LAPORAN PRAKTIKUM METODE PEMISAHAN BAHAN ALAM

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KANDUNGAN TERPENOID DARI HERBA

SAMBILOTO (Andrographis paniculata (Burm.f.) )
KELOMPOK PRAKTIKUM : 2
Rabu, ! "a#uar$ 2%&
D$'u'u# O()* :
I+a A,u R$'-a .u(a#'ar$ %%/!%!%/
I G)+) Pa')0 .$#a#1ara Pu1ra %%/!%!%2%
Pu1u P)br$ 2a*,a#a %%/!%!%2
N$ .a,a# R)'1$0a N34$a#1$ %%/!%!%22
Lu* Ra'm$1a D)5$ %%/!%!%2&
N$ Ma+) G$1ar$#$ %%/!%!%2/
N$ Pu1u M$1a "u#$ar$ %%/!%!%26
I+a Ba7u' Pu1u Na1a Ku'uma %%/!%!%89
Lab3ra13r$um Farma037#3'$ +a# F$130$m$a
"uru'a# Farma'$
Fa0u(1a' Ma1)ma1$0a +a# I(mu P)#7)1a*ua# A(am
U#$4)r'$1a' U+a,a#a
2%&
1
BAB I
PENDAHULUAN
. La1ar B)(a0a#7
Indonesia merupakan negara yang kaya akan tanaman obat, dan sangat potensial
untuk dikembangkan. Berdasarkan hasil penelitian, dari sekian banyak jenis tanaman
obat, baru 20-22% yang dibudidayakan. Sedangkan sekitar !% diperoleh melalui
pengambilan langsung "eksplorasi) dari hutan. #otensi tanaman obat di Indonesia,
termasuk tanaman obat kehutanan, apabila dikelola dengan baik akan sangat berman$aat
dari dalam bidang kesehatan dan industri ke$armasian. %egara berkembang mempunyai
peranan penting dalam penyediaan bahan baku produk $armasi "&!% untuk medical dan
aromatic plants, 2'% untuk vegetables saps dan extract, dan 11% untuk vegetables
alkaloids) "(ephut, 2010).
Salah satu tanaman yang banyak digunakan sebagai pengobatan adalah sambiloto.
Sambiloto atau Andrographis paniculata "Burm.$.) atau yang dikenal king of bitter,
yang tergolong family )*antha*eae, merupakan salah satu tanamn obat yang telah
banyak digunakan untuk pengobatan tradisional di India, +ina, ,hailand, -epan,
S*andina.ia, /alaysia, dan Indonesia. Se*ara kimia sambiloto mengandung diterpena,
$la.onoid, stigmasterol, alkane, keton, aldehid, mineral "kalsium, natrium, kalium),
asam kersik, dan damar. 0omponen utamanya adalah androgra$olid, yang merupakan
senya1a diterpen lakton yang memiliki berbagai akti.itas $armakologis, yang banyak
terdapat pada bagian daun dan batang "2osidah dkk., 2012).
Sambiloto mempunyai berbagai ma*am man$aat bagi kesehatan manusia.
Berbagai e$ek $armakologi dari sambiloto adalah antiin$lamasi, antibakteri, antipiretik,
antioksidan, antiparasitik, hepatoprotekti$, dan antidiabetes "0umar et al., 2012). 3al
tersebut menunjukkan bah1a sambiloto dapat digunakan untuk mengobati beberapa
penyakit, seperti hepatitis, demam, in$luen4a, dan disentri "(alimartha, 2005). Beberapa
dari hasil penelitian se*ara empiris, sambiloto dapat menurunkan kadar lipid dalam
darah "(4ulkarnain dkk., 1665). (i samping itu, tanaman ini juga mempunyai potensi
yang besar sebagai sumber hayati untuk keperluan biopharmaceutical industry serta
dapat dikembangkan dalam industri $ito$armaka ")delyna, 1666). ,elah diketahui juga
bah1a ekstrak terpuri$ikasi Andrographis paniculata "Burm. $.) %ees dan isolatnya
2
"androgra$olid) dapat menurunkan kadar trigliserida dan 7(7 pada tikus yang diberi
diet tinggi $ruktosa dan lemak namun tidak menunjukkan penurunan kadar kolesterol
se*ara signi$ikan "%ugroho et al, 2012).
0andungan senya1a yang ditemukan pada keseluruhan tanaman, daun dan
batang yang diekstraksi dengan etanol atau metanol mengandung lebih dari 20
diterpenoid dan lebih dari 10 $la.onoid. )ndrogra$olid adalah diterpenoid utama yang
kandunganya paling banyak dan juga merupakan senya1a $itokimia paling akti$ dalam
sambiloto. Selain )ndrogra$olid, senya1a lain yang terdapat di dalam sambiloto adalah
deoksiandrogra$olid-16-8-(-glukosida dan neo-androgra$olid yang keseluruhannya
diisolasi dari daun, 1'-deoksi-11,12-didehydroandrogra$olid "androgra$olid- (),
homoandrogra$olid, androgra$an, androgra$on, androgra$osterin, dan stigmasterol
"Siripong et al, 1662).
Banyaknya kandungan kimia yang terkandung dalam sambiloto, menyebabkan
perlunya dilakukan suatu proses pemisahan, isolasi serta identi$ikasi untuk mendapatkan
senya1a tunggal berupa androgra$olid. 3al inilah yang melatarbelakangi pentingnya
dilakukan suatu pemisahan, isolasi, dan identi$ikasi senya1a androgra$olid dalam
tanaman sambiloto "Andrographis paniculata "Burm. $.) %ees).
.2 Rumu'a# Ma'a(a*
1.2.1 Bagaimana *ara mengisolasi androgra$olid dari matriks yang terdapat pada herba
sambiloto9
1.2.2 Bagaimana metode identi$ikasi androgra$olid pada herba sambiloto 9
.8 M3+$f$0a'$ S)+)r*a#a ,a#7 D$1am:$(0a#
/odi$ikasi yang dilakukan pada praktikum kali ini adalah setelah maserasi ekstrak
diuapkan hingga menjadi ekstrak kental kemudian di*u*i menggunakan n-he:ane dan
etil asetat. (ilakukan 07, untuk mengetahui pengotor yang masih ada dan di*u*i
kembali dengan pelarut yang dapat meghilangkan pengotor tersebut.
BAB II
&
TIN"AUAN PUSTAKA
2. T)r:)#3$+
Senya1a terpenoida berasal dari unit +
;
yang disebut dengan unit isoprene
"+3
2
<+"+3
&
)-+3<+3
2
). =nit +
;
ini dinamakan demikian karena kerangka karbonnya
sama seperti senya1a isopren.
>ambar 2.1. 0erangka =nit Isopren ")*hmad, 16!5)
,erpenoid dibagi ? bagi menjadi beberapa golongan berdasarkan jumlah satuan
unit +
;
yang terdapat di dalam senya1a tersebut@ dua "+
10
), tiga "+
1;
), empat "+
20
), enam
"+
&0
), atau delapan "+
'0
) satuan. ,erpenoid terdiri atas beberapa ma*am senya1a, mulai
dari komponen minyak atsiri, yaitu monoterpenoida dan seskuiterpenoida yang mudah
menguap "+
10
dan +
1;
), diterpen yang lebih suka rmenguap "+
20
), sampai senya1a yang
tidak menguap, yaitu triterpenoid dan sterol "+
&0
), serta pigmen karotenoida "+
'0
).
"3arborne,16!). Se*ara umum biosintesa dari terpenoid melalui & reaksi dasar yaitu A
1. #embentukan isoprene akti$ berasal dari asam asetat melalui asam me.alonat.
2. #enggabungan kepala dan ekor unit isoprene akan membentuk mono-, seskui-, di-,
sester-, dan politerpenoid.
&. #enggabungan ekor dan ekor dari unit +
1;
atau +
20
menghasilkan triterpenoid dan
steroid.
Senya1a terpenoid dapat dikelompokkan sebagai berikut A
%o -enis Senya1a -umlah atom karbon Sumber
1 /onoterpenoid 10 /inyak atsiri
2 Seskuiterpenoid 1; /inyak atsiri
& (iterpenoid 20 2esin pinus
' ,riterpenoid &0 (amar
; ,etraterpenoid '0 Bat 1arna karoten
5 #oliterpenoid C'0 0aret alam
"7enny, 2005)
Si$at umum ,erpenoid A
'
- Si$at $isika dari terpenoid adalah A
1) (alam keadaan segar merupakan *airan tidak ber1arna, tetapi jika
teroksidasi 1arna akan berubah menjadi gelap
2) /empunyai bau yang khas
&) Indeks bias tinggi
') 0ebanyakan optik akti$
;) 0erapatan lebih ke*il dari air
5) 7arut dalam pelarut organik A eter dan alkohol
- Si$at 0imia dari terpenoid adalah A
1) Senya1a tidak jenuh "rantai terbuka ataupun siklik)
2) ,erpenoid kebanyakan bentuknya khiral dan terjadi dalam dua bentuk
enantiomer.
"7enny, 2005)
2.. D$1)r:)#3$+
(iterpenoid merupakan senya1a +20 yang berasal dari empat satuan isoprenoid.
0arena titik didihnya yang tinggi biasanya diterpenoid tidak ditemukan dalam minyak
atisri tumbuhan. (iterpenoid men*akup beberapa senya1a dari segi $isiologi sangat
menarik seperti golongan hormone tumbuhan yang dikenal sebagai giberelin. Seperti
seskuiterpenoid, diterpenoid men*akup banyak senya1a yang bekerja sebagai $ungisida,
ra*un terhadap he1an, penolak serangga dan sebagainya. Senya1a ini dapat bersi$at
karsinogen.
Beberapa senya1a ini mempunyai e$ek ra*un atau e$ek penolakan terhadap
serangga sementara senya1a lainnya menarik serangga. Beberapa senya1a mempunyai
akti.itas anti.irus dan sebagai $ungisida. Satu senya1a dari kemangi mempunyai
akti.itas hormon remaja. #artenolida dari Parthenum tanacetum berguna untuk
mengobati migraine karena menghambat pelepasan serotonin. )ndrogra$olid merupakan
senya1a diterpenoid dari tanaman Sambiloto "Andrographis paniculata) yang
mempunyai akti.itas sebagai antihiperlipidemia " %ugroho, 2012). Senya1a diterpenoid
dapat berbentuk asiklik, bisiklik, trisiklik dan tetrasiklik "7enny, 2005)
;
>ambar 2.2. Struktur (asar (iterpenoid "Breitmaier, 2005)
2.2 Samb$(313 (Andrographis paniculata)
2.2. K(a'$f$0a'$ Ta#ama# Samb$(313 (Andrographis paniculata)
0ingdom A #lantae
Superdi.isi A Spermatopita
(i.isi A )ngiospermae
0elas A (ikotiledon
Drdo A #ersonales
Eamili A )*antha*eae
>enus A )ndrographis
Spesies A Andrographis paniculata
"Si.ananthan and Flamaran, 201&)
>ambar 2.&. Andrographis paniculata "Si.ananthan and Flamaran, 201&)
2.2.2 M3rf3(37$ Ta#ama#
Andrographis paniculata diduga berasal dari India dan dikenal sebagai
Chirayetah dan Kalmegh dalam bahasa =rdu dan Bahasa 3indi. ,anaman ini termasuk
tanaman menahun, tingginya men*apai 1-& kaki. Andrographis paniculata merupakan
salah satu yang paling sering tanaman yang digunakan dalam sistem tradisional =nani
5
dan obat-obatan )yur.eda ")kbar, 2011). (i India, Andrographis paniculata
merupakan tumbuhan liar yang digunakan untuk mengobati penyakit disentri, diare,
atau malaria. 3al tersebut ter*antum dalam Indian Pharmacopeia dan ter*atat paling
sedikit dalam 25 $ormula )yur.eda. (alam Traditional Chinese Medicine ",+/),
Andrographis paniculata sering digunakan sebagai Gcold propertyG untuk menurunkan
panas serta sebagai Hblood purifyingG untuk membersihkan ra*un-ra*un di dalam tubuh.
Selanjutnya tanaman ini terus menyebar ke daerah )sia hingga akhirnya sampai di
Indonesia "Iidya1ati, 200).
=mumnya Andrographis paniculata tumbuh di tempat-tempat terbuka yang teduh
dan agak lembab, seperti kebun, tepi sungai, semak, atau rumpun bambu. ,anaman
Andrographis paniculata merupakan terna yang tumbuh tegak, tinggi '0 *m sampai 60
*m, per*abangan banyak dengan letak yang berla1anan, *abang berbentuk segi empat
dan tidak berambut. /emiliki batang berkayu berbentuk bulat dan segi empat dan
ber*abang banyak "monopodial). (aun tunggal saling berhadapan, berbentuk pedang
"lanset) dengan tepi rata "integer) serta permukaan yang halus dan ber1arna hijau.
Bunganya ber1arna putih keunguan, berbentuk jorong "bulan panjang) dengan pangkal
dan ujung lan*ip "Iidya1ati, 200). #anjang daun & *m sampai 12 *m dan lebar 1 *m
sampai & *m, panjang tangkai daun ; mm sampai 2; mm, daun di bagian atasnya
sebagai daun pelindung. #erbungaan tegak ber*abang-*abang, gagang bunga & mm
sampai mm, panjang kelopak bunga & mm sampai ' mm, bunga berbibir berbentuk
tabung panjang 5 mm, bibir bunga bagian atas ber1arna putih dengan 1arna kuning di
bagian atasnya, bibir bunga ba1ah lebar, ber1arna ung. Bentuk buah jorong dengan
ujung yang tajam, bila tua akan pe*ah menjadi ' bagian "(epkes 2I, 166).
