CCM Phospholipids

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N ordre : 850
THESE
prsente
lInstitut National des Sciences Appliques de Toulouse
par
Marlne COT
en vue de lobtention du
DOCTORAT
De Sciences Ecologiques, Vtrinaires, Agronomiques et Bioingnieries
Spcialit : Microbiologie et Biocatalyse industrielles
Etudes physiologiques de ladaptation et de la rsistance de la
levure Saccharomyces cerevisiaeau cours de la production
intensive dthanol
Thse soutenue le 10 novembre 2006 14h, salle des thses lInstitut National des Sciences
Appliques de Toulouse devant la commission d'examen :
M. Thierry BERGES......................................................................................................Prsident
M. Herv ALEXANDRE............................................................................................Rapporteur
M. Jean-Marie SABLAYROLLES.............................................................................Rapporteur
M. Mostapha SALHI................................................................................................Examinateur
M. Jean-Marie FRANCOIS......................................................................................Co-directeur
M. Laurent BENBADIS...........................................................................................Co-directeur
Cette thse a t prpare au Laboratoire de Biotechnologie-Bioprocds UMS-CNRS 5504,
UR-INRA 792 de lINSA de Toulouse, dpartement de Gnie Biochimique et Alimentaire.
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3
Remerciements
Je tiens tout dabord remercier M. Grard Goma de mavoir accueilli au sein du laboratoire
alors quil en tait le directeur et pour son enthousiasme pour ce projet.
Je remercie mes co-directeurs de thse Laurent BENBADIS et Jean Marie FRANOIS. Ils
ont su chacun leur tour me remotiver en mettant en valeur mon travail par leurs connaissances
scientifiques. Jai appris beaucoup de nos discussions, qui aurait du tre plus frquentes.
Cette thse a t ralise, avec les difficults que cela a comports, en collaboration avec
lquipe de Gnie microbiologique et lquipe de Physiologie Microbienne des Eucaryotes. Je
remercie donc lensemble des personnes de lquipe fermentation qui ont particip aux
longues nuits devant le fermenteur. En particulier, je suis redevable Carole Jouve et
Stphane Guillouet qui ont port leur part du projet et qui ont notamment fortement contribu
finaliser la collaboration avec lentreprise Amylum. Je remercie le JMFs lab pour leur
soutien plus que scientifique. Merci au personnel de la plateforme Transcriptome-biopuce de
Toulouse pour leurs conseils et leur contribution lobtention des donnes transcriptomiques.
Parmi, les personnes qui ont directement contribues ce travail, je remercie Kenza Boulahya
qui, dans le cadre de son stage de DESU, a permis la mise en place des mthodes dextraction
et de dosage des lipides cellulaires. Je remercie aussi N.ROZES, qui ma accueilli au sein de
son laboratoire lUniversit nologique de Tarragone afin de mapprendre les bases des
analyses lipidiques.
Jai une pense toute particulire pour les anciens et les actuels doctorants du laboratoire avec
qui jai partag mes joies et mes dceptions. Que lavenir vous soit favorable et bon courage
ceux qui suivent ! Et je remercie aussi toutes les personnes du laboratoire qui mont aid un
moment ou un autre, celles qui ont partag mon bureau ou les pauses-caf Je remercie
particulirement MarieOdile Loret qui ma coute et paule dans les moments difficiles.
Un grand merci Hlne, Lidwine et Delphine avec qui jespre avoir partage une relation
privilgie dans les bons et les mauvais moments. Jai grandement apprci nos longues
discussions refaire nos vies et celles beaucoup moins ambitieuses mais nettement plus
rigolotes.
Un grand merci Fred pour avoir su mcouter au moment opportun. Merci Lucile de me
faire apprcier, du haut de ces 7 mois, chaque moment de la vie.
Enfin, je tiens ddier cette thse aux personnes de ma famille disparues trop tt et plus
particulirement mon frre Philippe qui me manque normment.
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Sommaire
RESUME............................................................................................................................ 13
INTRODUCTION GENERALE................................................... 15
PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIE....................................... 21
I. CHAPITRE 1 : Production microbienne de (bio-)thanol ...................................... 23
I.1. Contexte conomique et environnemental ................................................. 24
I.2. Les microorganismes utiliss...................................................................... 25
I.3. Les substrats utiliss ................................................................................... 26
I.4. Les procds de fermentation alcoolique utilisant des levures.................. 27
I.4.i. Fermentation type batch .................................................................... 28
I.4.ii. Fermentation type fed-batch.............................................................. 28
I.4.iii. Fermentation type continu................................................................. 29
I.4.iv. Procd dtude dvelopp au sein du laboratoire Biotechnologie
Bioprocds........................................................................................................ 31
II. CHAPITRE 2 : Gnralits sur la croissance des levures et la composition lipidique
des membranes................................................................................................................... 32
II.1. Les diffrents types de mtabolismes ......................................................... 32
II.1.i. Mtabolisme fermentaire................................................................... 32
II.1.ii. Mtabolisme oxydatif........................................................................ 33
II.1.iii. Orientation du mtabolisme et effet glucose ...................................... 33
II.2. Les principaux produits de la fermentation alcoolique............................. 34
II.3. Les exigences nutritionnelles ...................................................................... 35
II.4. Les phnomnes dinhibition lors de la production dthanol .................. 37
II.4.i. Par le substrat.................................................................................... 37
II.4.ii. Par les co-mtabolites produits .......................................................... 37
II.4.iii. Par lthanol : notion de tolrance lthanol .................................... 38
a. Sur la croissance cellulaire .................................................................. 38
b. Sur la capacit fermentaire .................................................................. 39
c. Sur la viabilit ..................................................................................... 39
d. Modle dinhibition............................................................................. 39
e. Notion de tolrance lthanol : .......................................................... 39
f. Facteur influenant la tolrance lthanol .......................................... 40
II.5. Constitution et proprits de la membrane plasmique.............................. 41
II.5.i. Les diffrents lipides et leur rle........................................................ 42
a. Les acides gras et esters dacides gras.................................................. 42
b. Les glycrophospholipides .................................................................. 43
c. Les mono-, di- et triglycrides ............................................................. 45
d. Les strols ........................................................................................... 46
e. Glycolipides et sphingolipides ............................................................. 48
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II.5.ii. Effet de la structure des lipides sur les proprits membranaires........ 49
a. La fluidit membranaire ...................................................................... 50
b. La permabilit ................................................................................... 51
III. CHAPITRE 3 : Effet de lthanol sur les cellules de Saccharomyces cerevisiae..... 52
III.1. Effet direct de l'thanol : ............................................................................ 52
III.1.i. Ethanol intracellulaire et extracellulaire :........................................... 52
III.1.ii. Effet de lthanol sur les enzymes glycolytiques................................ 53
III.1.iii. Perturbation des transports et de la rgulation de lhomostasie......... 53
III.1.iv. Effet de lthanol sur les membranes ................................................. 54
III.2. Action indirecte et rponse de la cellule..................................................... 55
III.2.i. Lthanol comme stress cellulaire : le water stress............................. 56
a. Le glycrol .......................................................................................... 56
b. Le trhalose......................................................................................... 57
c. Effet de lthanol sur lADN et la rgulation gntique........................ 59
III.2.ii. Influx et efflux de protons travers la membrane : Rle de lATPase
membranaire....................................................................................................... 59
III.2.iii. Modification de la permabilit et de la fluidit membranaire............ 60
a. La composition en acides gras ............................................................. 60
b. La composition en strols.................................................................... 61
c. Les phospholipides .............................................................................. 62
d. Les protines membranaires et autres molcules.................................. 62
III.3. Rponse transcriptomique la prsence dthanol ................................... 63
III.4. Gnes impliqus dans la tolrance lthanol ........................................... 65
III.5. Conclusion................................................................................................... 67
7
PARTIE II : MATERIEL ET METHODES................................. 69
I. Fermentation............................................................................................................. 71
I.1. Souche ......................................................................................................... 71
I.2. Milieux de culture ....................................................................................... 71
I.2.i. Milieu de conservation ...................................................................... 71
I.2.ii. Milieu riche....................................................................................... 71
I.2.iii. Milieux de prculture et de fermentation ........................................... 71
I.3. Bioracteur et conditions de culture .......................................................... 73
I.3.i. Prparation de l'inoculum.................................................................. 73
I.3.ii. Prparation du bioracteur................................................................. 73
II. mthodes analytiques ................................................................................................ 74
II.1. Caractrisation de la biomasse................................................................... 74
II.1.i. Mesure de la densit optique ............................................................. 74
II.1.ii. Dtermination de la masse sche totale.............................................. 74
II.1.iii. Dtermination de la viabilit cellulaire .............................................. 75
a. Bleu de mthylne............................................................................... 75
b. Fun1 .................................................................................................. 75
II.1.iv. Caractrisation morphologique de la biomasse .................................. 76
II.2. Dosage du glucose extracellulaire............................................................... 78
II.2.i. Dosage par mthode enzymatique ..................................................... 78
II.2.ii. Dosage par HPLC ............................................................................ 78
II.3. Dosage glucose, thanol, actate, glycrol. ............................................. 78
III. Analyses des composants macromolculaires .......................................................... 79
III.1. Protines : mthode du Biuret ................................................................... 79
III.2. Carbohydrates .......................................................................................... 80
III.3. ADN+ARN ................................................................................................. 80
IV. Analyses des composants lipidiques.......................................................................... 81
IV.1. Extraction des lipides cellulaires ............................................................... 81
IV.2. Dosage des lipides totaux par gravimtrie ................................................ 83
IV.3. Dosage des lipides par Chromatographie Couche Mince ......................... 83
IV.3.i. Solutions talons ............................................................................... 83
IV.3.ii. Sparation des lipides neutres par CCM............................................ 84
IV.3.iii. Sparation des phospholipides par CCM .......................................... 85
IV.3.iv. Rvlation des lipides sur plaque de CCM......................................... 86
IV.4. Dosage phospholipides totaux par une mthode colorimtrique ............. 87
IV.5. Dosage des strols totaux par une mthode colorimtrique ..................... 88
IV.6. Dosage des acides gras par chromatographie gazeuse ............................. 89
8
V. Analyse des composants paritaux .......................................................................... 91
V.1. Extraction des parois cellulaires ................................................................ 91
V.2. Dosage sucres totaux................................................................................... 92
V.3. Dosage de la chitine .................................................................................... 93
V.4. Dosage des mannanes et des glucanes ........................................................ 94
V.4.i. Hydrolyse acide................................................................................. 94
V.4.ii. Dosage par HPAEC .......................................................................... 95
VI. Analyse du contenu en rserves intracellulaires ..................................................... 96
VI.1. Lyse des cellules .......................................................................................... 96
VI.2. Dgradation du trhalose en unit glucose ................................................ 96
VI.3. Dgradation du glycogne en unit glucose ............................................... 97
VI.4. Dosage du glucose libr............................................................................. 97
VII. Mtabolites intracellulaires....................................................................................... 98
VII.1. Extraction.................................................................................................... 98
VII.2. Quantification par HPAEC Dionex............................................................ 99
VIII. Analyse des profils dexpression des gnes par lutilisation de puces ADN de type
microarray ....................................................................................................................... 101
VIII.1. Obtention des ARNm................................................................................ 101
VIII.1.i. Echantillonnage des cellules............................................................ 101
VIII.1.ii. Extraction des ARN ........................................................................ 101
VIII.1.iii. Vrification de la qualit des ARN : ................................................ 102
VIII.2. Prparation des sondes et des lames......................................................... 102
VIII.3. Rtrotranscription en ADNc et marquage............................................... 103
VIII.4. Qualit de la rtrotranscription ............................................................... 105
VIII.5. Hydridation............................................................................................... 106
VIII.6. Lecture du signal....................................................................................... 106
VIII.7. Analyse des donnes.................................................................................. 106
VIII.7.i. Normalisation.................................................................................. 106
VIII.7.ii. Identification des gnes diffrentiellement exprims........................ 106
VIII.7.iii. Calcul du nombre de rptitions ncessaires .................................... 107
a. Estimation lerreur exprimentale moyenne....................................... 108
b. Estimation du ratio seuil et du nombre de lames ................................ 109
VIII.7.iv. Analyse approfondie des rsultats de lanalyse transcriptomique ..... 110
9
PARTIE III :CHOIX ET OPTIMISATION DE LA METHODE
DEXTRACTION NECESSAIRE A LA QUANTIFICATION
DES CONTENUS INTRACELLULAIRES EN LIPIDES......... 111
I. Choix de la mthode dextraction des lipides cellulaires ....................................... 114
I.1. Descriptif des diffrentes mthodes.......................................................... 114
I.1.i. Mthode 1 ...................................................................................... 114
I.1.ii. Mthode 2 : extraction des lipides totaux sur biomasse frache ....... 116
I.1.iii. Mthode 3 : dite de gradient de solvant ........................................... 117
I.1.iv. Mthode 4 : Extraction au soxhlet ................................................... 118
I.2. Critres de choix ....................................................................................... 119
II. Validation de la mthode dextraction aux gradients de solvant : mthode 3 ...... 121
II.1. Efficacit et optimisation des diffrentes tapes ...................................... 121
II.1.i. Optimisation du nombre dtapes et du temps dextraction.............. 121
II.1.ii. Optimisation de ltape de lavage.................................................... 124
II.1.iii. Antioxydant .................................................................................... 126
II.2. Reproductibilit ........................................................................................ 128
II.3. Evaluation du rendement dextraction .................................................... 130
II.3.i. Sur solution de standards seuls ........................................................ 130
II.3.ii. Sur solution de standards en prsence de cellules............................. 131
III. Conclusion de la partie III ...................................................................................... 134
10
PARTIE IV : DYNAMIQUE DADAPTATION DE LA LEVURE
SACCHAROMYCES CEREVI SI AE A SA PRODUCTION
DETHANOL : ASPECTS MACROCINETIQUE ET
MICROSCOPIQUE...................................................................... 135
I. Aspect macrocintique des fermentations alcooliques de type fed-batch ............. 137
I.1. Suivi cintique des fermentations alcooliques de type fed-batch ............ 138
I.2. Analyse des titres et des rendements 45h.............................................. 142
I.3. Conclusion................................................................................................. 144
II. Analyse de la viabilit cellulaire, de la morphologie des cellules et de la composition
macromolculaire de la biomasse.................................................................................... 145
II.1. Analyse de la viabilit cellulaire au cours des procds de production
intensive dthanol .................................................................................................. 145
II.1.i. Mthode de mesure de la viabilit cellulaire .................................... 145
II.1.ii. Etat des cellules pendant les fermentations alcooliques par mesure de la
coloration au bleu de mthylne........................................................................ 148
II.1.iii. Conclusion sur la viabilit cellulaire................................................ 149
II.2. Evolution de la morphologie des cellules pendant une fermentation...... 150
II.2.i. Accumulation de cellules brillantes au cours de la fermentation ...... 151
II.2.ii. Evolution de la rpartition des diffrentes catgories des cellules
(cellules non bourgeonnantes, cellules bourgeonnantes et bourgeons) au cours de
la fermentation.................................................................................................. 155
II.2.iii. Conclusion : .................................................................................... 155
II.3. Etat de la composition macromolculaire des cellules au cours de la
production dthanol en mode fed-batch................................................................ 157
III. Conclusion de la partie IV ...................................................................................... 158
11
PARTIE V : REPONSE TRANSCRIPTOMIQUE DES
LEVURES LORS DUNE FERMENTATION DE TYPE FED-
BATCH.......................................................................................... 161
I. Prsentation du plan exprimental :....................................................................... 163
I.1. Choix de la fermentation et des prlvements pour le suivi cintique.... 163
I.2. Stratgie et traitement statistique ............................................................ 165
II. Analyse des rsultats ............................................................................................... 166
II.1. Description globale des changements transcriptionnels.......................... 166
II.2. Approfondissement des tendances mtaboliques et localisation
cellulaire des produits des gnes sur-exprims et sous-exprims .......................... 170
II.2.i. Familles fonctionnelles intervenant dans ladaptation lthanol..... 170
II.2.ii. Localisation cellulaire des produits des gnes sur-exprims pendant la
fermentation alcoolique .................................................................................... 174
II.3. Etude dtaille des donnes dexpression pertinentes pour la
comprhension de ladaptation de la levure sa production dthanol................ 176
II.3.i. Synthse protique rprime et ralentissement de la croissance ....... 176
II.3.ii. La rponse aux stress et changements environnementaux : deux
facteurs de transcription impliqus ................................................................... 176
II.3.iii. Mtabolisme li aux alcools ........................................................... 178
II.3.iv. Mtabolisme des rserves : trhalose et glycogne .......................... 179
II.3.v. Mtabolisme parital ...................................................................... 180
II.3.vi. Mtabolisme lipidique .................................................................... 181
II.3.vii. Respiration et balance redox ........................................................... 182
II.3.viii. Homostasie et transport cellulaire .................................................. 182
III. Conclusion de la partie V........................................................................................ 187
12
PARTIE VI : ANALYSE DE LA PHYSIOLOGIE DES
LEVURES AU COURS DE DEUX FERMENTATIONS
CONDUISANT A DES DIFFERENCES SIGNIFICATIVES EN
TITRE ETHANOLIQUE ............................................................. 191
I. Impact de la production dthanol sur lactivit glycolytique et laccumulation de
sucres de rserves des levures.......................................................................................... 193
I.1. Evolution des mtabolites glycolytiques et nergtiques intracellulaires 194
I.2. Fuite extracellulaire de mtabolites ......................................................... 198
I.3. Evolution du contenu intracellulaire en sucres de rserves : trhalose et
glycogne.................................................................................................................. 200
II. Impact de la production dthanol sur le contenu lipidique et les structures
membranaires et paritales ............................................................................................. 203
II.1. Impact de la production dthanol sur le contenu lipidique ................... 203
II.1.i. Evolution du contenu cellulaire en strols et esters de strols........... 204
II.1.ii. Evolution du contenu cellulaire en phospholipides ......................... 206
a. Phospholipides totaux........................................................................ 206
b. Proportions des diffrents phospholipides cellulaires......................... 209
II.1.iii. Evolution des autres composs lipidiques : Glycrides, Acides gras et
esters dacides gras ........................................................................................... 210
II.1.iv. Evolution du contenu cellulaire en lipides totaux pendant les
fermentations.................................................................................................... 212
II.1.v. Evolution des compositions relatives dans les diffrents acides gras en
fonction du degr dinsaturation et de la longueur de la chane ......................... 214
II.2. Impact de la production dthanol sur le contenu en sucres paritaux .. 216
III. Conclusion de la partie VI ...................................................................................... 218
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES.................. 223
ANNEXE.......................................................................................................................... 225
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES........................................................................ 237
LISTE DES FIGURES .................................................................................................... 255
LISTE DES TABLEAUX................................................................................................ 261
NOMENCLATURE......................................................................................................... 265
13
Rsum
Etudes physiologiques de ladaptation et de la rsistance de la levure S.cerevisiae au
cours de la production intensive dthanol
Dans le cadre de lintensification de la production dthanol par Saccharomyces cerevisiae,
une stratgie de fermentation alcoolique, qui a conduit un titre final en thanol de 120 147
g.l
-1
(15% 19 % v/v) en 45h, a t mise en place au sein du laboratoire. Une des
caractristiques de ce procd est de favoriser une phase de production dthanol dcouple
de la croissance cellulaire. La performance du procd dpend du maintien de lactivit
mtabolique des cellules aux fortes concentrations en thanol pendant cette phase. Durant ce
travail, ltat physiologique des levures pendant cette phase a pu tre caractris par
lintgration de donnes macrocintiques (taux de croissance, vitesse daccumulation,
rendement, productivit), microscopiques et mtaboliques. Cette tude a montr que
laccumulation de fortes concentrations en thanol provoque chez la levure un stress
environnemental et une perte de lintgrit membranaire. Une partie du contenu intracellulaire
se retrouve dans le milieu de culture. Ainsi, une part croissante de la population cellulaire du
fermenteur perd toute activit mtabolique. Les levures qui se maintiennent le plus longtemps
dans un tel environnement sont celles qui semblent acqurir un tat spcifique, proche dun
tat de quiescence.
Mots cl :
Fermentation alcoolique, Saccharomyces cerevisiae, tolrance lthanol, viabilit, lipides,
permabilit membranaire, physiologie
Physiologic study on yeast S.cerevisiae adaptation and resistance during intensive
production of ethanol
For ethanol intensive production with Saccharomyces cerevisiae, a specific alcoholic
fermentation strategy optimised in our laboratory leads to a production of 120 to 147 g.l
-1
of
ethanol (15 % to 19 % v/v) in 45h. At the end of the process, an ultimate phase allows
production of ethanol without biomass growth. The performance of the process depends on
maintaining the metabolic activity of cells exposed to high concentrations of ethanol during
this phase. During this work, the yeast physiology was characterized by integration of
macrokinetic (growth rate, ethanol production rate, yield, productivity), microscopic and
metabolic data. This work shows that intensive accumulation of ethanol induces an
environmental stress and a loss of membrane integrity in yeast. Part of the intracellular
content spreads in the culture medium. An increasing part of the cell population in the
fermentor loses their metabolic activity. Yeasts that are able to remain in such an extreme
environment seem to acquire a specific state, close to quiescent state.
Mots cl :
Alcoholic fermentation, Saccharomyces cerevisiae, ethanol tolerance, viability, lipids,
membrane permeability, physiology
14
15
Introduction gnrale
16
Introduction gnrale
17
Depuis une dizaine dannes, lUnion Europenne a revu totalement sa politique nergtique
et opte pour les nergies renouvelables. La directive 2003/30/CE vise promouvoir
lutilisation de biocarburants prsentant un double intrt : conomique (baisse de la
dpendance envers les pays dtenteurs des ressources fossiles, scurit dapprovisionnement,
valorisation des produits agricoles) et cologique (nergie renouvelable, rduction des gaz
effet de serre, impact environnemental des transports). Lthanol produit par fermentation
des sucres contenus dans des produits agricoles (betterave sucre, bl, mas, ), le plus
souvent par la levure Saccharomyces cerevisiae, fait partie des deux principales formes de
biocarburants encourages par lUnion Europenne (bio-thanol et bio-diesel). Il est
aujourdhui trs largement utilis au Brsil, o prs de 4,5 millions de vhicules lgers
fonctionnent avec un mlange riche en thanol (85%). La directive europenne vise
remplacer prs de 20% de la consommation europenne dessence et de diesel par du
biocarburant dici 2020. Il va donc falloir augmenter nos capacits de production pour
atteindre 9,3 millions de tonnes de bio-thanol dici 2010.
Ainsi, un effort particulier est fait sur la recherche de nouveaux procds plus performants,
notamment au niveau de la production dthanol par des microorganismes ou tape de
fermentation. Les performances des fermentations sont dpendantes de contraintes
technologiques (composition du substrat, taille de linstallation, difficult de mise en uvre et
de rcupration du produit ) et biologiques (notamment une inhibition par le produit form
lui-mme). Plusieurs stratgies ont dj permis dobtenir des titres en thanol, des rendements
et des productivits de plus en plus levs : une meilleure utilisation des sucres contenus dans
les substrats, des conditions de production mieux contrles, la conduite du procd (batch,
fed-batch, multi-tag, continu, continu recyclage.). Mais, lthanol devient, dans tous les
cas, toxique pour la cellule ce qui limite lobtention de productions forte concentration.
Ltude prsente ici se situe dans une logique de comprhension du phnomne de tolrance
lthanol de la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour raliser cette tude, nous avons choisi
dutiliser un procd de type fed-batch dvelopp au laboratoire (Alfenore et al. 2002) qui
nous a permis datteindre des concentrations comprises entre 120 et 147 g.l
-1
. Il sagit dun
procd relativement simple sur milieu synthtique optimis qui se caractrise par deux
phases distinctes :
Introduction gnrale
18
- Phase I : la production dthanol est couple la croissance
- Phase II : la croissance sarrte mais la production dthanol continue.
Cette dernire phase prsente un double intrt. Tout dabord, dun point de vue industriel, la
majorit des sucres consomms vont tre transforms en thanol. Dautre part, cest
lefficacit de production pendant cette phase qui semble dterminante dans la performance
du procd. Lefficacit de production pendant cette phase est lie la capacit pour la levure
de sadapter laccumulation dthanol.
De nombreux travaux ont dj t raliss pour essayer de comprendre le phnomne de
tolrance lthanol chez Saccharomyces cerevisiae. La diversit des conditions de cultures,
des souches, des mthodes utilises et enfin des phnomnes tudis ncessite tout dabord de
prciser la notion de tolrance lthanol. Il ny a pas de dfinition universelle, ni de
mthode unique pour la mesurer. La tolrance lthanol sera, pour nous, la capacit de la
levure sadapter et rsister leffet toxique de ce dernier, sachant que cette action peut
intervenir trois niveaux : linhibition de la croissance, linhibition de la production dthanol
et la perte de viabilit cellulaire. La littrature est trs exhaustive sur le sujet. Labondance des
donnes, parfois contradictoires, conduit des hypothses qui seront dveloppes dans ltude
Bibliographique (partie I).
Malgr labondance de la littrature, les mcanismes dadaptation de la levure des
concentrations toxiques en thanol, ne sont pas connus. Nous nous proposons ici daborder le
problme par une nouvelle approche. Cette tude se distingue des prcdents travaux sur deux
points. Nous tudions leffet de lthanol en condition de production et des concentrations
trs leves. Ce sont donc leffet dynamique de la production dthanol par la levure
Saccharomyces cerevisiae elle-mme et le comportement des levures en fin de fermentation
qui sont ici les points centraux de lanalyse et non leffet de lthanol ajout. Dautre part, le
milieu a t dfini pour viter toute carence nutritionnelle, les conditions sont matrises et
laccumulation de sous-produits est limite, contrairement aux fermentations nologiques,
brassicoles ou de production dthanol sur milieu complexe (mlasse, )
Mon travail a eu pour but dapporter une comprhension au phnomne dadaptation
de la levure Saccharomyces cerevisiae face sa production intensive dthanol afin
didentifier les processus physiologiques mis en uvre pour rsister laccumulation
dthanol et atteindre des performances de production de 147 g.l
-1
en 45 heures.
Introduction gnrale
19
En utilisant les diffrentes comptences du laboratoire, ltude sest construite autour de trois
niveaux dobservation. Au niveau du fermenteur, dans un premier temps, les donnes
macrocintiques permettent de quantifier les vitesses de consommation de substrat et de
production de produits et didentifier les diffrentes phases du processus de fermentation sur
lensemble des cellules. Au niveau de la cellule, diffrentes populations, en terme de viabilit
et de morphologie, sont mises en vidence par des analyses microscopiques quantitatives.
Enfin, lintrieur de la cellule, lanalyse du profil dexpression des gnes et de la
composition cellulaire en terme de lipides, de sucres paritaux, de sucres de rserves et des
principaux mtabolites intracellulaires rvle le comportement physiologique des levures dans
nos conditions de production intensive dthanol.
Les rsultats exprimentaux de cette thse ont dabord ncessit une approche
mthodologique approfondie pour obtenir des donnes quantitatives et fiables. Une partie
importante du travail a donc t consacre la slection et la mise au point de mthodes.
Pour le suivi des compositions lipidiques, les diffrentes mthodes testes et les critres de
choix, ainsi que les amliorations apportes sont dtailles dans la partie III.
La partie IV prsente le procd de fermentation et identifie le(s) paramtre(s) le(s) plus
important(s) pour la performance du procd de fermentation partir des donnes
macrocintiques obtenues pour quatre fermentations identiques lexception du mode
dapport de glucose, et ayant conduit des performances variables. Lobservation
microscopique des levures, couple aux donnes macrocintiques, nous a aussi permis de
mieux caractriser lvolution de la biomasse au cours de ce procd.
La rponse transcriptionnelle de la levure Saccharomyces cerevisiae, lors de la dynamique
daccumulation intensive dthanol produit au cours dune fermentation, a t dtermine par
la technologie des puces ADN. Le suivi cintique des profils dexpression de lensemble du
gnome, combin aux donnes de la littrature, a permis de mieux cerner des cibles
physiologiques potentielles de la rponse laccumulation dthanol dans nos conditions. Ces
donnes sont analyses dans la partie V.
Enfin, dans la partie VI, ltude se focalise sur lvolution des contenus intracellulaires des
diffrents lipides, des sucres de rserves et paritaux et de certains mtabolites glycolytiques
et nergtiques. Le suivi de la composition cellulaire met en vidence des changements
physiologiques lis laccumulation dthanol.
Introduction gnrale
20
Introduction gnrale
21
Partie I :
Etude bibliographie
Introduction gnrale
22
Partie I : Etude bibliographique
23
Dans les contextes cologique et conomique actuels, la production dthanol par voie
biologique connat un regain dintrt. Pourquoi Saccharomyces cerevisiae est-elle un
organisme de choix pour la production dthanol ? Quels sont les diffrents procds
envisags pour augmenter le titre final, le rendement ou la productivit ? Place dans les
bonnes conditions, avec le bon apport nutritionnel, la levure Saccharomyces cerevisiae peut
produire jusqu 20 GL (soit 20% v/v). Comme tout procd biotechnologique, il faut veiller
viter les inhibitions par le substrat et la formation de co-produits de fermentation. Mais
linhibition par lthanol produit est un frein majeur lobtention dun titre et dune
productivit leve en thanol. En effet, lthanol inhibe la croissance, la production dthanol
elle-mme et la viabilit. Aprs avoir dfini la notion de tolrance lthanol, je ferai un tour
dhorizon de la littrature qui nous donne des pistes sur les perturbations cellulaires
engendres par lthanol et sur les changements physiologiques et molculaires probablement
mis en place par la levure en rponse la prsence dthanol dans son environnement.
I. CHAPITRE 1 : Production microbienne de (bio-)thanol
Lutilisation de Saccharomyces cerevisiae pour la production dthanol comme produit
majoritaire a t fortement relance suite au contexte conomico-cologique actuel. En effet,
cet organisme eucaryote unicellulaire et non pathogne pour lhomme reprsente un modle
exprimental avec de nombreux avantages (la petite taille de son gnome, la facilit le
manipuler gntiquement, le squenage de son gnome en 1996 et labondance de la
littrature disponible). De plus, depuis des sicles, les proprits de fermentation de la levure
Saccharomyces cerevisiae sont utilises dans de nombreux procds de transformation :
vinification, brassage de la bire, Son utilisation pour la production dthanol-biocarburant
date de la fin du 19
me
sicle avec linvention de lautomobile. Dautres microorganismes,
dont Zymomonas mobilis, sont aussi de bons producteurs dthanol. Une multitude de
substrats dorigine vgtale, faible cot, peuvent tre ferments, du moment quils
contiennent une quantit importante de sucres assimilables. De plus, les outils de la gntique
permettent aujourdhui doptimiser les rendements dutilisation de la plante en tendant les
molcules assimilables. Aprs comparaison des diffrents procds de production, le
laboratoire a choisi de travailler sur la mise au point dun procd, appel bi-racteur
membrane.
24
I.1. Contexte conomique et environnemental
La production de biocarburants permet de rpondre lobjectif stratgique de diversifier nos
sources d'approvisionnement nergtique en dveloppant une nergie renouvelable partir de
matires agricoles (biomasse) produites en Europe. En effet, l'Union europenne connat une
dpendance nergtique croissante : aujourd'hui, nous dpendons 50 % des sources
d'nergie importes et, si rien n'est fait, ce pourcentage passera 70 % en 2030. Ds les
annes 1970, le souci de diversifier les sources dnergie devient une relle proccupation.
Les biocarburants ont tout dabord t carts car jugs peu rentables. Cependant, au vu de la
conjoncture conomique actuelle et du prix de plus en plus lev du ptrole, lthanol, produit
partir de la biomasse vgtale, apparat de plus en plus attrayant et a connu un regain
dintrt depuis les quinze dernires annes. Une tude, mene par lADEME et le ministre
de lindustrie, montre qu partir d'une unit d'nergie fossile 0,87 unit d'nergie est produite
sous forme d'essence, contre 2,05 sous forme d'thanol (ADEME/DIREM 2002). Les filires
biocarburants bnficient de plus de possibilits de progression significatives puisque
l'amlioration des techniques utilises, notamment lors de la fermentation et de la distillation,
permettrait de porter ce bilan nergtique de 2,05 3,3-3,5 dici 2009, alors que les marges de
progression sont moindres pour l'essence. L'tude montre aussi que pour chaque litre
d'essence remplac par un litre d'thanol, les missions de gaz effet de serre seraient rduites
de 75 % par rapport ce qu'aurait produit ce litre d'essence. Lutilisation dthanol permettrait
donc de rduire nos missions de gaz effet de serre, conformment aux engagements pris
dans le cadre du Protocole de Kyoto.
De nombreux progrs ont t raliss pour la rduction du cot des tapes des procds de
production d thanol partir de la biomasse (cf. Figure 1), notamment au niveau de ltape
de pr-traitement (cf. Figure 1). La distillation, qui tait au dpart une tape coteuse, a aussi
t fortement amliore (Wyman 2001). Les efforts de recherche se portent sur lamlioration
de ltape de fermentation, notamment par la recherche dorganismes ou de souches plus
rsistantes aux diffrents stress rencontrs lors de la fermentation alcoolique (temprature,
faible concentration en glucose, haute concentration en thanol). Des efforts sont aussi faits
pour diversifier les sources de carbones utilisables et amliorer les rendements, notamment
avec lutilisation des pentoses (Jeffries et Jin 2004).
25
Figure 1 : Schma regroupant les grandes tapes de lobtention dthanol biocarburant partir
de biomasse vgtale (Bothast et Schlicher 2005;Glazer et Nikaido 1993).
Les organismes les plus producteurs dthanol partir de sucres sont les levures de types
Saccharomyces ou Kluyveromyces et la bactrie Zymomonas mobilis. Au niveau mondial,
pour le moment, le bio-thanol est surtout produit partir de canne sucre au Brsil et de
mas aux USA. Le Brsil est le pays qui sinvestit le plus dans le bio-thanol, avec plus de
1 350 000 vhicules mixtes (qui peuvent fonctionner avec du carburant classique ou du
biocarburant) (Coelho 2005). Au niveau europen, la Directive europenne 2003/30/CE fixe
des objectifs de rfrence pour les biocarburants. Ceux-ci devront reprsenter 5,75% de
l'essence et du gazole mis la consommation d'ici 2010. La directive europenne 98/70/CE
rglemente lajout dthanol dans lessence sans modification des moteurs conventionnels :
soit sous forme dthanol hauteur de 5%, soit sous forme dETBE (Ethyl Tertio Butyl
Ether : additif lessence sous forme dester dthanol avec lisobutne) hauteur de 15 %.
I.2. Les microorganismes utiliss
Une grande varit de microorganismes produit de lthanol partir de polysaccharides.
Cependant peu sont rellement comptitifs en terme :
- de rendement en thanol par rapport au substrat consomm
- de capacit fermentaire
- de tolrance lthanol leve
- dadaptation aux conditions de fermentation
Etape 1
Etape 3
Culture
sucrire (canne
sucre)
Amidon (mas,
bl,sorgho, pomme
de terre, )
Lignocellulose
bois, dchets.)
Extraction du jus
par pressage
Hydrolyse
enzymatique
Broyage, vapeur
deau, Hydrolyse
acide, enzymatique
Fermentation : conversion des sucres
Rcupration de lthanol
Distillation
Dshydratation
Etape 1
Etape 2
Etape 3
Conversion de la biomasse en sucres
Culture
sucrire (canne
sucre)
Amidon (mas,
bl,sorgho, pomme
de terre, )
(rsidus agricoles,
Extraction du jus
par pressage
Hydrolyse
enzymatique
Broyage, vapeur
deau, Hydrolyse
acide, enzymatique
Dshydratation
26
Les levures (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces
pombe, Kluyveromyces sp.) et les bactries, comme Zymomonas mobilis, sont les plus
utilises, prsentant chacune des avantages et des dsavantages, notamment en fonction de la
composition du substrat et du procd employ. Les bactries produisent souvent dautres
sous-produits : dautres alcools, des acides organiques, des polyols, des ctones, ou des gaz
(mthane, dioxyde de carbone, hydrogne, ). Il existe quelques souches de Clostridium qui
peuvent avoir de bons rendements en thanol. Cependant, seule Zymomonas mobilis est
considre comme un strict producteur dthanol.
Dans les procds fermentaires utilisant la levure, loxygne est ncessaire pour des raisons
de maintenance de lintgrit cellulaire. Des conditions ares vont malheureusement
favoriser aussi la production de biomasse. Zymomonas prsente lavantage dtre anarobe
stricte et donc de produire peu de biomasse mais plus dthanol (Kosaric et Vardar-Sukan
2001c). Elle serait au moins aussi, voire plus, tolrante lthanol que Saccharomyces
cerevisiae suivant les souches (Glazer et Nikaido 1993). Zymomonas est trs efficace sur
glucose mais produit beaucoup de sous-produits lorsque le saccharose est la source de carbone
(notamment des acides organiques). Saccharomyces cerevisiae offre un plus large spectre
dutilisation de substrats. De plus, Saccharomyces cerevisiae est efficace en terme de
production dthanol bas pH (jusqu un pH de 4), ce qui vite les contaminations, alors que
la strilisation est encore ncessaire pour utiliser Zymomonas mobilis. Lutilisation de lun ou
de lautre de ces microorganismes va donc dpendre du substrat, de la facilit de mise en
uvre et surtout de la rentabilit totale du procd.
I.3. Les substrats utiliss
Les substrats utilisables pour la production dthanol sont trs varis : canne sucre, bl, riz,
mas, pomme de terre, sorgho, manioc Le choix va dpendre du cot et de la rentabilit du
procd.
Ces produits vgtaux dorigine agricole contiennent des rserves de glucides sous forme
damidon ou de saccharose. Les molcules damidon sont pralablement hydrolyses par voie
enzymatique le plus souvent, Saccharomyces cerevisiae ne possdant pas d-amylase
efficace. Les produits rsultant sont le glucose et le fructose, facilement assimilables par
Saccharomyces cerevisiae. Ce sont donc, en gnral les substrats riches en amidon et
saccharose qui sont privilgis pour la fermentation alcoolique.
27
Cependant, une part importante de la plante reste encore inexploite. Cest pourquoi, depuis
quelques annes, il a t envisag dutiliser aussi la lignocellulose, souvent abondamment
prsente dans les vgtaux. La lignocellulose se compose de molcules trs rsistantes qui
restent cependant plus difficiles hydrolyser en molcules assimilables par la levure. Elles
sont hydrolyses soit par hydrolyse acide, soit par hydrolyse enzymatique. Lhydrolyse de la
lignocellulose libre majoritairement du glucose, du galactose, du mannose, du xylose et de
larabinose. Or, Saccharomyces cerevisiae assimile peu ou pas les sucres cinq atomes de
carbones comme le xylose (Kosaric et Vardar-Sukan 2001b).
Pour palier leur dficience sur les sucres en C5, des approches dingnierie mtabolique
sont dveloppes pour lutilisation de composs lignocellulosiques :
- soit par intgration de gnes dutilisation des pentoses chez des microorganismes
producteurs dthanol : Saccharomyces cerevisiae (Jeffries et Jin 2004) ou Zymomonas
mobilis (Deanda et al. 1996;Gunasekaran et Chandra Raj 1999)
- soit en intgrant les gnes de production dthanol chez des organismes possdant les
enzymes pour mtaboliser ces composs (Ingram et al. 1998).
Ces modifications gntiques sont encore peu efficaces pour lactivit fermentaire et
demandent encore des amliorations. Une autre voie est lexploration et la comprhension du
mtabolisme de souches de levures peu connues qui fermentent naturellement le xylose
(comme Pichia stipitis) (Jeffries 2006).
Dans tous les cas, la production dthanol partir de produits vgtaux revient une
premire tape dhydrolyse en sucres monomriques facilement utilisables par le
microorganisme lors de ltape de fermentation. Le glucose, hexose majoritairement prsent,
peut donc servir de modle pour les tudes visant optimiser la production dthanol par voie
microbienne (cf. figure 1)
I.4. Les procds de fermentation alcoolique utilisant des levures
Avant ltape de fermentation, le substrat est dabord prpar (pressage, broyage,
vapocraquage, hydrolyse chimique ou enzymatique) afin den faire ressortir le jus qui pourra
tre ferment par les microorganismes (cf. figure 1). Des fermentations rapides avec des titres
et des rendements levs en thanol sont recherches pour minimiser les cots dexploitation
et lnergie ncessaire la distillation.
28
Dans cette partie, nous ne nous intresserons quaux procds technologiques de production
prioritaire dthanol par les levures, en faisant abstraction des mthodes usage agro-
alimentaire, comme la vinification et le brassage de la bire o de nombreuses autres
molcules sont galement produites (glycrol, actate, succinate, molcules aromatiques, ).
Lthanol en tant que molcule chimique est produit principalement par trois grands types de
procds : le batch, le fed-batch (ou semi-continu) et les procds continus. Les procds
batch et continu sont les plus utiliss lchelle industrielle.
I.4.i. Fermentation type batch
Cest le plus simple des procds utiliss en terme de mise en uvre et dinvestissement. Le
substrat et les levures sont initialement mis dans le racteur. Les fermentations se poursuivent
en gnral pendant 36 48h (Kosaric et Vardar-Sukan 2001a). Les performances dpendent
videmment des conditions de culture et des substrats utiliss. Les rendements de conversion
sont de lordre de 90 95% du rendement thorique pour une concentration finale en thanol
de 10 16 %(v/v) (environ 80 125 g.l
-1
) (Casey et Ingledew 1986). La productivit est en
moyenne assez faible sur tout le procd mais elle volue tout au long de la fermentation.
Un procd VHG (pour Very High Gravity) utilisant un substrat contenant plus de 300 g de
matires solides (origine : bl) par litre de milieu avec des enzymes de saccharification, a
permis datteindre des titre finaux maximum en thanol de 23,8 % v/v (environ 185 g.l
-1
) en
130 heures (Thomas et al. 1993).
Pour augmenter la productivit, les levures peuvent tre rcupres dun batch sur lautre : on
parle de batch recycl. La phase de latence peut ainsi tre rduite.
I.4.ii. Fermentation type fed-batch
Le fed-batch est un driv du batch, o le substrat est ajout au fur et mesure de la
fermentation, afin dviter les inhibitions par les substrats. La production dthanol se droule
selon deux phases : une phase de croissance cellulaire et de production dthanol et une phase
de production sans croissance.
Les concentrations finales en thanol peuvent atteindre 19% (v/v) (147 g.l
-1
) en 48h pour
Saccharomyces cerevisiae (Alfenore et al. 2002), ou 20,8 % (v/v) (environ en 160 g.l
-1
) en 20
jours pour Saccharomyces sake (Hayashida et Ohta 1981).
29
Lthanol peut tre retir au fur et mesure de sa production. Ainsi et grce un recyclage du
milieu de culture, Lu et al. (2003) ont atteint une productivit de 12 g dthanol.l
-1
.h
-1
.
I.4.iii. Fermentation type continu
A un tage
Le but est de bloquer les cellules en phase de croissance exponentielle et de production
dthanol. Cependant, le taux de production est difficile maintenir en raison de problmes de
stabilit du processus dans le temps (contamination, stabilit de la souche). La production
dthanol est aussi limite par une faible concentration en cellules et par linhibition par
lthanol lui-mme. La productivit dpend de lapport en substrat ; il convient donc de
trouver un optimum entre limitation et inhibition (Prenosil 1983).
A plusieurs tages
Plusieurs racteurs sont mis en cascade. A chaque tage, seffectue une phase diffrente de la
fermentation (croissance de la biomasse, production dthanol). Cette technique permet de
limiter linhibition par les produits finaux, daugmenter les titres de sortie en thanol et donc
la productivit (Maiorella et al. 1984). Une application dun procd continu plusieurs
tages (MCCF) conduit la production finale de 16,7 % (environ 130 g.l
-1
) dthanol
(Bayrock et Michael 2001).
A haute densit cellulaire et/ou recyclage de la biomasse
Pour augmenter la densit cellulaire, et donc la productivit, des systmes cellules recycles
sont utiliss. Il faut cependant purger une partie des cellules pour maintenir la viabilit
cellulaire. La concentration en biomasse peut atteindre jusqu plus de 100 g.l
-1
(Escobar et al.
2001), avec des productivits en thanol de lordre de 30-40 g.l
-1
.h
-1
(Ben Chaabane et al.
2006;del Rosario et al. 1979;Dellweg 1983;Prenosil 1983).
Dautres techniques consistent augmenter la productivit en soutirant lthanol au fur et
mesure de sa formation : soit par vaporation, soit par utilisation de membrane de dialyse,
mais son utilisation parat trop complexe pour une industrialisation.
Chaque type de procd prsente des avantages et des inconvnients. Les procds
discontinus sont faciles mettre en uvre et ont un faible cot dinvestissement. Mais la
productivit reste faible. Les procds continus permettent davoir des productivits plus
importantes mais connaissent des problmes de contamination et de stabilit de la souche dans
le temps, et de colmatage pour les procds cellules recycles (cf. tableau 1).
30
.
Tableau 1 : Principaux avantages, principaux inconvnients et ordre de grandeur de la
productivit atteinte par diffrents procds de production dthanol.
Avantages Inconvnients Productivit
g.l
-1
. h
-1
Batch
- Facilit dutilisation et de
mise en uvre
- Cot investissement
- Concentration finale en
thanol importante
- Phase de latence, faible
productivit,
- Temps de prparation et
de nettoyage important
2
Batch recycl
- Id batch mais phase de
latence raccourcie
- Temps de prparation et
de nettoyage important
15
Fed-batch ou
semi-continu
- Idem batch
- Limiter inhibition par le
substrat
- Productivit qui reste
faible
2-3
(1)
, 12
(2)
continu
- Gain de temps de
prparation
- Fermenteur souvent plus
petit
- Plus conomique
- Problme de stabilit
dans le temps :
contaminations, stabilit
des souches
- Faible concentration
cellulaire et en thanol
5
Continu haute
densit cellulaire
- Forte productivit
- Problme pour le
recyclage des cellules
(colmatage.)
40
(3)
Continu multi-
tag
- Sparation des tapes donc
limitation des inhibitions
- Beaucoup dquipement 12-18
(4)
Continu recycl
vaporation
biomasse
recycle
- Limite inhibition par thanol
- Forte productivit
- Problme pour le
recyclage des cellules
(colmatage.)
80
(5)
(1)
(Alfenore et al. 2002)
(2)
(Lu et al. 2003)
(3)
(Ben Chaabane et al. 2006;del Rosario et al. 1979)
(4)
(Bayrock et Michael 2001)
(5)
(Cysewski et Wilke 1978)
31
I.4.iv. Procd dtude dvelopp au sein du laboratoire Biotechnologie
Bioprocds
Chaque procd prsente des avantages et des inconvnients. Le choix dun type de procd
est un compromis entre le type de substrat, le cot dinvestissement et de fonctionnement, la
productivit et les rendements recherchs Le choix du laboratoire sest port sur un bio-
racteur bi-tag haute densit cellulaire (cf. figure 2) fonctionnant en continu avec
Saccharomyces cerevisiae comme organisme producteur afin doptimiser les rendements et la
productivit tout en minimisant les volumes traits (Ben Chaabane et al. 2006).
Figure 2 : a) schma de fonctionnement du BRM (Bi-Racteur Membrane),
s
: flux
dapport du substrat,
p
: flux de sortie du produit (thanol) ; b) rsultats cintiques dune
fermentation fed-batch avec lvolution de la viabilit (u ), de la vitesse spcifique de
production dthanol
p
( ) et du taux de croissance ( ) en fonction de la concentration
en thanol dans le milieu.
Un premier racteur R1 ar vise produire de la biomasse (Raction de croissance). Il
permet dobtenir des microorganismes dans un tat physiologique favorable la production
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 20 40 60 80 100 120 140 160
ethanol concentration g.l
-1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
g
r
o
w
t
h

