : W ; n 1 100Av
W ; nom%re de "treptoco-ue"& dan" 100 ml d,c'antillon
n ; nom%re de colonie" caractri"ti-ue" dnom%re" dan" 100 ml de l,c'antillon
S ; volume de l,c'antillon 2iltr en ml0
3.(. Inter"rtation
!e dnom%rement de" "treptoco-ue" du #roupe D a pour %ut de prvoir le tau1 de
contamination d,une eau de"tine 7 la con"ommation 'umaine0
!e" "treptoco-ue" "ont con"idr" comme tmoin" de pollution 2cale -ui peut 4tre d,ori#ine
'umaine ou animale0
!or"-ue le rapport $coli2orme" 2cau1 I "treptoco-ue" 2cau1) $SN) e"t "uprieur 7 M&
la pollution a de #rande" c'ance" d,4tre d,ori#ine e""entiellement 'umaine $#out" ur%ain")0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
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Et lor"-ue :NASN e"t 0&E& l,ori#ine animale "em%le *ouer un r+le prdominant par
la contamination de l,eau0
Donc le" "treptoco-ue" 2cau1 "ont d,e1cellent" indicateur" de pollution0
'. Recherche de "seudomonas aeru#inosa
Milieu de culture : la #lo"e C(trimide
:,e"t une #lo"e "lective au ctrimide et 7 l,acide nalidi"ci-ue "lective pour p"eudomona"
aeru#ino"a $%acille p.oc.ani-ue)& ce milieu e"t utili" en 8actriolo#ie indu"trielle dan"
le contr+le de" eau1& de" aliment" et de" produit" co"mti-ue"0
!e" Pseudomonas "ont de" %acille" Gram n#ati2" 2in" droit" u%i-uitaire et tr/" mo%ile" #rIce
7 un 2la#elle polaire $ciliature monotric'e)& dpourvu" de "pore" et de cap"ule"0 Jue l,on
rencontre dan" le" "ol"& "ur le" v#tau1 et "urtout dan" le" eau1 douce" et marine"0
De nom%reu"e" "ouc'e" pouvant "e dvelopper 7 %a""e temprature $p".c'rop'ile)
contaminant le" denre" alimentaire" ou produit" p'armaceuti-ue" con"erve" au
r2ri#rateur0 Elle e"t caractri"e par leur capacit 7 r"i"ter 7 de nom%reu1 anti%ioti-ue" et
anti"epti-ue e1pli-uant leur pr"ence de plu" en plu" 2r-uente en milieu 'o"pitalier& elle" "e
comportent comme de" pat'o#ne" opportuni"te" "ouvent 7 l,ori#ine d,in2ection no"ocomiale0
0 Temprature d,incu%ation : GEF:
0 Dure d,incu%ation : MP 'eure"
0 A"pect de" colonie" : colonie" verte"
'.1. ,thode :
Mt'ode par 2iltration "ur mem%rane
'.2. Princi"e :
Apr/" 2iltration "ur mem%rane& celle ci e"t plac "ur la #lo"e nutriti2 ? P"eudomona"
aeru#ino"a @
Sur la-uelle elle "e dveloppe p"eudomona" aeru#ino"a& le" m4me" mt'ode" de
dnom%rement de p"eudomona" aeru#ino"a pourront 4tre utili"e" au""i %ien pour le" eau1
minrale" et le" eau1 d,alimentation -ue pour le" eau1 de pi"cine prleve" de pr2rence dan"
le 2ilm d,eau "uper2iciel0
'.3. ,ode o"ratoire :
0 A#iter "oi#neu"ement l,c'antillon d,eau 7 anal."er
0 Niltrer la pri"e d,e""ai de 100 ml "ur une mem%rane 2iltrante0
0 A l,aide d,un pince "trile& placer la mem%rane "ur une %oite de milieu "olide de
p"eudomona" aeru#ino"a& au moment de l,emploi& 2aire 2ondre la #lo"e au %ain marie
%ouillant& pui" la couler en %o=te" de ptrie "trile& apr/" "olidi2ication& "c'er le" %o=te" 7
GEF:0
0 !,incu%ation "e 2ait 7 GEF: pendant MP 'eure"
Lecture :
<n diam/tre de 1&9 7 2 mm& un contour circulaire une "ur2ace li""e et %rillante0
!e" colonie" de P"eudomona" aeru#ino"a apparai""ent "ou" 2orme de colonie" verte"0
'.'. &onfirmation
Pour la con2irmation& on 2ait :
<n i"olement d,une colonie "u"pecte "ur la #lo"e de p"eudomona" aeru#ino"a et
on l,incu%e 7 GEF: pendant 2M 'eure" T
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<n e1amen micro"copi-ue apr/" coloration de #ram : 8acille"& #ram n#ati2& non
"porul" T