(i beberapa daerah di Indonesia, Andrographis paniculata dikenal dengan
beberapa nama tergantung daerah tempat tumbuhnya. (i -a1a ,engah dan -a1a ,imur,
Andrographis paniculata disebut dengan nama bidara, sambiroto, sadilata, takilo,
sambiloto, sandiloto dan paitan. Sebagian besar masyarakat /elayu dan Sumatera
menyebutnya dengan ampadu atau pepaitan. (i -a1a Barat disebut dengan takila,
kioray, atau kipeurat. (i Bali lebih dikenal dengan samiroto. Selain itu, terdapat pula
nama lain Andrographis paniculata di negara lain, yaituA green chiretta dan king of
bitter "Inggris)@ kirayat, kalmegh, dan kirata "India)@ uasabhuva ")rab)@ congcong dan

xuyen tam lien "Jietnam)@ nainehavandi "#ersia)@ serta yi !ian xi, chuan xin lian, dan
lan he lian "+ina) "Iidya1ati, 200).
Semua bagian tanaman Andrographis paniculata, seperti daun, batang, bunga,
dan akar, memiliki rasa sangat pahit. 2asa pahit ini diduga ini berasal dari androgra$olid
yang terkandung di dalamnya. Bagian tanaman yang sering digunakan dalam
pengobatan adalah herba tanaman. Bagian akar dapat pula digunakan namun masih
memerlukan penelitian lebih lanjut ")kbar, 2011). %amun bagian yang paling sering
digunakan sebagai bahan ramuan obat tradisional adalah bagian daun dan batangnya
"Iidya1ati, 200). (alam pengobatan tradisional, Andrographis paniculata digunakan
dalam bentuk in$use, dekok, dan serbuk baik dengan pemakainan tunggal maupun
kombinasi dengan tanaman herbal lainnya ")kbar, 2011).
2.2.8 Ka#+u#7a# K$m$a
Se*ara umum Andrographis paniculata mengandung diterpen lakton, dan
$la.onoid. ,erkandung & jenis diterpen lakton pada Andrographis paniculata yaitu
androgra$olid, neoandrogra$olid dan deoksiandrogra$olid "Iongkittipong et al, tt)
0andungan tersebut terutama terdapat pada bagian akar, namun dapat pula diisolasi
dari daun. 3erba ini mengandung alkana, keton, dan aldehida. )1alnya pahit 4at yang
terkandung dalam daun diduga merupakan lakton androgra$olid. #enyelidikan
selanjutnya menunjukkan bah1a pada daun terdapat 2 4at pahit, yaitu androgra$olid dan
senya1a lain bernama kalmegin. Fmpat jenis lakton diisolasi dari herba Andrographis
paniculata di +hina. (ua jenis lakton telah terdeteksi dalam daun dan enam jenis
diterpenoid dari jenis ent"labdane, yaitu dua glukosida diterpen dan ' diterpen dimer
telah diisolasi dari herba tersebut. (ua jenis $la.onoid diidenti$ikasi sebagai ;,,2K,&K-
tetrametoksi$la.anon dan ;-hidroksi-,2K,&K-trimetoksi$la.on telah diisolasi dari seluruh
bagian tanaman, sementara 12 $la.onoid baru dan 1' diterpenoid telah dilaporkan
terdapat pada herba Andrographis paniculata. (ua $la.onoid glikosida baru dan
diterpenoid baru "asam androgra$ik) telah dilaporkan, dan 2 diterpenoid glikosida ent"
labdane baru telah diisolasi dari herba ini ")kbar, 2011)
2.8 S)#,a5a A#+r37raf3($+
!
)ndrogra$olid merupakan senya1a akti$ utama dari tanaman sambiloto.
)ndrogra$olid terkandung paling banyak di daun "kurang lebih 2,&6 %) dan paling
sedikit pada biji "Sharma dkk., 1662). /enurut 0umoro "200) androgra$olid
merupakan senya1a yang masuk dalam grup trihidroksilakton memiliki rumus molekul
+
20
3
&0
D
;
. Struktur molekul androgra$olid dapat terlihat pada gambar ' berikutA
>ambar 2.'. Struktur /olekul )ndrogra$olid "0umoro, 200)
)ndrogra$olid bersi$at mudah larut dalam metanol, etanol, pyridine, asam asetat,
dana *eton, tetapi sedikit larut dalam ether dan air. Se*ara $isika, androgra$olid memiliki
titik leleh 22!-2&0
o
+ dan spektrum ultra.iolet dalam etanol L maskimal 22& nm
"0umoro, 200).
)ndrogra$olid dan kalmeghin bertanggung ja1ab terhadap rasa pahit pada
tanaman sambiloto. Selain androgra$olid, terdapat senya1a lakton lainnya yang
ditemukan pada sambiloto, antara lain A deoksiandrogra$olid-16-8-(-glukosa, neo-
androgra$olid "yang keseluruhannya diisolasi dari daun) "+hem dan 7iang, 16!2), 1'
deoksi-11,12-didehidroandrogra$olid "androgra$olid (), homoandrogra$olid,
androgra$an, androgra$on, androgra$osterin, dan stigmasterol "Siripong dkk., 1662).
Beberapa penelitian terkait khasiat androgra$olid, 3anda dan Sharma "1660)
mengungkapkan androgra$olid mampu menetralkan ra*un yang terdapat di dalam hati
tikus yang diinduksi parasetamol dan galaktosamin. #enelitian ini diperkuat oleh
Sara1at B. dkk. "166;) dan Jisen dkk. "166&) yang menyatakan androgra$olid mampu
memproteksi hati tikus yang berturut-turut diinduksi dengan galaktosamin dan
parasetamol.
/ishra "1662) melaporkan ekstrak sambiloto dapat menghambat pertumbuhan
Plasmodium berghei. Fkstrak metanol, kloro$orm dan petroleum eter dari sambiloto
6
juga dilaporkan mempunyai daya hambat terhadap pertumbuhan Plasmodium
falciparum in .itro pada stadium shi4ontosida "Iidya1aruyanti, 1666). Sementara
Iidyo1ati "200&) menyatakan bah1a isolat sambiloto mampu menghambat
pertumbuhan Plasmodium falciparum pada stadium gametosit in .itro.
#enggunaan androgra$olid yang diekstrak menggunakan metanol dalam terapi
kombinasi berbasis artemisinin telah diteliti oleh /ishra "2011). /ereka menyatakan
bah1a androgra$olid bersinergi baik dengan kurkumin dan artesunat. Se*ara in .i.o,
androgra$olid-kurkumin memiliki akti.itas anti malaria !1% lebih tinggi dibandingkan
kontrol dan mampu memperpanjang umur hingga 2-& kali.
2.& E0'1ra0'$, I'3(a'$ +a# I+)#1$f$0a'$ M)1ab3($1 S)0u#+)r +ar$ Ba*a#A(am
Fkstraksi adalah proses pengambilan komponen yang larut dari bahan atau
*ampuran dengan menggunakan pelarut seperti air, alkohol, eter, aseton dan sebagainya.
/etode ekstraksi yang dipilih untuk mendapatkan senya1a bahan alam tergantung
kepada jenis sampel tumbuhan dan jenis senya1a yang ada. ,erutama tergantung pada
keadaan $isik senya1a tersebut misalnya senya1a berupa *airan yang mudah menguap
"3arbone,16!).
Se*ara umum ekstraksi senya1a metabolit sekunder dari seluruh bagian tanaman
seperti bunga, buah, daun, kulit batang, dan akar menggunakan sistem maserasi
menggunakan pelarut organik polar seperti metanol. Beberapa metode ekstraksi
senya1a bahan alam yang umum digunakan antara lain maserasi, perkolasi, sokletasi,
digesti, destilasi uap "(ar1is, 2000).
3asil yang diperoleh berupa ekstrak yang mana seluruh senya1a bahan alam yang
terlarut dalam pelarut yang digunakan berada pada ekstrak kini. #enentuan jumlah
komponen senya1a dapat dideteksi dengan kromatogra$i lapis tipis "07,) dengan
menggunakan plat 07, yang sudah siap pakai. ,erjadinya pemisahan komponen-
komponen pada plat 07, dengan 2$ tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk
memisahkan komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatogra$i dan
sebagai $ase diam dapatdigunakan silika gel dan eluen yang digunakan berdasarkan
hasil yang diperoleh dari 07, dan akan lebih baik jika kepolaran eluen pada kolom
kromatogra$i sedikit diba1ah kepolaran eluen pada 07,. #emilihan eluen sebaiknya
10
dimulai dari pelarut organik yang tidak polar seperti heksana dan peningkatan kepolaran
dengan etil asetat atau pelarut yang lebih polar lainnya "3arbone, 16!)
2.&. Ma')ra'$
Istilah maceration berasal dari bahasa latin macerare, yang artinya adalah
HmerendamG. /aserasi merupakan proses ekstraksi paling tepat dimana obat yang sudah
halus memungkinkan untuk direndam dalam pelarut sampai meresap dan melunakkan
susunan sel, sehingga 4at-4at yang mudah larut akan terlarul di dalamnya ")nsel, 16!6).
/aserasi merupakan *ara penyarian yang paling sederhana yang dilakukan dengan
meredam serbuk simplisia dalam *airan penyari selama beberapa hari pada temperatur
kamar dan terlindung dari *ahaya, dimana *airan penyari akan masuk kedalam sel
mele1ati dinding sel "Sudjadi, 200!).
/etode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung
komponen kimia yang mudah larut dalam *airan penyari, tidak mengandung ben4oin,
tiraks dan lilin. #ada teknik maserasi, *airan penyari akan masuk kedalam sel melalui
dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan
didalam sel dan diluar sel. 7arutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan
diganti oleh *airan penyari dengan konsentrasi rendah melalui proses di$usi. #eristi1a
tersebut berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan didalam sel
dan diluar sel. Selama proses maserasi, dilakukan pengadukan dan penggantian *airan
penyari setiap hari. Fndapan yang diperoleh dipisahkan dan $iltratnya dipekatkan.
">andjar dan 2ohman, 200)
0e*uali dinyatakan lain, maserasi dilakukan sebagai berikutA sepuluh bagian
simpilisia atau *ampuran simplisia dengan derajat halus yang *o*ok dimasukkan di
dalam bejana, lalu dituangi ; bagian penyari, ditutup dan dibiarkan selama ; hari
terlindung dari *ahaya sambil sering diaduk. Setelah ; hari *ampuran tersebut diserkai,
diperas, di*u*i ampasnya dengan *airan penyari se*ukupnya hingga diperoleh 100
bagian. 7alu maserat dipindah dalam bejana tertutup dan dibiarkan di tempat sejuk,
terlindung dari *ahaya selama 2 hari, maserat disaring. 0emudian maserat disuling atau
diuapkan pada tekanan rendah pada suhu tidak lebih dari ;0
0
hingga konsistensi yang
dikehendaki. /aserat dipanasi pada suhu 60
0
untuk mengendapkan protein agar sediaan
tahan lama ")nie$, 166).
11
0euntungan dari metode ini yaitu unit alat yang dipakai sederhana, "hanya
dibutuhkan bejana perendam), biaya operasionalnya relati$ rendah. prosesnya relati$
hemat penyari, tanpa pemanasan. 0elemahan dari metode ini yaitu proses penyariannya
tidak sempurna, karena 4at akti$ hanya mampu terekstraksi sebesar ;0% saja, prosesnya
lama, butuh 1aktu beberapa hari "0usmardiyani dan %a1a1i, 1662).
2.&.2 S0r$#$#7 F$130$m$a
Sebelum melakukan isolasi terhadap suatu senya1a kimia yang diinginkan dalam
suatu tumbuhan maka perlu dilakukan identi$ikasi pendahuluan kandungan senya1a
metabolit sekunder yang ada pada masing-masing tumbuhan, sehingga dapat diketahui
kandungan senya1a yang ada se*ara kualitati$ dan mungkin juga se*ara kuantitati$
golongan senya1a yang dikandung oleh tumbuhan tersebut "(ar1is, 2000)
Skrining $itokimia merupakan langkah a1al yang dapat membantu untuk
memberikan gambaran tentang golongan senya1a yang terkandung dalam tanaman
yang sedang diteliti serta ada atau tidaknya senya1a kimia tertentu dalam tumbuhan
tersebut yang dapat dikaitkan dengan akti.itas biologinya. Se*ara umum dapat
dikatakan bah1a metodenya sebagian besar merupakan reaksi pengujian 1arna dengan
suatu pereaksi 1arna. "0ristanti dkk., 200!).
). #emeriksaan alkaloid
Sebanyak 2 m7 larutan ekstrak uji diuapkan diatas *a1an porselin hingga diperoleh
residu. 2esidu kemudian dilarutkan dengan ; m7 3+7 2%.7arutan yang didapat
kemudian di bagi ke dalam & tabung reaksi. ,abung pertama ditambahkan dengan asam
en*er yang ber$ungsi sebagai blanko. ,abung kedua ditambahkan pereaksi (ragendro$$
sebanyak & tetes dan tabung ketiga ditambahkan pereaksi /ayer sebanyak & tetes.