r
a
t
e

h
-
1
e
t
h
a
n
o
l

p
r
o
d
u
c
t
i
o
n

r
a
t
e

g
.
g
-
1
.
h
-
1
,

v
i
a
b
i
l
i
t
y
Raction de croissance
Apport nutritionnel
Concentration en thanol
permissive
Aration
Raction de production
Faible aration
Concentrations en biomasse
et en produit leves
Gestion du dcs
purge
S

P
Boucle de rgnration
R1 R2
p
g
.
g
-
1
.
h
-
1
V
i
a
b
i
l
i
t
r
e
l
a
t
i
v
e
h
-
1
Ethanol g.l
-1
a)
b)
32
dthanol qui seffectuera dans le deuxime racteur R2 micro-ar (Raction de production),
limitant ainsi linhibition de la croissance par lthanol et lassimilation des vitamines. R2 est
coupl un systme de filtration tangentielle qui permet datteindre des hautes densits
cellulaires. La gestion de la viabilit et de lactivit des microorganismes est ralise par la
recirculation du milieu ractionnel de R2 vers R1. Lintrt dun tel systme est avant tout la
forte productivit lie la concentration en biomasse qui est trs leve. Il sagit donc
dobtenir de hautes concentrations en microorganismes actifs et viables dans les conditions de
concentrations en produit trs leves.
Les conditions optimales de fonctionnement de chaque tage peuvent tre dduites de ltude
dun systme de type fed-batch, plus facile mettre en uvre. En effet, dans ce type de
raction en continu, chaque tage du racteur est fig dans un tat de fonctionnement qui se
rapproche de ceux rencontrs dans une fermentation fed-batch (cf. figure 2). Dans le racteur
R1, ce sont des cellules en phase de croissance avec peu dthanol dans le milieu. Dans le
racteur R2, comme en fin de fermentation fed-batch, les cellules sont soumises un
environnement extrme. Les performances du procd dpendent donc en partie de la capacit
des levures tolrer les fortes concentrations en thanol. Dans le cadre du travail prsent
dans ce manuscrit, nous nous sommes focaliss sur le comportement des levures en fin de
fermentation fed-batch, afin de comprendre le phnomne dadaptation des levures aux hautes
concentrations en thanol.
II. CHAPITRE 2 : Gnralits sur la croissance des levures et la composition lipidique
des membranes
II.1. Les diffrents types de mtabolismes
II.1.i. Mtabolisme fermentaire
Comme il ny a pas chez la levure dautre accepteur dlectron que loxygne (O
2
), en
prsence de glucose et en absence doxygne, lATP ncessaire la cellule provient de la
production dthanol selon lquation suivante
C
6
H
12
O
6
+ 2 P
i
+ 2 ADP 2 C
2
H
6
O + 2 CO
2
+ 2 ATP
Le rendement thorique en thanol est de 0,51 g d'thanol par gramme de glucose consomm.
Cependant les ractions de maintenance, de synthse des infrastructures cellulaires et la
formation des composs secondaires (glycrol, acide actique, substances de rserve) limitent
33
ce rendement 80-90 % de sa valeur thorique. Le rendement en biomasse est de lordre de
0,10 g.g
-1
de glucose (Kappeli 1986).
En plus de lthanol, se forment dautres sous-produits dont le plus important est le glycrol.
Le but de la production de glycrol est de rquilibrer la balance rdox en rponse la
production de biomasse associe la raction fermentaire (Nevoigt et Stahl 1997;van Dijken
et Scheffers 1986).
II.1.ii. Mtabolisme oxydatif
En prsence doxygne, le glucose est en partie dgrad en H
2
O et CO
2
, aprs avoir emprunt
successivement la voie de la glycolyse, le cycle des acides tricarboxyliques et la chane
respiratoire, selon lquation bilan suivante :
C
6
H
12
O
6
+ 6 O
2
+ (4+12) P
i
+ (4+12) ADP 42 H
2
O + 6 CO
2
+ (4+12) ATP
Le rendement , aussi appel P/O car cest le nombre de moles dATP formes par mole
doxygne (1/2 O
2
) consomme, dpend de lefficacit de la chane respiratoire (Verduyn et
al. 1991). Le rendement P/O est en thorie de 1,5 mais in vivo, il est infrieur, de lordre de
1,2 1,3 (van Gulik et Heijnen 1995).
Au cours du mtabolisme oxydatif, une partie du glucose mtabolis gnre des
intermdiaires utiliss pour l'laboration de nouvelles cellules, en consommant lnergie
fournie par la chane respiratoire. Le rendement thorique en biomasse en conditions
oxydatives est denviron 0,5 g/g de glucose (Kappeli 1986).
Ce processus gnre beaucoup plus de moles d'ATP que lors de la fermentation.
II.1.iii. Orientation du mtabolisme et effet glucose
En anarobiose, la levure adopte un mtabolisme fermentaire indpendamment de la
concentration en substrat carbon. Cependant, des conditions danarobie stricte sont
difficiles mettre en place. La micro-aration est donc plus frquemment rencontre.
En prsence doxygne, cest le substrat carbon qui va tre dterminant dans l'orientation de
son mtabolisme. En mode batch sur glucose, la levure fermente, mme en prsence dO
2
. En
mode continu, les levures peuvent tre maintenues en rgime oxydatif des taux de dilution
trs faibles. Lorientation du mtabolisme est lie lefficacit glycolytique. Cest leffet
Crabtree. Certains avancent lhypothse que cest le flux glycolytique qui, lorsquil est trop
important sature la capacit respiratoire. Le surplus est rorient vers la production dthanol
34
(Sonnleitner et Kappeli 1986). Cependant des tudes plus rcentes montrent que le flux
travers le TCA est diminu en rgime oxydo-fermentaire par rapport un rgime purement
oxydatif (Frick et Wittmann 2005), concomitant une augmentation du flux glycolytique et
de la vitesse dassimilation du glucose. La baisse du flux au niveau du TCA pourrait tre due
la prsence de glucose qui induit la rpression dun certain nombre de gnes codant des
enzymes du TCA (Ronne 1995). Dautres gnes sont rprims au niveau transcriptionnel par
la prsence de glucose :
- Gnes de la gluconognse : FBP1 et PCK1
- Gnes codant des enzymes impliques dans la respiration
- Gnes codant des transporteurs et des enzymes dutilisation des autres sucres,
notamment les gnes MAL, SUC et GAL, dutilisation du maltose, du saccharose et du
galactose (Ronne 1995).
Bien que tout le phnomne ne soit pas encore lucid, le passage dun mtabolisme oxydatif
oxydo-fermentaire serait rgul au niveau traductionnel, mais aussi post-traductionnel
(Daran-Lapujade et al. 2004). Ce seraient les transporteurs de glucose qui serviraient de signal
de la prsence de glucose et induiraient ces rgulations (Carlson 1999).
II.2. Les principaux produits de la fermentation alcoolique
Les principaux produits de la fermentation alcoolique sont videmment lthanol et le dioxyde
de carbone. A eux deux, ils reprsentent entre 90 et 95% du glucose consomm. Le reste du
glucose est utilis lors de la croissance pour la production de biomasse et la production de
sous-produits. Les sous-produits majeurs de la fermentation alcoolique sont le glycrol, le
succinate et lactate (cf. figure 3) qui utilisent autour de 4 5% du substrat carbon restant
(Oura 1977). En plus petites quantits, peuvent tre aussi produits de lactaldhyde, des
acides gras (acide hexanoque, octanoque, dcanoque .. ), des alcools plus de deux
carbones.
35
Figure 3 : Schma rcapitulatif de la voie de production dthanol et des voies mtaboliques
annexes pouvant conduire la production de sous-produits.
II.3. Les exigences nutritionnelles
Les fermentations alcooliques se font sur des milieux riches en sucres. Saccharomyces
cerevisiae peut fermenter : le glucose, le maltose, le maltotriose, le trhalose, le galactose, le
mannose, le fructose, le saccharose, le raffinose. Elle ne fermente pas le lactose, le
melibiose, le cellobiose, le rhamnose, ni les sucres 5 atomes de carbones comme le xylose
ou larabinose (Jones et al. 1981)
L'azote, qui reprsente environ 10% du poids sec, joue un rle capital car il entre dans la
constitution de molcules simples (acides amins, nuclotides, vitamines et coenzymes)
Glucose
Fructose 1-6-P
Glycraldhyde-
3-P
Dihydroxy-
acttone-P
Glycrol
Pyruvate
Acetyl CoA
Actaldhyde
Ethanol
Actate
NADH
2
NAD
NAD
NADH
2
NADH
2
NAD
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
Citrate
Isocitrate
-ctoglutarate
Succinate
Fumarate
Malate
oxaloactate
NAD
NADH
2
NADH
2
NAD
FADH
2
FAD
CO
2
Synthse acides
gras, strols
Acetyl CoA
Pyruvate
ATP
ADP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
H+
NAD
NADH
2
O
2
H
2
O
ATP
ADP
Chane
respiratoire
CYTOSOL
MITOCHONDRIE
Glucose
Fructose 1-6-P
Glycraldhyde-
3-P
Dihydroxy-
acttone-P
Glycrol
Pyruvate
Acetyl CoA
Actaldhyde
Ethanol
Actate
NADH
2
NAD NADH
2
NAD
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
NADH
2
NAD
NADH
2
NAD
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
Citrate
Isocitrate
-ctoglutarate
Succinate
Fumarate
Malate
oxaloactate
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
NADH
2
NAD
NADH
2
NAD
FADH
2
FAD
FADH
2
FAD
CO
2
Synthse acides
gras, strols
Acetyl CoA
Pyruvate
ATP
ADP
ATP
ADP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
ADP
ATP
H+
NAD
NADH
2
NAD
NADH
2
O
2
H
2
O
O
2
H
2
O
ATP
ADP
ATP
ADP
Chane
respiratoire
CYTOSOL
MITOCHONDRIE
36
essentielles au fonctionnement cellulaire. La seule source d'azote minral utilisable par
Saccharomyces cerevisiae est l'ammonium (Jones et al. 1981).
Le phosphore se trouve principalement inclus dans les acides nucliques et les nuclotides di-
phosphate et tri-phosphate, mais aussi dans de nombreux constituants macromolculaires des
cellules, comme les phospholipides, ancres GPI, Le phosphore est assimilable par la levure
sous forme de phosphate par un mcanisme de transport actif (Jones et al. 1981).
Le soufre reprsente 0,4% du poids sec. Il peut tre assimil sous forme de mthionine ou
moindre cot de (NH
4
)
2
SO
4
(Jones et al. 1981).
Les oligo-lments sont essentiels tant sur le plan structural que catalytique. Les apports
minimaux en oligo-lments ncessaires la croissance et la production d'thanol par
Saccharomyces cerevisiae ont t dfinis (Suzuki et al. 1985).
Saccharomyces cerevisiae est incapable de synthtiser toutes les vitamines dont elle a besoin.
Par consquent, il est ncessaire de lui en apporter suffisamment. Les exigences vitaminiques
et les auxotrophies varient d'une souche l'autre. Les vitamines sont pour la plupart des
constituants des coenzymes ou des groupements prosthtiques denzymes :
- la biotine est implique dans le transport et lactivation du CO
2,
en tant que cofacteur
des enzymes de carboxylation
- le mso-inositol est un prcurseur de la synthse de lipides essentiels, tels que le
phosphatidyl-inositol et les sphingolipides
- l'acide nicotinique est un constituant du NAD, du NADP
- l'acide pantothnique est un constituant essentiel du CoenzymeA
- la pyridoxine se trouve dans les sites catalytiques denzymes et participe des
ractions de transamination et de dcarboxylation pour les mtabolismes des acides
amins, des lipides et des carbohydrates.
- la thiamine est un cofacteur des ractions de dcarboxylation
- lacide p-amino-benzoique est un coenzyme qui participe la synthse de purines et
des pyrimidines et de certains acides amins
L'oxygne joue un rle dans la production dthanol. Il va avoir une influence sur la
production de sous-produits. Plus le milieu va tre ar, moins il y a production de glycrol
37
(Alfenore et al. 2004;Kuriyama et Kobayashi 1993;Nissen et al. 2000). La production de
biomasse est fortement privilgie en conditions ares au dtriment du rendement
Y
ethanol/substrat
, mais le plus souvent en faveur dune meilleure productivit (Alfenore et al.
2004;Grosz et Stephanopoulos 1990;Ryu et al. 1984). La prsence doxygne aide aussi au
maintien de la viabilit et donc assure une meilleure tolrance lthanol, notamment par sa
participation au maintien de la composition lipidique des membranes. En absence doxygne,
il faut rajouter de lergostrol et des acides gras insaturs dans le milieu.
II.4. Les phnomnes dinhibition lors de la production dthanol
II.4.i. Par le substrat
De fortes concentrations en substrat induisent une inhibition de la croissance cellulaire et de la
capacit fermentaire. Linhibition de la capacit fermentaire devient significative entre 150 et
250 g.l
-1
de sucres, pour une inhibition complte rapporte 400 g.l
-1
de glucose, alors que
linhibition de la croissance commence des concentrations souvent plus faibles (Casey et
Ingledew 1986). Des concentrations en sucres suprieures 150 g.l
-1
inhibent gnralement
totalement la croissance cellulaire. Ce phnomne sexpliquerait par une inhibition des
enzymes de la glycolyse (Duntze et al. 1967) ou par une pression osmotique leve
accompagne d'une faible activit de l'eau (Nishino et al. 1985).
II.4.ii. Par les co-mtabolites produits
Leffet inhibiteur sur la croissance des principaux sous-produits a t test par Maiorella et al.
(1983) : acide actique, acide formique, acide lactique, actaldhyde, glycrol
(cf. tableau 2).
38
Tableau 2 : Concentrations inhibant 80% de la croissance cellulaire de Saccharomyces
cerevisiae pour les principaux sous-produits de la fermentation alcoolique (Maiorella et al.
1983) sur milieu synthtique glucose en mode continu pour la souche. Les sous-produits ont
t rajouts diffrentes concentrations dans lalimentation.
Sous-produit Concentration inhibitrice g.l
-1
Glycrol 450
Acide lactique 38
Acide actique 7,5
Actaldhyde 5
Acide formique 2,7
Linhibition de la croissance par les acides gras chane moyenne, tels que les acides
dcanoque et octanoque, est aussi connue notamment lors de fermentations nologiques
(Alexandre et al. 1998). Il semble y avoir une action nfaste sur le gradient de protons
transmembranaire. Lacide dcanoque induit une altration de la membrane en augmentant la
fluidit et donc linflux de proton (Alexandre et al. 1996).
Winter (1988) identifie les acides gras hexanoques, octanoques et dcanoques comme
principaux inhibiteurs en conditions de fermentation de type batch sur un milieu synthtique
proche de celui utilis dans notre tude. Il estime cette inhibition environ 1% par mg.l
-1
dacide gras, sachant que lacide dcanoque est plus toxique que loctanoque (Viegas et al.
1989). Il met aussi en vidence que la production de ces mtabolites peut-tre rduite de
manire importante par un apport adapt en vitamines.
II.4.iii. Par lthanol : notion de tolrance lthanol
L'effet ngatif de l'thanol se traduit par une inhibition gnrale de la cellule affectant aussi
bien la croissance cellulaire que la capacit fermentaire (D'Amore et Stewart 1987).
a. Sur la croissance cellulaire
Linhibition de la croissance par lthanol commence autour de 20 40 g.l
-1
(Casey et
Ingledew 1986). Chez Saccharomyces sp., la concentration inhibitrice (=0) pour la
croissance est de l'ordre de 70 110 g.l
-1
(Casey et Ingledew 1986) selon les souches et les
espces.
39
b. Sur la capacit fermentaire
Pour la production dthanol, la concentration inhibitrice peut aller jusqu plus de 20% (v/v)
pour Saccharomyces cerevisiae sake (Hayashida et Ohta 1981).
Linhibition par lthanol sur la capacit fermentaire est moins importante que sur la
croissance cellulaire. En effet, la production dthanol peut se poursuivre une fois la
croissance arrte.
c. Sur la viabilit
Leffet de lthanol sur la viabilit cellulaire ne se fait sentir que pour des concentrations plus
importantes que celles provoquant larrt de la croissance (Casey et Ingledew
1986;Kalmokoff et Ingledew 1985).
d. Modle dinhibition
Plusieurs modles peuvent tre proposs pour modliser ces inhibitions :
- modle linaire : ( )
Pcrit
Pi
G G = 1 max
- modle exponentiel : ( )
e
G G
kPi
= max
- modle hyperbolique : ( )
Pi Ki
Ki
G G
+
= max
O G est la grandeur tudie : soit le taux de croissance, soit la capacit fermentaire, soit la
viabilit. P
i
est la concentration en thanol et G
max
est cette mme grandeur pour P
i
=0 . P
crit
est
la concentration en thanol o la croissance est totalement inhibe. K et K
i
sont des constantes
dinhibition.
Il a t dcrit des relations, le plus souvent linaires, mais aussi exponentielles pour
linhibition de la croissance et de la capacit fermentaire (Casey et Ingledew 1986) et une
inhibition de type exponentiel pour la viabilit (Kalmokoff et Ingledew 1985).
e. Notion de tolrance lthanol :
Le phnomne de tolrance l'thanol est particulirement dlicat tudier dans la mesure o
il n'existe pas de technique universelle permettant de le quantifier. Certains auteurs s'appuient
40
sur les valeurs relatives la croissance cellulaire (Beavan et al. 1982;Thomas et Rose 1979),
la vitesse spcifique de production de l'thanol (Thomas et Rose 1979)ou encore la
viabilit cellulaire (Birch et Walker 2000;Dombek et Ingram 1987). Il est aussi possible
d'tudier le flux de protons travers la membrane plasmique (Jimnez et van Uden 1985).
En conclusion, la tolrance lthanol dpend du paramtre auquel on se rfre. Dans
cette tude, la tolrance lthanol sera dfinie comme la capacit des levures
maintenir leur viabilit de fortes concentrations en thanol.
f. Facteur influenant la tolrance lthanol
Dans ce cas, de nombreux facteurs peuvent influer sur la tolrance lthanol :
- La temprature : Plus la temprature de fermentation est leve (30-40C), plus la
croissance, la viabilit et la production dthanol sont sensibles lthanol (Aldiguier et
al. 2004;Casey et Ingledew 1986;D'Amore et Stewart 1987).
- Laration : laugmentation de laration amliorerait les vitesses de production
dthanol et diminuerait leffet inhibiteur de lthanol sur la croissance en condition de
production dthanol (Casey et Ingledew 1986). Leffet inhibiteur de lthanol ajout sur
le taux de croissance et la vitesse spcifique de production
p
dpend aussi des
conditions daration . Pour ces deux paramtres, leffet inhibiteur de lthanol diminue
en condition arobie par rapport lanarobiose (Aguilera et Benitez 1985). La prsence
de mitochondries et dun mtabolisme oxydatif actif dans les cellules semblent
essentiels au maintien dune plus faible inhibition par lthanol (Aguilera et Benitez
1985). De plus, loxygne est ncessaire la levure pour la synthse de certains
composs amliorant sa tolrance lthanol (acides gras insaturs, strols.)
- La composition du milieu : l'apport dans le milieu et la composition cellulaire en
lipides ont un impact sur la tolrance lthanol, tout comme loptimisation de lapport
en vitamines, surtout la biotine (Alfenore et al. 2002).
Lthanol est connu pour avoir un effet inhibiteur sur des enzymes, notamment celles de la
glycolyse (Pascual et al. 1988), mais cest surtout la membrane qui semble tre la plus
affecte.
41
II.5. Constitution et proprits de la membrane plasmique
La levure de boulanger est constitue de protines (45-60%), de carbohydrates (25-35%), de
lipides (5-15%) et de cendres (6-9%) (kockova-kratochvilova 1990). La composition des
levures en lipides varient beaucoup, en fonction de lespce (levure lipogne ou non), des
conditions de culture, de la composition des milieux et de la mthode de mesure (Sajbidor
1997), pouvant atteindre jusqu 80% pour certaines levures lipognes.
Pour Saccharomyces cerevisiae, les teneurs en lipides rpertories par Rattray (1988) vont de
3,5% 14,7% selon les souches et les conditions environnementales. Les lipides se retrouvent
surtout au niveau des membranes, mais peuvent aussi se retrouver au sein de particules de
lipides dans le cytosol. Ces particules de lipides sont constitues dun noyau de triglycrides
et desters de strols entour dune mono-couche de phospholipides dans laquelle se retrouve
quelques protines (Daum et al. 1998).
Toutes les membranes biologiques sont structures selon le mme modle : une bicouche de
phospholipides dans laquelle sont enchsses des molcules plus ou moins hydrophiles ou
hydrophobes. Ces molcules sont dautres lipides (strols, glycrides,.), des protines
membranaires et des parties glucidiques pour la plupart ancres sur des protines ou des
lipides. Les parties hydrophiles sorientent vers lextrieur de la membrane et les parties
hydrophobes vers lintrieur de la bicouche lipidique.
Les membranes:
- servent de barrire entre lintrieur et lextrieur de la cellule (membrane
plasmique) ou entre le cytosol et lintrieur des diffrentes organelles.
- contiennent des protines qui servent de transporteurs spcifiques, de senseurs, de
facteurs de transmission de signaux et qui interviennent dans des voies de
remodelage de la membrane
- exposent leur surface des rcepteurs qui participent au processus de
reconnaissance.
42
II.5.i. Les diffrents lipides et leur rle
a. Les acides gras et esters dacides gras
Les acides gras les plus prsents chez la levure sont les acides gras comportant 16 et 18
atomes de carbone. Le nombre de carbones est gnralement pair et compris entre 10 et 20.
Nanmoins, des acides gras avec un nombre impair datomes de carbone et des acides gras
allant de 6 26 atomes de carbone ont t identifis plus rarement (Daum et al. 1998). Les
acides gras insaturs les plus frquemment rencontrs sont : le C14:1 (cis 9), le C16:1 (cis 9),
le C18:1 (cis 9), le C18:2 (cis 9,12), le C18:3 (cis 9, 12, 15) (Pour les noms des acides gras se
rapporter au tableau 3). Les C16:1 et C18:1 reprsentent environ 80-90% des acides gras
totaux et les C16:0 et C18:0 entre 15 et 20%. Le reste est souvent infrieur 1% (Arnold
1980).
On peut aussi rencontrer dautres types dacides, comme lacide cyclopropne et lacide
cyclopropane, acides gras avec chanes carbones ramifies mais en trs petites quantits par
rapport aux autres dcrits ci-dessus.
Ils existent sous forme libre dans les cellules mais sont le plus souvent engags dans des
liaisons esters au sein des phospholipides, des mono-, di-, triglycrides et des esters de strols,
ou des liaisons amides dans le cas des sphingolipides. Les acides gras sont donc parmi les
premires molcules essentielles la structuration cellulaire. Lacide gras le plus rpandu
dans la famille des triglycrides est souvent lacide palmitique (C16:0), alors que pour les
esters de strols, lacide palmitolique (C16:1) et lacide olique (C18:1) sont souvent
prsents en grande quantit.
Les teneurs des diffrents acides gras varient selon les conditions de culture mais aussi selon
le genre et lespce pour des cultures ralises dans les mmes conditions. Le profil en acides
gras peut ainsi tre utilis en taxonomie (Rozs 1992).
La prsence doxygne est essentielle la synthse dacides gras insaturs. Il intervient au
niveau de lajout dune insaturation sur un ester CoA dacide gras satur par une dsaturase
(Ole1). L'apport en acide olique dans le milieu est essentiel pour une croissance en
anarobiose (Parks 1978).
43
Tableau 3 : Nom commun et systmatique des diffrents acides gras saturs et insaturs
prsents chez la levure.
Nombre carbones :
nombre insaturation
Nomcommun Nomsystmatique
6:0 Ac. caproque Ac. hexanoque
8:0 Ac. caprylique Ac. octanoque
10:0 Ac. caprique Ac. decanoque
12:0 Ac. laurique Ac. dodcanoque
14:0 Ac. myristique Ac. tetradecanoque
16:0 Ac. palmitique Ac. hexadcanoque
18:0 Ac. starique Ac. octadcanoque
Saturs
20:0 Ac. arachidique Ac. eicosanoque
14:1 (cis9) Ac. myristolique Ac. cis
9
ttradcanoque
16:1 (cis9) Ac. palmitolique Ac. cis
9
hexadcnoque
18:1 (cis9) Ac. olique Ac. cis
9
octadcnoque
18:2 (cis9,12) Ac. linolique Ac. cis
9,12
octadcadinoque
Insaturs
18:3 (cis9,12,15) Ac. linolnique Ac. cis
9,12,15
octadcatrinoque
b. Les glycrophospholipides
Sept glycrophospholipides (phospholipides) diffrents sont majoritairement rencontrs chez
Saccharomyces cerevisiae (cf. figure 4). Ce sont les constituants essentiels des membranes
biologiques. Ce sont eux qui forment la bicouche lipidique de la membrane plasmique. La
partie polaire est lextrieur de la bicouche et la partie hydrophobe est lintrieur. Ils
reprsentent entre 25 et 65% des lipides totaux et se rpartissent comme indiqu dans le
tableau 4. Sont aussi prsents en faible quantit les intermdiaires de la synthse de
phospholipides.
Les glycrophospholipides sont de la forme dcrite dans la figure 4 :
44
Figure 4 : Structure des diffrents phospholipides.
Les interactions entre phospholipides et protines et entre phospholipides et strols
influencent la structure et lactivit de la membrane. Suivant le type de phospholipides, les
parties polaires sont charges diffremment, donc la membrane va tre plus ou moins charge
suivant sa composition en phospholipides. La choline et lthanolamine donnent une charge
globale neutre (swittrion), alors que lacide phosphatidique, le phosphatidyl-glycrol et la
phosphatidyl-srine ont une charge ngative (anion). La phosphatidyl-choline est
frquemment le phospholipide le plus abondant (cf. tableau 4).
Acide gras 1
Acide gras 2
Partie hydrophile
Partie hydrophobe
R=
Phosphatidylcholine PC
Phosphatidylethanolamine PE
Phosphatidylinositol PI
Phosphatidylsrine PS
PG Phosphatidyglycerol
Cardiolipides CL
Acide phosphatidique PA
Acide gras 1
Acide gras 2
Acide gras 1
Acide gras 2
Partie hydrophile
Partie hydrophobe
R=
Phosphatidylcholine PC
Phosphatidylethanolamine PE
Phosphatidylinositol PI
Phosphatidylsrine PS
PG Phosphatidyglycerol
Cardiolipides CL
Acide phosphatidique PA
45
Tableau 4 : Teneur relative moyenne des diffrents phospholipides par rapport aux
phospholipides totaux.
Le phosphatidyl-inositol est un phospholipide essentiel probablement pour son rle dans la
signalisation cellulaire et comme senseur membranaire (Daum et al. 1998). Le phosphatidyl-
inositol participe la synthse des ancres GPI pour lancrage de nombreuses protines et la
synthse des sphingolipides.
La phosphatidyl-thanolamine, la phosphatidyl-choline et le phosphatidyl-inositol sont trs
prsents dans la membrane plasmique et dans lensemble des membranes subcellulaires. Par
contre, la phosphatidyl-thanolamine et les cardiolipides sont majoritairement prsents dans la
membrane plasmique et la membrane interne des mitochondries (Daum et al. 1998).
c. Les mono-, di- et triglycrides
Il sagit dune molcule de glycrol estrifie par un, deux ou trois acides gras.
Le triglycride est le glycride le plus prsent dans les levures (en gnral entre 7 et 15% des
lipides totaux pour Saccharomyces cerevisiae). Son rle nest pas clairement connu : il est
suppos servir de stockage dnergie et dacides gras. Il est prsent au sein de la membrane
plasmique et des membranes vacuolaires chez Saccharomyces cerevisiae (Rattray 1988). Une
partie peut saccumuler sous forme de granules. En cas daccumulation de triglycrides, ils
peuvent servir de prcurseurs aux phospholipides (Rattray 1988).
Les mono- et di-glycrides sont normalement beaucoup moins prsents dans les extraits
lipidiques des levures mais sont des constituants essentiels car intermdiaires dans la synthse
des triglycrides et des phospholipides.
% of total
phospholipids
Phosphatidylcholine PC 20-50
Phosphatidylethanolamine
PE
15-40
Phosphatidylinositol PI 10-40
Phosphatidyls rine PS 5-15
Phosphatidyglycerol PG < 3
Autres (cardiolipides )
% of total
phospholipids
Phosphatidylcholine PC 20-50
PE
15-40
Phosphatidylinositol PI 10-40
Phosphatidyls rine PS 5-15
Phosphatidyglycerol PG < 3
Autres (cardiolipides )
Phospholipides
% of total
phospholipids
% of total
phospholipids
20-50 20-50
PE
PE
15-40 15-40
Phosphatidylinositol PI Phosphatidylinositol PI 10-40 10-40
Phosphatidyls rine PS Phosphatidyls rine PS 5-15 5-15
Phosphatidyglycerol PG Phosphatidyglycerol PG < 3 < 3
Autres (cardiolipides ) Autres (cardiolipides )
< 20
% des phospholipides
totaux
46
d. Les strols
Les strols sont des constituants essentiels des membranes biologiques. Ils reprsentent en
gnral entre 0,1 et 1% du poids sec cellulaire. Lergostrol prsent plus de 90% est le
principal strol libre chez la levure (Rattray 1988). Les autres sont essentiellement des
intermdiaires entre le squalne et lergostrol (notamment le lanostrol). Ces strols libres se
retrouvent essentiellement au niveau des membranes, avec un ratio strols:phospholipides
gnralement compris entre 0,4 et 0,8. Les strols se caractrisent par une structure plane au
niveau des cycles, avec une extrmit (en du C3) une fonction hydroxyde non estrifie et
de lautre (C24) une longue chane carbone qui peut interagir avec les chanes carbones des
acides gras des phospholipides (cf. figure 5). Les strols libres ont probablement un rle
structural au sein des membranes, et en modifient ainsi considrablement les proprits. Ils
influenceraient ainsi la fluidit et la permabilit de la membrane, et par la mme occasion
lactivit des enzymes membranaires. Les strols vont condenser les phospholipides et donc
diminuer la fluidit de la membrane (Bottema et al. 1985).
Les teneurs en strols de la levure vont dpendre de la disponibilit de loxygne, des
conditions de culture dont la temprature, du milieu de culture et bien sur de la souche utilise
(Parks 1978). Le principal facteur influenant la composition en strols est laration.
Lergostrol nest pas synthtis en anarobiose, la prsence dergostrol dans le milieu est
donc essentielle pour assurer une croissance. En effet, loxygne intervient au niveau
de (Aries et Kirsop 1977;Aries et Kirsop 1978):
- la rgulation de la transcription des enzymes intervenant dans la conversion du 3-
hydroxy-3methyl-glutaryl CoA en acide mvalonique
- la cyclisation du squalne en lanostrol
- la dmthylation et dsaturation du lanostrol en ergostrol.
47
Figure 5 : Principaux intermdiaires de la voie de synthse de lergostrol. Dans lordre de la
voie de synthse, a) acide mvalonique, b) squalne, c) lanostrol, d) zymostrol, e)
5,7,24(28)-ergostatrienol, f) 5 ,7,22,24(28)-ergostatetraenol, g) ergostrol.
Plusieurs strols se retrouvent communment sous forme estrifie avec un acide gras :
essentiellement lergostrol, le zymostrol, le 5 ,7,24(28)-ergostatetrienol et le 5 ,7,22,24(28)-
ergostatetraenol. La diminution du taux de croissance semble tre un facteur daccumulation
des esters de strols chez Saccharomyces cerevisiae, ainsi que le passage en phase
stationnaire, la sporulation, la disponibilit en oxygne, certaines carences nutritionnelles
(glucose, phosphate) (Rattray 1988;Sandager et al. 2002). Les esters de strol sont
essentiellement localiss dans des vsicules de stockage de lipides, mais peu ou pas dans les
membranes. Cette observation suggre que les esters de strol servent de rserves dacides
gras et dintermdiaires de la synthse des strols libres, et vitent ainsi leur accumulation qui
peut tre toxique. La partie acide gras peut alors aussi tre utilise pour la synthse des
composants membranaires (Rattray 1988).
48
P-Inositol
P-Inositol-Mannose
P-Inositol-Mannose-P-Inositol
IPC
MIPC
M(IP)2C
e. Glycolipides et sphingolipides
Les glycolipides sont des lipides (diglycrides, strols) prsentant une ou plusieurs
glycosylations la surface de la membrane.
Les sphingolipides sont des composants essentiels des membranes des levures. Ils peuvent
reprsenter jusqu 30% des phospholipides totaux et 7% de la masse de la membrane
plasmique. Ils sont prsents en plus faible quantit dans les mitochondries (Patton et Lester
1991). Chez la levure, ils ont la structure dcrite dans la figure 6 :
Figure 6 : Structures des principaux sphingolipides. (van der Rest et al. 1995)
Les sphingolipides semblent jouer dabord un rle structural dans les membranes au mme
titre que les autres lipides. Ils joueraient aussi un rle de signal molculaire en rponse un
choc temprature (Dickson et al. 1997;Dickson et Lester 2002). Ils seraient aussi impliqus
dans les phnomnes dendocytose et dexocytose, de contrle de la croissance cellulaire, de
maintien de lintgrit cellulaire et de longvit cellulaire. Associs des strols, les
sphingolipides joueraient un rle de mdiateurs dans la transduction du signal et le bon
adressage la membrane plasmique de certaines protines (Ex :Gas1p, Pma1p, Nce2p)
(Dickson et al. 2006;Dickson et Lester 2002). En effet, les mannoprotines peuvent tre
49
ancres la membrane par lintermdiaire dune partie lipidique appele ancre GPI
(cf. figure 7).
Figure 7 : Structure des ancres GPI (Glycosylated Phosphatidyl-Inositol) rencontres pour les
protines de Saccharomyces cerevisiae (Fankhauser et al. 1993). La partie lipidique est le plus
souvent un cramide. Il y a en gnral quatre mannoses (M1 M4). M5 est optionnel en
(1-2) ou (1-3).
Certains sphingolipides sont aussi requis pour que lATPase vacuolaire soit fonctionnelle
(Chung et al. 2003).
II.5.ii. Effet de la structure des lipides sur les proprits membranaires
Les membranes ne sont pas des structures rigides. La bicouche lipidique constitue la fois
une structure suffisamment solide pour maintenir lintgrit cellulaire mais aussi assez fluide
pour permettre les mouvements des protines transmembranaires et membranaires et dautres
molcules. Les diffrents lments de la membrane bougent les uns par rapport aux autres. La
cohsion de la bicouche est assure par deux types dinteractions (cf. tableau 5) :
- les liaisons hydrognes : entre les parties polaires, soit directement entre les
phospholipides, soit par lintermdiaire de molcules deau
- les interactions de type Van der Walls entre les chanes carbones.
50
Tableau 5 : Nature et force des interactions au sein des membranes
Une membrane est donc caractrise par un quilibre entre les forces hydrophiles et
hydrophobes. Ces forces dpendent de la taille et de la charge de la partie polaire, de la
longueur, du nombre dinsaturations et de mthylations de la chane carbone.
A la temprature physiologique, la structure de la membrane biologique nest ni liquide ni
solide. Cet tat particulier de la matire est appel cristal liquide (Beney et Gervais 2001) :
cristal car ldifice est hautement organis et liquide car il confre la membrane sa
fluidit.
a. La fluidit membranaire
La fluidit de la membrane est la capacit des diffrentes molcules pouvoir se dplacer les
unes par rapport aux autres dans une mme couche (horizontalement).
Les interactions qui stabilisent le cur de la membrane concernent les parties apolaires des
constituants membranaires, il sagit de liaisons lectrostatiques de type Van de Walls, qui sont
beaucoup moins fortes que les liaisons qui unissent les ttes polaires et elles varient fortement
avec la distance entre les molcules (la force de linteraction est inversement proportionnelle
la distance puissance douze).
La nature hydrophobe de ces interactions est une barrire la diffusion passive des ions et aux
molcules polaires (Beney et Gervais 2001).
La labilit des interactions assure une fluidit plus forte au sein de la membrane qu
lextrieur ce qui permet le positionnement et lactivit enzymatique ou de transport des
protines intrinsques.
Les principaux facteurs agissant sur ces interactions sont :
- la prsence de chanes insatures car la prsence de doubles liaisons principalement de
configuration cis a pour effet dcarter les chanes hydrocarbones et donc de
diminuer les interactions de van der Walls.
- la prsence de strols : Les strols sintercalent dans la membrane et vont avoir
tendance en diminuer la fluidit. La configuration plane et volumineuse du noyau
strode et sa rigidit tend compresser les chanes aliphatiques des lipides
Partie de la molcule Nature de linteraction
lectrostatique
Ordre de grandeur de
lnergie dinteraction
ttes polaires Liaisons hydrognes 5 30 KJ/mol
chanes hydrocarbones Interaction de Van der Walls
diple instantan/diple induit
1 5 KJ/mol
51
environnants ce qui augmente la force des liaisons entre ces chanes (Bottema et al.
1985). Cet effet se rpercute jusquau carbone C
8
des phospholipides. Au-del de ce
carbone, la courte chane aliphatique des strols va avoir tendance augmenter la
fluidit entre les chanes des phospholipides adjacentes. Cet effet est plus important
lorsque la chane du strol est insature (comme cest le cas chez lergostrol qui est le
principal composant strode de la membrane de S. cerevisiae ou le stigmastrol) que
lorsque la chane est linaire (comme chez le cholestrol ou le campestrol). La
prsence dergostrol a donc tendance rigidifier la membrane.
- Les lipides longue chane diminuent la fluidit de la membrane : en effet, plus la
chane aliphatique des phospholipides est longue, plus les interactions de van der
Walls sont importantes et vont rigidifier la membrane.
b. La permabilit
La permabilit est la proprit que possde la surface cellulaire d'absorber directement des
substances du milieu extracellulaire et d'y liminer d'autres substances. Elle peut prendre deux
formes.
1. La permabilit passive ou diffusion. Elle dpend uniquement des lois physico-
chimiques et ne ncessite pas l'intervention active de la cellule. Le passage dun ct
lautre de la membrane suit les lois de la thermodynamique. On en distingue deux types :
La diffusion simple : elle nimplique aucun transporteur spcifique et dpend
du gradient de concentration, de lpaisseur et de la composition de la membrane, de
la taille de la molcule, du degr dionisation et de la liposolubilit : cest le cas des
molcules telles que les gaz (O
2
, N
2
, CO
2
), H
2
O, des petites molcules polaires non
charges (ure, )
La diffusion facilite : elle concerne la permabilit de diverses molcules
polaires (oses, ions, acides amins) qui passent travers la membrane plasmique sous
l'effet du gradient de concentration. Ces substances sont prises en charge par des
transporteurs (permases) qui les dlivrent l'intrieur de la cellule. Il s'agit d'un
mcanisme saturable.
2. La permabilit active ou transport actif. Celui-ci implique la participation de la cellule par
un apport d'nergie mtabolique. Ce mcanisme permet le transport contre le gradient de
52
concentration. Ce transport, relativement spcifique une molcule ou une famille de
molcules, se fait par laction dune enzyme dont lactivit est fortement dpendante de la
structure de la membrane. Le plus souvent, lnergie ncessaire est apporte par couplage
avec une molcule dATP (ABC transporteur, ATPase)
Les diffrentes proprits de la membrane, ainsi que leur composition lipidique sont
modifies en prsence dthanol. La membrane est-elle la seule cible de laction de
l thanol ? Comment se manifeste leffet toxique de lthanol sur la cellule? Et comment va
ragir la cellule ?
III. CHAPITRE 3 : Effet de lthanol sur les cellules de Saccharomyces cerevisiae
III.1. Effet direct de l'thanol :
III.1.i. Ethanol intracellulaire et extracellulaire :
La tolrance lthanol est en gnral dtermine pour de lthanol ajout, or il est souvent
dcrit que lthanol produit serait plus toxique que lthanol ajout sur la croissance cellulaire
(Casey et Ingledew 1986;D'Amore et al. 1990;Novak et al. 1981).
Une des hypothses pour expliquer la diffrence de toxicit entre lthanol ajout et produit
est laccumulation intracellulaire dthanol pendant la fermentation. Cependant, cette ide a
t contredite par dautres travaux (Dombek et Ingram 1986;Guijarro et Lagunas 1984) qui
trouvent des concentrations similaires en intracellulaire et en extracellulaire. Les artefacts des
travaux antrieurs seraient probablement dus la mthodologie employe pour le dosage de
lthanol intracellulaire.
Des travaux plus rcents utilisant une mthode adapte montrent une accumulation dthanol
intracellulaire en dbut de fermentation. Les concentrations entre thanol intracellulaire et
extracellulaire squilibrent au fur et mesure de lavancement de la fermentation (D'Amore
et al. 1988) (ds 15-20 g.l
-1
dthanol). Dombek et Ingram (1986) nont en effet travaill
quaprs 12 h de fermentation, moment o il ny a plus de diffrence entre thanol intra et
extracellulaire. Mais DAmore et al. (1988) nuancent leur conclusion, en laissant entrevoir de