<n e1amen direct entre lame et lamelle il permet de con"tater la mo%ilit de" #erme" :
monotric'e T
Te"t de l,o1.da"e o1.da"e po"iti2 T
AP6 20 WE0
Inter"rtation :
P"eudomona" aeru#ino"a *oue un r+le primordial dan" la pat'olo#ie de" %ai#nade"& de" eau1
douce"& de" rivi/re"& lac" et tan#"& "e "ont de" a#ent" pat'o#/ne" contaminant l,'omme par
voie cutano-mu-ueu"e0
!a mi"e en vidence dan" le" eau1 de diver"e" nature" et ori#ine" peut avoir diver" o%*ecti2"0
Elle peut 4tre con"idre comme un tmoin de contamination de" eau1 "outerraine"0
6l e"t rec'erc' dan" le cadre de" e1amen" de "urveillance de la -ualit %actriolo#i-ue
de" eau1 minrale"0
6l e"t au""i rec'erc' dan" le" eau1 de pi"cine" traite"& ramen #nralement par
le" %ai#neur" atteint" d,in2ection" locale"& ou de la "p'/re otor'inolar.n#olo#i-ue et
op'talmi-ue& il" r"i"tent en #nral %ien au1 d"in2ectant" de" pi"cine"& il" peuvent alor"
in2ecter le" mu-ueu"e" de" %ai#neur"& d,autant mieu1 -ue celle" ci "ont "ouvent tr/" irrite"
par de" concentration" a%u"ive" en d"in2ectant"0
(. *nom!rement des sta"h.locoques + coa#ulase "ositie
Milieu de culture : Chapman mannit(
:,e"t un milieu "lecti2 -ui 2avori"e la croi""ance et le dnom%rement de" "tap'.loco-ue"&
"a teneur leve en "el $Wacl) in'i%e la plupart de" autre" %actrie" 7 l,e1ception de certain"
#erme" 'alop'ile"& d,ori#ine marine $dan" le ca" d,anal."e de l,eau de mer)0
Apr/" incu%ation "u22i"ante 7 la temprature corre"pondante on a l,apparition de deu1 t.pe"
de colonie" :
- le" colonie" de "tap'loco-ue" coa#ula"e po"itive "ont entoure" d,une 3one
*aune %rillante0
- le" colonie" de "tap.loco-ue" coa#ula"e n#ative non pat'o#/ne" pr"entent
un 'alo rou#e pourpre0
Temprature d,incu%ation : GEF:
Priode d,incu%ation : MP 'eure"
A"pect de" colonie" : colonie" de taille importante la%orant leur propre pi#ment *aune dore
"urmontant une 3one *aune du milieu "ou" la mem%rane r"ultante de la 2ermentation
du mannitol0
(.1. ,thode :
Mt'ode par 2iltration "ur mem%rane
(.2. Princi"e :
Apr/" concentration de" c'antillon" par 2iltration "ur mem%rane de cellulo"e 7 0&M9 um& celle
ci e"t dpo"e "ur un milieu "lecti2 pour %actrie" acceptant de 'aute" concentration" en Wacl&
tel le milieu de :'apman mannitol& le" colonie" pr"entant l,a"pect de "tap'.lococcu" aureu"
"ont "oumi"e" alor" au1 e""ai" de ? pat'o#nicit coa#ula"e
(.3. ,ode o"ratoire
Avant de commencer la 2iltration& il 2aut prparer le" %oite" en 2ondant la #lo"e& au %ain
marie %ouillant& pui" la couler en %oite" de ptri "trile& apr/" "olidi2ication "ur un plan
'ori3ontal& elle peut 4tre utili"e pour 2aire l,anal."e0
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- A#iter "oi#neu"ement l,c'antillon d,eau 7 anal."er
- Niltrer la pri"e d,e""ai de 100 ml "ur une mem%rane 2iltrante0
- A l,aide d,une pince "trile& tran"va"er la mem%rane "ur une %o=te de milieu
"olide de :'apman0
- 6ncu%er la %oite 7 GEF: pendant MP 'eure"0
Lecture
Sur le milieu #lo" :'apman& le" colonie" apparai""ent "ou" 2orme de colonie" de pi#ment
*aune dor 7 re2let *aune par "uite de la 2ermentation du mannitol0
(.'. &onfirmation
( '.1. &onfirmation + la coa#ulase
Repi-uer de" colonie" t.pi-ue"& le" mettre dan" un tu%e contenant un %ouillon
d,enric'i""ement le %ouillon cCur cerveau $8B6) et on le" incu%e 7 GEF: pendant 2M 'eure"
pour la revivication de" %actrie" "tre""e"0
!a %onne multiplication et la meilleure croi""ance de" %actrie" "ont mar-ue" par une trou%le