,erbentuknya endapan jingga pada tabung kedua dan endapan kuning pada tabung
ketiga menunjukkan adanya alkaloid "Earns1orth, 1655).
B. #emeriksaan saponin
Sebanyak 10 m7 larutan ekstrak uji dalam tabung reaksi diko*ok .ertikal selama 10
detik kemudian dibiarkan selama 10 detik.#embentukan busa setinggi 1-10 *m yang
stabil selama tidak kurang dari 10 menit, menunjukkan adanya saponin. #ada
penambahan 1 tetes 3+7 2%, busa tidak hilang "(epkes 2I, 166;).
+. #emeriksaan tanin dan poli$enol
12
Sebanyak & m7 larutan ekstrak uji dibagi kedalam & bagian yaitu tabung ), tabung
B, tabung +. ,abung ) digunakan sebagai blanko, tabung B direaksikan dengan larutan
besi "III) klorida 10%, 1arna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin
dan poli$enol, sedangkan pada tabung + hanya ditambahkan garam gelatin. )pabila
terbentuk endapan pada tabung + maka larutan ekstrak positi$ mengandung tanin
"2obinson, 1661@ /arliana dkk, 200;).
(. #emeriksaan steroid dan triterpenoid
#emeriksaan steroid dan triterpenoid dilakukan dengan reaksi 7iebermamn-
Bur*hard. Sebanyak 2 m7 larutan uji diuapkan dalam *a1an penguap. 2esidu
dilarutkan dengan 0,; m7 kloro$orm, kemudian ditambahkan 0,; m7 asam asetat
anhidrat. Selanjutnya ditambahkan 2 m7 asam sul$at pekat melalui dinding tabung.
,erbentuknya *in*in ke*oklatan atau .iolet pada perbatasan larutan menunjukkan
adanya triterpenoid, sedangkan bila mun*ul *i*in biru kehijauan menunjukkan adanya
steroid "+iulei, 16!').
0esulitan dalam skrining $itokimia adalah adanya reaksi positi$ palsu "false"positive
resulte), dimana komposisi *ampuran senya1a yang terkandung dalam tanaman dapat
memberikan hasil positi$ meskipun senya1a yang diuji tidak terdapat dalam tanaman
tersebut "0ristanti dkk, 200!).
2.&.8 E0'1ra0'$ 2a$r;-a$r
Fkstrasi pelarut merupakan suatu teknik dimana suatu larutan "biasanya dalam
bentuk air) dibuat bersentuhan dengan suatu pelarut kedua "biasanya organi*) yang pada
hakikatnya tak ter*ampurkan dengan pelarut pertama dan menimbulkan perpindahan
satu atau lebih 4at terlarut "solute) ke dalam pelarut kedua. "Basset , -.dkk, 166')
Fkstrasi pelarut digunakan sebagai *ara untuk pra perlakuan sampel atau clean up
sample untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang
mungkin menggangu pada saat kuanti$ikasi atau deteksi analit. (isamping itu, ekstrasi
pelarut juga digunakan untuk memekatkan analit yang ada dalam sampel dengan jumlah
ke*il sehingga tidak memungkinkan atau menyulitkan deteksi atau kuanti$ikasinya.
">andjar dan 2ohman,200)
=ntuk memahami prinsip-prinsip dasar ekstrasi, harus terlebih dahulu dibahas
berbagai istilah yang digunakan untuk menyatakan kee$ekti$an pemisahan. =ntuk suatu
1&
4at terlarut ) yang didistribusikan diantara dua $ase tak ter*ampurkan antara a dan b,
hukum distribusi "atau partisi) %ernst menyatakan bah1a, asal keadaan molekulnya
sama dalam kedua *airan dan temperature adalah konstan A
0onsentrasi 4at terlarut dalam pelarut a < M)Na < 0d
0onsentrasi 4at terlarut dalam pelarut b M)Nb
(imana 0d adalah sebuah tetapan yang dikenal sebagai koe$isien distribusi
"koe$isien partisi). 3ukum seperti ini, se*ara termodinamis tidaklah benar-benar tepat
"misalnya, tidak diperhitungkan akti.itas dari bebagai spesi itu dan karenanya
diharapkan hanya berlaku pada larutan en*er dimana angka banding akti.itas itu
mendekati satu), tetapi merupakan suatu pendekatan yang berguna. 3ukum ini dalam
bentuknya yang sederhana, tak berlaku bila spesi yang didistribusikan itu mengalami
asosiasi, disosiasi dalam salah satu $ase tersebut. #ada penerapan praktis ekstrasi pelarut
ini, kita terutama memperhatikan $raksi 4at terlarut total dalam $ase yang satu dengan
$ase yang lainnya, tak peduli bagaimanapun *ara-*ara disosiasi, asosiasi atau
interaksinya dengan spesi-spesi lain yang terlarut. =ntuk memudahkan, diperkenalkan
istilah angka banding distribusi "() atau koe$isien ekstraksi "F).
"+))b
"+))a
(=
(imana lambang +) menyatakan konsentrasi ) dalam bentuknya seperti yang
telah ditetapkan se*ara analitis.
F$isiensi proses ekstrasi tergantung pada nilai distribusinya "() dan tergantung
juga pada .olume relati.e kedua $ase. (engan menggunakan ekstrasi, banyaknya analit
yang terekstrasi dapat dihitung dengan rumus berikut A
.
N
Jorg
JaO
M(
100(
F
+
=
Jorg dan JaO masing-masing merupakan banyaknya .olume $ase organi* dan $ase air
yang digunakan.( merupakan rasio distribusi. #ada analit dengan nilai ( yang ke*il,
adanya ekstrasi yang berulang "bertingkat) akan meningkatkan e$isiensi ekstrasi. 2umus
yang digunakn untuk ekstrasi bertingkat adalah A
n
N
aO) J Jorg "(
aO J
M aO + aO)n "+
+
=
(imana + aO A banyaknya analit dalam $ase air mula-mula
1'
"+aO)n A banyaknya analit dalam $ase air setelah n kali ekstrasi
J org A banyaknya .olume $ase organi*
J aO A banyaknya .olume $ase *air
n A banyaknya "$rekuensi) ekstrasi
0ebanyakan ekstrasi dilakukan dengan menggunakan *orong pisah dalam 1aktu
beberapa menit. )kan tetapi untuk e$ekti$itas ekstrasi analit dengan rasio distribusi yang
ke*il "P1), ekstraksi hanya dapat di*apai dengan mengenakan pelarut baru pada larutan
sampel se*ara terus menerus. 3al ini dapat dilakukan dengan re$luks menggunakan alat
yang digunakan khusus.
#elarut yang dipakai untuk ekstrasi pelarut adalah A mempunyai kelarutan yang
rendah dalam air "P10%), dapat menguap sehingga memudahkan penghilangan pelarut
organik setelah dilakukan ekstraksi, dan mempunyai kemurnian yang tinggi untuk
meminimalkan adanya kontaminasi sampel. "Basset,-.dkk, 166')
2.&.& Kr3ma137raf$ La:$' T$:$'(KLT)
0romatogra$i lapis tipis digunakan untuk pemisahan se*ara *epat, dengan
menggunakan 4at penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rata pada
lempeng ka*a. 7empeng yang dilapis dapat dianggap sebagai Hkolom kromatogra$i
terbukaG dan pemisahan dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian, atau
gabungannya, tergantung dari jenis 4at penyerap dan *ara pembuatan lapisan 4at
penyerap dan jenis pelarut. 3arga 2$ yang diperoleh kromatogra$i lapis tipis tidak tetap,
karena itu lempeng yang sama disamping kromatogram 4at yang diuji perlu dibuat
kromatogram 4at pembanding kimia. #erbandingan ukuran ber*ak se*ara .isual atau
densitometry dapat digunakan untuk memperkirakan kadar "(epkes 2I, 166).
Eenomena yang terjadi pada 07, adalah berdasarkan pada prinsip adsorpsi.
Setelah sampel ditotolkan di atas $asa diam, senya1a-senya1a dalam sampel akan
terelusi dengan ke*epatan yang sangat bergantung pada si$at senya1a-senya1a tersebut
"kemampuan terikat pada $asa diam dan kemampuan larut dalam $asa gerak), si$at $asa
diam "kekuatan elektrostatis yang menarik senya1a di atas $asa diam) dan si$at $asa
gerak "kemampuan melarutkan senya1a). #ada 07,, se*ara umum senya1a-senya1a
yang memiliki kepolaran rendah akan terelusi lebih *epat daripada senya1a-senya1a
polar karena senya1a polar terikat lebih kuat pada bahan silika yang mengandung
1;
silanol "SiD3
2
) yang pada dasarnya memiliki a$initas yang kuat terhadap senya1a polar
"0ristanti dkk., 200!).
#arameter pada 07, yang digunakan untuk identi$ikasi adalah nilai 2$. 2$
dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap jarak ujung $ase geraknya. Eaktor
retardasi solut "2$) dide$inisikan sebagaiA
%ilai maksimum 2$ adalah 1 dan ini di*apai ketika solut mempunyai
perbandingan distribusi "() dan $aktor retensi "kQ) sama dengan 0 yang berarti solut
bermigrasi dengan ke*epatan yang sama dengan $ase gerak. %ilai minimum 2$, adalah 0
dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik a1al di permukaan $ase diam
">andjar dan 2ohman, 200).
2.&.! Kr3ma137raf$ K3(3m Lamba1
#ada proses pemisahan dengan 0romatogra$i kolom lambat, *ampuran yang akan
dipisahkan diletakkan pada bagian atas kolom adsorben yang berada dalam suatu
tabung. #elarut sebagai $ase gerak karena gaya berat atau dengan tekanan tertentu
dibiarkan mengalir melalui kolom memba1a serta pita linarut yang bergerak dengan
ke*epatan berbeda. 7inarut yang telah memisah dikumpulkan berupa $raksi yang keluar
dari bagian ba1ah kolom sehingga metode ini merupakan kromatogra$i elusi. (alam
pemisahan ini interaksi antara larutan senya1a yang dianalisis dengan $ase diam dapat
terjadi dengan *ara interaksi langsung antara senya1a dengan permukaan $ase diam atau
$ase stationer hanya bersi$at menyangga *airan kedua sehingga pemisahan terjadi
berdasarkan partisi antara dua $ase *airan. "0usmardiyani dan %a1a1i, 1662).
Eaktor yang harus diperhatikan dalam pemilihan jenis adsorben antara lain ialah
si$at tidak boleh bereaksi dengan senya1a yang akan dianalisis, tidak bersi$at sebagai
katalis yang menyebabkan dekomposisi 4at, tidak larut dalam pelarut yang digunakan,
sedapat mungkin tidak ber1arna atau tidak mengganggu pengamatan hasil pemisahan
4at ber1arna, mempunyai si$at yang stabil selama berlangsungnya proses pemisahan
dan mempunyai ukuran partikel yang seragam. "0usmardiyani dan %a1a1i, 1662).
#ada kromatogra$i kolom, kolom yang digunakan berupa tabung yang biasanya
terbuat dari ka*a yang dilengkapai dengan kran jenis tertentu pada bagian ba1ahnya
15
untuk mengatur aliran pelarut. #ada bagian ba1ah tabung biasanya segumpal ke*il 1ol
ka*a atau kapas untuk menahan adsorben. =kuran kolom sangat beragam, umumnya
perbandingan panjang terhadap diameter bagian dalam kolom adalah 10 kalinya atau
bisa sampai 100 kalinya, tergantung derajat kesulitan proses pemisahan. "0usmardiyani
dan %a1a1i, 1662).
#enyiapan kolom dapat dilakukan dengan dua *ara, yaitu *ara kering dan *ara
basah. #erbedaan kedua *ara ini yaitu pada *ara kering adsorben langsung dimasukkan
dalam kolom sedangkan pada *ara basah dibuat terlebih dahulu *ampuran adsorben
dengan $ase gerak yang digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom ">andjar dan
2ohman, 200).
2.&.< R)0r$'1a($'a'$
0ristalisasi atau sering disebut rekristalisasi adalah teknik permurnian padatan-
padatan organik yang mempunyai ke*enderungan membentuk kisi-kisi kristal yang
dilakukan dengan *ara mengkristalkan kembali 4at tersebut setelah dilarutkan dalam
pelarut yang sesuai. #rinsip umum yang berlaku dalam proses kristalisasi adalah
penurunan temperatur yang akan menyebabkan perbedaan kelarutan antara 4at yang
dimurnikan dengan 4at pen*emarnya dan hanya molekul-molekul yang sama yang
mudah masuk ke dalam struktur lattik kristalnya, sedangkan molekul-molekul lain atau
pengotor tetap di dalam larutan atau berada di luar kristalnya. /etode ini sederhana,
material padatan ini terlarut dalam pelarut yang *o*ok pada suhu tinggi "pada atau dekat
titik didih pelarutnya) untuk mendapatkan larutan jenuh atau dekat jenuh. 0etika larutan
panas perlahan didinginkan, kristal akan mengendap karena kelarutan padatan biasanya
menurun bila suhu diturunkan. (iharapkan bah1a pengotor tidak akan mengkristal
karena konsentrasinya dalam larutan tidak terlalu tinggi untuk men*apai jenuh.