possibles erreurs dues des concentrations trs faibles en thanol en dbut de fermentation et
un faible nombre de cellules. Par contre, Guijaro et Lagunas (1984) affirment que lthanol
pntre au travers des membranes par simple diffusion, sans utilisation dun transporteur. Ils
53
avancent plusieurs arguments pour cela : lquilibre entre lintrieur et lextrieur est
rapidement atteint et les vitesses dinflux et defflux dthanol sont insensibles au changement
de pH, la prsence danalogues structuraux de lthanol et dinhibiteurs de protines. Leffet
de laccumulation dthanol na donc pas pu tre clairement dmontr.
Une autre hypothse pour expliquer leffet plus toxique de lthanol produit est
laccumulation de sous-produits inhibiteurs pendant la fermentation et les changements de
conditions de culture (limitation nutritionnelle, pression osmotique) qui vont aussi avoir
une influence sur la croissance cellulaire (Casey et Ingledew 1986).
III.1.ii. Effet de lthanol sur les enzymes glycolytiques
Les enzymes les plus sensibles in vitro lthanol semblent tre : la phosphoglycrate kinase,
la phosphoglycrate mutase et la pyruvate dcarboxylase (Millar et al. 1982) pour des
concentrations en thanol infrieures 10% (v/v). Pour les autres enzymes de la glycolyse les
auteurs semblent saccorder sur le fait quil ny a pas dinhibition significative jusqu
pratiquement 12% (v/v) (Millar et al. 1982;Pascual et al. 1988).
Pour la majorit des enzymes glycolytiques, il semblerait y avoir une inhibition non-
comptitive, cest--dire que lthanol ne prend pas la place du substrat sur son site de
fixation, mais agit de manire plus gnrale sur la structure de lenzyme (Millar et al. 1982).
III.1.iii. Perturbation des transports et de la rgulation de lhomostasie
En utilisant le D-xylose (analogue non mtabolisable du glucose), Leao et van Uden (1982)
ont tudi leffet de lthanol et dautres alcools sur le transport de glucose. Aucun alcool ne
change laffinit du transporteur. Par contre, la vitesse maximale dassimilation dcrot avec
laugmentation de la concentration en alcool selon la relation :
S Km
S
e
V v
kx
+
=
.
0
max
V
0
max
= Vitesse maximale dassimilation en absence dthanol
,
x=concentration en alcool,
k=constante dinhibition, Km = constante daffinit et S= concentration en substrat
De plus, il existe une corrlation entre la constante dinhibition de chaque alcool et le
coefficient de rpartition entre la membrane et le tampon. Le degr dinhibition de chaque
54
alcool est dpendent de la solubilit de lalcool dans les lipides membranaires et de leur
volume molculaire (cf. figure 8). Leao et van Uden (1982) ont conclu que les alcools
inhibent le transport du glucose par changement de lenvironnement lipidique de la
membrane. Du fait de la perturbation des membranes cellulaires par lthanol, les systmes de
transport sen trouvent profondment perturbs.
Figure 8 : Relation entre la concentration en alcool qui inhibe de 50% lactivit du
transporteur du glucose et le coefficient de partage des alcools entre les membranes et le
tampon utilis pour lexprience (Leao et van Uden 1982).
Lapport dans le milieu dacides gras poly-insaturs (C18 :2) diminue leffet dun choc
thanol sur les transports de glucose, de glucosamine, dalanine et de lysine par rapport un
apport dacide gras mono-insaturs (C18 :1) (Thomas et Rose 1979).
En plus du transport des sucres, sont aussi affects par la prsence dthanol les transports
dacides amins (Ferreras et al. 1989;Garcia et Kotyk 1988) et dammonium (Cardoso et Leao
1992).
III.1.iv. Effet de lthanol sur les membranes
Lthanol, comme tout alcool, est une molcule amphiphile. La fonction hydroxyle est la
partie hydrophile de la molcule qui peut interagir avec les ttes polaires des phospholipides.
Coefficient de partage lipides/Tampon
[alcanol]
50%
mol/l
55
Paralllement, la fonction thyle, partie hydrophobe, peut potentiellement sintercaler entre
les chanes aliphatiques des phospholipides. Lthanol peut donc simmiscer et perturber la
structure de la membrane (Slater et al. 1993).
Les alcools linaires causeraient des dsordres au niveau de la chane glycrique de
phospholipides dans les membranes, suggrant que les groupements hydroxyles de ces
composs sancrent au niveau de linterface aqueuse des lipides (Weber et de Bont 1996). Les
liaisons hydrognes formes entre phospholipides et thanol sont moins fortes quavec leau.
Ces modifications se traduisent par une augmentation de la fluidit membranaire avec des
mouvements lipidiques (diffusion latrale et rotation) plus frquents (Ghosh 1988) et par une
altration du processus dinsertion de certaines protines, ncessitant la formation de liaisons
hydrognes (Ingram et Buttke 1984). Dautre part, la pntration de la molcule dthanol
lintrieur de la bicouche augmente la polarit de cette zone normalement impermable aux
molcules polaires (Alexandre et al. 1994a;Slater et al. 1993). Ainsi, la membrane deviendrait
plus permable aux ions et autres petites molcules polaires, comme leau et les protons.
Lthanol aurait donc pour effet de dissiper la force protomotrice, de diminuer les interactions
de van der Walls et donc daugmenter la fluidit membranaire.
III.2. Action indirecte et rponse de la cellule
Lthanol va crer localement une baisse de lactivit de leau, en sintercalant entre les ttes
hydrophiles des phospholipides. Leau devient ainsi moins disponible pour les fonctions
cellulaires ce qui va crer un stress cellulaire appel Water stress (Iwahashi et al. 1995).
La baisse de la disponibilit en eau se rpercute diffrents niveaux :
Au niveau membranaire : leau nest plus disponible pour stabiliser la face extracellulaire et
intracellulaire de la membrane ce qui augmente la fluidit membranaire.
Au niveau enzymologique : leau nest plus disponible pour maintenir le site actif des
enzymes et des transporteurs hydrophiles (transporteur du glucose, des acides amins) en
conformation native, ce qui va affecter leur activit. Lactivit des enzymes dont la raction
utilise directement la molcule deau est ainsi diminue.
Au niveau molculaire : notamment sur la configuration de lADN.
56
III.2.i. Lthanol comme stress cellulaire : le water stress
La molcule dthanol perturbe les liaisons hydrognes responsables de la stabilit des
interfaces qui sparent la bicouche lipidique et la phase aqueuse. Ces liaisons hydrognes
relient les parties hydrophiles des constituants membranaires en rseau.
Ces liaisons hydrognes peuvent tre distingues en deux catgories suivant quelles
ncessitent ou non lintervention de molcule deau. Les liaisons hydrognes
directes stablissent directement entre les ttes polaires des phospholipides tandis que les
liaisons hydrognes indirectes stablissent entre deux phospholipides via une ou plusieurs
molcules deau. Seules la phosphatidyl-srine et la phosphatidyl-thanolamine sont capables
via leur fonction amine dtablir des liaisons hydrognes directes, de ce fait les liaisons
indirectes sont les plus rpandues.
De part sa nature amphiphile, lthanol va monopoliser des molcules deau qui ne seront plus
disponibles pour dautres fonctions biologiques (Iwahashi et al. 1995). Le water stress
provient de la baisse de lactivit de leau, au moins localement, due la prsence de
molcules dthanol. Lactivit de leau diminue quand la concentration en thanol augmente
ce qui va avoir une influence sur les composs hydrats de la levure comme les enzymes et la
membrane (Hallsworth 1998). Les liaisons hydrogne de la membrane sen trouvent ainsi
perturbes. La permabilit et la fluidit de la membrane augmentent allant parfois jusqu la
lyse cellulaire (Hallsworth 1998;Kollar et al. 1993b).
En cas de water stress , la cellule accumule des composs qui sont supposs protger la
structure et la fonction des autres composs cellulaires dshydrats en remplaant les
molcules deau : les polyols comme le glycrol, les acides amins et le trhalose (Hallsworth
1998).
a. Le glycrol
Le glycrol qui a une masse molculaire plus faible que le trhalose va intervenir dans les
phnomnes dajustement osmotique (Edgley et Brown 1983). Lorsque la concentration en
sucre dans le milieu extrieur est trs leve (solution hypertonique) leau va avoir tendance
sortir de la cellule afin de tendre vers lquilibre osmotique des solutions. Pour contrebalancer
cette perte en molcules deau la cellule va augmenter losmolarit de son milieu
intracellulaire (Hallsworth 1998) en augmentant la synthse de glycrol et en diminuant la
permabilit de la membrane pour le glycrol ce qui permet laccumulation de glycrol dans
57
le cytoplasme. Laugmentation de losmolarit intracellulaire assure le rtablissement de la
pression de turgescence et du volume cellulaire.
Le glycrol va intervenir dans des chocs osmotiques modrs lorsque lactivit de leau Aw
atteint 0,98 (Hounsa et al. 1998). Le glycrol va principalement tre impliqu dans les
mcanismes lis ladaptation lthanol endogne. Lors de la production dthanol
endogne il y a augmentation progressive de la production de glycrol afin de maintenir
lquilibre osmotique des solutions, la fonction et lintgrit des enzymes. A laction du
glycrol sajoute gnralement la synthse des protines chaperonnes (les Hsp) qui sont
galement impliques lors de la rponse aux chocs thermiques (Lewis et al. 1995) et dans le
maintien de la stabilit membranaire. A de fortes concentrations en thanol endogne et lors
des chocs en thanol exogne, laction protectrice du glycrol sur la membrane est limite.
b. Le trhalose
Le trhalose est un disaccharide non rduit dunits glucose. Il est synthtis par un complexe
enzymatique : la trhalose synthase, code par quatre gnes (TPS1, TPS2, TPS3 et TSL1)
partir dUDP-glucose et de Glucose-6-phosphate. Il est hydrolys par deux voies distinctes :
par une trhalase neutre cytosolique (Nth1) (Kopp et al. 1993) et par une trhalase (ath1p)
dont 90% de lactivit est situe dans lespace priplasmique (Jules et al. 2004). Ces
trhalases sont rgules par un mcanisme de phosphorylation/ dphosphorylation catalys
par des protines kinases AMPc dpendantes (de Virgilio et al. 1991).
Le trhalose a un rle prpondrant lors de la rsistance la dshydratation de S. cerevisiae
(Gadd et al. 1987). Laccumulation de trhalose pourrait donc tre stimule en rponse la
baisse de lactivit de leau.
Le trhalose joue galement un rle prpondrant dans la protection de la cellule contre des
stress environnementaux de diverses natures (thermiques, osmotiques) (Alexandre et al.
1998;Franois et Parrou 2001;Parrou et al. 1997). Ces proprits sont utilises afin
daugmenter la tolrance de la levure aux oprations de conglation, de schage et de
rhydratation (Coutinho et al. 1988). Le trhalose va intervenir lorsque leau nest plus
disponible pour tablir des liaisons hydrognes : ce qui est notamment le cas lorsque les
molcules deau sont utilises pour solubiliser lthanol fortes concentrations ou bien
lorsque lactivit de leau est minimale comme cest le cas chez les organismes
anhydrobiotiques, pour lesquels la teneur en trhalose peut atteindre jusqu 20% de la masse
sche (Crowe et Crowe 1984). Le trhalose intervient donc en conditions de stress osmotique
58
intense lorsquil ne sagit plus seulement dquilibrer losmolarit des solutions mais de
compenser la chute de lactivit des molcules deau dans la cellule.
En absence de water stress lhydratation des ttes polaires des phospholipides et la
formation de liaisons hydrognes indirectes participent maintenir un espace entre les ttes
polaires des phospholipides de manire limiter les interactions de Van der Walls entre les
chanes aliphatiques en configuration de cristal liquide. Lorsque lactivit de leau est rduite,
le trhalose va se substituer leau en tablissant des liaisons hydrognes entre ses fonctions
OH et les groupes phosphates des phospholipides et ainsi maintenir les phospholipides en
conditions optimales de fluidit (Crowe et Crowe 1984) et de stabilit (Iwahashi et al. 1995).
Le trhalose va donc agir directement sur la membrane afin de maintenir cette dernire en
configuration de cristal liquide (Leslie et al. 1995).
Entre la prsence dthanol dans lenvironnement cellulaire et laccumulation de trhalose, il
doit ncessairement exister un signal intracellulaire transducteur. Par augmentation de la
permabilit de la membrane vis vis du gradient de protons, la prsence dthanol dans le
milieu induit une baisse du pH intracellulaire (pH
i
) (Jimnez et van Uden 1985), tout comme
avec la synthse dacide actique (Arneborg et al. 1997), dacide dcanoque, et une lvation
de temprature (Alexandre et al. 1998), c'est--dire la plupart des stress aboutissant une
lvation de la concentration en trhalose. La chute du pH
i
est un candidat pour tre llment
inducteur de la prsence de trhalose. Cette hypothse fut invalide lors de ltude de la
rponse un stress thanolique de mutants prsentant une activit rduite de lH
+
-ATPase
membranaire (principale enzyme rgulatrice du pH
i
in vivo) (Alexandre et al. 1998).
Des analyses gntiques ont montr que les deux principaux gnes impliqus dans la synthse
du trhalose (TPS1, TPS2) possdent au niveau de leur rgion promotrice de nombreuses
squences STRE. Ces gnes sont donc inductibles en condition de stress thanol, thermique,
osmotique. Ces squences STRE sont la cible de facteurs de transcription spcifiques qui
sont cods par deux gnes homologues MSN2 et MSN4 (Martinez-Pastor et al. 1996). Des
expriences ont montr que les chocs thermiques et les chocs alcooliques avaient deux
consquences communes : la premire est laugmentation du taux en acides gras insaturs au
sein de la membrane, la seconde est laugmentation de la teneur cellulaire en trhalose
(Odumeru et al. 1993). Une hypothse de travail consisterait corrler ces deux phnomnes.
De plus, des travaux ont montr que la sensibilit de lactivation des gnes STRE tait
fonction de la composition en acide gras insaturs de la membrane (Chatterjee et al. 2000).
59
c. Effet de lthanol sur lADN et la rgulation gntique
Chez E.coli, lthanol entrane un retard dans la synthse des ARN, de lADN et des
protines, mais nagirait pas comme un inhibiteur spcifique de ces processus (Ingram 1977).
Il a t dmontr que le statut nergtique de leau contrlait lexpression gntique (Balke et
Gralla 1987;Dorman et al. 1990). En effet, ce sont des liaisons hydrognes via des molcules
qui sont impliques dans la conformation super-enroule de la double hlice. Une baisse de
lactivit de leau va engendrer une transition structurale de la molcule dADN, ce qui va
avoir des effets au niveau de la rplication et de la transcription.
Au niveau gntique, le water stress nagit pas uniquement au niveau structural de la
molcule dADN, mais galement en affectant les protines responsables de la rgulation
gntique (Hallsworth 1998).
De plus, lthanol est un inducteur de mutants dficients de la respiration. Ce sont les
mitochondries et plus particulirement lADN mitochondrial qui sont affects (Ibeas et
Jimenez 1997) mais le mcanisme daction nest pas connu.
III.2.ii. Influx et efflux de protons travers la membrane : Rle de
lATPase membranaire
La prsence dthanol induit une augmentation de linflux de protons. Le gradient
transmembranaire sen trouve alors fortement affect (Cartwright et al. 1987;Leao et van
Uden 1984). Or une baisse de ce gradient lectrochimique peut tre critique pour la cellule.
Pour lutter contre la diminution du gradient de protons, lactivit de lATPase membranaire
est stimule chez des cellules cultives en prsence dthanol (Alexandre et al. 1994a). En
effet, lATPase membranaire est in vitro sensible la prsence dthanol, mais aprs culture
de Saccharomyces cerevisiae en prsence dthanol lactivit spcifique de lATPase dans les
membranes est active et la sensitivit de lenzyme lthanol baisse (Alexandre et al. 1994a)
afin de maintenir le pH intracellulaire (Dombek et Ingram 1987). Lors de cultures en prsence
dthanol, la consquence physiologique est donc une activation de lefflux de protons.
Lactivit spcifique de lATPase se trouve stimule alors quil semble que la quantit de
protines ATPase diminue dans les membranes cause de lthanol (Monteiro et al. 1994).
De plus, Aguilera et al. (2006) corrle 96,6% la tolrance lthanol (inhibition de 50% du
taux de croissance) avec lactivit ATPasique aprs un choc thanol 4% pour diffrentes
souches de levures vinicoles.
60
Le mcanisme par lequel lactivit de lATPase se trouve active peut tre d la
modification de la composition lipidique de la membrane. Plusieurs tudes ont report
linfluence de lenvironnement lipidique sur lactivit de lATPase. La prsence dacides gras
longue chane (Johannsson et al. 1981a;Johannsson et al. 1981b), dacides gras insaturs
(Aguilera et al. 2006), dergostrol (Aguilera et al. 2006) et le rapport strol :phospholipides
(Cooke et Burden 1990), ainsi que la composition en phospholipides (Dufour et Goffeau
1980) semblent avoir une influence sur lactivit de lATPase. De plus, HSP30, une
chaperonne membranaire induite en cas de stress thanol (Piper et al. 1994), pourrait avoir un
rle de conservation de lnergie en limitant la consommation excessive dATP par lATPase
membranaire (Piper et al. 1997)
III.2.iii. Modification de la permabilit et de la fluidit membranaire
La cellule rpond au stress thanol en augmentant ce que les auteurs appellent la pression
interne de la membrane (Conrad et Singer 1981). La pression interne est constitue de
toutes les molcules : strols, phospholipides insaturs, protines intrinsques prsentes dans
la membrane et qui sont absentes des bicouches synthtiques. Le rle de la pression
interne est de tamponner les proprits structurales et thermodynamiques des
phospholipides (Conrad et Singer 1981). La pression interne des membranes biologiques
permet de limiter la solubilit des molcules amphiphiles comme lthanol. En effet, la
concentration de petites molcules amphiphiles comme lthanol dans les membranes
biologiques nexcde pas 1/10
me
de la concentration dans la phase aqueuse ; alors que dans
les vsicules phospholipidiques synthtiques, le ratio [EtOH]
phase aqueuse
/ [EtOH]
vsicule
est
proche de lunit (Conrad et Singer 1981).
Il a t dmontr que lthanol modifiait la composition de la membrane plasmique chez les
microorganismes procaryotes (E.coli (Dombek et Ingram 1984) ; Zymomonas mobilis
(buchholz et al. 1987)) ainsi que chez les microorganismes eucaryotes tels que S. cerevisiae
(Thomas et al. 1978).
a. La composition en acides gras
Llvation de la concentration en thanol induit une diminution en acides gras saturs et une
augmentation en acides gras insaturs (principalement lacide olique C
18 :1
) (Beavan et al.
61
1982;Sajbidor et al. 1995). Le niveau dinsaturation en prsence dthanol (10 % v/v) peut
augmenter de 25 % (Alexandre et al. 1994a).
De plus, une complmentation en acide olique dans le milieu induit une augmentation de la
tolrance lthanol chez S.cerevisiae (Ghareib et al. 1988). Des expriences de
complmentation en acides gras de longueurs de chanes aliphatiques gales mais de degrs
dinsaturation diffrents (acide olque, acide linolque, acide linolnique) chez
S.cerevisiae montrent que la tolrance lthanol (efflux de protons, taux de fermentation et
assimilation de L-alanine) augmente avec le degr dinsaturation des acides gras (Mishra et
Prasad 1989;Thomas et al. 1978).
Plus rcemment, ltude de mutants de S. cerevisiae dficients pour le gne OLE1, codant une
acide gras dsaturase (transformant le C16:0 et le C18:0 en C16:1 et C18:1), et complments
par une dsaturase dinsecte, qui augmente la proportion de C18:1 par rapport au C16:1,
soulignent leffet des acides gras insaturs dans la tolrance lthanol et notamment leffet
plus important de lacide olique (You et al. 2003).
Certains auteurs suggrent aussi une influence des acides gras longue chane sur la tolrance
lthanol (Chi et Arneborg 1999)
b. La composition en strols
Selon certains auteurs, la proportion de strols dans les cellules augmente lors de cultures en
prsence dthanol (Sajbidor et al. 1995). Or, dautres travaux contredisent cette constatation
(Alexandre et al. 1994b;Koukkou et al. 1993;Walker-Caprioglio et al. 1990). Laccumulation
dergostrol peut aussi tre dpendante de la concentration dthanol dans le milieu (Del
Castillo Agudo 1992).
Cependant, une souche est dautant plus tolrante lthanol si son ratio
strols/phospholipides est lev (Chi et Arneborg 1999;Del Castillo Agudo 1992;Swan et
Watson 1998).
De mme que pour lacide olique, une complmentation en ergostrol dans le milieu de
culture induit une augmentation de la tolrance lthanol en terme de viabilit chez
S.cerevisiae (Thomas et al. 1978). Des rsultats identiques ont t obtenus lors dexpriences
de complmentation, en cholestrol, en ergostrol, en stigmastrol, et en campestrol, en
condition danarobiose. Laugmentation de la tolrance lthanol observe est cependant
62
suprieure avec les strols possdant une ramification insature (ergostrol et stigmastrol)
quavec les strols chane linaire (cholestrol, campestrol) (Thomas et al. 1978).
c. Les phospholipides
Linfluence de la composition en phospholipides est controverse, dautant que peu dtudes
ont t ralises.
Les cellules enrichies en PS semblent plus tolrantes lthanol que les cellules enrichies en
PC ou PE (Mishra et Prasad 1988). Un ratio anion:zwittrion de la membrane lev
entranerait une augmentation de la tolrance lthanol comme suggr par des travaux
raliss chez E.coli (Clark et Beard 1979). Cependant cette hypothse est contredite par
plusieurs auteurs qui notent plutt limportance de PC dans la tolrance a lthanol (Chi et
Arneborg 1999;Hayashida et Ohta 1980).
Mais la capacit des levures maintenir un taux de biosynthse des phospholipides suffisant
est aussi un facteur influenant la tolrance lthanol (Alexandre et al. 1994b;Koukou et al.
1990).
d. Les protines membranaires et autres molcules
Les protines intrinsques de la membrane participent galement la pression interne de
celle-ci. (Jimenez et Benitez 1987). Chez E.coli, il fut dmontr que le ratio lipides/protines
de la membrane influenait la tolrance lthanol : une diminution du ratio lipides/protines
provoque une augmentation de la tolrance de la bactrie lthanol (Dombek et Ingram
1984).
Laugmentation de la pression interne est galement observable lors de la prsence de
petites molcules amphiphiles comme le dinitrophnol et le dcanol, ce qui laisse suggrer
quune partie des effets de laccumulation de lthanol nest pas spcifique de la molcule
dthanol (Hallsworth 1998) mais commune toute molcule amphiphile de petite taille.
La cellule va galement ragir au stress thanol en modifiant lactivit des enzymes
membranaires. En effet, des analyses gntiques chez plusieurs levures (Schizosaccharomyces
pombe (Gille et al. 1993) et Saccharomyces sake (Ogawa et al. 2000)) ont montr que la
prsence dthanol exogne stimulait lexpression de gnes codant des catalases. Ces enzymes
sont impliques lors des stress oxydatifs causs gnralement par la prsence de peroxyde
dhydrogne (Ventsislava et al. 2002). Une autre enzyme semble tre implique dans
63
lacquisition de la tolrance lthanol : cest la superoxyde dismutase (Costa et al. 1993).
Elle agit lintrieur de la cellule au niveau de la mitochondrie et protgerait ainsi la cellule
en transformant les radicaux superoxydes en peroxyde dhydrogne, pris alors en charge par
les catalases. La prsence dthanol induirait donc un stress oxydatif mais les mcanismes ne
sont l encore pas connus (Costa et al. 1993;Costa et al. 1997).
Gnralement une cellule soumise un stress quelconque va rpondre en contrant les effets
responsables du stress. Lors du stress thanol, lthanol va fluidifier la membrane (Alexandre
et al. 1994b;Ghosh 1988) et augmenter la permabilit de la membrane (Slater et al. 1993).
Malgr cela, la cellule en condition de stress thanol augmente son taux dacides gras
insaturs (Thomas et al. 1978). Or les acides gras insaturs augmentent galement la fluidit
membranaire (Beney et Gervais 2001). Il y a donc une discordance entre leffet fluidifiant de
lthanol et la rponse de la cellule. En effet, on pourrait sattendre ce que la levure qui
peroit une augmentation de la fluidit de sa membrane plasmique, cherche contrer ce
phnomne en rigidifiant la membrane (Bottema et al. 1985). Au lieu de cela la levure
incorpore dans sa membrane des composs qui augmentent la fluidit de celle-ci. Les auteurs
expliquent cette discordance physiologique par le fait que les acides gras insaturs ne seraient
pas utiliss par la cellule pour contrler la fluidit membranaire (Jones et Greenfield 1987),
mais plutt la permabilit membranaire : ce qui sexplique par le fait que les doubles liaisons
vont provoquer des coudes dans les chanes hydrocarbones des phospholipides. Ces coudes
apolaires vont constituer des obstacles la diffusion passive des composs polaires engendre
par la prsence dthanol.
III.3. Rponse transcriptomique la prsence dthanol
La rponse de la cellule de levure la prsence dthanol a t tudie :
- aprs un ajout dthanol exogne (Alexandre et al. 2001;Fujita et al. 2004),
- pendant une fermentation alcoolique (Devantier et al. 2005a;Shima et al. 2005)
Lors dun choc thanol 7% (v/v) sur des levures en phase exponentielle (Alexandre et al.
2001), Alexandre et al.(2001) isolent 194 gnes induits de plus de trois fois, et 201 rprims
de plus de 3 fois aprs le choc thanol. La famille de gnes sur-exprims la plus importante
est la famille cell rescue defense and virulence (Alexandre et al. 2001), en rponse un
stress environnemental, notamment certains gnes connus dans la rponse au choc thermique
64
(Heat Shock Protein). Parmi les familles de gnes induits, il y a aussi le mtabolisme
nergtique, le maintien de lhomostasie cellulaire, la synthse et dgradation du trhalose et
la rponse au stress oxydatif (Alexandre et al. 2001).
(Fujita et al. 2004) ont tudi la rponse transcriptionnelle de la levure aprs incubation 2
heures dans diffrents alcools de toxicit croissante (thanol, 1-pentanol, 1-octanol) et un
hydrocarbure (n-pentane) moins toxique que lthanol. Les alcools pntrent lintrieur de la
cellule et endommagent les organelles cellulaires, contrairement lalcane. De mme la
rponse transcriptomique est beaucoup plus intense pour les alcools que pour le pentane.
Entre 176 et 373 gnes sont sur-exprims en prsence dun alcool contre seulement 35 en
prsence de pentane, avec de plus des ratios de sur-expression nettement plus faibles. Les
alcanes sont moins toxiques que les alcools pour les levures soulignant encore limportance de
la fonction hydroxyle dans le processus de toxicit (Fujita et al. 2004;Weber et de Bont 1996).
Une exposition aux diffrents alcools entrane, l aussi, linduction des gnes de rponse au
stress (HSP12, 26, 30, 78, 82, 104, SSA3, 4 et SSE2). La prsence de pentane ninduit pas ce
type de rponse. Linduction de gnes lis lnergtique cellulaire est aussi caractristique
de la prsence dalcool. Ils mettent lhypothse dune action des alcools au niveau des
fonctions hydrophiles des phospholipides des membranes qui perturberaient la fluidit
membranaire et le fonctionnement de lATPase membranaire. En prsence de pentanol et
doctanol (Fujita et al. 2004), quelques gnes lis la synthse et la dgradation des acides
amins sont sur-exprims.
Ces diffrentes tudes se sont attaches la comprhension de la rponse transcriptomique de
la levure aprs ajout dthanol exogne. Mais que se passe-t-il pendant la production
dthanol et comment la levure peut-elle se protger de son propre thanol produit ?
Linterprtation des rsultats transcriptomiques lors de fermentations alcooliques nest pas
aussi aise car plusieurs phnomnes se succdent voire se superposent. Dans les productions
de boissons fermentes, les levures sont aussi soumises des conditions particulires : milieu
complexe, anarobiose, carence nutritionnelle, forte pression, hautes densits cellulaires ou
encore basse temprature. Les fermentations oenologiques (Marks et al. 2003;Perez-Ortin et
al. 2002;Rossignol et al. 2003) et brassicoles (James et al. 2003;Olesen et al. 2002) ont t
explores. Mais ce nest pas avec ce type de procds, car trop complexes, que lon peut
mettre en vidence les gnes impliqus dans la tolrance lthanol. Il existe dautres
procds, comme le procd VHG (Very High Gravity), qui visent uniquement produire de
lthanol et qui ont t tudis dun point de vue transcriptomique (Devantier et al.
2005b;Devantier et al. 2005a;Shima et al. 2005).
65
Shima et al. (2005) comparent la mme souche de levure sur milieu synthtique et sur
mlasse en fed-batch. La levure tant plus rsistante aux stress sur mlasse, ils esprent ainsi
identifier les gnes impliqus dans cette rsistance. Ils ont russi, par lanalyse gnomique
fonctionnelle, mettre en vidence linduction de gnes lis la synthse et lassimilation
de vitamines (biotine, thiamine et pyridoxine) dans le milieu-mlasse, suggrant une plus
faible concentration en vitamines dans ce milieu. Inversement, il suppose une carence en fer
dans leur milieu synthtique car des gnes impliqus dans lutilisation du fer y sont sur-
exprims
De mme, Devantier et al. (2005a) ont compar, en procd batch VHG, une souche de
laboratoire et une souche industrielle, plus tolrante aux stress. Le milieu contient initialement
280 g.l
-1
de maltodextrine. La diffrence de comportement au niveau transcriptomique des
deux souches se situe surtout pendant la phase stationnaire. La souche industrielle, plus
tolrante que la souche de laboratoire sur-exprime plus de gnes lis au stress cellulaire. Les
deux souches expriment diffrentiellement ADH7 et GDH1, suggrant une meilleure
rgulation de la balance redox pour la souche industrielle et elles semblent rguler de manire
diffrente les transporteurs dhexose.
Les deux tudes prcdentes peuvent permettre doptimiser les procds mais nont
malheureusement pas permis de mettre directement en vidence les gnes impliqus dans la
tolrance lthanol.
III.4. Gnes impliqus dans la tolrance lthanol
Pour essayer de mettre en vidence les gnes impliqus dans la tolrance lthanol, plusieurs
stratgies ont dj t utilises :
- ltude de la tolrance de diffrents mutants (Inoue et al. 2000;Kajiwara et al.
2000;Novotny et al. 1992;Takahashi et al. 2001;van Voorst et al. 2006),
- la comparaison de lexpression gnique en phase de croissance de souches ou de
mutants prsentant des degrs de tolrance diffrents (Ogawa et al. 2000;Takahashi et
al. 2001),
La comparaison de lexpression gntique de souches mutantes tolrantes lthanol et de
lexpression gntique de souches sauvages sensibles lthanol a permis de rvler le rle
dans la tolrance au stress thanol de plusieurs gnes habituellement exprims lors des stress
thermiques, osmotiques ou oxydatifs. Ces gnes sont caractriss par des squences consensus
au niveau de leur rgion promotrice CCCCT, AAAAG : ces squences sont appeles
66
squence STREs par les auteurs (STress Reponsive Elements). Parmi ces gnes, on trouve des
gnes codant des enzymes de la synthse du trhalose (TPS1 (van Voorst et al. 2006) et
TPS2), des protines chaperonnes (la famille des HSP70, HSP12, HSP104) et du glycrol
(GPD1) et une enzyme implique lors des stress oxydatifs (CTT1) (Ogawa et al. 2000).
La dltion de ERG6, dont le produit est impliqu dans la synthse des strols, rend les
mutants plus sensibles (Inoue et al. 2000) et la sur-expression de OLE1, qui code une
-9-dsaturase dacide gras, diminue la sensibilit de la souche (Kajiwara et al. 2000). La
prsence de strols et dacides gras insaturs dans les membranes est dj connue pour avoir
une importance dans la tolrance lthanol.
Takahashi et al. (2001) isolent 5 mutants de dltion sensibles lthanol impliqus soit dans
lintgrit paritale (BEM2, ROM2 et VSP34), soit dans la conformation de lADN (PAT1 et
ADA2). Limportance de lintgrit paritale dans la tolrance lthanol est aussi dmontre
par van Voorst et al. (2006), aprs screening de la banque EUROSCARF sur 6% dthanol, en
plus des fonctions vacuolaires et mitochondriales.
Il y a donc relativement peu de choses connues sur la rponse gntique de la tolrance
lthanol chez Saccharomyces cerevisiae. Celle-ci semble trs difficile apprhender,
notamment par la nature probablement polygnique de cette rponse (D'Amore et al. 1990).
67
III.5. Conclusion
Figure 9 : Schma rcapitulatif du modle daction de lthanol sur une cellule de levure.
La premire cible de lthanol est donc la membrane plasmique, mais lthanol est aussi
prsent lintrieur de la cellule (cf. figure 9). Lthanol de part sa nature amphiphile
simmisce dans la bicouche de phospholipides. Les forces de liaisons qui maintiennent
lintgralit de la membrane sen trouvent alors perturbes ainsi que les proprits de la
membrane. Lthanol augmente la fluidit et la permabilit de la membrane et le gradient de
protons en est fortement affect. De manire plus indirecte, la baisse de lactivit de leau a
des consquences sur les activits enzymatiques impliques dans les voies de la glycolyse et
de la synthse dADN et plus particulirement celles prsentes au sein des membranes.
Lactivit de diffrents transporteurs membranaires (glucose, maltose, acides amins,
ammonium), ainsi que de lATPase membranaire est aussi perturbe par la prsence
dthanol.
Ethanol
ATPase membranaire
Systme de transport
Membrane plasmique
Paroi
H+
H+
H+
H+
H+
H+
H+ ATP
ADP
Glucose
Glucose-6-P
Voies des
pentoses
phosphate
Pyruvate
Glucose
ADN
Mitochondrie
Trhalose
Glycrol
Noyau
Transporteurs
membranaires
Lipides
membranaires
Gradient de protons
transmembranaire
68
En raction, la cellule modifie sa composition membranaire de manire contrecarrer laction
de lthanol. Les principales modifications tudies concernent linfluence des acides gras
insaturs et des strols sur la tolrance lthanol. Ladaptation de lenvironnement lipidique
des enzymes membranaires en modifierait aussi les proprits pour les rendre plus
performantes dans la lutte contre leffet inhibiteur de lthanol. Lthanol agit aussi comme un
stress cellulaire. Cet tat gnral de stress cellulaire se traduit par une accumulation de
trhalose, de glycrol et linduction de gnes impliqus dans les phnomnes de stress (HSP,
HOG, stress oxydatif ).
La tolrance lthanol est un phnomne qui a t et reste encore trs tudi. La littrature
est trs abondante dans le domaine ce qui implique parfois lapparition de rsultats
contradictoires. Ceci sexplique par la complexit de la rponse mise en place et la difficult
dtudier ce phnomne. En effet, lthanol exogne na pas la mme toxicit que lthanol
produit par la cellule elle-mme (thanol endogne) ; ladaptation peut donc tre diffrente.
Or, il apparat beaucoup plus simple dun point de vue pratique dtudier la tolrance
lthanol ajout (choc-thanol ou croissance en prsence dthanol). Cependant, la
transposition aux phnomnes observs pendant les fermentations nest pas aise, dautant
que la majorit des tudes ne va pas au-del de 12% dthanol. Mais, ltude en condition de
production dthanol et des fortes concentrations pose dautres problmes : notamment la
superposition des stress (thanol, osmotique, carence nutritionnelle), la ncessit de la
matrise du procd et lobtention dun titre lev en thanol. De plus, malgr la multitude des
publications, de nombreuses questions sont encore sans rponse. Y a-t-il des gnes
spcifiquement impliqus dans la tolrance lthanol ? Quels sont-ils ? Y a-t-il une rponse
unique la toxicit de lthanol ? Quel(s) est(sont) le(s) signal(aux) dclencheur(s) de la
rponse visant a contrecarrer leffet de lthanol ?.
Le laboratoire a fait le choix dune production par lintermdiaire dun racteur bi-tag
recyclage de la biomasse (BRM). Or, cest un systme trs complexe qui ncessite une longue
phase de mise au point. Ltude de leffet de lthanol produit par lintermdiaire dun tel
procds nous est apparu trop complexe. Dans un premier temps, nous disposons dun
procd de type fed-batch plus simple mettre en uvre et dj optimis au niveau
nutritionnel. De plus, les rsultats sur ce dernier ont servi de base la modlisation du BRM.
Cest donc par ltude des diffrents tats physiologiques de la levure au cours de
fermentations fed-batch que nous esprons mieux comprendre leffet des hautes
concentrations dthanol produit sur la levure.
69
Partie II :
Matriel et Mthodes
70
Partie II : Matriel et mthodes
71
I. Fermentation
I.1. Souche
La souche utilise au cours de ce travail est Saccharomyces cerevisiae CBS 8066. Il s'agit
d'une souche de laboratoire commercialise par le Centraal Bureau voor Schimmelcultures
(Hollande).
I.2. Milieux de culture
I.2.i. Milieu de conservation
La souche est conserve 80C, aprs ajout de 2 ml de glycrol 5 ml de culture sur le
milieu de composition suivante:
Tryptone: 10 g.l
-1
Extrait de levure: 5 g.l
-1
NaCl: 10 g.l
-1
Glucose: 2 g.l
-1
Eau distille
I.2.ii. Milieu riche
A partir de colonies isoles sur boite de ptri de la mme composition que le milieu de
conservation avec 15 g.l
-1
dagar, la souche est mise en culture dans un milieu riche de
composition :
Bactopeptone: 10 g.l
-1
Extrait de levure: 10 g.l
-1
NaCl: 9 g.l
-1
Glucose: 20 g.l
-1
Eau distille
I.2.iii. Milieux de prculture et de fermentation
Le milieu de fermentation est un milieu synthtique bas sur celui dcrit par BAUDET
(1990). Il est utilis pour les prcultures et les fermentations. Les concentrations en
oligo-lments ont t adaptes selon la mthode de EGLI et FIECHTER (1981) o les
72
auteurs dfinissent, partir de la composition cellulaire de Saccharomyces cerevisiae, les
rendements de conversion R
X/E
1
des oligo-lments (Mg, Zn, Mn, Co, Cu, Mo, Ca, Fe, et B)
(Egli et Fiechter 1981). Pour cette tude, les concentrations en oligo-lments ont t
calcules de faon ne pas limiter la croissance jusqu' 20 g.l
-1
de biomasse.
Composition du milieu salin de prculture :
Sels principaux : KH
2
PO
4
: 3,0 g.l
-1
(NH
4
)
2
SO
4
: 3,0 g.l
-1
Na
2
HPO
4
, 12H
2
O : 3,0 g.l
-1
Source azote : Glutamate de sodium : 1,0 g.l
-1
Oligo-lments : MgSO
4
: 0,5 g.l
-1
ZnSO
4
, 7H
2
O : 4,0.10
-2
g.l
-1
MnSO
4
: 3,8.10
-3
g.l
-1
CoCl
2
: 5,0.10
-4
g.l
-1
CuSO
4
: 9,0.10
-4
g.l
-1
Na
2
MoSO
4
: 6,0.10
-5
g.l
-1
CaCl
2
: 2,3.10
-2
g.l
-1
(NH
4
)
2
Fe(SO
4
)
6
: 2,3.10
-2
g.l
-1
H
3
BO
3
: 3,0.10
-3
g.l
-1
Vitamines : Acide pantothnique : 5,0.10
-3
g.l
-1
Acide nicotinique : 5,0.10
-3
g.l
-1
Mso-inositol : 125,0.10
-3
g.l
-1
Thiamine : 5,0.10
-3
g.l
-1
Pyridoxine : 5,0.10
-3
g.l
-1
Acide para-aminobenzoique : 1,0.10
-3
g.l
-1
biotine : 1,2.10
-5
g.l
-1
Eau du rseau de ville
2
Chaque oligo-lment est prpar sparment sous forme dune solution concentre puis
strilise sur filtre Minisart 0,2 m (SARTORIUS). Les solutions sont conserves 4C.
Les vitamines sont prpares sous forme d'une solution concentre (400X ou 1000X)
contenant l'ensemble des composs l'exception de la biotine. La biotine est prpare
sparment (concentre 5000X ou 10000X). Les solutions sont strilises sur filtre Minisart
0,2 m(SARTORIUS) et conserves 4C.
Composition du milieu salin de fermentation : le milieu de fermentation est le mme que le
milieu de prculture sauf pour les vitamines qui sont rajoutes de manire squence au cours
de la fermentation (Alfenore et al. 2002).