-ui appara=t dan" le tu%e0
On 2ait la rec'erc'e de la coa#ula"e& en mlan#eant dan" un tu%e 7 'mol."e "trile 001 ml de
pla"ma de lapin di""out et 0&1 ml de la culture en %ouillon de la "ouc'e 7 tudier prpare
prcdemment& mettre 7 incu%er 7 GEF: durant M 7 1P 'eure"
<ne coa#ulation rapide et ma""ive appara=t dan" le tu%e Normation d,un culot au 2ond
du tu%e 7 'mol."e
Alor" :
Pr"ence coa#ulation ; pr"ence de "tap'.lococcu" aureu"
A%"ence de coa#ulation ; a%"ence de "tap'.loco-ue" coa#ula"e po"itive0
En plu" du te"t con2irmation 7 la coa#ula"e& on peut m4me 2aire :
(.'.2. &oloration #ram : :occi& #ram V
(.'.3 7est + la catalase : :atala"e V
(.(. Inter"rtation
!a rec'erc'e de" "tap'.loco-ue" coa#ula"e po"itive pour rvler une contamination d,ori#ine
'umaine0
). *nom!rement des s"ores des anaro!ies sulfito rducteurs
Milieu de culture : 'SC! d(cyclos(rine ou la #lo"e Viande./oie
:e" deu1 milieu1 "ont utili"" pour le dnom%rement de" anaro%ie" "ul2ito rducteur" et tout
particuli/rement pour celui de clo"tridium per2rin#en" dan" le" produit" alimentaire
6l" donnent de %on" r"ultat" lor" de la rec'erc'e de cette %actrie dan" le" eau1 par
la mt'ode de 2iltration "ur mem%rane0
Temprature d,incu%ation : GEFc
Priode d,incu%ation : MP 'eure"
A"pect de" colonie" : colonie" noire"
).1. ,thode :
Mt'ode par 2iltration "ur mem%rane0
).2. Princi"e :
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Apr/" traitement de l,c'antillon par la c'aleur pour dtruire le" 2orme" v#tative"& et
2iltration de celui-ci& la mem%rane e"t dpo"e 7 la "ur2ace de la #lo"e T cette #lo"e e"t
incu%e dan" de" condition" permettant une croi""ance en anaro%io"e de" colonie" "ul2ito-
rductrice" -ui "ont reconnai""a%le" par un 'alo noir de "ul2ure de 2er0
).3. *omaine da""lication :
:ette mt'ode e"t particuli/rement intre""ante pour l,tude de" eau1 non tur%ide" et non
colmatant& "u"cepti%le de contenir de" %actrie" "porule" anaro%ie" "ul2ito rductrice" en
tr/" 2ai%le concentration& elle ",appli-ue donc pr2rentiellement au1 eau1 de"tine" 7
l,alimentation0
).'. ,ode o"ratoire
- Apr/" avoir "oi#neu"ement a#it l,c'antillon 7 anal."er di"po"er le volume c'oi"i pour
la pri"e d,e""ai dan" un ou plu"ieur" tu%e" ou 2lacon" T
- Placer le" rcipient" corre"pondant" 7 c'acun de" c'antillon" 7 anal."er dan" un %ain-marie&
r#l 7 E9Fc X 9Fc pendant 19 minute" T
- Prparer le" %oite" de la #lo"e "trile" :
Naire 2ondre la #lo"e dan" un %ain marie& ramener la temprature du milieu 7 90F:&
on a*oute le Dc.lo"rine 7 rai"on de 1 ml d,une "olution 7 MQ de dc.lo"rine "trili"e par
2iltration pour 100 ml de milieu de culture0
8ien 'omo#ni"er le" 2lacon"& couler le milieu ain"i prpar dan" de" %oite" de ptri vide"& et
lai""er place pour la 2
/me
couc'e lai""er "olidi2ier "ur un plan 'ori3ontal0
- Apr/" "lection de" "pore" par c'au22a#e& 2iltrer $20&90& 100 ml) "ur mem%rane0
- Placer la mem%rane renver"e "ur le milieu "lecti2
- :ouler une 2
/me
couc'e pour crer une anaro%io"e
- 6ncu%er 7 GEF: X1F: durant MP 'eure"0
Lecture : !e" colonie" apparai""ent noire"
).(. &onfirmation
Repi-ua#e de" colonie" noire" "u"pecte"& le" mettre dan" un tu%e contenant le %ouillon
t'io#l.colate V r"a3urine et on l,incu%e 7 GEF: pendant 20 'eure" en anaro%io"e0
En"emencer un tu%e de %ouillon lacto"e "ul2ite $8!S) avec 9 #outte" de la culture prcdente
et on l,incu%e 7 MMF: pendant 2M 'eure"
&onclusion