"3ostettmann, 166;).
0ristal dapat terbentuk karena suatu larutan dalam keadaan atau kondisi le1at
jenuh "supersaturated). Rang dimaksud dengan kondisi le1at jenuh adalah kondisi
dimana pelarut "sol.en) mengandung 4at terlarut "solute) melebihi kemampuan pelarut
tersebut untuk melarutkan solute pada suhu tetap. 0ondisi tersebut terjadinya karena
pelarut sudah tidak mampu melarutkan 4at terlarutnya, atau jumlah 4at terlarut sudah
melebihi kapasitas pelarut. Sehingga kita dapat memaksa agar kristal dapat terbentuk
1
dengan *ara mengurangi jumlah pelarutnya, sehingga kondisi le1at jenuh dapat di*apai.
proes kristalisasi dimualai dengan menambahkan senya1a yang akan dimurnikan
dengan pelarut panas sampai kelarutan senya1a tersebut berada pada le.el super jenuh.
#ada keadaan ini, bila larutan tersebut didinginkan, maka mlekul-molekul senya1a
terlarut akan saling menempel, tumbuh menjadi kristal-kristal yang akan mengendap di
dasar 1adah. Sementara kotoran-kotoran yang terlarut tidak ikut mengendap.
#embentukkan kristal itu sendiri terdiri dari dua tahap. ,ahap pertama adalah
nukleasi primer atau pembentukkan inti, yaitu tahap dimana kristal-kristal mulai tumbuh
namun belum mengendap. ,ahap ini membutuhkan keadaan superjenuh dari 4at terlarut.
Saat larutan didinginkan, pelarut tidak dapat HmenahanG semua 4a-4at terlarut, akibatnya
molekul-molekul yang lepas dari pelarut saling menempel, dan mulai tumbuh menjadi
inti kristal. Semakin banyak inti-inti yang bergabung, maka akan semakin *epat pula
pertumbuhan kristal tersebut. ,ahap kedua setelah nukleasi primer adalah nukleasi
sekunder. #ada tahap ini petumbuhan kristal semakin *epat, yang ditandai dengan saling
menempelnya inti-inti menjadi kristal-kristal padat.
2.&.9 KLT;S:)01r3f313+)#'$13m)1r$
#enggunaan kromatogra$i sangat membantu dalam pendeteksian senya1a
metabolit sekunder dan dapat dijadikan sebagai patokan untuk proses pengerjaan
berikutnya dalam menentukan struktur senya1a. 0romatogra$i lapis tipis merupakan
metode pemisahan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh
$ase diam di ba1ah gerakan pelarut pengembang atau pelarut pengembang *ampur
"/ulja dan Suharman, 166;). 07, merupakan bentuk kromatogra$i planar selain
kromatogra$i kertas, dengan $ase diam berupa lapisan yang seragam "uni$orm) pada
permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng ka*a, plat aluminium, atau plat
plastik. Ease gerak dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak disepanjang $ase
diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan se*ara menaik "ascending) atau
karena pengaruh gra.itasi pada pengembangan se*ara menurun "descending) ">andjar
dan 2ohman, 200). /etode ini dapat digunakan untuk memisahkan senya1a-senya1a
yang tidak .olatil atau senya1a yang si$at .olatilitasnya rendah, senya1a dengan
polaritas rendah hingga tinggi, bahkan untuk memisahkan senya1a-senya1a ionik
"3ahn dan (einstrop, 200).
1!
>ambar 2.;. Bejana berisi plat 07, sebelum dan sesudah pengembangan
"Stahl, 16!;)
#rinsip dari pemisahan komponen senya1a kimia dengan 07, didasarkan pada
perbedaan laju migrasi masing-masing molekul senya1a diantara $ase diam dan $ase
gerak yang dipengaruhi oleh berbagai $aktor seperti adsorpsiSpartisi pada $ase diam,
kelarutan dalam *airan partisi dan pelarut pembilas, serta polaritas dari *airan partisi
dan pelarut "Satiadarma, 200').
Ease gerak atau pelarut pengembang akan bergerak naik sepanjang $ase diam
karena adanya gaya kapilaritas pada sistem pengembangan menaik #ascending$.
#emilihan $ase gerak baik untuk ,7+ maupun 3#,7+ didasarkan pada keterpisahan
senya1a-senya1a dalam analit yang didasarkan pada nilai 2$ atau h2$ "1002$). %ilai
2$ diperoleh dari membagi jarak pusat kromatogra$ik dari titik a1al dengan jarak
pergerakan pelarut dari titik a1al. #enghitungan nilai h2$ ditunjukkan dengan
persamaan diba1ah ini.
Ease gerak pada 07, dapat dipilih dari pustaka, tapi lebih sering dengan
men*oba-*oba karena 1aktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling
sederhana ialah *ampuran dua pelarut organik karena daya elusi *ampuran kedua
pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi se*ara
optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi $ase
gerakA
16
1. Ease gerak harus memiliki kemurniaan yang sangat tinggi karena 07,
merupakan teknik yang sensiti$.
2. (aya elusi $ase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga 2$ terletak
antara 0,2 sampai 0,! untuk memaksimalkan pemisahan.
&. =ntuk pemisahan dengan menggunakan $ase diam polar seperti silika gel,
polaritas $ase gerak akan menentukan ke*epatan migrasi solut yang berarti juga
menentukan nilai 2$. #enambahan pelarut yang bersi$at sedikit polar seperti
dietil eter kedalam pelarut non polar seperti metil ben4en akan meningkatkan
harga 2$ se*ara signi$ikan.
'. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan *ampuran pelarut
sebagai $ase geraknya, seperti *ampuran air dan methanol dengan perbandingan
tertentu. #enambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan
meningkatkan solut-solut yang bersi$at basa dan asam.
">andjar dan 2ohman, 200)
0eterulangan harga 2$ sangat dipengaruhi oleh perbedaan kondisi proses
pemisahan senya1a tertentu dibandingkan kondisi yang telah dibakukan sekali.
/eskipun dalam hal ini harga 2$ bukanlah harga absolut seperti pada konstanta $isik
lain "titik didih, titik lebur, dll). Beberapa $aktor yang mempengaruhi penentuan harga
2$ ini antara lain kualitas adsorben "ukuran partikel, p3 dan kemurnian), ketebalan
lapisan adsorben "untuk ketebalan 0,2;-& mm), kejenuhan bejana, teknik
pengembangan, suhu "mempengaruhi kapasitas adsorpsi dari adsorben sehingga suhu
pada saat pengukuran 2$ harus di*antumkan), dan kualitas pelarut "kromatogram bisa
sangat beragam untuk kualitas pelarut yang berbeda, karena itu untuk penentuan harga
2$ harus selalu digunakan pelarut segar) "0usmardiyani dan %a1a1i, 1662).
=ntuk analisis kuantitati$ pada 07, dapat digunakan dua *ara. #ertama, ber*ak
pada plat 07, diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau
dengan teknik densitometri. +ara kedua adalah dengan mengerok ber*ak lalu
menetapkan kadar senya1a yang terdapat dalam ber*ak tersebut dengan metode analisis
yang lain, misalkan dengan metode spektro$otometri ">andjar dan 2ohman, 200).
)nalisis kuantitati$ dari suatu senya1a yang telah dipisahkan dengan 07,
biasanya dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng 07, "atau se*ara in
20
situ). (ensitometer dapat bekerja se*ara serapan atau $louresensi, dimana kebanyakan
densitometer mempunyai sumber *ahaya yang diarahkan menuju monokromator "untuk
memilih rentang panjang gelombang yang *o*ok antara 200-!00), sistem untuk
mem$okuskan sinar pada lempeng, pengganda $oton, dan rekorder ">andjar dan
2ohman, 200).
(ensitometer atau Thin %ayer Chromato &canner makin banyak digunakan se*ara
luas. (ensitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan interaksi
radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada 07,. Interaksi radiasi
elektromagnetik dengan noda pada plat 07, yang ditentukan adalah absorpsi, transmisi,
pantulan "re$leksi) pendar $luor atau pemadaman pendar $luor dari radiasi semula.
(ensitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitati$ analit-analit dengan kadar
yang sangat ke*il yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan 07, "/ulja
dan Suharman, 166;).
#rinsip kerja spektro$otodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi
elektromagnetik dari sinar =J-Jis dengan analit yang merupakan noda pada plat.
2adiasi elektromagnetik yang datang pada plat diabsorpsi oleh analit, ditransmisi atau
diteruskan jika plat yang digunakan transparan. 2adiasi elektromagnetik yang
diabsorpsi oleh analit atau indikator plat dapat diemisikan berupa $louresensi dan
$os$oresensi "Sherma and Eried 166'). #emadaman $louresensi indikator E-2;' dapat
terjadi akibat adanya noda pada plat sehingga teramati di ba1ah lampu =J sebagai
noda hitam "/ulja dan Suharman, 166;).
0ebanyakan densitometer mempunyai sumber *ahaya monokromator "rentang
panjang gelombang 160 sSd !00 nm) untuk memilih panjang gelombang yang *o*ok,
sistem untuk mem$okuskan sinar pada lempeng, pengganda $oton, dan rekorder
">andjar dan 2ohman, 200). Dutput detektor dikon.ersikan menjadi signal dan
diampli$ikasi. Sebagai tambahan untuk scanning instrumen densitometer dilengkapi
dengan digital kon.erter, dan data akan diproses se*ara digitalisasi oleh komputer.
)nalis dapat bekerja dengan densitometri pada jangkauan panjang gelombang 160
sSd !00 nm. ,erjadinya penyimpangan baseline yang disebabkan oleh .ariasi ketebalan
dan ketidakseragaman lapisan pada densitometer sangat ke*il dan le.el signalnya relati$
tinggi.
21
)nalisis 07, dengan menggunakan spektro$otodensitometri dapat dilakukan
dengan menggunakan mode absorbsi atau $louresensi. #ada umumnya yang paling
sering digunakan adalah mode absorbsi dengan menggunakan sinar =J pada L 160-&00
nm. Dleh karena kebanyakan plat 07, menggunakan silika gel yang bersi$at opaue
"tidak tembus *ahaya), maka pengukuran dengan mode transmitan tidak *o*ok
digunakan. #enentuan absorpsi analit pada plat 07, opaue didasarkan pada rasio
intensitas antara radiasi elektromagnetik yang datang dengan intensitas radiasi
elektromagnetik yang dipantulkanSdire$leksikan. #engukuran $louresensi merupakan
metode pengukuran langsung yang peka untuk senya1a dalam daerah ultra.iolet dapat
ditentukan melalui emisi penyinaran sekunder. Intensitas *ahaya $louresensi setelah
dipan*arkan melalui suatu monokromator, diukur se*ara selekti$ dalam kondisi yang
sesuai, berbanding lurus dengan berat senya1a yang ada dalam noda "Sherma and Eried,
166').
>ambar 2.5. Skema spektro$otodensitometer radiasi berkas ganda dan tunggal
"/ulja dan Suharman, 166;)
0eteranganA 7 #light$@ S7 #slit$@ /+ "monokromator)@ #/ #photomultiplier$@ EE #filter
fluorescens$@ # "plat)@ S+S #sistem for circular scanning$.
Beberapa keunggulan metode kromatogra$i lapis tipis atau lebih dikenal dengan
,7+ #thin layer chromatography$ maupun kromatogra$i lapis tipis kinerja tinggi yang
dikenal dengan 3#,7+ #high performance thin layer chromatography$ dengan
kombinasi spektro$otodensitometri dibandingkan dengan metode 3#7+ maupun >+
"Sherma and Eried, 1665) diantaranya adalahA
1. +epat, karena penggunaannya biasanya tidak membutuhkan preparasi khusus.
2. (apat digunakan untuk analisis sampel dengan jumlah men*apai &0 sampel pada
satu pelat dan dapat memisahkan sampel-sampel tersebut se*ara bersamaan.
&. )danya instrumen s*anning modern yang dikontrol dengan komputer, instrumen
aplikasi sampel semi otomatis maupun otomatis, serta instrumen pengembangan
22
dapat membantu memberikan akurasi dan presisi yang setara dengan metode
3#7+ maupun >+.
'. ,erdapat berbagai pilihan pelarut pengembang "$ase gerak) untuk memisahkan
sampel seperti basa, asam, aOua-organik.
;. Setiap sampel dapat dipisahkan dengan pelat baru sehingga dapat menghindari
masalah kontaminasi silang sampel dan tidak perlu melakukan regenerasi sorben.
5. (alam hal konsumsi pelarut pengembang, metode ,7+ maupun 3#,7+
tergolong hemat, sehingga dapat meminimalkan biaya untuk pembelian pelarut.
. 0ombinasi ,7+S3#,7+ dengan densitometer adalah dapat dilakukan
pengulangan pada tahap s*anning tanpa mengkha1atirkan gangguan pada proses
lanjutan, ini dikarenakan semua proses berjalan se*ara independen.
