Revista Tropica: Cincias Agrrias e Biolgicas, v.6,n. 3 p.

154-157 2012
Centro de Cincias Agrarias e Ambientais-Universidade Federal do Maranho, MA.
ISSN 1982-4831

Autor para Correspondncia: Sueli T. Van Der Sand, Departamento de microbiologia Imunologia e Parasitologia,
ICBS/UFRG, Rua Sarmento Leite, 500. Sala 158, CEP: 90050-170. Porto Alegre, RS, Brasil. Telefone: (51) 3308-4505.
svands@ufrgs.br
Revista Trpica Cincias Agrrias e Biolgicas
V. 6, N.3, pg. 154,2012

Avaliao da atividade antimicrobiana de actinomicetos endofticos contra
bactrias Gram-negativas resistentes a beta-lactmicos.
Tiele da Silva Carvalho
1,2
, Daniele Vargas de Oliveira
1
e Sueli Teresinha Van Der Sand
1*
.
Resumo - O uso indiscriminado de antibiticos em humanos e animais tem sido um dos principais fatores responsvel
pelo aumento de bactrias resistentes aos diferentes compostos hoje disponveis no mercado. Levando em considerao
esta perspectiva a prospeco de microrganismos que produzam novas molculas biativas de suma importncia. Os
actinomicetos so os principais produtores naturais de compostos antimicrobianos derivados do seu metabolismo
secundrio. O gnero Streptomyces responsvel por 90% dos antibiticos produzidos desde a descoberta do primeiro,
em 1942. Os actinomicetos endofticos, presentes em diversas espcies vegetais, so uma nova fonte promissora para a
produo de compostos bioativos. Este estudo tem como objetivos avaliar a atividade antimicrobiana de actinomicetos
endofticos contra bactrias Gram-negativas resistentes a beta-lactmicos, e avaliar a influncia de diferentes fontes de
carbono e tempos de incubao na atividade dos actinomicetos. Dois actinomicetos isolados de tomateiro e treze
isolados bacterianos Gram-negativos provenientes de gua contaminada com esgoto foram utilizados no trabalho. A
produo de compostos bioativos pelos actinomicetos foi determinado pelo ensaio da dupla camada e posteriormente
utilizando o extrato bruto difuso em poos. O isolado R18(6), quando crescido em meio de cultura contendo glicerol
ou glicose, apresentou, aps sete dias de crescimento, a capacidade de produzir metablito(s) bioativo(s) contra os
microrganismos testes.
Palavras-chave: agentes antibacterianos, Streptomyces, fontes de carbono.
Evaluation of the antimicrobial activity of endophytic actinomycetes against Gram-negative bacteria resistant to
beta-lactams.
Abstract - The indiscriminate use of antibiotics in humans and animals is a major factor responsible in the increase of
bacteria resistance to the compounds available in the market today. Taking in consideration this perspective, the search
for microorganisms which are able to produce new molecules with bioactive activity is very important. The
actinomycetes are major natural producers of antimicrobial compounds derived from their secondary metabolism. The
genus Streptomyces is responsible for 90% of the antibiotics produced since the discovery of the first, in 1942. The
endophytic actinomycetes present in different plant species are promising new sources for the production of bioactive
compounds. This study aims to evaluate the antimicrobial activity of endophytic actinomycetes against Gram-negative
bacteria resistant to beta-lactams antibiotics, and verify the influence of different carbon sources and incubation times in
the activity of actinomycetes. Two actinomycetes isolated from tomato and thirteen Gram-negative bacteria isolates
from water contaminated with sewage were used in this study. To evaluate the production of bioactive metabolites two
assays were used the double layer method and well diffusion of crude extract. The isolate R18 (6), when grown in
culture medium containing glycerol or glucose, showed, after seven days of growth, the ability to produce metabolite (s)
bioactive (s) against the test microorganisms.
Key words: antibacterial agents, Streptomyces, carbon sources.
CARVALHO TIELE DA SILVA ;DE ET AL
Revista Trpica Cincias Agrrias e Biolgicas
V. 6, N.3, pg.155,2012