!e" %actrie" en 8!S& produi"ent du #a3e et 2orment un prcipit de "ul2ure de 2er& "ont
con"idre" comme tant de" clo"tridium per2rin#en"0
Pour le compta#e de" ASR on ne tient -ue le" %oite" contenant moin" de 100 colonie" par
l,application de la 2ormule "uivante : W ; n 1 100Av
W ; nom%re de" ASR dan" 100 ml d,c'antillon
n ; nom%re de colonie" caractri"ti-ue" dnom%re" dan" 100 ml d,c'antillon
S ; volume de l,c'antillon 2iltr en ml0
).). Inter"rtation
!e" anaro%ie" "ul2ito rductrice" et plu" prci"ment le" clo"tridium "ont con"idr" comme
tmoin" de la contamination 2cale0
!a 2orme r"i"tante de la "pore peut dceler une pollution 2cale ancienne
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
!eur dnom%rement 7 pour %ut de montrer l,e22icacit d,un traitement p'."i-ue $2iltration "ur
"a%le)& alor" une a%"ence de "pore" 7 l,aval du traitement e"t un %on "i#ne de "on e22icacit0
Dan" l,indu"trie alimentaire& la pr"ence de" ASR con"titue une nui"ance d,ordre
tec'nolo#i-ue0 Alor" -ue clo"tridium per2rin#en" con"titue de plu" une nui"ance d,ordre
"anitaire& 7 cau"e de la "crtion de" to1ine" -ui m/nent 7 de" to1i-in2ection" alimentaire0
5. Recherche des salmonella
!a mt'ode de rec'erc'e de ce" micro-or#ani"me" "e %a"e "ur deu1 donne" importante" :
- D,une part leur pr"ence en nom%re relativement 2ai%le dan" le" eau1 ain"i -ue
leur di22icult d,. "uivre0
- D,autre part de l,e1i"tence 'a%ituelle d,un nom%re important de #erme"
d,accompa#nement d,ori#ine 2cale $coli2orme"& "treptoco-ue"& p"eudomona")0
:e" #erme" ont tendance 7 "upplanter le" #erme" pat'o#/ne" -ui di"parai""ent
rapidement0
:e" con"tatation" entra=nent l,o%li#ation de concentrer le" c'antillon" 7 partir de volume"
important" d,eau et utili"er de" milieu1 d,enric'i""ement" "lecti2"& dan" le %ut d,in'i%er
le dveloppement de" autre" %actrie"0
!e" manipulation" de prl/vement et de prparation de l,c'antillon pr"entent un intr4t
particulier en rai"on du volume important #nralement nce""aire 7 l,anal."e& le volume
e1act dpendant de l,ori#ine de l,e22luent0
Par e1emple : par une eau de"tine 7 l,alimentation& le volume d,eau 7 anal."er devrait 4tre au
moin" 7 9 litre"0
5.1. ,thode :
!a mt'ode de 2iltration "ur mem%rane e"t la plu" utili"e pour le" eau1 "u22i"amment claire"0
5.2. Princi"e :
Apr/" concentration de" c'antillon" par 2iltration "ur mem%rane 7 0&M9 microm& celle-ci e"t
dpo"e dan" un milieu d,enric'i""ement eau peptone taponne "uivie par de" milieu1 et
d,enric'i""ement pour la revivication de" %actrie" "tre""e"0
Et on 2ait l,i"olement "ur de" milieu1 "lecti2" pour au#menter le" c'ance" de trouver
le" "almonelle" "an" -u,elle" entrent en comptition avec le" autre" %actrie"0
!e" colonie" "u"pecte" "eront "oumi"e" 7 de" te"t" %ioc'imi-ue" pour leur identi2ication0
5.3. *iffrentes ta"es des salmonelles
Pour la rec'erc'er le" "almonelle"& on "uit -uatre tape" :
4ta"e 1 K "r enrichissement
On 2iltre 9 litre" de" l,eau 7 anal."er& et on met le" 2iltre" dan" un 2lacon de 100 ml d,eau
peptone tamponne& l,incu%ation "e 2ait 7 GEF: durant 2M 'eure"0
4ta"e 2 K 4nrichissement
<us"ension m8re
1 ml de SM 0&1 de SM
Dan" %ouillon "lnite c."tine dan" le %ouillon rappaport va""iliadi"
GEF: 2M ' MMF: 2M '
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
&ulture 1 &ulture 2
4ta"e 3 : Isolement !actries sur #lose
On utili"e le" #lo"e" Mac conHe.& E[M& SS& BeHtoen et 5!DA
Isolement de la culture 1 Isolement de la culture 2