BAB III
METODE
8. A(a1 +a# Ba*a#
8.. A(a1
- ,empat toples ka*a
- 0ertas saring
- #ipet ukur
- >elas ukur'
2&
- 0ain kasa
- Batang pengaduk,
- Botol .ial, ,
- 7abu ukur,
- Botol semprot,
- >elas pengembang 07,
- Spektro$otodensitometer,
- #ipet tetes,
- +orong pisah
- Stati$,
- Frlenmeyer'
- Baker glass,
- 2otae.aporator,
- +a1an penguap,
- (ot plate'
- 0olom kromatogra$i
8..2 Ba*a#
- Serbuk kering Andrographis paniculata
- etanol
- n-he:an
- Ftil )setat
- )Ouadest (/
- /etanol pro analis
- 0loro$orm pro analis
- #lat 07, >E 2;0
- 3
2
SD
'
8.2 Pr3')+ur K)r=a
8.2. Pr3')+ur Ma')ra'$
(itimbang sebanyak 100 gram serbuk simplisia sambiloto. 0emudian dimasukkan
ke dalam bejana maserasi, ditambah sebanyak ;00 m7 etanol 65%, kemudian diaduk
2'
serta didiamkan selama satu malam. Selanjutnya disaring, $iltrat disimpan dan ampas
diremaserasi dengan etanol 65% sebanyak 2;0 m7, diaduk, kemudian didiamkan
selama satu hari dengan sesekali diaduk. Selanjutnya disaring, $iltrat ditampung dan
ampas diremaserasi kembali dengan 2;0 m7 etanol 65%, diaduk. (idiamkan sehari dan
sesekali diaduk. Selanjutnya disaring, semua $iltrat ditampung dan diuapkan
pelarutnya.
8.2.2 Pr3')+ur S0r$#$#7 F$130$m$a
- #embuatan 7arutan =ji
Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 2; m7 metanol.
- =ji untuk Steroid dan ,riterpenoid
#emeriksaan steroid dan triterpenoid dilakukan dengan reaksi 7iebermann-
Bur*hard. Sebanyak 2 ml larutan uji diuapkan dalam *a1an penguap. 2esidu
dilarutkan dengan 0,; ml kloro$orm, kemudian ditambahkan 0,; ml asam asetat
anhidrat. Selanjutnya ditambahkan 2 ml asam sul$at melalui dinding tabung.
,erbentuknya *in*in ke*oklatan atau .iolet pada perbatasan larutan
menunjukkan adanya triterpenoid, sedangkan bila mun*ul *in*in biru kehijauan
menunjukkan adanya steroid.
- =ji untuk Saponin
Sebanyak 10 ml larutan ekstrak uji dalam tabung reaksi diko*ok .ertikal
selama 10 detik kemudian dibiarkan selama 10 detik. #embentukkan busa
setinggi 1-10 *m yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit, menunjukkan
adanya saponin. #ada penambahan 1 tetes 3+l 2 %, busa tidak hilang.
- =ji untuk )lkaloid
Sebanyak 1! ml larutan ekstrak uji diuapkan di atas *a1an porselen hingga
didapatkan residu. 2esidu kemudian dilarutkan dengan 5 ml 3+7 2 %. 7arutan
yang didapat kemudian dibagi ke dalam ' tabung reaksi. ,abung pertama
ditambahkan pereaksi Iagner sebanyak & tetes. ,abung kedua ditambahkan
pereaksi /ayer sebanyak & tetes. ,abung ketiga ditambahkan pereaksi 3ager
sebanyak & tetes. ,abung keempatditambahkan pereaksi (ragendor$$ sebanyak &
tetes. #ada pereaksi Iigner terbentuknya endapan putih. #ada pereaksi /ayer
2;
terbentuknya endapan merah ke*oklatan. #ada pereaksi 3ager terbentuknya
endapan kuning. #ada pereaksi (ragendro$$ terbentuknya endapan *oklat muda
sampai kuning.
8.2.8 Pr3')+ur P)m$'a*a# (:ur$f$0a'$)
Fkstrak kental disisihkan 10 mg. Fkstrak kental sisanya kemudian di*u*i dengan
n-heksan dengan perbandingan 1A20. Fkstrak tidak larut disisihkan se*ukupnya. Sisanya
di*u*i kembali dengan etil asetat dengan perbandingan 1A1dan diambil $ase etil
asetatnya. Fkstrak larut etil asetat dan yang tidak larut etil asetat diuapkan pelarutnya
hingga terbentuk ekstrak kental.
8.2.& KLT Ha'$( P)m$'a*a#
#lat 07, )l Silika gel >E 2;' disiapkan dan dipotong ' *m : 10 *m, ditandai
dengan batas atas 0,; *m, batas ba1ah 1 *m, dan batas kiri-kanan 1 *m serta jarak antar
totolan 0,5 *m. #lat di*u*i dengan metanol kemudian diakti.asi pada suhu 110T+
selama 1; menit. +hamber "bejana pengembang kromatogra$i) dijenuhkan dengan $ase
gerak *ampuran kloro$ormAmetanol "6A1 .S.) sebanyak 10 m7. 0emudian ekstrak kental
sambiloto hasil maserasi, ekstrak tidak larut etil asetat dan ekstrak larut etil asetat
masing-masing dilarutkan 1 m7 metanol lalu ditotolkan masing-masing sebanyak 5 U7.
Standar androgra$olid ditotolkan pada plat 07, sebanyak 5 U7 dengan jarak antar
ber*ak 0,5 *m. #lat dimasukkan ke dalam *hamber yang telah dijenuhkan, dan dielusi
dengan jarak pengembangan !,; *m. Setelah dielusi, plat 07, dikeringkan selama 10
menit dengan dryer dan diamati diba1ah sinar =J 2;' nm dan &55 nm.
Bila masih banyak pengotor yang terdapat pada plat setelah pemisahan, maka
dilakukan pen*u*ian kembali dengan air panas pada ekstrak yang larut etil asetat hingga
1arnanya bening. Fkstrak yang tidak larut air panas dan yang larut air panas diuapkan
pelarutnya hingga terbentuk ekstrak kental kemudian di 07, kembali untuk melihat
metode yang sama. =kuran plat 07, ' : 10 *m. #ada plat ditotolkan ekstrak tidak larut
air panas, ekstrak larut air panas dan standar androgra$olid masing-masing sebanyak 5
U7. (ilihat hasil pemisahannya pada =J 2;' nm dan &55 nm.
8.2.! Pr3')+ur P)m$'a*a# K3(3m
25
0olom disiapkan dengan bagian ba1ah diisi dengan glass )ool dan dimasukkan
silika gel 50 hingga 10 *m dan ditimbang bobot silika gel 50 tersebut. 0olom diisi
dengan kloro$orm hingga 10 *m. Silika gel 50 yang telah ditimbang dibuat bubur silika
dengan kloro$orm. Bubur silika dimasukkan ke dalam kolom dengan hati-hati se*ara
kontinyu bergantian dengan memasukkan kloro$orm dengan pipet tetes pada dinding
kolom untuk men*egah terbentuknya lapisan-lapisan. 0eran pada bagian ba1ah kolom
dibuka. Ease gerak kloro$orm ditampung digunakan lagi untuk menyiapkan kolom.
0olom diekuilibrasi dengan kloro$orm sebanyak 20 ml dan didiamkan semalam.
Eraksi dari pemisahan 1 "bagian tidak larut air) disisihkan 10 mg, sisanya
ditambahkan metanol hingga larut. 7arutan $raksi dimasukkan ke bagian atas kolom
se*ara hati-hati dengan pipet tetes melalui dinding kolom "agar kolom silika tidak
rusak). (ieluasi dengan pelarut kloro$orm sebanyak10 ml. Eraksi ditampung dengan
.ial. 0emudian dieluasi kembali dengan 10 m7 metanol. Eraksi kloro$orm dan metanol
yang diperoleh kemudian diuapkan dan ditimbang.
8.2.< KLT Ha'$( P)m$'a*a# 2
#lat 07, )l Silika gel >E 2;' disiapkan dan dipotong ' *m : 10 *m, dengan
batas atas 0,; *m, batas ba1ah 1 *m, dan batas kiri-kanan 1 *m serta jarak antar totolan
0,5 *m. #lat di*u*i dengan metanol kemudian diakti.asi pada suhu 110T+ selama 1;
menit. Fkstrak etil asetat terpuri$ikasi "bagian tidak larut air), $raksi kloro$orm dan
$raksi metanol yang telah diuapkan dilarutkan dengan metanol. +hamber "bejana
pengembang kromatogra$i) dijenuhkan dengan $ase gerak *ampuran kloro$ormAmetanol
"6A1 .S.) sebanyak 10 m7. /asing-masing ditotolkan pada plat sebanyak ' U7. Standar
androgra$olid ditotolkan pada plat sebanyak ' U7. #lat dimasukkan ke dalam *hamber
yang telah dijenuhkan, dan dielusi dengan jarak pengembangan !,; *m. Setelah dielusi,
plat 07, dikeringkan selama 10 menit dengan dryer dan diamati diba1ah sinar =J 2;'
nm dan &55 nm.
8.2.9 KLT Ha'$( P)m$'a*a# 8
(isiapkan standar androgra$olid, kristal yang terbentuk dari $ase kloro$orm dan
$raksi kloro$orm masing-masing sebagai sampel 1, 2 dan &. #lat 07, >E2;' dipotong
dengan panjang ; *m dan lebar & *m. plat kemudian di*u*i dengan methanol
2
selanjutnya diakti.asi pada suhu 110
0
+ selama &0 menit. Ease gerak dibuat dengan
menggunakan *ampuran pelarut kloro$om methanol "6A1) sebanyak 10 ml dan
selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan *hamber. Selama proses penjenuhan
*hamber, dilakukan penotolan sampel pada plat yang telah diakti.asi dengan jarak
penotolan 0, *m antar sampel. #lat yang telah ditotol kemudin dieluasi dengan jarak
elusi &,; *m. plat dikeringkan dengan *ara diangin-anginkan kemudian dideteksi pada
=J 2;' nm dan &55 nm. (ihitung nilai 2$ masing-masing spot yang terdeteksi pada
tiap sampel.
8.2./ R)0r$'1a($'a'$
(isipkan kristal yang diperoleh dari $ase kloro$orm hasil kromatogra$i kolom
kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan ; ml metanol. ,abung
dipanaskan di atas penangas air hingga kristal larut seluruhnya dan .olume pekarut
berkurang V 1S& nya. 7arutan kemudian disaring dan didinginkan perlahan pada suhu
ruang. 7arutan yang telah dingin kemudian dimasukkan ke dalam lemari pendingin
selama 2' jam hingga terbentuk kristal kembali.
8.2.9 I+)#1$f$0a'$ G3(3#7a# Ka#+u#7a# K$m$a D)#7a# KLT D)#'$13m)1)r
#lat 07, Silika gel >E 2;' disiapkan dan dipotong dengan ukuran 2 : 10 *m dan
diberi batas atas 0,; *m, batas ba1ah 1 *m, dan batas kiri-kanan 1 *m. +hamber "bejana
pengembang kromatogra$i) dijenuhkan dengan $ase gerak *ampuran kloro$ormAmetanol
"6A1 .S.) sebanyak 10 m7. 0ristal yang diperoleh dilarutkan dengan ; m7 metanol, lalu
masing-masing ditotol pada plat sebanyak 5 U7. #lat dimasukkan ke dalam *hamber
yang telah dijenuhkan, dan dielusi dengan jarak pengembangan !,; *m. Setelah dielusi,
plat 07, dikeringkan dengan *ara diangin-anginkan dan diamati diba1ah sinar =J 2;'
nm dan &55 nm. #lat dipindai dengan densitometer pada panjang gelombang 200-'00
nm. Selanjutnya dilakukan pen*o*okan spectrum dan nilai 2$ dengan pustaka dan
reference data bank yang terdapat pada komputer untuk mengetahui golongan
kandungan kimia yang terdapat pada $raksi.
2!
BAB I>
HASIL
&.. Ma')ra'$
,abel 1. 3asil #engamatan /aserasi herba sambiloto
26
Da1a "um(a* .ar#a
Eiltrat I 20 m7 3ijau tua WWW
Eiltrat II 22; m7 3ijau tua WW
Eiltrat III 2;2 m7 3ijau tua W
,otal Eiltrat ' m7
Bobot *a1an 5,'6&1 gram
Bobot *a1an X
ekstrak
56,6!!& gram
Bobot ekstrak 2,'6 gram
W < ,inggat kepekatan 1arna.
%2endemen <
<
< 2,'6 %
&.2 S0r$#$#7 F$130$m$a
a. =ji Saponin
3asil negati$ "-), larutan ber1arna hijau tanpa busa.
b. =ji Steroid dan ,riterpenoid
- Steroid
3asil negati$ "-) tidak terbentuk *in*in ber1arna biru kehijauan.
- ,riterpenoid
3asil positi$ "X) terbentuk *in*in ke*oklatan pada pembatas larutan.
*. =ji ,anin
3asil negati$ "-) tidak terbentuk endapan ber1arba putih.
d. =ji alkaloid
- #ereaksi Iigner
3asil negati$ "-), larutan ber1arna bening tidak terdapat endapan ber1arna
merah ke*oklatan.
- #ereaksi /ayer
3asil negati$ "-), larutan ber1arna bening tidak terdapat endapan putih.
&0
- #ereaksi 3ager
3asil negati$ "-), larutan ber1arna kuning muda tidak terdapat endapan
ber1arna kuning.
- #ereaksi (ragendro$$
3asil negati$ "-), larutan ber1arna kuning tidak terdapat endapat ber1arna
*oklat muda atau kuning.