INTRODUO
O uso indiscriminado de antibiticos tem-
se tornado um motivo importante para
investimentos na busca por novos compostos,
uma vez que esse fato pode acarretar a seleo
de microrganismos resistentes. A maioria dos
antibiticos usados clinicamente originada
de produtos naturais microbianos ou so
derivados destes (Clardy et al., 2006). Essa
produo natural de compostos
antimicrobianos de interesse clnico tem
chamado a ateno da indstria farmacutica.
Uma das principais fontes naturais de
antibiticos os actinomicetos. Os
actinomicetos so bactrias Gram-positivas
pertencentes ao filo Actinobacteria,
apresentam elevada concentrao de guaninas
e citosinas no seu DNA e exibe uma grande
variedade morfolgica e metablica (Nett et
al., 2009). O principal habitat desse filo o
solo, representando mais de 30% da
populao de microrganismos, onde so
responsveis pela degradao e reciclagem de
matria orgnica (Kennedy, 1999). Sua
variedade morfolgica representada pelas
estratgias reprodutivas devido formao de
uma diversidade de esporos que so
caracterizados de acordo com o gnero
(Ensign, 1978). A versatilidade metablica
est nos produtos resultantes do metabolismo
secundrio: antifngicos (Caffrey et al.,
2008), antitumorais (Olano et al., 2009),
imunossupressores (Graziani, 2009), enzimas
extracelulares (Insam, 2001) e antibiticos
(Waksman, 1953). O primeiro antibitico
derivado de actinomicetos foi descoberto, em
1940, proveniente da espcie Actinomyces
antibioticus. A actinomicina, como foi
nomeado, mostrou-se ativa contra bactrias
Gram-positivas, porm apresentou elevada
toxicidade em experimentos com animais. Em
1942, foi descoberto um novo composto
designado estreptotricina, originado da
espcie Actinomyces lavendulae, que mostrou
um amplo espectro de atividade e baixa
toxicidade em animais (Waksman, 1953).
Watve et al. (2001) estimaram que a ordem
Actinomycetales produziu, aproximadamente,
3.000 antibiticos conhecidos desde 1942 e
que 90% destes foram originados do gnero
Streptomyces.
Uma nova fonte de compostos bioativos
com potencial atividade antimicrobiana o
grupo dos actinomicetos endofticos. Eles so
importantes produtores de metablitos
secundrios como enzimas e antibiticos
(Tian et al., 2004). Essas bactrias esto
presentes dentro de tecidos vegetais saudveis
(Castillo, 2006) e no so patognicas para a
planta (Hallmann, 1997). Algumas espcies
desse grupo j foram isoladas de tomate,
banana, trigo e milho (Verma et al., 2009).
Este estudo tem como objetivos avaliar a
atividade antimicrobiana de actinomicetos
endofticos contra bactrias Gram-negativas
com perfil de resistncia a beta-lactmicos,
CARVALHO TIELE DA SILVA ;DE ET AL
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isoladas de gua contaminada com esgoto, e
verificar a influncia de diferentes fontes de
carbono e tempo de incubao do
actinomiceto em sua atividade.