1
R
X/E
reprsente la quantit de biomasse (g) que l'on peut thoriquement obtenir avec un gramme
d'lment E.
2
Leau du rseau est utilise car la fermentation se droule plus rapidement quavec leau distille
73
I.3. Bioracteur et conditions de culture
Les cultures sont ralises dans un bioracteur de 20 litres de volume utile quip dun
systme de strilisation en place (BRAUN, Biostat E). Les diffrentes fonctions disponibles
sont :
- Les mesures et rgulations de temprature, pH, oxygne dissous, pression.
- La dtection de mousse avec ajout rgul d'antimousse.
- Le contrle de la procdure de strilisation par vapeur vive.
La vitesse d'agitation est fixe 400 tr.min
-1
jusqu' ce que la PO
2
atteigne 20 % puis
augmente de faon ne pas limiter la culture en oxygne. La temprature est rgule 30C
et le pH 4 l'aide d'une solution d'ammoniaque 14 % (v/v). La pression dans le racteur
est impose 0,2 bar (pression relative).
I.3.i. Prparation de l'inoculum
Deux tubes contenant chacun 5 ml de milieu riche sont ensemencs partir de colonies
isoles conserves sur glose. Les tubes sont incubs pendant 16 heures 30C sous agitation
(100 tr.min
-1
). Le contenu de chaque tube est ensuite transfr dans un erlenmeyer de 250 ml
muni de chicanes contenant 50 ml de milieu de prculture 40 g.l
-1
de glucose (pr-levain).
Ces erlenmeyers sont incubs 10 heures 30 C sous agitation (100 tr.min
-1
). Chaque
pr-levain sert ensemencer un erlenmeyer de 3000 ml muni de chicanes et contenant 500 ml
de milieu de prculture 40 g.l
-1
de glucose. Ces cultures sont alors incubes 10 heures
30C sous agitation (100 tr.min
-1
). Nous obtenons ainsi 1 litre de levain qui servira
ensemencer 9 litres de milieu de fermentation, soit un taux densemencement de 10 % (v/v).
I.3.ii. Prparation du bioracteur
Le milieu salin est prpar initialement. Il contient les sels d'ammonium, de potassium et de
sodium. 9 litres de milieu salin sont striliss in situ dans le racteur. Les vitamines et les
oligo-lments sont ajouts dans le racteur aprs strilisation.
Le glucose est apport partir d'une solution concentre 700 g.l
-1
par lintermdiaire d'une
pompe pristaltique (MASTERFLEX) pilote par ordinateur. Le mode dapport de sucre est
diffrent selon les fermentations. Il sera dtaill ultrieurement dans ce travail.
74
Le racteur est connect un micro-ordinateur. Un programme informatique ralise
lacquisition en ligne des paramtres de contrle du racteur (pH, temprature, pression
partielle en oxygne dissous, pression relative, ajouts dammoniaque et dantimousse). De la
mme manire, la masse de glucose ajoute dans le racteur est estime en temps rel par
lintermdiaire dune balance sur laquelle est place le bidon dalimentation de glucose.
Lensemble des autres paramtres est obtenu hors ligne par dosage (CO
2
produit, O
2
consomm, biomasse, mtabolites forms, glucose rsiduel, etc.).
II. mthodes analytiques
II.1. Caractrisation de la biomasse
II.1.i. Mesure de la densit optique
La croissance cellulaire est suivie par mesure de la densit cellulaire par spectrophotomtrie
620 nm (spectrophotomtre HITACHI U
-1
100) dans une cuve en verre de 2 mm de trajet
optique. La suspension cellulaire est dilue de faon obtenir une densit optique comprise
entre 0,05 et 0,8 unit dabsorbance, de manire toujours se situer dans la zone de linarit
de la mthode.
II.1.ii. Dtermination de la masse sche totale
La biomasse sche, exprime en g.l
-1
est mesure par une mthode gravimtrique.
Un volume connu de culture est filtr l'aide d'une pompe vide sur une membrane Sartolon
polyamide 0,45 m (SARTORIUS) pralablement sche et pese. Aprs filtration, les
membranes sont sches l'tuve 60C sous vide (200 mm de Hg) pendant 48 heures, puis
peses. La diffrence de masse avant et aprs filtration de la suspension cellulaire sur la
membrane ramene au volume filtr permet de dterminer la concentration en masse sche de
biomasse (g.l
-1
).
75
II.1.iii. Dtermination de la viabilit cellulaire
a. Bleu de mthylne
Le bleu de mthylne est une molcule organique, qui peut exister sous les deux
formes (cf. figure 10) :
forme Oxyde : bleue forme Rduite : incolore
Figure 10 : Molcule de bleu de mthylne sous forme oxyde et sous forme rduite. Cette
molcule va ragir avec les activits oxydorductases des cellules encore actives.
La viabilit cellulaire est dtermine par comptage sur cellule de THOMA aprs coloration au
bleu de mthylne. La solution colorante est prpare comme suit :
Diluer 10 mg de bleu de mthylne dans 10 ml d'eau distille.
Ajouter 2 g de tricitrate de sodium dihydrat.
Aprs filtration sur membrane Minisart 0,2 m (SARTORIUS), complter 100
ml avec de l'eau distille.
La technique consiste mlanger 200 l de solution de bleu de mthylne avec 200 l de
suspension cellulaire dilue. Aprs homognisation et 10 min dincubation temprature
ambiante, les cellules sont alors comptes au microscope sur la cellule de THOMA. Les
cellules viables apparaissent incolores tandis que les cellules non viables se colorent en bleu.
Le pourcentage de viabilit est calcul en faisant le rapport entre le nombre de cellules viables
et le nombre total de cellules.
a. Fun
1 (Molecular Probes)
Les membranes cellulaires sont permables au FUN
1 (cf. figure 11). Il sagit dun