Mac conHe. SS E[M BeHtoen
GEFc 2M ' GEF: 2M B GEF: 2M B GEF: 2M B
:olonie" 6ncolore" colonie" incolore" colonie" ro"e indien :olonie" noire" 7
contour verdItre
4ta"e ' K confirmation
Repi-ua#e de" colonie" t.pi-ue" "ur li)ler ha"na :
B
2
SV
GAb X
!acto"e -
Gluco"e V
Et on peut ren2orcer le" con2irmation" par l,application de la #alerie 20 E "uivie
d,une a##lutination
5.'. Luelques tests !iochimiques "our lidentification de salmonelle
,ilieu de culture 7ests <almonella
*ilieu 0li)ler 1a"na Gluco"e
Ga3
!acto"e
8 #alato"ida"e
B2S
!D:
V
V
-
-
V $"au2 " part.p'i& S c'olerae)
V $"au2 S part.p'i A)
*annitol *obilit( 2itrate Mannitol
Mo%ilit
Witrata"e
V
V
V
3r(e indole 'ryptophane
4(saminase
<ra"e
6ndole
TDA
-
-
-
Sunmose :itrate V
"au2 $"t.p'i et S part.p'i A)
,lyc(rol EP V1A#l.crol -AV
5.(. Inter"rtation
Tout t.pe de colonie" dont l,a"pect e"t caractri"ti-ue ou douteu1 doit 4tre "oumi" 7
une con2irmation0 En e22et la reconnai""ance de" colonie" de "almonella e"t en #rande partie
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
une -ue"tion d,e1prience et leur a"pect peut par2oi" varier non "eulement en 2onction
de" "ouc'e" i"ole"& mai" #alement en 2onction" de" lot" de milieu de culture utili"e"0
5.(.1. Inoculation dun milieu de Ml.#ler
- :'oi"ir le" colonie" t.pi-ue" ou "u"pecte" "ur le" #lo"e" d,i"olement T
- Repi-uer de" colonie" "ur milieu de Hli#ler : ce milieu permet de vri2ier la puret
de" colonie" et de 2ournir le" -uantit" de culture nce""aire" pour l,identi2ication
%ioc'imi-ue et "rolo#i-ue T
- En"emencer le milieu de Hli#ler par pi->re du culot et par "trie lon#itudinale "ur la pente T
- !,incu%ation "e 2ait 7 une temprature GEF: pendant 2M 'eure"0
Lecture :
- !e culot du milieu de Hli#ler doit alor" 4tre *aune $2ermentation du #luco"e et la pente
demeura rou#e a%"ence de 2ermentation du lacto"e) T
- <n noirci""ement partiel ou total $#4nant par2oi" le" lecture" tardive") tmoi#ne de
la 2ormation d,'.dro#/ne "ul2ur T
- !,apparition de %ulle" dan" le culot montre la 2ormation de #a3 7 partir du #luco"e0
5.(.2. 7est dox.dase :
O1.da"e n#ati2
5.(.3. &oloration de #ram :
8acille"& #ram-& mo%ile" par une ciliature pritrice0
Inter"rtation
!a rec'erc'e de "almonelle" 7 pour %ut la dtection de %onne prati-ue d,'.#i/ne de
production pour le" eau1 de"tine" 7 la con"ommation 'umaine0
6. Recherche des l#ionella
Milieu de culture : C5E, ,VPC
!e" "ouc'e" de Le)ionella "e pr"entent "ou" la 2orme de %acille" 7 Gram n#ati2& non
"porul"& non cap"ul"& pr"entant *u"-uL7 0 p0 cent dLacide" #ra" in"atur" dan" la paroi
$caract/re in'a%ituel pour une %actrie 7 Gram n#ati2)& po""dant de" u%i-uinone" dont
le nom%re dLunit" i"opr/ne" e"t lev $de 7 1M)& me"urant de 0&G 7 0& cm de diam/tre "ur
1&9 7 9 cm de lon#ueur& pouvant donner de" 2orme" 2ilamenteu"e" $de 20 cm ou plu") apr/"
culture in 6itro& aro%ie" "trict"& 7 mta%oli"me non 2ermentati2& catala"e po"itive $raction
par2oi" 2ai%lement po"itive)& ne rdui"ant pa" le" nitrate" et ne ".nt'ti"ant pa" dLura"e0
Apr/" coloration de Gram& le" l#ionelle" "ont 2ai%lement colore" par la "a2ranine et
il convient "oit de lai""er a#ir le colorant plu" lon#temp" "oit de le remplacer par de
la 2uc'"ine 7 0&09 p0 cent ou par un mlan#e "a2ranine et 2uc'"ine0 <n caract/re
dLacidor"i"tance a t mi" en vidence pour le" cellule" de Le)ionella micdadei pr"ente"
dan" le" prl/vement" dLori#ine clini-ue0 :e caract/re e"t toute2oi" perdu apr/" culture0