MATERIAL E MTODOS
Este estudo foi realizado no
Departamento de Microbiologia, Imunologia
e Parasitologia, do Instituto de Cincias
Bsicas da Sade (ICBS), da UFRGS. Para
realizao do mesmo foram utilizados dois
actinomicetos endofticos isolados de
tomateiro do gnero Streptomyces isolados
R(2) e R18(6) pertencentes bacteriotca do
Laboratrio de Microbiologia do
Departamento de Microbiologia, Imunologia
e Parasitologia, ICBS, UFRGS. A coleta, o
isolamento e a identificao das amostras por
meio de provas morfolgicas, bioqumicas e
moleculares foram realizadas por Oliveira
(2009). Os isolados de actinomicetos foram
conservados em tubos de ensaio contendo
meio inclinado gar triptona de soja (TSA -
Tryptic Soy Agar) a 4 C.
Os treze isolados Gram-negativos
utilizados nos ensaios de antibiose (Tabela 1)
pertencem a bacteriotca do departamento. Os
microrganismos so provenientes de amostras
de gua contaminada com esgoto. As
bactrias foram isoladas e identificadas por
meio de provas morfolgicas, bioqumicas e
moleculares, realizadas por Oliveira (2011).
Esses microrganismos foram selecionados
devido ao seu perfil de resistncia aos
antibiticos da classe dos beta-lactmicos. Os
isolados Gram-negativos encontravam-se
conservados em glicerol 20% a -20 C. Para a
recuperao das clulas, uma alquota foi
retirada com a ala de platina, inoculada em
Caldo Triptona de Soja (TSB - Tryptic Soy
Broth) e incubada durante 24 h a 37 C.

Tabela 1. Bactrias Gram-negativas e seu perfil de resistncia aos antimicrobianos beta-
lactmicos utilizados nos ensaios de atividade antimicrobiana
Bactria Gram-negativa Cdigo

Resistncia a antimicrobianos
beta-lactmicos
1
Gene de resistncia
Enterobacter intermedium 1CC07 AMC, AMP, CFL, CFO, CRO bla
TEM
Klebsiella pneumoniae 1CE02 AMP bla
SHV
Klebsiella oxytoca 2BS08 AMP bla
SHV

Escherichia coli 2CC12 AMP, CFL bla
TEM

Escherichia coli 4EE02 AMP, CFL bla
TEM

Escherichia coli 4DE05 AMC, AM, CFL, CFO bla
TEM

Escherichia coli 4DC04 AMP, CFL, CFO bla
TEM

Escherichia coli 4EC05 AMC, AMP, CFL bla
TEM

CARVALHO TIELE DA SILVA ;DE ET AL
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V. 6, N.3, pg.155,2012


Para avaliao inicial do potencial de
produo de composto(s) bioativo(s) dos dois
isolados de actinomicetos, contra os
microrganismos testes, foi utilizada a tcnica
de dupla camada. Os actinomicetos foram
inoculados, pelo mtodo de picada, em placa
de Petri contendo meio gar amido casena
(ACA) (amido 1%; casena 0,012% ; NaCl
0,2% ; KNO
3
0,2%; K
2
HPO
4
0,2%; MgSO
4

0,005%; FeSO
4
0,001%; CaCO
3
0,002%; gar
bacteriolgico 0,6%). Os actinomicetos foram
incubados durante 14 dias a 30 C. Aps o
perodo de incubao, foram vertidas, sobre
os crescimentos, suspenses contento 1 mL da
uma concentrao de 10
8
clulas da bactria
teste/mL o que corresponde a 0,5 na escala
McFarland e 9 mL de gar Mller-Hinton
fundido. As placas foram incubadas durante
24 h/48 h a 37 C. A partir da medio dos
halos de inibio, foi determinada a atividade
antimicrobiana quantitativa dos isolados de
actinomicetos contra bactrias Gram
negativas.
Para produo do extrato bruto, os
actinomicetos foram crescidos em
Erlenmeyers contento 50 mL de caldo Amido
Casena (AC) (amido 1%; casena 0,012% ;
NaCl 0,2% ; KNO
3
0,2%; K
2
HPO
4
0,2%;
MgSO
4
0,005%; FeSO
4
0,001%; CaCO
3

0,002%;

). O pr-inoculo para cada isolado foi
incubado durante 48 h a 30 C sob agitao.
Aps o perodo de incubao, 5 mL do cultivo
foi transferido para um novo frasco contento o
meio AC e incubado durante 7 dias a 30 C
sob agitao. Aps esse perodo, uma alquota
das amostras foram submetidas filtrao,
com membranas filtrantes de 0,22 m e de
0,45 m de porosidade, e a outra alquota
submetida ao processo de centrifugao a
13.000 r.p.m. durante 10 min, para obteno
de extrato bruto livre de clulas. O extrato
bruto resultante de ambos os mtodos foi
empregado na tcnica de difuso em poo.
A tcnica de difuso em poo consistiu
em inocular, utilizando suabe estril, uma
suspenso de clulas na concentrao de 10
8

clulas de bactria teste/mL sobre uma placa
Escherichia
adecarboxylata
4CE06 AMC, AMP, CFL, CFO bla
TEM