fluorochrome qui, dans des cellules actives est internalis sous forme des structures
cylindriques intravacuolaires (appeles CIVS) rouge-orange ou jaune-orange. Les cellules
inactives diffusent uniformment dun vert-jaune intense et une absence de CIVS (Millard et
al. 1997).
76
Figure 11 : Molcule de FUN
1.
Lquivalent de 1 ml de suspension de levure DO
620
= 1 est centrifug 2 min 15000 rpm.
Le culot est lav avec 1 ml de tampon HEPES (10 mM Hps, pH = 7,2, 2% glucose), puis
recentrifug et resuspendu dans 1 ml de tampon HEPES (10 mM Hepes, pH = 7,2, 2%
glucose). 0,5 ml de cette suspension est alors utilis pour le marquage au colorant FUN
1.
Le marquage se passe dans une salle noire car les fluorochromes ne doivent pas tre exposs
la lumire. 1 l de FUN
1 est rajout et mlang la suspension de levure, puis le tout est

laiss 30 min 33C.
Lobservation se fait au microscope (Olympus BH2, objectif 40X, DplanApo40UVPL) quip
dune camera CCD (DXM 1200, Nikon), sous UV (avec un filtre dexcitation =470 nm). Les
images sont ensuite analyses grce au logiciel Lucia 4.6 (Laboratory imaging Ltd).
II.1.iv. Caractrisation morphologique de la biomasse
Ltude sur la morphologie des cellules a t ralise partir de photos prises au microscope
fond noir (cf. figure 12). La mesure des paramtres morphologiques se fait grce un
programme danalyse dimage ddi (Ohtani et al. 2004). Le programme permet, de manire
automatique, didentifier le contour des cellules et de distinguer les cellules seules des cellules
bourgeonnantes et aussi disoler le bourgeon. Certaines formes cellulaires (agrgats de
cellules) ne peuvent tre identifies : elles sont appeles formes complexes (cf. figure 12).
+
77
a
b
a/b = allongement de la cellule
Figure 12 : Exemple dimage de microscopie fond noir obtenue lors dune culture typique
de levure en bioracteur (120g.l
-1
dthanol produit), sur laquelle se superpose lanalyse par le
logiciel danalyse dimage dvelopp par Ohtani et al. (2004) et lidentification des
diffrentes formes.
Pour chaque cellule identifie, le programme adapte une ellipse passant au plus prs des
contours cellulaires. Il renvoie alors de nombreux paramtres parmi lesquels des donnes
concernant :
- le type de cellule : non-bourgeonnante, bourgeonnante, bourgeon
- les paramtres de forme des cellules
o a= axe long
o b=axe court
o Taille de la cellule = aire de lellipse (unit : pixel x pixel ;
1 pixel=0,129512 m)
petit : 100< taille cellule<350
moyen : 350< taille cellule <475
gros : 475< taille cellule <850
Cellule non bourgeonnante
Cellule mre
bourgeonnante
Cellule fille
ou bourgeon
Cellule brillante
Cellule sombre
Forme
complexe
78
- les paramtres concernant les bourgeons
o Taille = la taille du bourgeon est donne en rapport avec celui de la cellule
mre :
petit bourgeon: 0<
mre cellule taille
bourgeon taille
<0,5
bourgeon moyen : 0,5
mre cellule taille
bourgeon taille
<0,7
gros bourgeon : 0,7
mre cellule taille
bourgeon taille
o orientation ou direction de croissance du bourgeon (angle )
II.2. Dosage du glucose extracellulaire
II.2.i. Dosage par mthode enzymatique
Le glucose est dos au cours de la fermentation sur un analyseur automatique YSI 27 A
(YELLOW SPRINGS INSTRUMENTS). Son principe repose sur la dtection de l'eau
oxygne libre lors de la transformation du glucose en acide gluconique par une glucose
oxydase fixe sur une membrane. La concentration en glucose est directement donne en
mg.dl
-1
. La prcision de l'appareil est de l'ordre de 10 %, mais la mesure est rapide. Les
concentrations en glucose sont ensuite mesures de manire prcise par HPLC.
La suspension de levures est centrifuge (12000 g, 3 min). Le surnageant est spar du culot
cellulaire et dilu afin de se trouver dans la gamme de linarit de l'appareil (0 2,5 g.l
-1
).
II.2.ii. Dosage par HPLC : cf. III.3
II.3. Dosage glucose, thanol, actate, glycrol.
La mthode par HPLC dcrite ici permet de quantifier, en plus du glucose et de lthanol,
certains composs susceptibles dtre produits au cours dune culture (glycrol, actate,
malate, succinate et lactate).
La suspension cellulaire est centrifuge (12000 g, 3 min). Le surnageant est spar du culot
cellulaire et filtr avant d'tre analys dilu ou non dilu.