&.8 P)m$'a*a# (:ur$f$0a'$)
#en*u*ianA
a. -umlah .olume %-3eksan yang diperlukan yaitu 1,2; 7
b. -umlah .olume etil asetat yang diperlukan yaitu '00 m7
*. -umlah .olume air panas yang diperlukan yaitu 100 m7
&.& KLT Ha'$( P)m$'a*a#
,abel 2. 3arga 2$ 3asil07, #en*u*ian %-heksan dan etil asetat
U> 2!& #m U> 8<< #m
Fra0'$ Fra0'$
&! , 0
*m !,;
*m &,2
1 Spot = = 1' , 0
*m !,;
*m 1,2
1 Spot = =
5 , 0
*m !,;
*m ;,1
2 Spot = =
Fra0'$ 2
&1
Fa0'$ 2
1; , 0
*m !,;
*m 1,&
1 Spot = =
&! , 0
*m !,;
*m &,2
1 Spot = =
Fra0'$ 8
5 , 0
*m !,;
*m ;,1
2 Spot = = 1; , 0
*m !,;
*m 1,&
1 Spot = =
Fra0'$ 8
&! , 0
*m !,;
*m &,2
1 Spot = =
Fra0'$ &
Fra0'$ &
1; , 0
*m !,;
*m 1,&
1 Spot = =
&! , 0
*m !,;
*m &,2
1 Spot = =
51 , 0
*m !,;
*m ;,2
2 Spot = =
,abel &. 3arga 2$ 3asil 07, 3asil #en*u*ian )ir #anas
U> 2!& #m U> 8<<#m
15 , 0
*m !,;
*m 1,'
1 Spot = =
,idak terlihat terbentuk spot yang
ber$luoresensi
&.! P)m$'a*a# +)#7a# Kr3ma137raf$ K3(3m
,abel '. Eraksi hasil pemisahan dengan kromatogra$i kolom
N3. Fra0'$ .ar#a
1 0loro$om ber1arna hijau pekat kehitaman
2 /etanol I ber1arna *oklat kehitaman
8 /etanol II ber1arna hijau ke*oklatan
&.< KLT Ha'$( P)m$'a*a# 2
,abel ;. 3arga 2$ 3asil 07, pemisahan 2
U> 2!& #m U> 8<< #m
&2
Fra0'$ (K(3r3f3rm)
'2 , 0
*m !,;
*m &,5
1 Spot = =
& , 0
*m !,;
5,2*m
2 Spot = =
6; , 0
*m !,;
!,1*m
& Spot = =
Fa0'$ 2 (M)1a#3( I)
'2 , 0
*m !,;
*m &,5
1 Spot = =
2 , 0
*m !,;
*m 5,1
2 Spot = =
6; , 0
*m !,;
*m !,1
& Spot = =
Fra0'$ 8
'' , 0
*m !,;
*m &,
1 Spot = =
Fra0'$ (K(3r3f3rm)
1' , 0
*m !,;
*m 1,2
1 Spot = =
2! , 0 , 0
*m !,;
*m 2,'
1 Spot = =
Fra0'$ 2 (M)1a#3( I)
1& , 0
*m !,;
*m 1,1
1 Spot = =
16 , 0
*m !,;
*m 1,5
2 Spot = =
2' , 0
*m !,;
2*m
& Spot = =
26 , 0
*m !,;
2,;*m
' Spot = =
&.9 KLT Ha'$( P)m$'a*a# 8
,abel 5. 3arga 2$ 3asil 07, pemisahan &
&&
U> 2!& #m U> 8<< #m
Fra0'$ (S1a#+ar
A#+r37raf3($+)
'5 , 0
*m !,;
*m 1,5
1 Spot = =
Fra0'$ 2 (Kr$'1a( Fa')
K(3r3f3rm)
' , 0
*m !,;
*m 1,'
1 Spot = =
Fra0'$ 8 (Fra0'$ K(3r3f3rm)
' , 0
*m !,;
*m 1,5
1 Spot = =
5 , 0
*m !,;
*m 2,1
2 Spot = =
Fra0'$ (S1a#+ar A#+r37raf3($+)
,idak telihat spot
Fra0'$ 2 (Kr$'1a( Fa') K(3r3f3rm)
'& , 0
*m !,;
*m 1,;
1 Spot = =
Fra0'$ 8 (Fra0'$ K(3r3f3rm)
'& , 0
*m !,;
*m 1,;
1 Spot = =
5& , 0
*m !,;
*m 2,2
2 Spot = =
&./ R)0r$'1a($'a'$
,abel . 3asil rekristalisasi
.ar#a #utih kehijauan
B)#1u0 0otak
B3b31 51,; mg
&.6 KLT D)#'$13m)1)r
&.6. Ha'$( S-a# U> 2!& #m +a# 8<< #m
&'
,abel !. 3asil S*an 2;' nm dan &55 nm
7amda Spot yang terlihat 0eterangan
2;' nm 1 spot Spot besar dan terjadi pemadaman $luoresensi
&55 nm ,idak terlihat spot -
#erhitungan harga 2$
asal titik dari pelarut ditempuh yang -arak
asal titik dari alit ditempuh -araknyang
2$ =
52 , 0
*m !,;
*m ;,&
2$ = =
&.6.2 Ha'$( KLT S:)01r3+)#'$13m)1)r
&.6.2. Ha'$( P)#7ama1a# KLT;S:)01r3f313+)#'$13m)1)r
#ada pengamatan meggunakan 07,-Spektrodensitometri terlihat adanya & spot,
kemudian masing-masing spot dis*an kembali pada rentang pangjang gelombang 200-
'00 nm dan diperoleh hasil sebagai berikut A
,abel 6. 3asil #engamatan 07,-Spektrodensitometer
S:31 Rf ? ma0'
Spot 1 0,0' 206 nm
Spot 2 0,10 20' nm
S:31 8 %,!/ 28& #m
&.6.8.2 Gambar Ha'$( P)#7ama1a# KLT;S:)01r3+)#'$13m)1)r
&;
>ambar '.1. Spektrum isolat 0ristal hasil rekristalisasi $raksi kloro$orm
>ambar '.2. Spektrum Spot 1
>ambar '.&. Spektrum spot 2
>ambar '.'. Spektrum Spot &
&5
>ambar '.;. Spektrum Standar )ndrogra$olid pada *eference data bank di 0omputer
BAB >
PEMBAHASAN
3erba Sambiloto "Andrographis paniculata) merupakan salah satu tanaman yang
paling sering digunakan dalam sistem pengobatan tradisional. #ada sistem pengobatan
ayur.eda, sambiloto digunakan untuk mengobati penyakit disentri, diare, atau malaria.
(alam ,raditional +hinese /edi*ine ",+/) sambiloto sering digunakan sebagai Hcold
&
Standar
)ndrogra$olid
propertyG untuk menurunkan panas serta sebagai Hblood purifyingG untuk
membersihkan ra*un-ra*un dalam tubuh. Senya1a akti$ yang merupakan senya1a
mayor pada herba sambiloto adalah androga$olid. 3ampir keseluruhan bagian tanaman
"akar, daun, batang, dan bunga) mengandung senya1a diterpen lakton adrogra$olid,
tetapi dalam persentase yang berbeda ")kbar,2011).
#ada praktikum ini dilakukan pemisahan, isolasi dan identi$ikasi senya1a
terpenoid dari herba sambiloto ")ndrographis pani*ulata "Burm.$.)). /etode yang
digunakan dalam pemisahan, isolasi dan identi$ikasi senya1a terpenoid dari herba
sambiloto ")ndrographis pani*ulata "Burm.$.)), diantaranya ekstraksi dengan metode
maserasi, ekstraksi padat-*air, kromatogra$i kolom lambat, rekristalisasi. Identi$ikasi
dilakukan dengan skrining $itokimia alkaloid dan metode 07,-(ensitometer.
,ahap pertama dilakukan ekstraksi dengan metode meserasi. #rinsip maserasi
adalah penyarian 4at akti$ yang dilakukan dengan *ara merendam serbuk simplisia
dalam *airan penyari yang sesuai selama beberapa hari pada temperatur kamar yang
terlindungi dari *ahaya. +airan penyari akan masuk kedalam sel melalui dinding sel. Isi
sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan didalam sel dan diluar
sel. 7arutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh *airan
penyari dengan konsentrasi rendah melalui proses di$usi. #eristi1a tersebut berulang
sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan didalam sel dan diluar sel.
7angkah pertama yang dilakukan adalah dengan menimbang 100 gram serbuk
herba sambiloto kemudian dimasukan ke dalam toples ka*a. (itambahkan ;00 ml
etanol 65% sebagai *airan penyari. ,oples kemudian ditutup rapat dan dilapisi dengan
kain hitam. #enggunan kain hitam disini bertujuan agar serbuk simplisia terlindung dari
*ahaya sehingga dapat men*egah terjadinya dekomposisi dan penguraian 4at akti$.
7arutan simplisia didiamkan selama 1 hari sambil dilakukan pengaduk sekali sehari.
#endiaman selama 1 hari bertujuan agar yang senya1a yang diinginkan dapat larut
dalam *airan penyari. #engadukan ber$ungsi untuk meratakan konsentrasi larutan diluar
butir simplisia sehingga perbedaan konsentrasi antara larutan didalam dan diluar sel
dapat dijaga seke*il-ke*ilnya. #ada saat inilah *airan penyari akan menembus dinding
sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung 4at akti$. Bat akti$ akan terdesak
keluar karena adanya perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar sel.
&!
Setelah 1 hari, dilakukan penyarian serbuk simplisia. Eiltrat yang didapat
sebanyak 20 ml kemudian ditampung pada botol. Sedangkan ampasnya diperas dan
ditambahkan lagi dengan 2;0 ml etanol 65% kemudian didiamkan lagi selama 1 hari.
Setelah 1 hari ampas diperas, $iltrate yang diperoleh sebanyak 22; ml dimasukan
kedalam botol yang sama yang berisi $iltrat sebelumnya. )mpasnya diperas dan
ditambahkan lagi dengan 2;0 ml etanol 65% kemudian didiamkan selama 1 hari lagi
kemudian disaring. )dapun penambahan etanol 65% pada ampas maserasi bertujuan
untuk memisahkan maserat yang masih mungkin terkandung dalam ampas sehingga
dapat mengoptimalkan hasil maserasi. ,otal Eiltrat yang didapat pada praktikum kali ini
adalah ' m7. Eiltrat yang didapat kemudian diuapkan diatas penangas dengan
menggunakan *a1an por*elain hingga di dapatkan ekstrak kental. Bobot ekstrak kental
yang yang diperoleh adalah sebanyak 2,'6 gram.
#emeriksaan golongan senya1a kimia dalam simplisia herba sambiloto se*ara
kualitati$ dilakukan dengan skrining $itokimia. Skrining $itokimia ini bertujuan untuk
mengetahui apakah didalam serbuk herba sambiloto memiliki kandungan kimia yang
akan ditentukan yaitu terpenoid. (alam skrining $itokimia pemilihan pelarut merupakan
hal yang penting karena pelarut berperan dalam melarutkan senya1a yang diinginkan
dan apabila pemilihan pelarut sudah tepat maka skrining $itokimia akan menunjukkan
hasil yang tepat. %amun pemilihan pelarut yang spesi$ik sulit dilakukan pada skrining
$itokimia. )pabila pemilihan pelarut hanya didasarkan pada ketentuan derajat kelarutan
suatu senya1a yang diteliti se*ara umum, maka akan ada kemungkinan hasil yang
didapat tidak sesuai dengan pustaka. 3al ini disebabkan karena hadirnya senya1a-
senya1a dari golongan lain dalam tanaman tersebut akan berpengaruh terhadap proses
kelarutan senya1a yang diinginkan "0ristanti dkk., 200!).
Sebelum dilakukan skrining $itokimia, hal yang pertama dilakukan adalah
pembuatan larutan uji untuk skrining $otokimia. Sebanyak 10 mg ektrak kental herba
sambiloto dilarutkan dengan 2; ml metanol.=ji skrining $itokimia pertama yang
dilakukan adalah identi$ikasi saponin. 2eaksi saponi$ikasi adalah hidrolisis basa suatu
ester dengan alkali yang bersi$at irreversible. 2eaksi saponi$ikasi adalah 2+DD2 X
D3- menjadi 2+DD2 X 2D3 "Sesmita, 201&). #ada uji saponin, dipipet 10 ml larutan
ekstrak herba sambiloto kedalam tabung reaksi, kemudian diko*ok se*ara .ertikal
selama 10 menit. (ibiarkan hasil ko*okan tersebut selama 10 menit. ,erbentuknya busa
&6
setinggi 1-10 *m yang stabil dari hasil pengo*okan kuat $iltrat selama 10 menit dalam
tabung reaksi menunjukkan adanya senya1a golongan saponin. (ari hasil identi$ikasi
uji saponin pada ekstrak herba sambiloto tidak terbentuk busa, sehingga pada skrining
$itokimia ektrak herba sambiloto negati$ mengandung saponin.
=ji steroid-terpenoid dilakukan dengan reaksi 7ieberman Bur*hard. Sejumlah
Sebanyak 2 ml larutan uji diuapkan dalam *a1an porselin. 2esidu diupkan dengan 0,;
ml kloro$om pada tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,; ml asam asetat anhidrat
dan 2 ml asam sul$at melalui dinding tabung reaksi "pereaksi %iebermann"+uchard).