Hafnia alvei 2AC02 CFL bla
SHV

Citrobacter diversus 3CC04 AMP, CFL bla
TEM

Citrobacter diversus 3EC04 AMP bla
TEM
; bla
SHV

Proteus mirabilis 3DC01 AMC, AMP, CFL bla
SHV


1
Antimicrobianos beta-lactmicos testados: AMC: amoxicilica + cido clavulnico; AMP:
ampicilina; CFL: cefalotina; CFO: cefoxitina; CRO: ceftriaxona.
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contendo meio de cultura gar Mller Hinton.
Aps a semeadura, foram realizados poos
equidistantes no gar utilizando cilindros
metlicos de 9 mm de dimetro. Em cada
poo foram adicionados 100 L do extrato
bruto do isolado que apresentou atividade
antimicrobiana positiva no teste de dupla
camada. A placa foi ento, incubada por 16 h
a 4C para difuso do extrato no meio de
cultura e posteriormente, a placa foi incubada
por 48 h a 37C. A partir dessa tcnica foi
analisada quantitativamente a atividade
antimicrobiana de cada isolado e determinado
qual mtodo, filtrao ou centrifugao, seria
o mais adequado para obteno de extrato
bruto com atividade antimicrobiana.
A avaliao da atividade antimicrobiana,
em diferentes fontes de carbono e tempos de
incubao, foi realizada com o isolado de
actinomiceto que, nos testes de dupla camada
e de difuso em poo, apresentou a melhor
atividade antibitica. O actinomiceto foi
inoculado em 50 mL de meio base (casena
0,03%; NaCl 0,2%; K
2
HPO
4
0,2%; MgSO
4

0,005%; FeSO
4
0,001%; CaCO
3
0,002%;
KNO
3
0,2%) no qual foram adicionadas,
individualmente, trs fontes de carbono na
concentrao de 1% (sacarose, glicose e
glicerol). O actinomiceto tambm foi
inoculado em 50 mL de meio Bennetts
(extrato de carne 0,1%; glicose 1%; peptona
0,2%; extrato de levedura 0,1%) e em 50 mL
de meio AC. Um pr-inculo foi preparado,
para cada meio, inoculando-se o isolado e
incubando por 48 h a 30C sob agitao. Aps
esse perodo, 5 mL do cultivo foi transferido
para um novo frasco contento o mesmo meio
de cultura. A produo de metablitos
secundrios com ao antimicrobiana foi
avaliada em 7, 10 e 14 dias, sob agitao.
Aps cada perodo de incubao, foram
retiradas alquotas de 5 mL de cada meio e
distribudas em microtubos para
centrifugao. As amostras foram
centrifugadas a 13.000 r.p.m. durante 10 min.
A avaliao quantitativa da produo de
metablito(s) secundrio(s) foi realizada por
meio da tcnica de difuso em poo,
utilizando-se 100 L do sobrenadante, com
posterior medio dos halos de inibio.