79
Appareil :
Chromatographe (WATERS, Alliance 2690) quip d'un rfractomtre
(WATERS) et d'un logiciel d'acquisition et de traitement des donnes.
Colonne Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm).
Conditions opratoires :
Temprature du four : 50C.
Volume d'chantillon inject : 20 l.
Solvant et condition de sparation : H
2
SO
4
5 mM
Dbit phase mobile (H
2
SO
4
5 mM) : 0,5 ml.min
-1
III. Analyses des composants macromolculaires
III.1. Protines : mthode du Biuret (Gornall et al. 1949;Lange et Heijnen 2001)
Les ions Cu
2+
(ajouts sous forme de sulfate de cuivre) se lient aux atomes dazote des liens
peptidiques de la protine dans des conditions de pH alcalin, produisant ainsi un complexe de
couleur mauve avec absorption maximale 540-550 nm.
Matriel spcifique :
Bain-marie 100C
- Tubes en verre
Solutions :
- solution de NaOH 3N (w/v)
- solution de sulfate de cuivre 2,5% (w/v)
- solutions standards de BSA (Bovin Serum Albumin) de 0 5 g.l
-1
Protocole :
- 2 ml de solution standard ou dchantillon contenant les cellules entires
- Ajouter 1 ml de solution de NaOH 3N
- homogniser
- 5 min au bain-marie 100C
- Ajouter 1 ml de CuSO
4
2,5 % : il se forme un prcipit
- centrifuger 5 min 14 000 rpm
- Lecture de la DO du surnageant =550nm.
80
III.2. Carbohydrates (Dubois et al. 1956;Herbert et al. 1971)
Le principe est bas sur la formation dune coloration jaune en prsence dacide sulfurique
concentr et de phnol , qui est mesure au spectrophotomtre 490 nm.
Matriel spcifique : tubes en verre bord pais.
Solutions :
- solution de phnol 5% (w/v)
- acide sulfurique concentr : solution commerciale 95%
- solutions standards de glucose de 0 200 g.l
-1
Protocole :
- 1 ml de solution standard ou dchantillon contenant les cellules entires
- Ajouter 1 ml de solution de phnol 5%
- homogniser
- Ajouter 5 ml dH
2
SO
4
concentr : attention, il faut les rajouter doucement car il y a
un fort dgagement de chaleur
- Attendre 30 min temprature ambiante, ensuite la couleur est stable pendant
plusieurs heures.
- Lecture de la DO =490nm.
III.3. ADN+ARN (Herbert et al. 1971)
Lextraction se fait laide dacide perchlorique 70 C. Ensuite, les quantits dacides
nucliques sont mesures au spectrophotomtre 260 nm.
Matriel spcifique : Tubes en verre centrifugeables.
Solutions :
- solution dacide perchlorique 0,25 N
- solution dacide perchlorique 0,5 N
81
Protocole :
- 25 mg masse sche de cellules entires
- Ajouter 5 ml de solution de HClO
4
0,25 N
- homogniser et laisser 0C pendant 20 min
- Centrifuger 3 min 5000 rpm, 4C. Jeter le surnageant
- Sur le culot de cellules, ajouter 3 ml de solution de HClO
4
0,5 N
- homogniser et laisser 70C pendant 15 min
- Centrifuger 3 min 5000 rpm, 4C.
- Faire deux extractions supplmentaires 70C, pendant 15 min sur le culot
rcupr aprs centrifugation
- Cumuler les trois extraits de 3 ml
- Lecture de la DO =260nm.
La composition des levures en acides nucliques est en moyenne de 10 % de la masse sche.
Sur ces 10 %, le contenu en ADN est trs faible (environ 0,3 %) (Oura 1983). La trs grande
majorit des acides nucliques tant des ARN, la concentration en acides nucliques sera
estime grce la relation 1UDO = 40 g/ml
IV. Analyses des composants lipidiques
La mthode dextraction des lipides a t optimise (cf. partie III). A partir de lextrait
lipidique obtenu, plusieurs quantifications peuvent tre effectues :
- mesure gravimtrique des lipides totaux
- mesure des diffrents lipides neutres et phospholipides par chromatographie
couche mince
- mesure colorimtrique des phospholipides totaux
- mesure colorimtrique des strols totaux
IV.1. Extraction des lipides cellulaires (adapte de la mthode de Stephan et al.,
2004)
La mthode dextraction des lipides sinspire de la mthode utilise par Stephan et al. (2004)
pour lextraction des lipides mycobactriens. Elle a t adapte pour les levures.
82
Matriel spcifique : Tout le matriel en contact avec les lipides doit tre en verre.
- Flacons en verre de 100 ml
- Tubes en verre centrifugeables
- Table agitante 250 rpm
- Rotavapor
- Ballons de 250 ml en verre
- Seringue en verre 250 l
Solutions :
- EDTA 0,1 M
- Mthanol contenant du BHT (butylated hydroxytoluene) 100 mg.l
-1
comme
antioxydant
- Chloroforme contenant du BHT (butylated hydroxytoluene) 100 mg.l
-1
Protocole :
- Le culot cellulaire est dabord lav 3 fois avec une solution dEDTA 0,1 M.
- Les lipides cellulaires sont extraits par 4 extractions successives dune journe,
sous agitation 250 rpm. Lextrait lipidique est rcupr aprs dcantation des
cellules ; les cellules sont alors prtes subir la prochaine extraction.
La proportion des solvants chloroforme (CHCl
3
) et mthanol (MeOH) sont diffrentes suivant
ltape dextraction :
Premire extraction : CHCl
3
/ MeOH (1V:2V)
Deuxime extraction : CHCl
3
/MeOH (1V:1V)
Troisime extraction : CHCl
3
/MeOH (2V:1V)
Quatrime extraction : CHCl
3
/MeOH (2V:1V).
Un volume V =15 ml pour 500 mg de cellules.
- Aprs la quatrime extraction, le culot cellulaire est centrifug et lav deux fois au
chloroforme.
- Toutes les phases organiques sont mlanges et le solvant est vapor au
rotavapor.
- Les lipides sont resuspendus dans 20 ml de CHCl
3
/MeOH (2:1 v/v). Deux lavages
au KCl 0,88% (w/v) sont effectus. Pour cela, est rajout 1 volume de KCl pour 4
volumes dextrait et aprs 10 min dans la glace, les deux phases sont spares par
centrifugation 5 min 3000 rpm.
- La phase organique est alors vapore au rotavapor et lextrait lipidique est
resuspendu dans un volume connu de chloroforme.
- Puis lextrait lipidique est conserv -80 C ou utilise pour lanalyse.
83
Remarque : Si lchantillon a t conserv -80C, il faut vaporer sous un courant dazote,
puis re-suspendre dans du chloroforme pour connatre avec prcision le volume avant
lanalyse des lipides.
IV.2. Dosage des lipides totaux par gravimtrie
Matriel : ballons pour rotavapor de 25 50 ml
Protocole :
Les extractions doivent tre faites sur des quantits importantes de cellules (500 mg).
La quantification par gravimtrie consiste tarer un ballon vide (masse initiale) , puis une fois
que lextraction est faite, lextrait lipidique aprs lavage est transvas dans le ballon puis les
solvants sont vapors au rotavapor. Le ballon doit revenir temprature ambiante avant
dtre pes (masse finale). Lvaporation et la pese sont rptes jusqu ce que deux peses
successives diffrent de moins de 0,5 mg. Par diffrence entre la masse initiale et finale, on
estime le pourcentage des lipides totaux.
IV.3. Dosage des lipides par Chromatographie Couche Mince : CCM
IV.3.i. Solutions talons
Une solution de mlange de tous les standards 0,25 g. l
-1
est prpare dans le chloroforme
partir de solutions mres 5 ou 10 g. l
-1
selon les diffrents standards (cf. tableau 6).
Les standards sont prpars avec prcision par pese des diffrents composs pour se placer
autour de la concentration thorique et les calculs seront faits avec la concentration relle.
La sparation des diffrentes classes lipides se fait sur gel de silice par chromatographie
couche mince. Les diffrents lipides cellulaires se classent en deux groupes : phospholipides
et lipides neutres. Ils sont spars sur deux plaques diffrentes.
84
Tableau 6 : Lipides standards utiliss pour lobtention de la solution standard 0,25 g. l
-1
pour la quantification par CCM, leur fournisseur et rfrence.
Nom du compos Rfrence
L- -Phosphatidylinositol SIGMA P-5766 5mg
Cardiolipin SIGMA C-1649 10mg
L- -Phosphatidyl-DL-glycerol, -oleoyl--palmitoyl (C18:1, [cis]-9/C16:0) SIGMA P-6956 5 mg
L- -Phosphatidyl-Choline, dioleoyl (C18:1, [cis]-9) SIGMA P-6354 25 mg
L- -Phosphatidyl-ethanolamine, dioleoyl (C18:1, [cis]-9) SIGMA P-1223 25 mg
L- -Phosphatidyl-L-srine SIGMA P-6641 5 mg
L- -Phosphatidic acid, dioleoyl (C18:1, [cis]-9) SIGMA P-2767 5 mg
Lanostrol SIGMA L-1504 25 g
Ergostrol SIGMA E 65109
Squalne SIGMA S 3626
Cholesteryl oleate SIGMA C 9253
Ethyl-oleate SIGMA O 9500
Acide Olique MERCK 1.00471
Diolein SIGMA D-8894 50 mg
Triolein SIGMA T-7140 100mg
IV.3.ii. Sparation des lipides neutres par CCM
Matriel :
- cuves en verre pour chromatographie couche mince
- plaque de silice 20x20 cm Alugram
Nano-SIL G/UV
254
pour CCM (Macherey-
Nagel,Germany) : 0,2 mm de nano gel de silice.
- Seringue en verre 10 l pour les dpts
Solutions :
- Solution de standards 0,25 g. l
-1
- Hexane
- Mthyl Tertio Butyl Ether
- Acide actique glacial
Protocole :
Comme leur nom lindique, les lipides neutres ne sont pas des composs chargs. Ils
comprennent : les acides gras libres ou estrifis, les mono-, di- et triglycrides, les strols
libres et estrifis. Ils sont spars en utilisant des solvants peu polaires : Hexane, Mthyl
Tertio Butyl Ether (MTBE),
La sparation des lipides neutres se fait dabord par une migration dans un solvant
hexane/MTBE/acide actique glacial (70 :30 :0,2, v/v) jusqu la moiti de la plaque. La
plaque est sche puis est ralise une deuxime migration jusqu 1 cm du bord de la plaque
avec de lhexane seul (cf. figure 13).
85
Figure 13 : Exemple de plaque obtenue aprs une premire migration avec un mlange
hexane/MTBE/acide actique (70 :30 :0,2, v/v) jusqu la moiti de la plaque, puis une
deuxime migration avec de lhexane seul jusqu 1 cm du bord de la plaque. Ceci permet de
sparer les diffrents lipides neutres. Les trois premiers dpts sont des talons. Les suivants
sont des extraits lipidiques de Saccharomyces cerevisiae CBS8066.
IV.3.iii. Sparation des phospholipides par CCM
Les phospholipides sont des molcules polaires spares en utilisant des combinaisons de
solvant trs polaires : eau, mthanol, chloroforme
La migration se fait en une seule fois avec un mlange :
Chloroforme/Actone/Mthanol/Acide actique/H
2
O (50/15/10/10/4 (v/v) (cf. figure 14). De
telles proportions sont la limite du mlange diphasique. Il faut rester en monophasique.
2
m
e
m
i
g
r
a
t
i
o
n
:

H
e
x
a
n
e
Dpt
Ergostrol
Squalne
Triglycrides
Ester de strol
Ester dacide gras
Acides gras
Lanostrol
Diglycrides
1
r
e
m
i
g
r
a
t
i
o
n
:

h
e
x
a
n
e
/
M
T
B
E
/
a
c
i
d
e

a
c
t
i
q
u
e

(
7
0
:
3
0
:
0
,
2
,

v
/
v
)
1 2 3 4 5 6
86
Figure 14 : Exemple de migration dans un solvant chloroforme/actone/mthanol/acide
actique/eau (50 :15 :10 :10 :5, v/v) permettant de sparer les diffrents phospholipides. Les
quatre premiers dpts sont des talons. Les suivants sont des extraits lipidiques de
Saccharomyces cerevisiae CBS8066.
Remarque : La sparation entre lacide phosphatidique et les cardiolipides nest pas toujours
aussi nette que sur la figure 14.
IV.3.iv. Rvlation des lipides sur plaque de CCM
La rvlation se fait par pulvrisation dune solution CuSO
4
10% (10g de CuSO
4
,5H
2
O dans
100ml de H
3
PO4 8% (v/v)). Une fois la plaque sche, elle est place environ 15 min dans un
four min 150C. Pour cette rvlation, la saturation des acides gras influe sur la coloration.
Elle donne une rponse plus faible avec des acides gras saturs quavec des acides gras
possdant une ou plusieurs insaturations (cf. figure 15). Mais, par rapport aux autres
rvlateurs utiliss (acide sulfurique, actate de cuivre, rhodamine, dichlorofluorescine,
bichromate de potassium dans H
2
SO
4
), il est celui qui prsente le meilleur rapport signal/bruit
de fond.
Dpt
Phosphatidylinositol
Acide Phosphatidique
Phosphatidylsrine
Phosphatidylthanolamine
Phosphatidylcholine S
e
n
s

d
e

m
i
g
r
a
t
i
o
n
Phosphatidylglycrol
Cardiolipides
1 2 3 4 5 6 7
87
Figure 15 : Comparaison du signal du dpt de 1 g dacide starique (18:0), olique (18:1),
et linolique (18:2) sur plaque de silice aprs rvlation au sulfate de cuivre (10% w/v dans
H
3
PO
4
8% v/v).
De plus, aprs analyse du profil dacides gras dans nos conditions, il y a prs de 80 %
dacides gras comportant une insaturation. Nous avons donc choisi des standards composs
dacide olique.
Les plaques sont ensuite scannes en haute rsolution et lintensit des taches est calcule
laide dun logiciel danalyse dimage : Quantity One (Bio-Rad) ou Image Quant (Molecular
Dynamics). Le bruit de fond est retir, toujours grce au logiciel de traitement dimage. Enfin,
pour chaque lipide, une courbe talon est ralise partir de huit dpts de quantits
croissantes (0,25 g 2 g).
IV.4. Dosage phospholipides totaux par une mthode colorimtrique (Rouser et al.
1970)
A partir des extraits lipidiques, les phospholipides totaux peuvent tre quantifis par dosage
du phosphore (P) pour avoir une estimation des phospholipides. Aprs digestion acide
chaud, le phosphore inorganique va ragir avec du molybdate dammonium en donnant une
couleur bleue dont la mesure 800 nm est proportionnelle la quantit de phosphore.
Matriel ncessaire :
- Bloc lectrique chauffant 180C
- Bain-marie deau bouillante 100C
- Tubes en verre : pour les nettoyer laisser pendant une nuit dans de lacide nitrique
30%, puis rincer leau mQ.
.
C18:0
C18:1
C18:2
- 30% + 30%
C18:0
C18:1
C18:2
C18:0
C18:1
C18:2
- 30% + 30% - 30% + 30%
88
Solutions :
- Acide perchlorique concentr (65%)
- Solution de molybdate dammonium (2,5 g dans 100 ml H
2
O mQ)
- Solution dacide ascorbique (10 g dans 100 ml H
2
O mQ, cette solution ne se
conserve pas plus dune semaine 4C)
- Solution stock de KH
2
PO
4
(439 mg.l
-1
dans H
2
O mQ , i.e. 100 g P.ml
-1
)
Protocole :
- 10 20 l dextrait lipidique sont placs dans un tube en verre. Il faut que le
chloroforme se soit totalement vapor.
- Rajouter 0,65 ml dacide perchlorique concentr 65%
- Placer les tubes dans un bain de sable 180C pendant au moins 1 h. Il faut
attendre que la coloration jaune-marron ait disparue.
- Une fois les tubes refroidis, ajouter 3,3 ml de H
2
O mQ, 0,5 ml de la solution de
molybdate et 0,5 ml dacide ascorbique les uns aprs les autres. Il faut vortexer
entre chaque ajout.
- Placer ensuite les tubes 5 min dans un bain-marie 100C
- Laisser refroidir et lire labsorbance 800nm.
Paralllement, les solutions dtalonnage sont prpares. A partir de la solution stock
KH
2
PO
4
, sont prpares diffrentes solutions pour obtenir 0 5 g P par tube dans 3,3 ml
dH
2
O mQ. 0,65 ml dacide perchlorique est rajout et les standards suivent le mme
protocole que les chantillons, sauf quils ne sont pas chauffs 1h 180C. Normalement,
5 g P donne une absorbance de 0,9.
IV.5. Dosage des strols totaux par une mthode colorimtrique (Zak 1957)
Le principe est bas sur la solubilisation des strols par addition dune solution de chlorure de
fer dacide sulfurique et dacide actique glacial. Il se forme une coloration rouge-pourpre qui
est mesure au spectrophotomtre 450 nm.
89
Matriel ncessaire : Tubes en verre : pour les nettoyer laisser pendant une nuit dans de
lacide nitrique 30%, puis rincer leau mQ.
Solutions :
- Acide actique glacial
- Solution de chlorure ferrique de composition suivante :
o 4 ml dune solution 2,5 % FeCl
3
,6H
2
O dans 85 % dacide
O-phosphorique.
o 46 ml avec lacide sulfurique. Lacide sulfurique est additionn juste avant
lutilisation de la solution de chlorure ferrique
- Une gamme talon de 0,1 1 mg.ml
-1
dergostrol est prpare dans le
chloroforme (le chloroforme est sch sous azote )
Protocole :
- 100 l dextrait lipidique ou de solution talon sont schs sous azote
- Rajouter 3 ml dacide actique glacial et 2 ml dune solution de chlorure ferrique
dans chaque tube
- Les tubes sont agits et la coloration est mesure au spectrophotomtre la
longueur donde de 450 nm, contre un tmoin blanc (seulement les solutions
dacide actique et de chlorure de fer).
.
La quantit de strols est ensuite dtermine partir de la gamme talon, puis ramene la
masse sche de biomasse.
IV.6. Dosage des acides gras par chromatographie gazeuse (Rozs 1992;Rozs et al.
1992)
Les acides gras sont saponifis en prsence de mthanol en milieu alcalin 100C. Les esters
mthyliques obtenus sont doss par Chromatographie en Phase Gazeuse.
Matriel :
- tubes en verre
- Seringue en verre 250 l
- Chromatographie en phase gazeuse : Hewlet-Packard 5890 connect un
ordinateur HP Vectra. Le logiciel dacquisition est le Software Chemstation
(Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA). La colonne utilise est une
FFAP-HP 30m x 0,25mm x 0,25 m (Agilent). Linjection de lchantillon se fait
par lintermdiaire dun injecteur automatique HP 7673 (Agilent).
90
Solutions :
- Solution de NaOH 5% (w/v) dans mthanol/H
2
O (v/v)
- Solution de HCl 5N
- Solution de Hexane/MTBE (v/v)
- Solution de standard et dtalons internes : les diffrents standards sont donns
dans le tableau 7. Les talons internes sont donns dans le tableau 8.
Tableau 7 : Noms communs, rfrences, nombre de carbones et dinsaturations (C nombre de
carbones :nombre dinsaturations) des standards dacides gras utiliss pour la quantification
par chromatographie gazeuse
Nomde lacide gras Rfrence Nombre de C : Nombre dinsaturations
Acide caproque SIGMA C2250 C6
Acide octanoque SIGMA 15,375-3 C8
Acide Caprique SIGMA C1875 C10
Acide Laurique SIGMA L4250 C12
Acide Myristique SIGMA M3128 C14
Acide Myristolque SIGMA M3525 C14 :1
Acide Palmitique SIGMA P5585 C16
Acide Palmitolque SIGMA P9417 C16:1
Acide Straque SIGMA S4751 C18
Acide Olique MERCK 1.00471 C18:1
Acide Linolique SIGMA L1376 C18:2
Acide Linolnique SIGMA L2376 C18:3
Acide Arachidique SIGMA 13631 C20
Tableau 8 : Noms communs, rfrences, nombre de carbones et dinsaturations (C nombre de
carbones : nombre dinsaturations) des talons internes dacides gras utiliss pour la
quantification par chromatographie gazeuse
Nomde lacide gras Rfrence Nombre de C : Nombre dinsaturations
Acide Heptanoque SIGMA H9378 C7
Acide Heptadcanoque SIGMA H3500 C17
Le C7 est utilise pour la quantification des acides gras de moyenne chane (C6 C14). Le
C17 est utilis pour quantifier les acides gras de longue chane (C16 C20).
91
Protocole :
- Entre 10 et 15 mg masse sche de cellules sont placs dans un tube en verre,
pralablement nettoy lacide nitrique 30 % pendant plusieurs heures, puis rincs
leau mQ.
- Ajouter 1 ml NaOH 5% (w/v) dans mthanol/H
2
O (v/v) et 10 l dtalon interne
- Vortexer
- Placer 30 min 100C
- Laisser refroidir
- Ajouter 500 l de HCl 5N pour neutraliser le mlange
- Vortexer
- Deux extractions successives avec 300 l de Hexane/MTBE (v/v) : 3 intervalles de
30 secondes dagitation et 1 min de repos, avant de rcuprer la phase organique
(phase suprieure) laide dune seringue en verre de 250 l. La phase organique
est ensuite place dans un vial.
Condition de lanalyse chromatographique :
- Le programme de temprature est : 140C + 4C.min
-1
jusqu 240C
- Temprature injecteur : 250C
- Temprature dtecteur : 280C
- Gaz vecteur : Hlium, dbit 1,2 ml.min
-1
V. Analyse des composants paritaux (Aguilar-Uscanga et Franois 2003a;Dallies et
al. 1998)
V.1. Extraction des parois cellulaires
Les cellules sont casses avec des billes de verre. Aprs plusieurs lavages avec du tampon TE,
les parois sont rcupres par centrifugation.
Matriel :
- Billes de verre (diamtre compris entre 0,2 et 0,5 mm)
- Appareil de cassage FastPrep
et tubes adapts
Solutions :
- Tampon TE froid (Tampon Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM)
- Eau distille
92
Protocole:
- Environ 50 mg masse sche de cellules sont transfrs dans un tube eppendorf
vis et lav 3 fois leau distille.
- Resuspendre le culot dans 50 l de TE froid
- Rajouter 0,45 g de billes de verre
- Broyer alors les chantillons au bead-beater par run de 20s la vitesse maximale.
Au moins 6 run sont raliss. Le taux de broyage se vrifie au microscope.
- Transfrer la suspension cellulaire alors dans un tube de 15 ml.
- Laver les billes au moins 5 fois avec du TE.
- Les lavages et la suspension initiale sont mlangs et centrifugs 4000tr.min
-1
pendant 5 min.
- Reprendre le culot dans 1ml de TE et le transfrer dans un tube eppendorf
- Centrifuger 2 min 5000 tr.min
-1
. Le culot est alors lav plusieurs fois avec du TE
(jusqu ce que le surnageant soit clair).
- Les parois ainsi obtenues sont resuspendues dans 0,5 ml de tampon TE et
conserves 20C.
V.2. Dosage sucres totaux
Le principe est bas sur la formation dune coloration jaune en prsence dacide sulfurique
concentr et de phnol , qui est mesure au spectrophotomtre 490 nm (Dubois et al. 1956).
Matriel :
- Tube hmolyse
- Bain-marie 30C
Solutions :
- Solution de phnol 5% (w/v)
- H
2
S0
4
concentr 95%
- solutions standard de glucose/mannose (50/50) de 5 200 g/ml
Protocole:
- 200 l de suspension de paroi (ou 200 l de solution standard) sont placs dans un
tube hmolyse
- Rajouter 200 l de Phnol 5% (w/v)
93
- Puis, 1 ml de H
2
S0
4
concentr est lentement rajout car la raction est
exothermique
- Aprs homognisation et refroidissement des tubes, les placer dans un bain-marie
20 min 30C
- Lire ensuite labsorbance =490 nm
V.3. Dosage de la chitine (Molano et al. 1977;REISSIG et al. 1955)
Aprs hydrolyse de la chitine en N-actyl-glucosamine de manire enzymatique, le
N-actyl-glucosamine est dos grce au ractif de Reissig. Il se forme une coloration violette
dont lintensit, proportionnelle la quantit de N-actyl-glucosamine, se mesure au
spectrophotomtre 585 nm.
Matriel :
- Tubes hmolyse
- Bain-marie 80C
- Bain-marie 100C
- Bain-marie 37C
- Table agitante 37C
Solutions :
- Solution de KOH 6% (w/v)
- Tampon phosphate 50 mM pH 6,5
- Solution de ttraborate de potassium 0,27 M, pH 9,0
- Ractif de Reissig obtenu par dilution du ractif de Reissig 10X : 10 g
4-dimethylaminobenzaldehyde, 12,5 ml HCl 10 N et 87,5 ml Acide actique
glacial. Le Reissig 10X est stable pendant plusieurs mois 4C et labri de la
lumire.
- Eau distille
- Solutions de N-actyl-glucosamine (0 10 mM) pour la calibration
- Zymolyase 20 T (Seikagaku corporation)
- chitinase de Serratia marcescens (SIGMA))
Protocole :
- 50 mg masse sche de cellules sont centrifugs 4000 g, 3 min
- Le culot est lav plusieurs fois leau
- 1 ml de KOH 6% (w/v) est rajout au culot et le tout est transfr dans un tube en
verre pyrex.
- Le tube est plac 80C pendant 90 min.
94
- Ajouter alors 0,5 ml acide actique glacial
- Refroidir le tube dans la glace
- Centrifuger 4000g pendant 3 min
- Laver le culot 2 fois avec de leau, puis avec du tampon phosphate.
- Resuspendre le culot dans 0,5 ml de tampon phosphate
- Rajouter 5U de zymolyase 0,1 unit.l
-1
et 250 mU de chitinase en solution 5
units.ml
-1

- La raction se fait sous agitation douce 37C pendant une nuit.
- A 100 l de milieu ractionnel, sont ajouts 150 l de H
2
O et 250 l de ttraborate
de potassium
- Placer le tube dans un bain-marie 100C pendant 8 min
- Laisser refroidir dans la glace.
- Rajouter 3 ml de ractif de Reissig 1X
- Aprs incubation 37C pendant 20 min, labsorbance est lue 585 nm
V.4. Dosage des mannanes et des glucanes
Aprs hydrolyse acide des mannanes et des glucanes, le mannose et glucose respectivement
forms sont doss par HPAEC (High performance Anion-exchange Chromatography).
V.4.i. Hydrolyse acide
Les parois obtenues prcdemment sont hydrolyses en milieu acide chaud.
Matriel :
- Etuve 30C
- bain-marie 100C
Solutions :
- Solution de H
2
SO
4
72%
- Solution dhydroxyde de baryum sature
- Eau distille
Protocole :
- 100 l de paroi sont transfrs dans un tube eppendorf vis
- Eliminer le surnageant aprs centrifugation 10000 tr.min
-1
pendant 30s
95
- Rajouter 50 l de H
2
SO
4
72%
- Laisser 3h 30C
- La concentration en acide est ramene 2N par ajout de 650 l deau.
- Placer alors les tubes dans un bain-marie 100C. La raction est arrte dans la
glace au bout de 4 h.
- Diluer lacide par ajout de 6 ml deau
- Neutraliser lacide par ajout dune solution dhydroxyde de baryum sature. 5,5 ml
de la solution de baryum sont ajouts goutte goutte en homognisant
rgulirement. Il se forme alors un prcipit de sulfate de baryum. Les ions sulfate
perturberaient lanalyse HPAEC. Il faut donc vrifier que lon a bien tout
neutralis en mesurant le pH qui doit dpasser 7. Si le pH est infrieur 7, il faut
rajouter du sulfate de baryum.
- Ajuster le volume avec de leau pour avoir une concentration en sucres de
50 g.ml
-1
au maximum.
- Eliminer le prcipit par centrifugation une premire fois 4000 g pendant 10 min,
puis, une deuxime fois, aprs une nuit 4C.
V.4.ii. Dosage par HPAEC (High Performance Anion-Exchange
Chromatography)
Les contenus en glucose et mannose des chantillons de parois hydrolyses ont t analyss
en chromatographie haute performance changeuse danion (HPAEC), couple une
dtection par ampromtrie pulse.
Matriel :
- HPAEC (High performance Anion-exchange Chromatography) :
Chromatographe DX 500 avec dtection ampromtrique
Logiciel : Dionex chromeleon
Colonne : CarboPac PA-10 (250 mm x 4 mm)
Conditions opratoires :
- Volume d'chantillon inject : 20 l
- Phase mobile : NaOH 18mM
- Dbit phase mobile (NaOH 18 mM) : 1 ml.min
-1
96
Cette technique permet de sparer le glucose (rsultat de lhydrolyse des glucanes), le
mannose (rsultat de lhydrolyse des mannanes) et glucosamine (rsultat de lhydrolyse de la
chitine). Le temps dhydrolyse ntant pas le mme pour la chitine et pour les glucanes et les
mannanes, la chitine sera estime par dosage enzymatique (Aguilar-Uscanga et Franois
2003b).
VI. Analyse du contenu en rserves intracellulaires (Parrou et Franois 1997)
Les rserves intracellulaires sont hydrolyses par des enzymes spcifiques :
l-amyloglucosidase pour le glycogne et la trhalase pour le trhalose. Le glucose libr est
ensuite dos par la mthode de la glucose oxydase.
VI.1. Lyse des cellules
La lyse des cellules permet d'extraire les rserves intracellulaires.
Matriel : bain-marie 95C
Solutions :
- Solution de carbonate de calcium 0,25 M
- Solution d'acide actique 1M
- Solution d'actate de sodium 0,2 M pH 5,2.
Protocole:
- centrifuger 12000 g, 5 min un volume de suspension cellulaire quivalent 7 mg
de biomasse sche.
- Le culot cellulaire est alors suspendu dans 250 l de carbonate de calcium 0,25 M
et incub 3 heures 95C.
- Rajouter 150 l d'acide actique 1M et 600 l d'actate de sodium 0,2 M pH 5,2.
VI.2. Dgradation du trhalose en unit glucose
La dgradation du trhalose en unit glucose est de type enzymatique.
Matriel : table agitante 37C
97
Solutions :
- Trhalase (SIGMA) 0,1 U/ml (prpare dans de l'actate de sodium 0,2 M pH
5,2)
Protocole:
- Prlever 500 l de l'extrait prcdemment prpar
- Ajouter 20 l de trhalase et laisser incuber une nuit 37C
- Centrifuger 12000 g, 3 min
- Doser le glucose libr dans le surnageant par la mthode de la glucose oxydase.
VI.3. Dgradation du glycogne en unit glucose
Matriel : chambre dincubation 56C
Solutions :
- d' -amyloglucosidase (BOEHRINGER MANHEIM) 8 UI/mL (prpare dans
de l'actate de sodium 0,2 M pH 5,2)
Protocole:
- Prlever 500 l d'extrait et ajouter 20 l d'-amyloglucosidase
- Incuber une nuit 56C
- Centrifuger 12000 g pendant 3 min
- Doser le glucose libr dans le surnageant par la mthode de la glucose oxydase
VI.4. Dosage du glucose libr
Le glucose est dos l'aide du kit enzymatique 510 A (SIGMA) par la mthode de la
glucose oxydase.
Matriel :
- Etuve 37C
- Plaque de microtitration 96 puits
98
Solutions :
- Kit enzymatique 510 A (SIGMA)
- Solutions talons de 0 300 mg.l
-1
de glucose partir de la
solution de glucose fournie 1 g.l
-1
Protocole :
- 20 l d'chantillon ou d'talon sont dposs dans une plaque de microtitration
- 200 l de ractif contentant les enzymes et la o-dianisine sont dposs dans chaque
puit
- Laisser incuber 30 minutes 37 C
- L'absorbance est mesure 490 nm sur un lecteur de plaques (Labsystem,
Multiscan Ascent) par rapport une solution tmoin constitue de 20 l d'eau
distille et de 200l de ractif.
VII. Mtabolites intracellulaires
Les cellules sont rcoltes directement la sortie du fermenteur dans une solution de
mthanol 60% 40C pour bloquer instantanment le mtabolisme. Les mtabolites sont
extraits avec de lthanol 80C (Gonzalez et al. 1997). Ils sont ensuite quantifis par
HPAEC.
VII.1. Extraction : selon la mthode de Gonzalez et al. 1997
Matriel :
- Bain-marie 80C
- Rotavapor
Solution :
- Solution de mthanol 60% (v/v), HEPES 10mM pH 7.5 40C
- Eau distille
- Solution dthanol dilue 75% (v/v) avec de lHepes, 70 mM pH 7.5
Protocole:
- Au moins 10 mg de cellules sont recueillies le plus rapidement possible par
quenching dans une solution de mthanol 60% 40C. Le volume dchantillon
ne doit pas dpasser 1/5 de la solution de quenching (habituellement, 5 ml
dchantillon pour 25 ml de solution 40C)
99
- Centrifuger rapidement 5000 rpm pendant 5 min 10C
- Eliminer le surnageant
- 5 ml de solution dthanol sont aussitt rajouts
- Placer 3 min dans un bain-marie 80C
- Les chantillons sont alors concentrs avec un rotavapor
- Resuspendre les chantillons dans 1 ou 2 ml deau
- Centrifuger 5000 rpm pendant 10 min 4C
- Le surnageant peut alors tre analys ou congel 20C (viter plus de deux
conglations/dconglations cause de la dgradation de certains mtabolites
(ATP, PEP, pyruvate).
VII.2. Quantification par HPAEC Dionex
Cette technique permet de dterminer les contenus intracellulaires en terme de :
- sucres phosphoryls : Glucose-6-P, Fructose-6-P, Fructose-1-6-P, Trehalose-6-P,
Fructose-1-P,
- nuclotides phosphates : AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, UDP, UTP,
UDP-glucose, UDP-acttylglucosamine.
- acides organiques : actique, formique, pyruvique, malique, fumarique, citrique, PEP,
-cetoglutarate
Matriel :
Le systme utilis est un systme DX 500 avec Chromeleon comme logiciel de commande
(Dionex, Sunnidale, CA , USA). Le gradient est assur par un systme de pompes GP40.
Lchantillonneur AS50 permet de garder les chantillons 4C. Les dtections se font grce
un dtecteur lectrochimique ED40 coupl un dtecteur barrette de diode PDA100.
100
35 65
100
Temps min
Actate de Na mM
0
500
0 75
350
0
30
60
0 30 60 45
12
Temps min
NaOH mM
0
20
40
0 30 60 45
8
Temps min
NaOH mM
Protocoles:
1. Nuclotides et nuclotides glycosyls
- Colonne : IonPac AS11 avec AG11 comme pr-colonne.
- Phase mobile : NaOH
Dbit : 1,5 ml.min
-1
- Dtection : conductimtrie couple une quantification 260 nm
2. Acides organiques
- Colonne : IonPac AS11H avec AG11H comme pr-colonne.
- Phase mobile : NaOH + 10 % mthanol
Dbit : 1,5 ml.min
-1
- co-lution Dtection : conductimtrie couple une dtection UV
3. Sucres phosphoryls
- Colonne : CarboPac PA1.
- Phase mobile : Actate de sodium + NaOH 50 mM
Dbit : 1 ml.min
-1
- Dtection : ampromtrie couple dtection UV
101
VIII. Analyse des profils dexpression des gnes par lutilisation de puces ADN de
type microarray
VIII.1. Obtention des ARNm
VIII.1.i. Echantillonnage des cellules
Les cellules sont rcoltes dans lazote liquide pour bloquer instantanment le mtabolisme.
VIII.1.ii. Extraction des ARN
Matriel :
- MicroDismenbrator (Braun, Melsungen)
- Midi kit Rneasy Qiagen
Solution :
- H
2
0-DEPC
- Solution de LiCl-DEPC 4M (LiCl 4M dans H
2
0-DEPC)
- Solution dthanol 70 % (v/v)
Protocole:
- Lextraction commence par un cassage mcanique des cellules (environ 10 mg masse
sche). Le matriel utilis est pralablement plac dans lazote liquide afin dviter
toute dconglation des cellules pouvant perturber leur profil transcriptionnel. Le
cassage se fait laide dune bille de tungstne de 7 mm de diamtre sur environ
10 mg de masse sche de cellules, avec un microDismenbrator dont la vitesse
dagitation est fixe 2600 rpm pendant 2 min.
- La purification des ARN est ralise grce au Rneasy midi kit de QIAgen. Tout
dabord, les fragments de cellules sont rcuprs dans un tube falcon contenant 1,9 ml
de tampon RLT et 19 l de -mercaptothanol par une centrifugation 4000 rpm
pendant 5 min. Le surnageant est ensuite purifi selon le protocole fournit avec le kit.
les ARN sont dabord fixs sur une colonne RNeasy et aprs plusieurs lavages avec
les tampons fournis pour enlever les fragments de cellule, une tape dlution leau
traite au DEPC permet de dcrocher lARN.
- Ces ARN sont alors transfrs dans un tube eppendorf et gards dans la glace
102
- Afin dliminer un maximum des protines restantes, il faut prcipiter pendant 1 heure
-20C aprs action de 500 l de LiCl-DEPC 4M.
- Centrifuger 15 000 rpm, 4C, 30 min
- Le culot est lav deux fois avec 250 l dthanol 70 %.
- Centrifuger 5 min, vitesse maximale
- Lthanol est enlev laide dune pipette et le culot est sch lair
- Redissoudre le culot dans 50 l de H
2
O-DEPC.
VIII.1.iii. Vrification de la qualit des ARN :
La qualit et la quantit de lARN extrait sont alors vrifies par lecture de labsorbance
280 nm (absorbance des protines) et 260 nm (absorbance des nuclotides), puis par
migration sur un gel dagarose (0,8 %).
La qualit et la concentration en ARN sont aussi mesures grce lAgilent 2100 bioanalyzer.
Le principe de cet appareil est de faire migrer les chantillons par lectrophorse capillaire sur
gel de polyacrylamide. Les ARN sont visualiss et quantifis par fluorescence. Il faut diluer
les chantillons au 1/50
me
pour se situer dans la fourchette danalyse de 5 500 ng.l
-1
dARN total.
Pour des ARN de bonne qualit :
- en terme de contamination protique : 1 , 2 8 , 1
280
260