-ika terbentuknya *in*in ber1arna ke*oklatan atau .iolet pada pembatas larutan
menunjukkan adanya triterpenoid. Sedangkan terbentuknya *in*in ber1arna biru
kehijauan menunjukkan adanya steroid. (ari hasil uji skrining $itokimia yang
dilakukan, terbentuk *in*in ke*oklatan pada pembatas larutan dan larutan yang berada
diba1ah *in*in ber1arna hijau. (imana dari hasil skrining $itokimia tersebut, ekstrak
herba sambiloto positi$ mengandung triterpenoid.
=ji skring $itokimia selanjutnya adalah uji tanin. (itimbang 2 mg ekstrak kental
herba sambiloto ditimbang. (ilarutkan dengan menggunakan 2 ml akuades, kemudian
ditambahkan & tetes pereaksi #B asetat. 3asil positi$ uji tannin, terdapat endapan
ber1arna putih pada larutan. (ari hasil skrining $itokimia tersebut, tidak terbentuk
endapan putih, larutan teteap ber1arna bening, sehingga dapat disimpulkan ekstrak
herba sambiloto negati$ mengandung tannin.
=ji skrining $itokimia yang terakhir dilakukan adalah identi$ikasi alkaloid.
Sebnayak 2 ml larutan uji diuapkan diatas *a1an poselin. 2esidu yang didapat
dilarutkan dengan ; ml 3+l 2% didalam tabung reaksi. 7arutan untuk uji alkaloid
tersebut dibagi kedalam ' tabung reaksi. ,abung pertama ditambahkan & tetes pereaksi
1agner. ,abung kedua ditambahkan & tetes pereaksi mayer. ,abung ketiga ditambahkan
& tetes peraksi hager. (an tabung terakhir ditambahkan & tetes pereaksi dragendro$$.
(ari uji skrining $itokimia identi$ikasi alkaloid didapatkan hasil pada tabung pertama
negati$ alkaloid, pada uji alkaloid dengan pereaksi 1igner larutan tetap ber1arna
bening. (ari hasil yang ditunjukkan pada tabung kedua pada uji alkaloid dengan
pereaksi mayer menunjukkan hasil negati$ dengan larutan tetap ber1arna bening. #ada
pembuatan pereaksi /ayer, larutan merkurium"II) klorida ditambah kalium iodida
akan bereaksi membentuk endapan merah merkurium"II) iodida. -ika kalium iodida
'0
yang ditambahkan berlebih maka akan terbentuk kalium tetraiodomerkurat"II)
"S.ehla, 1660). )lkaloid mengandung atom nitrogen yang mempunyai pasangan
elektron bebas sehingga dapat digunakan untuk membentuk ikatan ko.alen koordinat
dengan ion logam "/*/urry, 200'). #ada uji alkaloid dengan pereaksi /ayer,
diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam 0
X
dari kalium
tetraiodomerkurat"II) membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap.
>ambar ;.1. #erkiraan 2eaksi =ji /ayer
(ari hasil yang ditunjukkan pada tabung ketiga pada uji alkaloid dengan pereaksi hager
menunjukkan hasil negati$ dengan larutan tetap ber1arna kuning muda. (ari hasil yang
ditunjukkan pada tabung keempat pada uji alkaloid dengan pereaksi dragendro$$
menunjukkan hasil negati$ dengan larutan tetap ber1arna kuning. 3asil positi$ alkaloid
pada uji (ragendor$$ juga ditandai dengan terbentuknya endapan *oklat muda sampai
kuning. Fndapan tersebut adalah kalium-alkaloid. #ada pembuatan pereaksi
(ragendor$$, bismut nitrat dilarutkan dalam 3+l agar tidak terjadi reaksi hidrolisis
karena garam-garam bismuth mudah terhidrolisis membentuk ion bismutil "BiD
X
).
Berikut gambar reaksi yang terjadiA
>ambar ;.2. 2eaksi 3idrolisis Bismut
)gar ion Bi
&X
tetap berada dalam larutan, maka larutan itu ditambah asam sehingga
kesetimbangan akan bergeser ke arah kiri. Selanjutnya ion Bi
&X
dari bismut nitrat
bereaksi dengan kalium iodida membentuk endapan hitam Bismut"III) iodida yang
'1
kemudian melarut dalam kalium iodida berlebih membentuk kalium
tetraiodobismutat "S.ehla, 1660). #ada uji alkaloid dengan pereaksi (ragendor$$,
nitrogen digunakan untuk membentuk ikatan ko.alen koordinat dengan 0
X
yang
merupakan ion logam "/irosla., 161).
>ambar ;.&. 2eaksi =ji (ragendor$$ "Soerya,200;).
Setelah proses skrining, tahap selanjutnya dilakukan pen*u*ian dengan n-heksan
yang bertujuan untuk puri$ikasi dengan menghilangkan kloro$il yang terkandung dalam
ekstrak herba sambiloto. (igunakan n-heksan karena kloro$il larut dalam n-heksan
sedangkan androgra$olid tidak larut dalam n-heksan sehingga ketika proses puri$ikasi,
androgra$olid tidak larut dan mengendap pada dasar *a1an porselin. Selanjutnya,
puri$ikasi dilakukan dengan pen*u*ian menggunakan etil asetat. Fndapan yang tidak
larut n-heksan di*u*i dengan etil asetat. 3asil pen*u*ian yaitu endapan tidak larut etil
asetat dan larutan etil asetat diperiksa dengan 07, untuk melihat distribusi
androgra$olid.
0eempat $raksi yang ditotolkan pada plat 07, yaitu $raksi etanol hasil maserasi,
$raksi tidak larut n-heksan, $raksi tidak larut etil asetat dan $raksi etil asetat. Berdasarkan
hasil, semua $raksi berisi spot yang diduga androgra$olid namun masih banyak pengotor
yang ditunjukkan dengan adanya spot lebih dari satu. (ari keempat spot tersebut, $raksi
tidak larut etil asetat yang paling bersih, namun masih ada pengotor diba1ah spot yang
diduga androgra$olid. Dleh karena itu, perlu di*u*i kembali dengan air panas untuk
menghilangkan pengtor dimana kelarutan androgra$olid sangat rendah dalam air
sehingga diharapkan pengotor yang bersi$at polar larut dalam air dan androgra$olid
mengendap. #ada $raksi larut etil asetat, se*ara .isual terlihat spot yang diduga
'2
androgra$olid namun dengan jumlah penotolan yang sama dengan $raksi tidak larut etil
asetat, pada $raksi larut etil asetat lebih redup. Dleh sebab itu, $raksi yang dilanjutkan ke
tahap pemisahan selanjutnya adalah $raksi tidak larut etil asetat. #ada 07, hasil
pen*u*ian dengan air panas, tidak terlihat spot yang diduga androgra$olid, hal ini
mungkin disebabkan karena jumlah penotolan yang terlalu ke*il yaitu 5 U7. 3al ini
menyebabkan sangat sedikitnya androgra$olid yang ber$luoresensi sehingga tidak
terlihat oleh mata.
0emudian dilakukan pemisahan dengan kromatogra$i kolom lambat yang dimana
dapat digunakan untuk pemisahan pada satu sampel yang berupa *ampuran dengan
berat beberapa gram "0ristanti dkk., 200!). #rinsip 0romatogra$i kolom adalah suatu
teknik pemisahan yang didasarkan pada peristi1a adsorpsi. Sampel yang biasanya
berupa larutan pekat diletakkan pada ujung atas kolom. Fluen atau pelarut dialirkan
se*ara kontinu ke dalam kolom. (engan adanya gra.itasi atau karena bantuan tekanan,
maka eluen atau pelarut akan mele1ati kolom dan proses pemisahan akan terjadi
"0ristanti dkk., 200!). #ada kromatogra$i kolom lambat, aliran eluen hanya disebabkan
oleh gra.itasi.
Eraksi pemisahan I "bagian yang tidak larut air) yang akan digunakan untuk
pemisahan, diuapkan pelarutnya terlebih dahulu. Fkstrak kental ini kemudian
direkonstitusi dengan metanol sampai larut dan diusahakan larutan yang dibuat sepekat
mungkin. Ease diam yang digunakan dalam kromatogra$i kolom lambat ini adalah silika
gel. 0olom yang digunakan memiliki tinggi 10 *m. #embuatan kolom dilakukan dengan
*ara basah karena pada umumnya *ara basah lebih sering digunakan untuk pembuatan
kolom silika gel, sedangkan *ara kering digunakan untuk pembuatan kolom alumina
"0usmardiyani dan %a1a1i, 1662). #embuatan dengan *ara basah juga bertujuan
supaya kolom yang terbentuk lebih kompak karena adsorben telah dibuat menjadi bubur
terlebih dahulu sehingga diharapkan terjadi pemisahan yang optimal. Bagian ba1ah
kolom diisi dengan glass )ool untuk menahan adsorben "0usmardiyani dan %a1a1i,
1662). ,lass )ool ini ber$ungsi men*egah $ase diam mele1ati kran yang dapat
menyumbat kran saat dilakukan pengelusian.Silika gel yang digunakan sebagai
adsorben sebanyak ,''6 gram. Silika gel ini dibuat bubur dengan *ara melarutkannya
dengan kloro$orm. 0loro$orm dipilih karena untuk memberikan pelarut yang *enderung
non-polar. (engan adanya pelarut non-polar, pengotor-pengotor non-polar yang
'&
melekat pada silika gel akan dialirkan bersama aliran eluen. Bubur yang telah terbentuk
dimasukkan sedikit demi sedikit se*ara kontinyu ke dalam kolom yang telah diisi
kloro$orm setinggi 10 *m melalui dinding kolom dan diusahakan tidak terbentuk
gelembung udara. )pabila terbentuk gelembung udara, kolom yang dihasilkan tidak
kompak dan proses pemisahan tidak optimum. >elembung yang terbentuk dapat diatasi
dengan memukul-mukul dinding kolom se*ara perlahan. Setiap memasukan bubur silika
ke dalam kolom, dinding kolom diketuk-ketukkan agar lapisan adsorben yang terbentuk
benar-benar mampat "tidak ada gelembung udara). Selain itu, pada saat penuangan
bubur silika, bubur silika diaduk dan ditambahkan kloro$orm se*ara kontinyu untuk
menghindari keringnya silika. Silika yang menempel pada dinding kolom harus segera
dibilas dengan eluen untuk menghindari mengerasnya silika pada dinding kolom.
0olom yang baik adalah kolom yang adsorbennya kompak dan tidak terdapat
gelembung udara didalamnya karena gelembung udara dan *elah pada adsorben
mengakibatkan kolom akan pe*ah dan dapat mengganggu proses pemisahan. Saat
pengisian bubur silika gel ke dalam kolom, kran dibuka untuk mengalirkan eluen
dengan ke*epatan tertentu dan dijaga supaya eluen tetap membasahi silika. Setelah
semua bubur dimasukkan ke dalam kolom, pada bagian atas silika diberi eluen kira-kira
setinggi ; *m kemudian ditutup dengan plastik ikan dan aluminium foil untuk men*egah
keringnya silika selama penyimpanan. 0olom yang telah dibuat didiamkan selama satu
hari supaya kolom yang terbentuk lebih kompak dan proses pemampatan $ase diam
menjadi lebih sempurna dan selama didiamkan harus terdapat sejumlah tertentu $ase
gerak di bagian atas kolom untuk men*egah kering dan rusaknya kolom. #e*ahnya
kolom atau $ase diam yang mengering dapat mengganggu proses pemisahan, sehingga
pemisahannya tidak maksimal. Selain itu, kolom harus dalam keadaan tertutup rapat
agar tidak memungkinkan udara untuk masuk "0ristanti dkk., 200!).
Sebelum diisi *uplikan, kolom terlebih dahulu diekuilibrasi dengan 20 m7
kloro$om supaya kolom tersebut lebih kompak. #emisahan dengan kromatogra$i kolom
dilakukan dengan meletakkan *ampuran yang akan dipisahkan pada bagian atas kolom
adsorben yang berada dalam suatu tabung. #elarut karena gaya berat dibiarkan mengalir
melalui kolom memba1a serta pita linarut yang bergerak dengan ke*epatan berbeda.
7inarut yang telah terpisah dikumpulkan berupa $raksi yang keluar dari bagian ba1ah
kolom "0usmardiyani dan %a1a1i, 1662). #engisian *uplikan dilakukan dengan
''
memasukkan *uplikan ke dalam kolom dengan bantuan pipet se*ara hati-hati melalui
dinding kolom supaya tidak merusak kolom yang telah dibuat. Sampel yang menempel
pada dinding kolom dibilas dengan menggunakan eluen kloro$orm.
Flusi pertama dilakukan dengan mengalirkan pelarut kloro$orm. 0e*epatan
penetesan eluat keluar dari kolom diatur konstan dan eluat yang keluar ditampung setiap
; m7 dengan *ara manual menggunakan botol .ial yang telah ditera terlebih dahulu.
Sedangkan elusi kedua menggunakan pelarut metanol. 0e*epatan elusi tidak boleh
terlalu *epat sehingga senya1a berada dalam keseimbangan antara $ase diam dan $ase
gerak, sebaliknya jika ke*epatan elusi ini terlalu ke*il, maka senya1a-senya1a akan
terdi$usi ke dalam eluen dan akan menyebabkan pita makin lama makin lebar yang
akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung dengan baik ke*epatan elusi yang besar
dapat dilakukan jika yang akan dipisahkan adalah *ampuran senya1a yang memiliki
kepolaran yang sangat berbeda "0ristanti dkk., 200!).