RESULTADOS E DISCUSSO
A atividade antimicrobiana dos isolados
de actinomicetos endofticos foi avaliada
quantitativamente pelo mtodo de dupla
camada. Apenas o isolado R18(6) mostrou-se
eficaz contra as bactrias Gram-negativas
apresentando halos de inibio entre 11 a 27
mm (Tabela 2). As bactrias Gram-negativas
possuem uma membrana externa composta de
lipopolissacardeos e fosfolipdeos (Hancock,
1997) uma das principais funes dessa
membrana agir como barreira de
permeabilidade (Nikaido, 2003). Dessa forma,
como houve inibio do crescimento das
bactrias Gram-negativas significa que a
molcula produzida pelo isolado R18(6) foi
capaz de permear a membrana externa. Os
compostos antimicrobianos, que passam pela
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membrana externa, podem agir como
desestabilizadores da mesma ligando-se aos
componentes estruturais da membrana
tornando-a mais permevel a ponto de romp-
la, como uma forma de atividade. As
molculas tambm podem ultrapassar a
membrana externa atravs das porinas ou
canais presentes nessa membrana (Hancock,
1997), agindo no interior da clula bacteriana.
Segundo o estudo de Oliveira (2011), os
isolados testados, no presente trabalho,
apresentam gene de resistncia aos beta-
lactmicos bla
TEM
e/ou bla
SHV
sugerindo
que o(s) metablito(s) secundrio(s)
produzido(s) pelo actinomiceto endoftico
R18(6) no apresenta(m) a estrutura do anel
beta-lactmico que seria clivada pelas
enzimas beta-lactamases produzidas por essas
bactrias.
Na tcnica de difuso em poo, foi
testada quantitativamente a atividade
antibitica do actinomiceto endoftico R18(6).
Os extratos brutos, aps crescimento de sete
dias, foram submetidos filtrao, com
membranas de 0,22 m e de 0,45 m, e
centrifugao. Apenas o extrato bruto
centrifugado apresentou atividade contra dois
isolados Gram-negativos 4EC05 e 4CE06
com halos de inibio de 6 e 15 mm
respectivamente.
Uma hiptese para a ausncia de
atividade bioativa nos extratos que foram
filtrados seria de que a(s) molcula(s)
presente(s) no extrato possam ter afinidade
pelos componentes da membrana ficando
dessa forma retida(s) na mesma. Nesse
ensaio, dois isolados de Escherichia sp. foram
inibidas na presena do(s) metablito(s). Esta
reduzida atividade observada com os extratos
brutos de actinomicetos j foram observados
em outros trabalhos (Badji et al., 2005; Takur
et al., 2007)

Tabela 2. Avaliao da atividade antimicrobiana dos actinomicetos endofticos pela tcnica
de dupla camada

Isolado Gram-negativo
Actinomicetos - Zona de inibio (mm)
R18(6) R(2)
1CC07 11 0
1CE02 19 0
2BS08 14,5 0
2CC12 24 0
4EE02 15,5 0
4DE05 17,5 0
4DC04 19 0
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A capacidade de produzir metablito(s)
secundrio(s) foi avaliada sob diferentes
fontes de carbono e diferentes tempos de
incubao. A avaliao foi realizada em
duplicata e os resultados esto expressos
como mdias entre os testes. O isolado
R18(6) cresceu em todos os meios de cultura
testados, mas o(s) metablito(s) com ao
antimicrobiana s foram observados nos
meios contendo glicerol, glicose e sacarose, e
no meio AC. Os meios de cultura mais
eficientes na produo de metablito(s) foram
aqueles contendo glicerol ou glicose como
fonte de carbono. O meio AC foi novamente
utilizado para verificar sua influncia como
fonte de carbono na atividade antimicrobiana
do actinomiceto, pois no teste de produo de
extrato bruto apenas dois isolados Gram-
negativos foram inibidos pelo extrato
produzido nesse meio. Oliveira (2009), em
estudo com o mesmo actinomiceto endoftico,
observou que o melhor meio para a produo
de metablitos foi o meio de cultura AC.
Takur et al. (2009) observaram que o meio
contendo glicerol era satisfatrio para o
crescimento e para a produo de antibiticos
por Streptomyces sp. Baos et al. (2009)
apontaram que a produo de cido
clavulnico pela espcie Streptomyces
clavuligerus era favorecida em meio contendo
glicerol. Aharonowitz & Demain (1978)
observaram que o meio contendo glicerol
permitia o crescimento do actinomiceto
Streptomyces clavuligerus, porm interfere na
produo de cefalosporina. Sathi et al. (2001)
relataram que o meio contendo sacarose foi o
melhor para a produo de metablitos
secundrios por actinomicetos. Sanchz &
Demain (2002) afirmaram que a glicose era
uma excelente fonte de carbono para o
crescimento celular e tem influncia na
produo de diversos antibiticos. Takur et al.
(2009) constataram tambm que o
crescimento celular no est relacionado com
a produo de metablitos secundrios. Ento,
um meio pode favorecer o crescimento do
4EC05 20,5 0
4CE06 21,5 0
2AC02 14,5 0
3CC04 17 0
3EC04 26,5 0
3DC01 11 0