nm
nm
DO
DO
- en terme de dgradation des ARNm: partir de laspect des ARNs ribosomiques
(Agilent 2100 Bioanalyzer) : 7 , 1
18
28
S
S
ARN
ARN
VIII.2. Prparation des sondes et des lames
Aprs extraction de lADN gnomique de la levure, les ORFs (Open Reading Frame) sont
amplifies par PCR avec des amorces spcifiques. Ces amorces prsentent des tag leur
extrmit. Ces tag sont des squences identiques pour les amorces de tous les gnes.
Pour chaque amplification, lenzyme utilise varie selon la taille des fragments amplifier
mais le programme reste le mme (cf. tableau 9).
103
Tableau 9 : Procdure damplification des ORFs de levure.
Fragments < 3kb Fragments >3kb
ADN gnomique 1 l 1 l
Tampon 10 l de tampon 10X buffer
(10mM TRIS-HCL, 500mM KCl,
15mM MgCl
2
)
10 l
tampon 1 du kit long expand
(Boehringer Mannheim)
dNTP
(25mM chacun)
1 l 1 l
Amorce 1
Amorce 2
2 l
2 l
2 l
2 l
Enzyme 0,3 l de Taq polymrase (Sigma)
0,3 l de pfu polymrase (Promega)
1l denzyme mix du kit long
expand (Boehringer Mannheim)
H
2
O mQ Complter 100l
Le programme damplification est le suivant : 94C pendant 2min, suivi de 10 cycles (10 sec 94 C, 30 sec 55
C, 8 min 68 C) et de 25 cycles (10 sec 94 C, 30 sec 55 C, 8 min 68 C + 20 sec par cycle supplmentaire
68C) et enfin 7 min 68C
La prsence du fragment dADN amplifi est contrle sur gel dagarose 0,8 %.
Les lames utilises sont des dendrilames (Le Berre et al. 2003). Les sondes ont t spottes
la Plateforme Transcriptome-Biopuce de Toulouse. Les dpts ont t faits par un jeu de 4x4
aiguilles sur la lame de verre pralablement active, puis fixs de manire covalente (Le Berre
et al. 2003). Chaque aiguille spotte un bloc de 21 lignes sur 20 colonnes. Chaque ORF est
spott en duplicat, lun cot de lautre sur la mme ligne. Il y a en tout 32 blocs (8 lignes de
blocs x 4 colonnes) de 420 dpts (soit 210 ORFs diffrents environ car il y a des spots
vides). En tout, il y a 6074 ORFs en duplicat soit 12148 dpts sur chaque lame.
VIII.3. Rtrotranscription en ADNc et marquage
Les ARN messagers sont retrotranscrits laide dune transcriptase reverse en prsence de
nuclotides dCTP marqus par un fluorochrome Cy5 ou Cy3. Les ADN complmentaires
marqus ainsi obtenus sont les cibles hybrids sur lame de verre.
Matriel : bain-marie 37C, 42C et 70C.
104
Solutions :
- Ractifs fournis dans le kit CyScribe First-Strand cDNA Labelling (Amersham
Biosciences)
- NaOH 2,5 M
- HCl 2M
Protocole :
Les ARN sont gards dans la glace tout au long du mlange des ractifs.
Un premier mlange est ralis, tel que le volume final soit 11 l.
20 g dARN totaux X l
Random nonamers 1 l
Oligo(dT) 1 l
Eau (fournie dans le kit) Y l
Total 11 l
X est le volume de solution dARN prlev pour avoir 20 g dARN totaux. Il est calcul
partir de la concentration en ARN totaux de lchantillon donne par lAgilent 2100
bioanalyzer. Y est le volume deau ajoute qui est ajust en fonction de X.
Le mlange ainsi obtenu est homognis par pipetages successifs et plac 70C pendant
5 min. Puis, il est laiss 10 min temprature ambiante : les primers shybrident aux ARNm.
Lchantillon est centrifug 30 s pour collecter tout le mlange, puis est plac dans la glace.
Sont alors rajouts les lments suivants dans lordre :
5 x CyScript buffer 4 l
0.1 M DTT 2 l
dCTP nucleotide mix 1 l
dCTP CyDye-labelled nucleotide 1 l
CyScript reverse transcriptase 1 l
Total 20 l
Aprs avoir vortexer et centrifuger 30 s, les tubes sont incubs 2 h 42C pour la synthse
des cDNA marqus.
Les ARN sont ensuite hydrolyss par ajout de 2 l de NaOH 2,5 M et laisss 15 min 37C.
Pour neutraliser, 10 l de solution acide chlorhydrique 2M sont ajouts.
105
Les ADNc marqus sont ensuite purifis sur colonne CyScribe GFX (Amersham
Biosciences). Les colonnes permettent de purifier des fragments de taille suprieure 50
bases.
Tout le mlange est plac dans une colonne, o ont t dposs au pralable 500 l de
Capture buffer fournit dans le kit. Aprs centrifugation vitesse maximale pendant 30 s dans
une microcentrifugeuse, la colonne est lave trois fois avec 600 l de tampon de lavage
fournit dans le kit. Les ADNc sont enfin lus avec 60 l de tampon dlution fournit.
VIII.4. Qualit de la rtrotranscription
La purification sur colonne permet de se dbarrasser des nuclotides non incorpors. La
qualit du produit, ainsi obtenu aprs rtrotranscription et purification, a pu tre estime par :
- la quantit dacides nucliques prsents
- la quantit de Cy3 et de Cy5 incorpor dans les acides nucliques
Pour avoir une ide des quantits dacides nucliques prsents, le flurochrome Ribogreen a
t utilis. Dans le kit Ribogreen (Molecular Probes) est fournie une solution de TE 20X qui
sera dilue dans H
2
O DEPC, et le ribogreen 200X qui sera dilu dans du TE.
4 l dchantillon sont dilus dans 80 l dH
2
O DEPC et placs dans une plaque de
microtitration de 96 puits. Le Ribogreen est rajout 5 min avant la lecture.
Pour la quantification de la fluorescence des Cy3 et des Cy5, 6 l dchantillon sont dilus
dans 14 l H
2
O DEPC et placs dans une plaque de microtitration de 384 puits.
La lecture se fait grce au Typhoon 9400 (Amersham bioscience) en ajustant les longueurs
donde dexcitation et dmission des diffrents fluorochormes (cf. tableau 10).
Tableau 10 : Longueurs donde dexcitation et dmission des diffrents fluorochromes
utiliss
Excitation (nm) Emission (nm)
Ribogreen 500 525
Cy3 532 570
Cy5 633 670
Ces techniques nont t utilises ici que pour comparer des quantits relatives entre
chantillons. Pour avoir des quantits absolues, il faudrait tablir des courbes dtalonnage.
106
VIII.5. Hydridation
10 l de cibles sont mlangs 300 l de RibeHybe (Ventana), avant dtre dposs sur lame.
Lhybridation se fait par hybridation automatique grce au systme Discovery (Ventana),
avec les paramtres suivants :
- temprature hybridation : 42C
- temps dhybridation : 10h
- Rincage : 2X SSC
VIII.6. Lecture du signal
Les lames sont scannes avec le Scanner GenePix 4000 (AXON INSTRUMENT) et le
logiciel GenePix Pro 3.0 (AXON INSTRUMENT).
VIII.7. Analyse des donnes
VIII.7.i. Normalisation
Aprs traitement des images et avant toute utilisation des donnes, il faut passer par une tape
de normalisation pour palier aux diffrences entre les lames et entre les marquages. La
normalisation se fait par lintermdiaire du logiciel Bioplot (http://biopuce.insa-toulouse.fr).
VIII.7.ii. Identification des gnes diffrentiellement exprims : test de
Student
Ensuite, pour comparer deux conditions A et B, il faut identifier les gnes qui varient dune
condition lautre. Pour cela, on commence par calculer les moyennes m
A
et m
B
. m
A
et m
B
sont les moyennes associes aux deux lots de donnes comparer pour un gne donn.
Une analyse du rapport
B
A
m
m
de sous ou sur-expression ne suffit pas pour conclure. Pour
poursuivre lanalyse, il faut appliquer un test statistique pour savoir si le gne est
significativement diffrent entre les deux conditions, cest--dire si la diffrence entre m
A
et
m
B
nest pas due aux erreurs exprimentales. Le test utilis est le test de Student.
107
Le test de Student permet de comparer deux lots de donnes. Il renvoie une probabilit qui
permet de dire pour chaque gne, si le test est significatif, cest--dire si les deux lots de
donnes peuvent tre considrs comme diffrents.
Pour calculer la probabilit de Student associe chaque gne, il faut dabord calculer le
nombre Ts selon la formule suivant :
( )
n
s s
m m
Ts
B A
B A
2 2
+
=
O n= nombre de valeurs servant au calcul de m et s
m= moyenne sur les n spots correspondant un mme gne
s= cart-type associ aux n valeurs. Il value lerreur exprimentale.
A partir de Ts, il existe des tables qui renvoient la probabilit de Student associe.
Dans nos conditions, nous travaillons avec les ratios dintensit des fluorochromes et nous
utilisons des valeurs logarithmiques.
Ensuite, un seuil pour que le test soit significatif est fix 5%. La probabilit de Student
calcule pour un gne donn est alors compare au seuil : si P>5%, le test nest pas
significatif et si P<5% le test est significatif. Si le test est significatif, alors il y a moins de 5%
de chance de se tromper en disant que m
A
et m
B
sont diffrentes.
Lapplication du test de Student se fait via logiciel Bioplot (http://biopuce.insa-toulouse.fr).
VIII.7.iii. Calcul du nombre de rptitions ncessaires
Pour tenir compte des variabilits exprimentales de la technique, il est ncessaire de faire des
rptitions. Plus il y aura de rptitions, plus nous aurons de prcision sur la mesure. Mais il
sagit de technologies onreuses donc il faut limiter le nombre dexpriences. Nous avons
donc mis en place une stratgie pour estimer un nombre de lames suffisant en fonction de la
prcision souhaite sur le ratio dexpression. En utilisant le test de Student et lerreur
moyenne sur lensemble du processus exprimental, nous pouvons estimer le ratio seuil de
sous- ou sur-expression pertinent pour un nombre de rptitions donn.
108
a. Estimation lerreur exprimentale moyenne
Lvaluation de lerreur exprimentale repose sur la comparaison de lames obtenues dans les
mmes conditions. Pour chaque condition, trois extractions indpendantes sont effectues.
Afin de cumuler lensemble des erreurs du processus, chaque extraction suit un processus
indpendant de rtrotranscription et dhybridation (cf. figure 16).
Figure 16 : Schma rcapitulatif de la dmarche exprimentale aboutissant lestimation de
lerreur exprimentale globale du processus.
Un calcul de rsidu va permettre destimer lerreur exprimentale moyenne entre lames
indpendantes. Un rsidu reprsente la diffrence entre la valeur observe et la valeur
attendue. Le calcul se fait en comparant les lames deux deux. Il faut dabord tracer les
corrlations entre les valeurs exprimentales yi = f((xi) o yi= valeur normalise du ratio des
intensits de chaque fluorochrome du spot i pour la lame 2 et xi = valeur normalise du ratio
des intensits de chaque fluorochrome du spot i pour la lame 1. yi et xi sont des valeurs
logarithmiques. Sans erreur exprimentale, les points (xi,yi) se trouveraient sur la droite
dquation y=x. Le principe de dtermination du rsidu est donc de calculer lcart entre les
points (xi,yi) et la droite y=x.
Enfin, le rsidu moyen r
moyen
sobtient par la formule suivante :
1
2
r
=
n
xi yi
moyen
o n=le nombre de spots sur la lame.
Le pourcentage derreur exprimentale sobtient partir du rsidu moyen :
% derreur exprimentale = (1- 10
rmoyen
)x100.
Dendrilame 1
Dendrilame 2
Dendrilame 3
R.T. B-1
R.T. B-2
R.T. B-3
R.T. A-2
R.T. A-3
R.T. A-1 ARN A-1
ARN A-2
ARN A-3
ARN B-2
ARN B-3
ARN B-1
Echantillon A
Echantillon B
Dendrilame 1
Dendrilame 2
Dendrilame 3
R.T. B-1
R.T. B-2
R.T. B-3
R.T. A-2
R.T. A-3
R.T. A-1 ARN A-1
ARN A-2
ARN A-3
ARN B-2
ARN B-3
ARN B-1
Echantillon A
Echantillon B
109
Les erreurs cumules pour les lames de verre conduisent un pourcentage derreur
exprimentale moyen denviron 30%.
Remarque : Dans cette stratgie, nous navons pas tenu compte des diffrences de marquage
entre les fluorochromes. Nous aurions du faire "un dye switch" sur les donnes, cest--dire
de marquer chaque chantillon alternativement avec lun et lautre des fluorochromes.
b. Estimation du ratio seuil et du nombre de lames
Aprs le calcul de lerreur exprimentale, le test de Student est appliqu avec une probabilit
seuil de 5%. A cette probabilit de 5% est associ un nombre de Student Ts qui va dpendre
du nombre de rptitions. En effet, soit N le nombre de lames, Ts sexprime de la manire
suivante :
=
N
rmoyen
M M
Ts
B A
2
o M
A
et M
B
sont les moyennes des intensits des spots de toutes les
lames pour les conditions A et B et rmoyen reflte lerreur exprimentale moyenne, il a t
calcul plus haut.
Ainsi, une diffrence M
A
-M
B
est associe un nombre de lames donn et un seuil de
probabilit donn. Comme nous travaillons, en valeurs logarithmique: ) log( / B A B A R M M = .
O R
A/B
est le ratio des intensits entre les deux conditions.
Il est vident que plus il y aura de rptitions, plus on pourra abaisser le seuil de dtection du
ratio de sur ou sous-expression. Il faut alors trouver un bon compromis entre un minimum de
lames et un rapport seuil intressant.
Tableau 11 : Relation entre le nombre de rptitions ncessaires et le ratio seuil
statistiquement dtectable au-del duquel un gne peut-tre rationnellement dclar
diffrentiellement exprim entre deux conditions, avec une erreur exprimentale estime
30%.
Nombre de lames N 9 6 5 4 3 2
Rapport seuil R 1,3 1,4 1,5 1,6 1,8 3
110
Il semble donc que 3 lames par condition soit un bon compromis entre nombre de lames
et niveau de sous- ou sur-expression mis en vidence. Le ratio seuil dtectable est alors
de 1,8.
VIII.7.iv. Analyse approfondie des rsultats de lanalyse transcriptomique
Le reste de lanalyse se fait par la combinaison de diffrents outils :
- des logiciels : R, Genespring (Silicon Genetics), Cluster et Treeview (Eisen et al.
1998), FUNSPEC (http://funspec.med.utoronto.ca/).
- des bases de donnes : SGD (Saccharomyces genome database), CYGD
(Comprehensive Yeast Genome Database) de MIPS (Munich Information center for
Protein Sequences), GO (Gene Ontology), YPD (Yeast Proteome Database).
111
Partie III :
Choix et optimisation de la mthode
dextraction ncessaire la
quantification des contenus
intracellulaires en lipides
Partie III
112
Partie III
113
Les mthodes utilises pour extraire les lipides microbiens sont inspires de mthodes mises
au point sur des chantillons biologiques tels que des denres alimentaires (poisson,) ou des
tissus animaux (cerveau, muscle.). Les mthodes de rfrence en la matire sont celles de
Folch et al. (1957) et Bligh et Dyer (1959). Ces deux mthodes reposent sur des extractions
avec un mlange de solvants mthanol/chloroforme, suivies dune tape de
lavage/purification. Il existe aussi des mthodes dextraction chaud (type soxhlet). Ces
mthodes ont d tre adaptes des chantillons de cellules de levure.
Seront prsentes ici quatre mthodes testes afin de trouver la mthode la plus adapte dans
notre cas. Les deux premires mthodes sont dj utilises sur des cellules de levures. La
mthode 3 est inspire dtudes sur des mycobactries et la dernire est une adaptation de la
mthode au soxhlet :
- mthode 1 (Rozs 1992) : inspire de la mthode de Folch et al. (1957)
- mthode 2 : mthode inspire de la mthode de Bligh et Dyer (1959)
- mthode 3 : mthode dite de gradients de solvant inspire de la mthode de
Stephan et al. (2004)
- mthode 4 : mthode au soxhlet
Pour valuer les performances de chaque mthode, il faut avoir des mthodes de
quantifications fiables. Plusieurs techniques de mesure soffrent nous pour quantifier
lextrait lipidique :
- La gravimtrie qui mesure des lipides totaux (erreur exprimentale de lordre de
7%)
- Deux mthodes colorimtriques : une pour la quantification des phospholipides
totaux par dosage du phosphore (erreur exprimentale de lordre de 7%) et lautre
pour le dosage des strols totaux (erreur exprimentale de lordre de 5%)
- la Chromatographie Couche Mince : sparation et quantification des diffrents
composs (erreur exprimentale de lordre de 10 %)
Dans un premier temps, les quatre principales mthodes seront compares et une mthode
sera retenue. La meilleure mthode nos yeux a t choisie selon plusieurs critres :
- Rendement dextraction sur standards de lipides
- Efficacit dextraction sur cellules de levures
- Reproductibilit
- Rapidit et simplicit de mise en uvre
Ensuite, je prsenterai comment la mthode retenue a t optimise.
Partie III
114
=> permettraient dinactiver les phospholipases
I. Choix de la mthode dextraction des lipides cellulaires
I.1. Descriptif des diffrentes mthodes
I.1.i. Mthode 1 (Folch et al. 1957;Rozs 1992) : cf. figure 17
Cette mthode consiste en une extraction mthanol /chloroforme (2:1 v/v) avec un cassage
des cellules, suivie par une tape de lavage. Elle a t dcrite par Rozs (1992). Lextraction a
d tre adapte au matriel disponible.
Elle est dcrite pour un chantillon de 25 mg de cellules en masse sche. Mais elle peut tre
adapte pour des plus gros volumes. Les cellules sont rcupres par centrifugation 5000 g
pendant 5 min. Le culot est lav plusieurs fois. Lchantillon peut tre conserv -80C pour
une utilisation ultrieure ou bien tre utilis immdiatement.
Sur un culot humide sont rajouts :
- 25 l dEDTA 0,1 M
- 125 l de mthanol froid (+4c)
- des billes de verre de diamtre 0,50 mm jusquau mnisque.
- 125 l de mthanol froid et 500 l de chloroforme froid
Les cellules sont broyes en utilisant un vortex treize fois 20 secondes et mises sous agitation
250 rpm pendant 2 heures. Puis lextrait est centrifug 5000 g pendant 2 min et la phase
organique est rcupre.
Sur les dbris cellulaires, deux extractions successives sont faites en plus dans les mmes
conditions.
Apres ces trois extractions, les trois phases organiques sont runies et purifies au moyen
dune solution aqueuse de KCl 0,88% (w/v) (25% du volume total). Le lavage consiste
vortexer, laisser reposer 10 min dans la glace, puis rcuprer la phase organique. Ce lavage
est ralis deux fois.
La phase chloroformique est ensuite sche sur une colonne de NaSO
4
anhydre pour liminer
toute trace deau. La phase chloroformique purifie est ramene sec sous un courant dazote,
puis lextrait lipidique est repris dans 50 l de chloroforme. Lextrait est ensuite conserv
-80 C ou utilis pour lanalyse.
Partie III
115
Figure 17 : Schma descriptif de la mthode n1 (Rozs 1992). TA = temprature ambiante,
HCCl
3
= chloroforme.
25 l EDTA 0,1M
250 l Mthanol
500 l HCCl
3
Billes de verre
Agitation 2H TA 250rpm
2 lavages au KCl
0,88% (w/v)
X2 Vortex
Phase organique
(cumul des 3
extractions)
Cellules
Phase aqueuse
Coton
Na
2
SO
4
anhydre
Schage phase
organique sous
azote
Resuspension dans
un volume connu de
chloroforme
25 mg de masse sche
Phase organique
Partie III
116
I.1.ii. Mthode 2 : extraction des lipides totaux sur biomasse frache : (Bligh
et Dyer 1959)
Lextraction est inspire de la mthode de Bligh et Dyer (1959) avec un solvant contenant
Mthanol/Chloroforme/H
2
O dans les proportions 2:1:0,8 (v/v), puis les proportions sont
ramenes 2:2:1,8 (v/v) pour obtenir deux phases bien distinctes : lune contenant le
chloroforme et les lipides ; lautre, leau, le mthanol et les restes de cellules.
Figure 18 : Schma descriptif de la mthode n2
Pour les levures, lextraction se fait directement sur une suspension de cellules :
- A 10 mg de masse sche de cellules resuspendues dans 0,8 ml deau, rajouter 3ml de
chloroforme/mthanol 2:1 (v/v)
- Vortexer : on obtient une phase
- Laisser en contact une heure
- Ajouter 1 ml de chloroforme, et 1 ml deau distille
- Vortexer : on obtient deux phases
- Rcuprer la phase chloroformique contenant les lipides
- Scher sous vide ou sous azote.
- Reprendre dans 50 l de chloroforme.
3 ml Mthanol/chloroforme 2:1
Vortex
Phase organique
Cellules + mthanol+H
2
0
Schage phase
organique sous
azote
Resuspension dans
un volume connu de
chloroforme
0,8 ml de suspension cellulaire UDO=10
1 heure de contact
1 ml chloroforme
1 ml H
2
O
Vortex
1 phase
2 phases
Partie III
117
I.1.iii. Mthode 3 : dite de gradient de solvant (Stephan et al. 2004)
Nous avons adapt une mthode utilise initialement pour extraire des lipides mycobactriens
(Stephan et al. 2004).
La mthode est dcrite en dtail dans la partie Matriel et Mthodes et dans la figure 19.
Quatre extractions successives sont ralises sur le mme chantillon de cellules. Le solvant
dextraction est un mlange mthanol/chloroforme de plus en plus enrichi en chloroforme
(Premire extraction : mthanol/chloroforme (2V:1V) ; Deuxime extraction :
mthanol/chloroforme (1V:1V) ; Troisime extraction : mthanol/chloroforme (1V:2V) ;
Quatrime extraction : mthanol/chloroforme (1V:2V). Les quatre extractions sont ensuite
regroupes et laves avec une solution de KCl 0,88% (cf. figure 19).
Lutilisation dun gradient de solvant permet desprer extraire un plus large spectre de
lipides. Cette mthode assez simple peut-tre adapte nimporte quelle quantit de cellules
au dpart.
Figure 19 : Schma descriptif de la mthode n3. Vm/Vc= (2:1), puis une fois (1:1) et enfin
deux fois (1:2). TA= temprature ambiante, Vm/Vc=volume de mthanol/volume de
chloroforme.
Vm Mthanol
Vc HCCl3
Agitation 1 journe TA 325 rpm
Lavage leau
Phase organique
Cellules + Phase
aqueuse
Phase organique
Phase aqueuse
Schage phase
organique sous
azote
X mg de masse sche
Vm/Vc
4 fois
Partie III
118
I.1.iv. Mthode 4 : Extraction au soxhlet
Il faut une quantit consquente de cellules (500 mg de masse sche) pour utiliser cette
mthode. Lextraction par solvant (100 ml de chloroforme/mthanol (2 /1)) chaud avec un
appareil de type Soxhlet est faite pendant 20 heures. Les cellules de prfrence lyophilises
sont places dans la cartouche (3) (cf. figure 20). Le ballon (2), contenant le solvant
dextraction est chauff. La condensation des vapeurs de solvant se ralise au niveau du
rfrigrant (1), le liquide retombe et saccumule dans la partie contenant les cellules (3).
Grce un systme de siphon (4), quand le solvant (charg de lipides) atteint le niveau du
coude, tout le liquide est vidang dans le ballon o saccumulent les lipides au fur et mesure
des vidanges.
A la fin de lextraction, aprs lavage de la phase organique, le solvant est vapor au
rotavapor, puis le rsidu de lipides est pes. Lextrait est ensuite stock dans du chloroforme.
Figure 20 : Schma descriptif de lappareillage soxhlet de la mthode n4.
rfrigrant (1)
cartouches
contenant les
cellules (3)