!a plupart de" e"p/ce" "ont mo%ile" #rIce 7 la pr"ence dLun ou de plu"ieur" 2la#elle" polaire"&
"u%polaire" ou latrau1& mai" la mo%ilit e"t par2oi" di22icile 7 mettre en vidence et
"on e1pre""ion e"t 2onction de" 2acteur" dLenvironnement et notamment de la temprature0
!a croi""ance e"t optimale pour un pB l#/rement acide $de lLordre de O&P - O&) et& pour
la ma*orit de" e"p/ce"& pour une temprature compri"e entre G9-GO F:& avec #alement
une atmo"p'/re enric'ie 7 2&9Q en :O2 tait nce""aire 7 la culture de" Le)ionella0
!e milieu d,i"olement de %a"e e"t additionn par le p.rop'o"p'ate de 2er et le c'or'.drate de
c."tine -ui con"tituent le" 2acteur" de croi""ance indi"pen"a%le"0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Pour 1 2lacon de 100 ml milieu de %a"e 2ondue au %ain marie& et ramen 7 une temprature de
90Fc on a*oute 0&9 ml de l c."tine B:! et 0&9 ml de p.rop'o"p'ate 2erri-ue0
:ouc'er le milieu dan" le" %oite" de ptri "trile" et lai""er "olidi2ier "ur un plan 'ori3ontal
7em"rature dincu!ation : 29F- MPF: $Optimum; (36 1) C)
*ure dincu!ation : pendant 10 - 19 *our"
,thode : mt'ode par 2iltration "ur mem%rane de poro"it 0&22 um
,ode o"ratoire :
!or"-ue l,eau prleve e"t pauvre en le#ionella& l,c'antillon doit 4tre concentr par 2iltration
"ur mem%rane& ain"i le" -uel-ue" %actrie" pr"ente" dan" un #rand volume d,eau "e trouvent
dan" un plu" petit volume& ce -ui permet d,au#menter la pro%a%ilit de le" dtecter apr/"
en"emencement "ur la #lo"e 2avora%le0
- !e" l#ionelle" "ont rec'erc'e" dan" 1 litre d,eau 7 anal."er T
- A#iter "oi#neu"ement le 2lacon d,eau 7 anal."er et ver"er "trilement dan" l,entonnoir T
- !,opration "era donc rpte *u"-u,7 2iltration d,1 litre T
- A l,aide d,une pince prala%lement 2lam%e et re2roidie "oulever le 2iltre et l,introduire
a"epti-uement dan" un 2lacon d,eau "trile contenant 100 ml T
- !e 2lacon contenant le 2iltre e"t trait par une "oni2ication le" ultra"on" 2avori"ent
la li%ration de" %actrie" -ui "ont colle" "ur la mem%rane 2iltrante T
- :omme l#ionella e"t r"i"tante 7 l,acide et 7 la c'aleur& la prparation e"t en"uite
dcontamine& d,une part par traitement t'ermi-ue et d,autre part par traitement acide cela
permet la de"truction de la 2lore inter2rente T
7raitement thermique :
2 ml d,c'antillon concentr e"t mi" dan" un tu%e "trile 7 %ouc'on vi""& ce tu%e" e"t
mi" dan" un %ain marie t'ermo"trat 7 90F:X 1F: pendant 10 min0
0&1 ml de cet c'antillon trait par la c'aleur e"t en"emenc "ur un milieu "lecti2 pour
l#ionella 8:dE d*7 coul en %oite0
7raitement acide :
Mettre dan" un tu%e "trile 7 %ouc'on vi"" 2 ml d,c'antillon concentr V2 ml d,acide
B:! [:! 1 W P' ; 2 T
A#iter doucement le tu%e pui" lai""er repo"er un moment pour -ue le contact
$c'antillonAacide) "oit e22icace0

- En2in prendre 0&1 ml de cet c'antillon trait par l,acide et l,inoculer "ur la #lo"e GSP:
- !e" G %oite" d,c'antillon non traite" t'ermi-uement et traite" par l,acide& "ont incu%e" 7
GEFc X 1Fc durant 10 *our"0
- Au cour" de la priode d,incu%ation& e1aminer le" %o=te" 7 partir du troi"i/me *our et 7 troi"
repri"e" au moin" 7 de" intervalle" de 2 7 M *our"0
- Woter le nom%re de c'a-ue t.pe de colonie"0
- Slectionner au moin" troi" colonie" caractri"ti-ue" de Le)ionella "ur c'acune de" %o=te" de
milieu0
- Repi-uer c'a-ue colonie "ur une %o=te de milieu 8:dEe "an" c."tine $8:dEe - c." ) et
une %o=te de milieu 8:dEe du co22ret 8T00E0