Dimetro dos halos de inibio (mm)

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microrganismo, mas a produo de compostos
bioativos pode no ser significante.
Ao avaliarmos a influncia do tempo de
incubao na atividade antimicrobiana do
actinomiceto observou-se que o extrato
produzido com sete dias de incubao
apresentou melhor atividade antimicrobiana
(Figura 1 e 2). Al-Zahrani (2007) encontrou
melhor atividade antibitica com o perodo de
incubao de seis dias para o Streptomyces sp.


Figura 1. Avaliao da atividade antimicrobiana do isolado de actinomiceto Streptomyces R18(6),
crescido em diferentes fontes de carbono, utilizando a tcnica de difuso em poo, aps 7 dias de
incubao.


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Figura 2. Avaliao da atividade antimicrobiana do isolado de actinomiceto Streptomyces R18(6),
crescido em diferentes fontes de carbono, utilizando a tcnica de difuso em poo, aps 10 dias de
incubao.

Aps sete dias de incubao observou-
se que a atividade antimicrobiana foi
diminuindo conforme aumentavam os dias de
incubao: com sete dias de incubao, o
extrato teve atividade antibitica contra 12
isolados Gram-negativos (Figura 1); 10 dias, a
atividade antimicrobiana foi contra 9 das
bactrias Gram-negativas (Figura 2) e com 14
dias, no houve atividade contra os isolados
Gram-negativos.
Durante os testes, observou-se que
houve uma maior atividade, representada por
halos de inibio maiores, quando o
actinomiceto endoftico R18(6) foi cultivado
em meio slido comparado com o resultado
obtido com a cultivo em meio lquido (Figura
3). Takur et al. (2007) relataram que os
actinomicetos com atividade antimicrobiana
em meio slido tiveram a diminuio da
atividade em meio lquido. Badji et al. (2005)
observaram crescimento dos actinomicetos
em meio lquido, mas sem produo de
substncias ativas comparada ao meio slido.
Iwai & Omura (1982) constataram que a
diminuio da atividade do actinomiceto em
meio lquido pode ser resultado da
decomposio do antibitico no meio e que
tambm pode ocorrer danos celulares durante
o processo de agitao, interferindo na
atividade.


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Figura 3. Comparao da atividade antimicrobiana do actinomiceto Streptomyces R18(6) quando
crescido em meio slido e em meio lquido.

Nos halos de inibio formados, em
todos os tempos de incubao, apareceram
algumas colnias satlites, que pode ser
resultado de uma baixa concentrao do
metablito no extrato. Oliveira (2009),
realizando uma caracterizao parcial do
isolado R18(6), observou que este possui
similaridade com a espcie Streptomyces
pluricolorescens. No entanto, sobre essa
espcie, pouco foi encontrado na literatura
quanto a produo de compostos bioativos.

CONCLUSO
O actinomiceto R18(6) apresenta
potencial para a produo de metablito(s)
ativo(s) contra bactrias Gram-negativas
resistentes as - lactamases. A biossntese
do(s) composto(s) antimicrobiano(s) por esse
actinomiceto influenciada pela composio
do meio de cultura e pelo perodo de
incubao do actinomiceto. O meio de cultura
contendo glicerol ou glicose e o tempo de
incubao de sete dias favoreram a atividade
antimicrobiana do actinomiceto R18(6).

REFERNCIAS
CARVALHO TIELE DA SILVA ;DE ET AL
Revista Trpica Cincias Agrrias e Biolgicas
V. 6, N.3, pg.155,2012

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