#emisahan dengan kolom kromatogra$i ini menghasilkan & $raksi, yaitu $raksi
kloro$om dan metano I dan metanol II. Flusi dengan kloro$om untuk bertujuan untuk
menghilangkan pengotor yang bersi$at nonpolar dari ekstrak, sedangkan androgra$olid
akan tertahan pada $ase diam. )ndrogra$olid bersi$at mudah larut dalam methanol,
sehingga androgra$olid akan terelusi dengan metanol "0umoro, 200). Eraksi kloro$om
ber1arna hijau pekat kehitaman, sedangkan $raksi metanol I dan metanol II ber1arna
hijau ke*oklatan./asing ? masing $raksi kemudian dianalisis dengan kromatogra$i lapis
tipis untuk melihat kemurniannya.
3asil pemisahan kromatogra$i kolom lambat didapatkan & $raksi, yaitu $raksi
kloro$orm, $raksi metanol I, dan $raksi metanol II. (ari ketiga $raksi tersebut
selanjutnya diuji menggunakan metode kromatogra$i lapis tipis "07,) untuk
mengetahui pada $raksi mana yang mengandung senya1a akti$ androgra$olid.
#ertama ?tama disiapkan $ase diam yaitu plat 07, silika gel >E
2;'
yang dipotong
dengan ukuran &,2 : 10 *m. #lat kemudian diberi batas atas dan ba1ah 0,;*m, batas
kanan dan kiri plat sebesar 1 *m, dan jarak antara penotolan $raksi sebesar 0,5 *m.
Setelah dipotong, plat di*u*i dengan metanol dan diakti.asi pada suhu 110
o
+ selama 1;
menit. ,ujuannya adalah untuk menghilangkan pengotor pada plat selama masa
penyimpanan dan mengakti$kan sisi akti$ dari plat silika. 0etiga $raksi kemudian
diuapkan pelarutnya dan dilarutkan kembali dengan metanol lalu ditotolkan pada plat
';
sebanyak ' U7. #lat kemudian dielusi menggunakan $ase gerak kloro$orm A metanol "6A1
.
S
.
) sebanyak 10 m7 dengan jarak pengembangan sebesar !,;*m. Setelah dielusi, plat
diangin ?anginkan dan diamati di ba1ah lampu =J 2;' dan &55 nm.
#ada pengamatan diba1ah =J 2;' nm dapat diamati semua spot mengalami
pemadaman $luoresensi. #ada $raksi kloro$orm yang ditotolkan terlihat & spot yang
memiliki nilai 2$ berturut ?turut dari atas ke ba1ah 0,'2 @ 0,&@ dan 0,6;. #ada $raksi
metanol I yang ditotolkan juga ditemui & spot dengan nilai 2$ berturut ?turut 0,'2@ 0,2@
dan 0,6;. Sedangkan pada $raksi metanol II hanya ditemukan satu spot saja dengan nilai
2$ 0,''.
#ada pengamatan di ba1ah =J &55 nm, dapat diamati pada $raksi kloro$orm
terdapat dua spot yang masing ?masing memiliki nilai 2$ 0,1' dan 0,2!. Sedangkan
pada $raksi metanol I ditemukan ' spot yang memiliki nilai 2$ berturut ?turut sebesar
0,1&@ 0,16@ 0,2'@ dan 0,26. %amun, pada $raksi metanol II tidak dijumpai adanya spot.
Berdasarkan data dari pustaka, andogra$olid mengalami pemadaman $luoresensi
pada =J 2;' nm dan ber$luoresensi biru di ba1ah =J &55 nm serta memiliki nilai 2$
0,&5 pada sistem $ase gerak kloro$orm A metanol "6A1 .S.). Sehingga dari hasil
pengamatan diduga, senya1a androgra$olid berada pada $raksi kloro$orm dan metanol I.
%amun, adanya pengaruh lingkungan menyebabkan perbedaan pada nilai 2$ yang
dihasilkan, yaitu berkisar antara 0,2! dan 0,26. %amun, $raksi kloro$orm dipilih untuk
dianalisis lebih lanjut karena dilihat dari pemisahan $raksi tersebut lebih baik dan
*enderung lebih sedikit terdapat pengotor karena spot yang dihasilkan terlihat lebih
bersih dibandingkan pada $raksi metanol I.
Berdasarkan hasil 07, terhadap standar kristal androgra$olid "sampel 1), kristal
yang terbentuk dari $ase kloro$orm "sampel 2), dan $ase kloro$orm "sampel &), dapat
disimpulkan bah1a sampel 2 merupakan androgra$olid karena memiliki 2$ yang mirip
dengan standar yaitu 0,'. #ada $ase kloro$orm juga terdapat spot yang memiliki nilai 2$
yang sama dengan sampel 2 sehingga $ase kloro$orm masih dapat dikristalisasi untuk
mendapatkan kristal.
0ristal yang terbentuk dari $ase kloro$orm kemudian direkristalisasi menggunakan
metanol untuk mendapatkan kristal yang ber1arna lebih bersih. 3al tersebut dilakukan
karena pembentukan kristal dari $ase kloro$orm menghasilkan kristal yang ber1arna
hijau karena masih ter*ampur dengan kloro$il. (igunakan methanol sebagai pelarut
'5
karena androgra$olid mudah larut dalam methanol sehingga membutuhkan .olume ke*il
untuk menjenuhkan pelarut dengan 0ristal androgra$olid. 7arutan yang telah le1at
jenuh dengan proses pendinginan perlahan akan mengendapkan kembali 0ristal-kristal
yang lebih bersih. Sebelum dilakukan proses pendinginan, larutan disaring terlebih
dahulu dalam keadaan panas bertujuan untuk memisahkan pengotor-pengotor tak larut.
#roses rekristalisasi memerlukan 1aktu 2' jam untuk pembentukan kembali kristal
karena dengan pendinginan yang perlahan dapat menghasilkan kristal yang lebih ke*il
dan lebih putih karena pengotor "kloro$il) tidak ikut terperangkap di dalam kisi kristal.
)pabila pendinginan dilakukan dengan *epat maka akan terbentuk kristal yang besar
namun masih menjerat pengotor sehingga harus dilakukan rekristalisasi kembali.
Identi$ikasi terhadap kristal yang diperoleh dilakukan uji kualitati$ dengan
teknik 07,-Spektrodensitometri. 0ristal yang diperoleh dilarutkan dengan metanol
kemudian ditotolkan pada plat 07, Silika >el >E
2;'
. sebelum ditotolkan, plat
seharusnya terlebih dahulu di*u*i dengan menggunakan metanol dan diakti.asi pada
suhu 110
0
+ selama &0 menit, namun karena keterbatasan 1aktu langkah tersebut tidak
dilakukan. #roses pen*u*ian ini bertujuan untuk menghilangkan pengotor yang dapat
mengganggu proses pendeteksian analit dalam sampel, metanol dipilih karena si$atnya
yang mudah menguap serta merupakan pelarut uni.ersal dimana bisa melarutkan
senya1a baik polar maupun non polar. Sedangkan pengakti.asian bertujuan untuk
mengakti$kan sisi akti$ dari plat sili*a >E
2;'
yang digunakan serta menjaga kelembapan
pada plat. #enotolan diusahakan seke*il mungkin agar hasil ber*ak yang didapat tidak
melebar yang akan mengganggu proses scanning dan memungkinkan terjadinya
himpitan pun*ak "0usmardiyani dan %a1a1i, 1662)
Sebelum dielusi dilakukan penjenuhan *hamber yang bertujuan
menyeimbangkan tekanan uap dalam *hamber sehingga proses pengelusian berjalan
dengan baik. Sebelum ditambahkan $ase gerak, didalam *hamber terlebih dahulu
diletakkan kertas saring sebagai penanda kejenuhan. Setelah dielusi plat dikeringkan
dengan *ara diangin-anginkan. ,ujuan dari pengeringan yaitu menguapkan sisa pelarut
yang masih terdapat pada plat 07, sehingga tidak menggangu proses scaning
denganspektro$otodensitometer. Selanjutnya plat dideteksi pada sinar =J 2;' nm dan
&55 nm untuk melihat spot yang terdapat. (ari hasil pengamatan pada =J 2;' terlihat
1 spot yang sangat besar dan ber1arna gelap "pemadaman $luoresensi) dengan 2$ 0,52
'
dan terdapat tailing. 3al ini kemungkinan disebabkan oleh pemisahan yang kurang
sempurna sehingga spot tidak memisah dengan baik dan menumpuk. #ada pengamatan
=J &55 nm tidak terlihat adanya spot. )ndrogra$olid pada =J &55 akan berpendar biru
jika konsentrasinya men*ukupi. (alam hal ini tidak adanya pendaran biru mungkin
disebabkan kurangnya konsentrasi )ndrogra$olid pada spot.
Selanjutnya dilakukan pengamatan menggunakan 07,-(ensitometer. #rinsip
dari densitometer adalah berdasarkan penyerapan radiasi elektromagnetik sinar =J-Jis
dengan analit yang berupa noda pada plat. &canning dilakukan pada rentang panjang
gelombang 200 sampai '00 nm. )ndrogra$olid dapat dideteksi menggunakan
spektro$otodensitometer pada panjang gelombang =J-Jis karena androgra$olid
memiliki gugus kromo$or. 2adiasi elektromagnetik yang mengenai analit akan diserap
oleh gugus kromo$or dari analit dimana besarnya serapan dapat diukur. 2adiasi
elektromagnetik yang diabsorpsi oleh analit atau indikator plat dapat diemisikan berupa
$louresensi dan $os$oresensi "Sherma and Eried 166'). #emadaman $louresensi indikator
E-2;' dapat terjadi akibat adanya noda pada plat sehingga teramati di ba1ah lampu =J
sebagai noda hitam "/ulja dan Suharman, 166;).
3asil dari 07,-(ensitometri di*o*okan dengan spektrum dan nilai 2$
berdasarkan pustaka dan reference data bank yang terdapat pada komputer untuk
mengetahui golongan kandungan kimia yang terdapat pada $raksi. (ari hasil scanning
diperoleh & pun*ak yaitu pada panjang gelombang 206 nm, 20' nm dan 2&' nm. #ada
panjang gelombang 200-210 semua analit baik pengotor dan pelarut dapat terdeteksi,
sehingga pun*ak yang diduga androgra$olid adalah pun*ak dengan panjang gelombang
2&' nm yaitu spot &. Berdasarkan pustaka panjang gelombang maksimum androgra$olid
pada larutan etanol adalah 22& nm "0umoro, 200) dan 2&0 nm ")1al, 2011). %amun
#anjang gelombang maksimum dari spot juga sama dengan panjang gelombang
maksimum androgra$olid pada reference data bank yang terdapat pada komputer yaitu
2&'-2&; nm. #ola spektrum spot & sampel kristal juga memiliki kemiripan dengan pola
spektrum standar andro$ragolid pada reference data bank yang terdapat pada *omputer
sehingga dapat dikatakan bah1a kristal yang diperoleh merupakan androgra$olid. %ilai
2$ yang diperoleh sebesar 0,;! dimana nilai tersebut berbeda dengan pustaka yang
mengatakan nilai 2$ androgra$olid dengan $ase gerak kloro$orm A methanol "6A1) adalah
sebesar 0,&5 ")1al, 2011).
'!
>ambar ;.'. Spektrum Spot & 3asil S*an
>ambar ;.;. Spektrum Standar )ndrogra$olid pada reference data bank.
,erjadinya perbedaan panjang gelombang maksimum dan nilai 2$ pada per*obaan
dengan literatur mungkin dikarenakan perbedaan kondisi yang digunakan pada
praktikum dan saat penetapan panjang gelombang maksimum pada literatur seperti hal
nya suhu dapat juga mempengaruhi hasil absorbansi yang diperoleh, sehingga sebaiknya
identi$ikasi dilakukan dengan menggunakan standar baku androgra$olid. )danya &
pun*ak pada spektrum menandakan bah1a kristal belum murni dan masih terdapat
pengotor sehingga untuk selanjutnya perlu dilakukan pemurnian terhadap kristal.
BAB >I
PENUTUP
<. K)'$m:u(a#
5.1.1 /etode yang dapat digunakan dalam isolasi senya1a androgra$olid dari herba
sambiloto "Andrographis paniculata "Burm.$.)), diantaranya ekstraksi dengan
'6
Standar
)ndrogra$olid
metode maserasi, ekstraksi padat-*air, kromatogra$i kolom lambat dan
rekristalisasi.
5.1.2 Identi$ikasi senya1a androgra$olid dari herba sambiloto "Andrographis
paniculata "Burm.$.)), dapat dilakukan dengan skrining $itokimia dengan
melihat hasil positi$ pada pengujian terpenoid dan metode 07,-(ensitometer
dengan *ara membandingkan pola spe*trum serta nilai 2$ dengan pustaka
yang tersedia.
<.2 Sara#
Saran penulis untuk praktikum selanjutnya adalah bila memungkinkan
sebaiknya digunakan standar androga$olid dalam identi$ikasi sehingga dapat dihitung
nilai kemurian isolat androga$olid yang didapat.
;0