- 6ncu%er 7 $GO X 1) F: pendant au moin" 2 *our"0
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
- :on"idrer comme Le)ionella toute" le" colonie" -ui "e dveloppent "ur le milieu 8:dEe
mai" ne cultivent pa" "ur le milieu 8:dEe - c."0
- 6denti2ier le" e"p/ce" de Le)ionella par "rolo#ie0
Lecture :
!e" colonie" de Le)ionella Sp0 "ont li""e" et %om%e" de 1 7 2 mm de diam/tre& elle" ont
une coloration %lanc'e 7 #ri"e& elle" peuvent #alement 4tre %leue"& ro"e"& pourpre"& marron"&
vert *aune ou rou#e 2onc et devenir %lanc'Itre" etAou 2ilamenteu"e" en vieilli""ant0
Elle" peuvent pr"enter un a"pect de verre pil 7 la loupe %inoculaire0 :ertaine" colonie"
pr"entent une 2luore"cence dLun %lanc %rillant "ou" lampe de `ood0
&onfirmation
:oloration de #ram : 8acille"& #ram n#ative"0
Inter"rtation
!a prvention repo"e "ur une "urveillance environnementale -ui nce""ite un pro#ramme
d,entretien r#ulier de" r"eau1 $netto.a#e) pour liminer le tartre& pour une circulation
permanente de l,eau avec limination de" %ra" mort" et une temprature "u22i"ante de l,eau
$O0F: au "ite de production et 90F : au1 point" d,u"a#e)
!,o%*ecti2 ci%le dan" l,ta%li""ement de "ant e"t de maintenir la concentration en l#ionelle"
a 10G <N:Alitre d,eau0
!e" l#ionelle" "ont rec'erc'e" dan" le" c'audi/re" et le" climati"eur"& car l,in2ection
appara=t dan" le" u"ine" dote" de l,air conditionn ou de #rand" volume" d,eau "ont remi" en
circulation et re2roidi par de l,air in"u22l dan" l,eau& dan" cette eau c'aude -ui circule "e
dveloppe une #rande -uantit de l#ionella -ui "ont pro*ete" avec l,air climati" et
contaminent le" pa""ant" c,e"t pour-uoi il e"t maintenant recommand0
II. Inter"rtation des rsultats :
<ne eau e"t con"idr pota%le "i :
!e" indicateur" de pollution "ont a%"ent" dan" 100 ml de l,c'antillon comme
le" coli2orme" totau1& le" coli2orme" 2cau1 et le" "treptoco-ue" 2cau1) T
!e" indicateur" de pat'o#nit "ont au""i a%"ent" dan" 100 ml de l,c'antillon comme
"tap'.loco-ue" pat'o#/ne"& p"eudomona" aeru#ino"a alor" -ue le" "almonelle"
doivent 4tre a%"ente" dan" 9 litre" d,c'antillon" T
!e" indicateur" d,e22icacit de traitement comme clo"tridium per2rin#en" doivent 4tre
in2erieur 7 1 <N: Aml T
!e" microor#ani"me" revivi2ia%le" 7 20Fc doivent 4tre in2rieur 7 100 <N: Aml T
!e" microor#ani"me" revivi2ia%le" 7 GEFc doivent 4tre a 20 <N: Aml0
*es 4xem"les :
E1emple : anal."e %actriolo#i-ue d,une eau minrale
Micro or#ani"me rec'erc' R"ultat" :rit/re"
Micro or#ani"me" revivi2ia%le" 7 20F:Aml a 10 100
Micro or#ani"me" revivi2ia%le" 7 GEF:Aml a 10 20
:oli2orme" totau1A290 ml A%"ence a%"ence
:oli2orme" T'ermotolrant"A290 ml A%"ence A%"ence
Streptoco-ue" 2cau1A290 ml A%"ence A%"ence
P"eudomona" aeru#ino"aA290 ml A%"ence A%"ence
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Stap'.lococcu" aureu"A290 ml A%"ence A%"ence
Anaro%ie" "ul2itorducteurA90 ml A%"ence a 1
Salmonelle" A9 l A%"ence A%"ence
!,c'antillon d,eau anal." rpond au1 crit/re" %actriolo#i-ue" d,une eau pota%le0
E1emple 2 R"ultat" d,anal."e %actriolo#i-ue d,une eau de ro%inet
Micro or#ani"me rec'erc' R"ultat" :rit/re"
Micro or#ani"me" revivi2ia%le" 7 GEF:Aml a 10 20
Micro or#ani"me" revivi2ia%le" 7 20F:Aml a 10 100
:oli2orme" totau1A100 ml A%"ence a%"ence
:oli2orme" T'ermotolrant"A100 ml A%"ence A%"ence
Streptoco-ue" 2cau1A100 ml A%"ence A%"ence
P"eudomona" aeru#ino"aA100 ml A%"ence A%"ence
Stap'.lococcu" aureu"A100 ml A%"ence A%"ence
Anaro%ie" "ul2itorducteurA20 ml A%"ence a 1
Salmonelle" A9 l A%"ence A%"ence
:onclu"ion l,c'antillon d, @eau anal." rpond au1 crit/re" %actriolo#i-ue" d,une eau
pota%le0
E1emple G : eau de pi"cine
Micro or#ani"me rec'erc' R"ultat" :rit/re"
Germe" totau1 7 GEFc Aml M0 100
:oli2orme" totau1A100 ml 1 1
:oli2orme" t'ermotolrant"A100 ml A%"ence A%"ence
Streptoco-ue" 2cau1A100 ml A%"ence A%"ence
P"eudomona" aeru#ino"aA100 ml A%"ence A%"ence
Stap'.lococcu" aureu"A100 ml A%"ence A%"ence
Salmonelle" A9 l A%"ence A%"ence
:onclu"ion : d,eau anal."e rpond au1 crit/re" %actriolo#i-ue" d,une eau de %ai#nade0
.erme (ilieu T /0 Temps Aspect des colonies
('% 12 PA 12 31h Polymorphes
('% 43 PA 43 15h 6
oli7ormes TCC-Te*4itol 43 15h *aunes dores
oli8thermo8 6 6 55 15h 6 6
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RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
Staphylocoques
hapman9
manitol
43 5:h 6 6
Streptocoques Slanet;9T 43 5:h %ou<es briques
Pseudomonas .lose au
ctrimide
43 5:h Vert=*aune9brillantes
AS% V)=TS 43 5:h Noires
III. 7."es danal.ses micro!iolo#iques
Au point de vue %actriolo#i-ue& troi" niveau1 dLanal."e" "ont d2ini" : anal."e rduite&
anal."e "ommaire et anal."e compl/te $voir ta%leau ci-de""ou")0
Analyses bactriolo<iques
R5d)ite 6t78e B19 Somm'i*e 6t78e B29 Com8l:te 6t78e B39
Coli3o*mes
t#e*motol5*'0ts
St*e8too;)es
35')2
8se)domo0's
'e*)4i0os'
s'lmo0elle
Coli3o*mes
t#e*motol5*'0ts
St*e8too;)es 35')2
<50omb*eme0t des
b't5*ies '5*obies
*e(i(i3i'bles = 20C et
= 3"C
8se)domo0's
'e*)4i0os'
s'lmo0elle
l54io0elle
Coli3o*mes
t#e*motol5*'0ts
St*e8too;)es 35')2
<50omb*eme0t des
b't5*ies '5*obies
*e(i(i3i'bles = 20C et =
3"C
S8o*es de b't5*ies
'0'5*obies s)l3ito-
*5d)t*ies
8se)domo0's 'e*)4i0os'
s'lmo0elle
l54io0ell'
LNanal.se rduite /OI2 e"t rali"e "ur le" eau1 de re""ource" T
Lanal.se sommaire /O22 "ur le" eau1 du r"eau $eau du ro%inet) T
Lanal.se com"l8te /O32 "ur le" eau1 de capta#e individuel $capta#e" de" "ource" ou de
#i"ement" "outerrain" #nralement de"tin" 7 lLapprovi"ionnement dLune mai"on&
dLun 'ameau ou dLune indu"trie& principalement en 3one rurale non de""ervie par lLeau de
di"tri%ution T la plupart du temp"& cette eau ne "u%it aucun traitement avant utili"ation)0
!e" eau1 de"tine" 7 la con"ommation 'umaine et animale $eau1 pota%le") 2ont lLo%*et de
di22rent" t.pe" dLanal."e"& -ui concerne la rec'erc'e de":
Oactries daltration
%actrie" aro%ie" revivi2ia%le" 7 20Fc $MOR 20)
P"eudomona"
Oactries tmoin de contamination
:oli2orme" 2cau1
11
RAPPORT DE STAGE : Dpartement de Scurit alimentaire et environnementale
Avril-Mai 200
coli2orme" t'ermo tolrant"&
%actrie" aro%ie" revivi2ia%le" 7 GEFc $MOR GE)
"treptoco-ue" 2cau1&
Oactries "atho#8nes
"pore" de" %actrie" anaro%ie" "ul2ito-rductrice" $ASR)0
Stap'.loco-ue" pat'o#/ne"
I92- &onclusion
!e traitement de" eau1 e22ectu pour le" rendre pota%le" du point de vue %actriolo#i-ue n,a
pa" pour %ut de dtruire tou" le" or#ani"me" vivant" dan" l,eau& mai" plut+t de #arantir
l,a%"ence de tou" #erme" in2ectieu1 et de mettre 'or" ri"-ue de contamination un point d,eau
ou un "."t/me de di"tri%ution a.ant une pollution0
Dan" la prati-ue et pour le ca" de" eau1 pota%le"& l,'a%itude a t pri"e de parler "trili"ation
alor" -u,il ",a#it en ralit d,une d"in2ection ce dernier terme e"t plu" volontier" utili"
lor"-u,il ",a#it de" eau1 u"e"& alor" -u,on devrait plut+t parler de dcontamination
micro%ienne0