Ballon (2)
siphon (4)
Partie III
119
I.2. Critres de choix
La mthode retenue doit tre quantitative. Dune part, il ne doit pas y avoir perte ou
dgradation de matriel lipidique pendant lextraction. De plus, elle doit tre reproductible. Et
enfin, elle doit extraire un maximum des lipides cellulaires. Cela dfinit donc trois critres
auxquels jai rajout une notion de rapidit et simplicit de mise en uvre. Les quatre critres
sont donc :
- Le rendement dextraction sur standards de lipides
Le rendement dextraction est obtenu en effectuant la totalit de lextraction sur des
solutions contenant les standards (dcrits dans la partie II Matriel et Mthodes ) en
concentrations connues. Les quantits de standards recueillies aprs extraction sont
quantifies par CCM et ramenes au pourcentage de lipides thoriquement introduit au
dpart.
- Efficacit dextraction sur les cellules de levures
Lefficacit est value par la quantit de lipides totaux extraits sur un chantillon de
cellules. La quantit de lipides contenue dans les cellules ntant pas connue au
pralable, lefficacit absolue dextraction ne peut tre quantifie. La meilleure
efficacit relative est dtermine par comparaison des quantits de lipides extraits pour
chaque mthode. Les efficacits pour les diffrentes mthodes sont calcules
relativement la quantit maximale extraite qui est donc assimile une efficacit de
100%.
- La reproductibilit
La reproductibilit consiste faire au moins trois extractions par mthode sur le mme
chantillon de cellule. On estime alors un pourcentage de variabilit.
- La rapidit et la simplicit de mise en uvre
Chacun des trois premiers critres a t valu sur lensemble des quinze lipides
potentiellement identifiables par CCM. Une synthse de ces rsultats est prsente dans le
tableau 12.
Partie III
120
Tableau 12 : Evaluation des diffrents critres dans le choix parmi les quatre mthodes
dextraction dcrites ci-dessus.
Critre de choix Mthode 1 Mthode 2 Mthode 3 Mthode 4
Rendement
dextraction (%)
-
(80-100%)
+
(90-100%)
+
(90-100%)
+
(90-100%)
Efficacit (%) +
90%
-
70%
++
100%
++
100%
Reproductibilit - ++ ++
Rapidit
(dure)
++
(1 journe)
+++
(quelques
heures)
-
(une semaine)
+
(2 jours)
Mise en uvre + + + -
La mthode 1 prsente linconvnient dune succession de plusieurs tapes qui affaiblissent le
rendement global et lefficacit de lextraction. Malgr nos tentatives doptimisation de la
mthode ce problme persiste.
La mthode 2 prsente lnorme dsavantage dtre peu efficace. En allongeant le temps
dextraction trois extractions de 2 heures, on gagne en efficacit mais celle-ci reste toujours
infrieure aux mthodes 3 et 4. Lajout dune tape de cassage des cellules namliore pas
lefficacit et diminue la reproductibilit.
Les mthodes 3 et 4 prsentent des performances comparables en terme de rendement,
defficacit et de reproductibilit. Le choix entre ces deux mthodes a t fait sur le critre de
mise en uvre. La technique au soxhlet prend deux journes mais un seul chantillon peut
tre trait la fois par appareil. Lextraction par la mthode 3 prend une semaine mais
beaucoup dchantillons peuvent tre raliss en parallle. Cest donc la mthode utilisant
des gradients de solvant (n3) qui a t retenue.
Partie III
121
II. Validation de la mthode dextraction aux gradients de solvant : mthode 3
II.1. Efficacit et optimisation des diffrentes tapes
La mthode finalement retenue (cf. figure 19) est celle qui utilise des gradients de solvant.
Nous avons dcid dtudier les diffrentes tapes de lextraction, afin doptimiser cette
mthode. Tout dabord, le temps et le nombre dtapes dextraction ont t optimiss. Ensuite,
nous nous sommes intresss ltape de lavage, puis, lutilit de rajouter un antioxydant
lors de lextraction.
II.1.i. Optimisation du nombre dtapes dextraction et du temps
dextraction
Nous avons souhait apprcier le nombre dtapes dextraction ncessaires. Sur un mme
chantillon, les diffrentes tapes dextractions ont t analyses sparment. Il a t effectu
six extractions successives de 1 journe chacune sur le mme chantillon. Les quatre
premires sont faites comme dcrites dans la figure 19. La cinquime et la sixime sont faites
avec un mlange mthanol/chloroforme 1V/2V. La quantit de lipides totaux extraits a t
estime dans un premier temps par gravimtrie (cf. figure 21). Comme nous pouvons
lobserver sur la figure 21, des lipides sont extraits au moins jusqu la quatrime extraction.
Il semblerait donc que pour quatre extractions, prs de 97% des lipides soient extraits.
Cependant, pour la cinquime et la sixime, les valeurs se trouvent dans la limite de
sensibilit de la mthode par gravimtrie. Donc, nous avons utilis une mthode plus sensible
pour estimer plus prcisment les quantits extraites sur les deux dernires extractions : la
chromatographie couche mince (cf. figure 22).
Partie III
122
Figure 21 : Estimation par gravimtrie du contenu total en lipides, rapport la masse sche
(MS) de cellules, aprs chaque tape dextraction (E1 E6)
Les lipides neutres sont rapidement extraits. Trois extractions seulement semblent ncessaires.
Par contre pour les phospholipides, la quatrime extraction permet encore dextraire des
quantits non ngligeables, notamment de PC (cf. figure 22).
Quatre extractions semblent suffisantes car 99,7% des lipides mesurables sur CCM sont
extraits au bout de ces quatre extractions, pour seulement 0,3% pour les deux dernires
(cf. figure 22).
0
1
2
3
4
5
6
7
E1 E2 E3 E4 E5 E6
Extractions
l
i
p
i
d
e
s

e
n

%

M
S

Etapes dextraction
Partie III
123
Figure 22 : Estimation du contenu en lipides, rapport la masse sche (MS) de cellules,
aprs chaque tape dextraction (E1 E6), mesur par Chromatographie Couche Mince.
ERG=ergostrol, AG=acides gras libres, TG=triglycrides, ES=esters de strol,
LAN=lanostrol, PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine,
PI=phosphatidyl-inositol, PS= phosphatidyl-srine, CL+PA= cardiolipides et acide
phosphatidique.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
E1 E2 E3 E4 E5 E6
Extractions
L
i
p
i
d
e
s

n
e
u
t
r
e
s

e
n

%

M
SERG
AG
TG
ES
LAN
0
0,1
0,2
0,3
0,4
E1 E2 E3 E4 E5 E6
Extractions
P
h
o
s
p
h
o
l
i
p
i
d
e
s

e
n

%

M
S
PC
PE
PI
PS
CL+PA
Etapes dextraction
Etapes dextraction
Partie III
124
Ensuite, nous voulions essayer de rduire le temps 4 heures pour les deux premires et la
dernire tape dextraction et une nuit pour la troisime extraction, de manire pouvoir
compiler la totalit de lextraction sur deux jours. Les rsultats du tableau 13 indiquent une
meilleure efficacit de la plus longue extraction. Nous avons donc gard quatre extractions
dune journe.
Tableau 13 : Quantit de lipides totaux ramens au pourcentage de la masse sche (% MS) de
cellules et extraits suivant deux temps dextraction : quatre tapes dune journe ou deux
tapes de 4h + une tape dune nuit + une tape de 4h.
4 extractions dune
journe
2 extractions 4h +
1 nuit + 4h
Lipides totaux (% MS)*
dtermins par gravimtrie
7,07% (+/-0,3) 6% (+/-0,2)
*moyenne sur 3 extractions
II.1.ii. Optimisation de ltape de lavage
De part la technique utilise, une quantit non ngligeable de dbris cellulaires et dacides
amins se retrouve avec lextrait lipidique aprs extraction. Il faut donc effectuer une tape de
lavage. Ltape de lavage est importante car elle doit purifier lextrait sans perte de lipides.
Nous avons test deux types de lavages :
- Deux lavages successifs leau mQ
- Deux lavages successifs au KCl 0,88%
Les deux types lavages sont comparables pour enlever les dbris cellulaires. Cependant, il y a
une nette diffrence quant lefficacit sur la prsence dacides amins (cf. figure 23). Les
acides amins ont t visualiss par chromatographie couche mince. Le solvant de migration
est un mlange butanol/acide actique/H
2
O (40/20/20). La rvlation se fait la ninhydrine
qui rvle tout compos ayant un NH
2
libre, comme les acides amins mais aussi la
phosphatidyl-tanolamine (PE). Sur la figure 23, deux zones de migration se distinguent : la
zone a o se sparent au moins deux acides amins prsents dans les extraits lipidiques ; la
zone b qui est la zone de migration de PE o certains acides amins ventuellement prsents
nont pu tre observs.
Sur les deux taches quantifiables attribues des acides amins (cf. figure 23), les
pourcentages dacides amins limins par les diffrents ont t estims. Le lavage leau a
Partie III
125
permis dliminer environ 40% des acides amins, contre plus de 90% pour le lavage au KCl.
Au vu de son efficacit sur llimination des acides amins, cest le lavage au KCl qui a t
retenu pour la suite des expriences.
Figure 23 : Comparaison de leffet du type de lavage sur llimination des acides amins
prsents dans lextrait lipidique. A) Chromatographie couche mince avec butanol/acide
actique/H
2
O (40/20/20) comme solvant de migration et rvlation la ninhydrine. B)
Tableau rcapitulatif des pourcentages dlimination des acides amins aprs deux lavages
soit leau, soit au KCl 0,88% (w/v).
Il faut que ce type de lavage nlimine pas en mme temps les lipides recherchs. Pour cela,
les tapes de lavage ont t ralises sur un mlange de standards. Les lipides rcuprs ont
t quantifis par CCM. Les tableaux 14 et 15 prsentent les pourcentages de rcupration
aprs deux lavages au KCl 0,88%. Compte-tenu de lerreur de mesure par la technique utilise
qui est de lordre de 10%, la totalit des lipides prsents avant lavage se retrouve aprs lavage
au KCl 0,88%.
b : zone de migration de certains acides amins +
phosphatidylethanolamine
a : zone identifie comme ne contenant que des
acides amins
1 2 3 4
Lavage l'eau lavage au KCl
Acide amin a1 35 92
Acide amin a2 42 100
% limination
1 : Phosphatidylethanolamine
2 : Extraction sans lavage
3 : Extraction + lavage leau
4 : Extraction + lavage au KCl 0,88%
a1
a2
A)
B)
Partie III
126
Tableau 14 : Pourcentage de rcupration des diffrents lipides neutres aprs deux lavages au
KCl 0,88%. DG=diglycrides, ERG=ergostrol, LAN=lanostrol, TG=triglycrides,
ES=esters de strol.
Tableau 15 : Pourcentage de rcupration des diffrents phospholipides aprs 2 lavages au
KCl 0,88%. PI=Phosphatidyl-inositol, PS= Phosphatidyl-srine, PC=Phosphatidyl-choline,
PG= Phosphatidyl-glycrol, PE=Phosphatidyl-thanolamine, CL=cardiolipides et PA=acide
phosphatidique.
II.1.iii. Antioxydant
Compte tenu des temps dextraction relativement longs, nous avons tudi lutilit de rajouter
un antioxydant, le BHT (Butyl-Hydroxy-Tolune), pour limiter, notamment, loxydation des
phospholipides. Le BHT est rajout hauteur de 100 mg.l
-1
dans le solvant dextraction.
Il ny a pas dinterfrence de lantioxydant sur les rsultats (cf. figure 24). Nous continuerons
rajouter le BHT, mme si la figure 24 montre quil ny a pas de diffrence de composition
entre les extraits avec antioxydant et les extraits sans antioxydant.
DG ERG LAN TG ES
% Rcupration* 108 105 94 107 109
* Moyenne sur 2 essais
PI PS PC PG PE CL PA
% Rcupration* 100 96 99 98 110 112 106
Partie III
127
Figure 24
F
i
g
u
r
e

2
4
:

C
o
m
p
a
r
a
i
s
o
n

d
u

p
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

l
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p
i
d
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s

e
x
t
r
a
i
t
s

r
a
m
e
n

l
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m
a
s
s
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s
c
h
e

(
%

M
S
)

d
e

c
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l
l
u
l
e
s

a
v
e
c

o
u

s
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i
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s
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t
i
o
n

d
a
n
t
i
o
x
y
d
a
n
t

(
B
H
T
)
.

a
)

l
i
p
i
d
e
s

t
o
t
a
u
x

o
b
t
e
n
u
s

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s

B
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A
v
e
c

B
H
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d
)
P
A
+
C
L
Partie III
128
II.2. Reproductibilit
Nous devons valuer la reproductibilit de notre mthode dextraction en prenant en compte
la fois, les variabilits dues la mthode dextraction, et celles dues la mthode de
quantification choisie. Un mme chantillon de cellules a t partag en six chantillons de
500 mg chacun (cf. figure 25). Sur chacun de ces chantillons, lextraction complte a t
effectue. Plusieurs techniques de mesure soffrent nous pour quantifier lextrait lipidique.
La reproductibilit mesure va donc dpendre de la mthode de mesure :
- La gravimtrie : mesure des lipides totaux
- Deux mthodes colorimtriques : une pour le dosage des phospholipides totaux,
lautre pour le dosage des strols totaux
- La CCM: sparation et quantification des diffrents composs
Figure 25 : Schma rcapitulatif de ltude de la reproductibilit de
lextraction+quantification.
En cumulant les erreurs dextraction avec les erreurs de mesure lors des quantifications, les
variabilits restent raisonnables (cf. tableau 16). En effet, avec les mesures des lipides totaux,
3 g MS de cellules
500 mg MS
de cellules
500 mg MS
de cellules
Extrait
E1
Extrait
E2
Extrait
E3
Extrait
E4
Extrait
E5
Extrait
E6
Gravimtrie
Extractions
Strol totaux Phospholipides
totaux
CMM
3 g MS de cellules
500 mg MS
de cellules
500 mg MS
de cellules
Extrait
E1
Extrait
E2
Extrait
E3
Extrait
E4
Extrait
E5
Extrait
E6
Gravimtrie
Extractions
Strol totaux Phospholipides
totaux
CMM
Partie III
129
strols totaux et phospholipides totaux, les variabilits sont infrieures 8%. Pour la mesure
par CCM, les variabilits dpendent des composs et atteignent au maximum 12%.
De plus, les valeurs obtenues par les mthodes colorimtriques concordent avec les valeurs
obtenues par CCM.
Par contre, il existe une diffrence non ngligeable entre les lipides totaux obtenus par
gravimtrie (12,4 % MS) et par cumul des diffrents composs par CCM (6,7 % MS). Cette
diffrence est toujours observe quelles que soient les expriences.
Tableau 16 : Tableau rcapitulatif des valeurs exprimentales pour chaque chantillon (E1
E6), de la moyenne et de lcart-type de ces valeurs, ainsi que le pourcentage que reprsente
cet cart-type par rapport la moyenne. Les lipides totaux sont obtenus par mthode
gravimtrique. Les strols totaux et les phospholipides totaux (PL totaux) sont obtenus par
mthodes colorimtriques. Les lipides individuels sont quantifis par CCM:
PI=phosphatidylinositol, PC=phosphatidylcholine, PE=phosphatidylthanolamine,
CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique, ERG=ergostrol, AG=acides gras libres,
TG=triglycrides, ES=esters de strol. Les valeurs sont exprimes en pourcentage de la masse
sche de cellules (%MS)
Ecart-type estim:
1
2
2
1

=
n
x n x
i
n ; n=6 ; x
i
= valeur de la grandeur pour lchantillon Ei ;
moyenne
n
x
x
n
i
=
1
E1 E2 E3 E4 E5 E6
12,48 11,80 13,64 11,20 13,28 11,90 12,38 0,93 7,5
1,07 1,04 1,14 1,01 1,09 1,05 1,07 0,04 4,1
1,43 1,34 1,42 1,52 1,42 1,43 1,43 0,11 7,6
PI 0,83 0,87 0,82 0,90 0,76 0,79 0,83 0,05 6,3
PC 0,21 0,22 0,22 0,21 0,22 0,22 0,004 2,0
PE 0,29 0,29 0,29 0,31 0,31 0,25 0,29 0,02 6,9
CL+PA 0,18 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,17 0,004 2,5
ERG 1,02 1,14 1,17 0,96 1,10 0,95 1,06 0,09 8,1
AG 2,83 2,86 3,24 3,34 3,81 3,04 3,19 0,37 11,5
TG 1,47 1,30 1,37 1,57 1,55 1,44 1,45 0,10 7,1
ES 0,05 0,05 0,05 0,05 0,04 0,06 0,05 0,00 10,5
CCM
Moyenne
% MS
Ecart-type
% MS
Ecart-type
% de la
moyenne
Valeurs exprimentales % MS
lipides totaux
(gravimtrie)
Strols totaux
PL totaux
Partie III
130
II.3. Evaluation du rendement dextraction
II.3.i. Sur solution de standards seuls
Lextraction complte est effectue sur une solution contenant tous les standards de
concentrations connues. Aprs extraction, les diffrents standards sont quantifis par CCM.
Cette exprience a t reproduite trois fois. Les rsultats sont prsents dans les tableaux 17 et
18.
Tableau 17 : Rendements dextraction sur solution de standards pour les diffrents lipides
neutres. Il sagit des quantits de standards recueillies aprs extraction exprimes en
pourcentage des quantits de standards introduites au dpart. DG=diglycrides,
ERG=ergostrol, LAN=lanostrol, TG=triglycrides, ES=esters de strol
Tableau 18 : Rendements dextraction sur solution de standards pour les diffrents
phospholipides. Il sagit des quantits de standards recueillies aprs extraction exprimes en
pourcentage des quantits de standards introduites au dpart. PI=phosphatidyl-inositol, PS=
phosphatidyl-srine, PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine,
PG=phosphatidyl-glycrol, CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique.
Les pourcentages de rcupration des diffrents lipides se situent entre 89 et 112%. Sachant
que lerreur de mesure par CCM est de lordre de 10%, nous considrons que lefficacit de
rcupration est correcte sur des solutions de standards seuls.
DG ERG LAN TG ES
% Rcupration* 90 98 89 101 89
PI PS PC PG PE CL + PA
% Rcupration* 89 102 112 105 96 109
Partie III
131
II.3.ii. Sur solution de standards en prsence de cellules
Comme vu prcdemment, lextraction ninduit pas de perte de standards sur des solutions
contenant uniquement ces standards. Nous voulons maintenant confirmer que la prsence de
cellules lors de lextraction ne va pas perturber lefficacit de rcupration des lipides.
Pour cela, des cellules sont mises en contact avec des quantits croissantes de standards. Une
solution mre de chaque standard est utilise 10 g.l
-1
. De 0 5 l de ces solutions sont
rajouts aux cellules (cf. tableau 19).
Tableau 19 : Mlange initial de chaque chantillon contenant des cellules de levures et
diffrentes quantits de solution mre de chaque standard de lipides.
Echantillon
Masse sche de
cellules (mg)
Quantit rajoute de chaque
solution mre de standards (g)
A 21,7 0
B 21,7 10
C 21,7 20
D 21,7 30
E 21,7 40
F 21,7 50
Lchantillon A sert connatre la composition des levures. Les quantits globales de chaque
compos rcupres aprs lextraction sur les mlanges sont prsentes dans la figure 26 pour
les lipides neutres et pour les phospholipides. Le volume (en l) de solution standard rajoute
est report en abscisse. Les ordonnes correspondent la quantit de lipides obtenue aprs
extraction et quantification par plaque de CCM. La valeur lorigine correspond la
composition de la biomasse utilise, et la pente correspond la concentration de la solution de
standards rajoute en g.l
-1
, soit autour de 10. Nous avons des droites avec de bons
coefficients de corrlation (R
2
>0,95), et avec une pente proche de la valeur attendue pour la
concentration des solutions standards. Les tableaux 20 et 21 donnent une ide de lcart entre
la valeur thorique de la concentration de la solution de standards et la valeur exprimentale
trouve sur les graphiques.
En conclusion, la prsence des cellules na pas perturb la rcupration des standards de
lipides introduits avant lextraction.
Partie III
132
Figure 26 : Quantits de lipides rcuprs aprs extraction complte en fonction du volume de
solution de standards rajout : a) pour les lipides neutres ; b) pour les phospholipides.
SQ=squalne, ES=esters de strols, TG=triglycrides, AG=acides gras libres,
LAN=lanostrol, ERG=ergostrol, PI=phosphatidyl-inositol, PS=phosphatidyl-srine,
PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine, PG=phosphatidyl-glycrol,
CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique.
y = 8,89x + 198,59
R
2
= 0,99
y = 11,37x + 9,09
R
2
= 0,99
y = 10,66x + 99,68
R
2
= 0,98
y = 9,20x + 7,18
R
2
= 0,98
y = 9,06x + 79,64
R
2
= 0,97
y = 9,97x + 108,74
R
2
= 0,98
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6
Volume de solution standard
(l)
q
u
a
n
t
i
t
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l
i
p
i
d
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s

r
c
u
p
s
(
g
)
PI
PS
PC
PG
PE
CL+PA
y = 10,40x + 5,69
R
2
= 0,98
y = 10,65x + 54,71
R
2
= 0,98
y = 11,30x + 66,97
R
2
= 0,99
y = 8,92x + 7,56
R
2
= 1,00
y = 9,97x + 3,06
R
2
= 0,99
y = 10,22x + 47,68
R
2
= 0,95
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6
(l)
q
u
a
n
t
i
t
d
e
l
i
p
i
d
e
s

r
c
u
p
s
(
g
)
SQ
EEAG
TG
AG
LAN
ERG
a)
b)
y = 8,89x + 198,59
R
2
= 0,99
y = 11,37x + 9,09
R
2
= 0,99
y = 10,66x + 99,68
R
2
= 0,98
y = 9,20x + 7,18
R
2
= 0,98
y = 9,06x + 79,64
R
2
= 0,97
y = 9,97x + 108,74
R
2
= 0,98
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6
(l)
q
u
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l
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s

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(
g
)
PI
PS
PC
PG
PE
CL+PA
y = 10,40x + 5,69
R
2
= 0,98
y = 10,65x + 54,71
R
2
= 0,98
y = 11,30x + 66,97
R
2
= 0,99
y = 8,92x + 7,56
R
2
= 1,00
y = 9,97x + 3,06
R
2
= 0,99
y = 10,22x + 47,68
R
2
= 0,95
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6
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g
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TG
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LAN
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y = 8,89x + 198,59
R
2
= 0,99
y = 11,37x + 9,09
R
2
= 0,99
y = 10,66x + 99,68
R
2
= 0,98
y = 9,20x + 7,18
R
2
= 0,98
y = 9,06x + 79,64
R
2
= 0,97
y = 9,97x + 108,74
R
2
= 0,98
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6
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q
u
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l
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i
d
e
s

r
c
u
p
s
(
g
)
PI
PS
PC
PG
PE
CL+PA
y = 8,89x + 198,59
R
2
= 0,99
y = 11,37x + 9,09
R
2
= 0,99
y = 10,66x + 99,68
R
2
= 0,98
y = 9,20x + 7,18
R
2
= 0,98
y = 9,06x + 79,64
R
2
= 0,97
y = 9,97x + 108,74
R
2
= 0,98
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6
(l)
q
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n
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p
i
d
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s

r
c
u
p
s
(
g
)
PI
PS
PC
PG
PE
CL+PA
y = 10,40x + 5,69
R
2
= 0,98
y = 10,65x + 54,71
R
2
= 0,98
y = 11,30x + 66,97
R
2
= 0,99
y = 8,92x + 7,56
R
2
= 1,00
y = 9,97x + 3,06
R
2
= 0,99
y = 10,22x + 47,68
R
2
= 0,95
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6
(l)
q
u
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n
t
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t
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g
)
SQ
EEAG
TG
AG
LAN
ERG
y = 10,40x + 5,69
R
2
= 0,98
y = 10,65x + 54,71
R
2
= 0,98
y = 11,30x + 66,97
R
2
= 0,99
y = 8,92x + 7,56
R
2
= 1,00
y = 9,97x + 3,06
R
2
= 0,99
y = 10,22x + 47,68
R
2
= 0,95
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6
(l)
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g
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SQ
EEAG
TG
AG
LAN
ERG
a)
b)
ES
Partie III
133
Tableau 20 : Rapport entre les concentrations des standards mesures exprimentalement et
les valeurs thoriques introduites pour les diffrents lipides neutres. ERG=ergostrol,
LAN=lanostrol, AG=acides gras libres, TG=triglycrides, ES= esters de strols,
SQ=squalne,
ERG LAN AG TG ES SQ
exprience/thorie 1,02 1,00 0,89 1,09 1,06 1,04
Tableau 21 : Rapport entre les concentrations des standards mesures exprimentalement et
les valeurs thoriques introduites pour les diffrents phospholipides. PI=phosphatidyl-inositol,
PS=phosphatidyl-srine, PC=phosphatidyl-choline, PE=phosphatidyl-thanolamine,
PG=phosphatidyl-glycrol, CL+PA=cardiolipides et acide phosphatidique.
PI PS PC PG PE CL+PA
exprience/thorie 0,89 1,09 1,07 0,93 0,91 0,97
Partie III
134
III. Conclusion de la partie III
Parmi les quatre mthodes que nous avons testes, nous avons choisi la mthode dextraction
par gradients de solvant (mthode 3) car elle rpondait aux critres que nous nous tions fixs.
Il ny a pas de perte de lipides lorsque lextraction est faite sur des solutions de standards (en
prsence ou non de cellules). Une quantit maximale de lipides est extraite des cellules. La
reproductibilit est correcte. Et enfin, cette mthode propose un bon compromis au niveau de
la rapidit et la simplicit de mise en uvre.
Cette mthode a t optimise en terme de temps dextraction, de nombre dtapes
dextraction, de la qualit du lavage et de lajout dun antioxydant. La reproductibilit a t
estime pour chacune des mthodes de dosage utilises. Pour la mthode gravimtrique nous
avons eu une variabilit de 7,5%. Les variabilits lies aux mthodes colorimtriques sont
respectivement de 4,1% et 7,6% pour les strols totaux et pour les phospholipides totaux.
Pour les dosages par chromatographie couche mince (CCM), les variabilits dpendent du
compos et varient en 2 et 12%.
Paralllement, cette tude a permis de valider nos mthodes de quantification. Les dosages
colorimtriques sont cohrents avec les quantits mesures par CCM. Cependant, la somme
des composs identifis par CCM ne correspond pas aux lipides totaux quantifis par
gravimtrie. Sur CCM, se retrouvent entre 50 et 70% des lipides totaux. En effet, nous ne
quantifions pas tous les composs prsents dans lextrait. Il reste peut-tre une petite quantit
dacides amins que nous nenlevons pas avec les lavages. De plus, certains lipides ne sont
pas quantifis, comme les glycolipides ou encore les protolipides. En effet, lutilisation des
diffrents gradients de concentration en mthanol et en chloroforme doit permettre dextraire
un large spectre de lipides.
Partie III
135
Partie IV :
Dynamique dadaptation de la levure
Saccharomyces cerevisiae sa
production dthanol : aspects
macrocintique et microscopique
Partie IV
136
Partie IV
137
Lhypothse de dpart de mon travail repose sur lide quun meilleur titre final en thanol est
dpendant de la capacit des cellules rsister leur propre production leve en thanol. Par
consquent la problmatique sous-jacente dveloppe dans cette thse est lidentification et la
comprhension des modifications physiologiques permettant ladaptation des levures leur
propre accumulation en thanol. Pour atteindre cet objectif, cette partie explore le
comportement macrocintique des levures au cours du processus de fermentation. Ce
comportement dpend des conditions des fermentations. Les fermentations sont suivies par les
donnes macrocintiques, que sont les concentrations en substrat (glucose) et produits
(biomasse, thanol, glycrol, actate, succinate, lactate, ..) et par la viabilit cellulaire mesure
par coloration au bleu de mthylne. A partir de ces donnes sur plusieurs fermentations, nous
avons identifi un paramtre important li la performance du procd : la mesure de viabilit
cellulaire au bleu de mthylne. Nous avons alors complt cette analyse microscopique par
une mesure de lactivit mtabolique des cellules par coloration au FUN 1 et par une analyse
morphologique qui nous a permis de quantifier le comportement de plusieurs sous-
populations de levures au cours de la production intensive dthanol.
I. Aspect macrocintique des fermentations alcooliques de type fed-batch
Les fermentations alcooliques prsentes dans cette thse ont t ralises en mode fed-batch
sur milieu synthtique (dcrit dans la partie Matriel et Mthodes) utilisant le glucose comme
substrat carbon et lammoniaque comme source dazote. Outre les sels et les oligo-lments
initialement introduits dans le racteur, des vitamines (acide pantothnique, acide nicotinique,
mso-inositol, thiamine, pyridoxine, acide para-aminobenzoique et biotine) sont aussi
ajoutes de manire squence pendant la phase de croissance (cf. Matriel et Mthodes).
Pendant la fermentation, plusieurs paramtres sont contrls et rguls : le pH 4, la
temprature 30C et lagitation et laration pour maintenir une pression partielle en
oxygne au-dessus de 20 %.
Ce type de fermentation se caractrise par un profil particulier en deux phases (cf. figures 27
et 28). Lors de la premire phase, la production dthanol et de glycrol sont couples la
croissance cellulaire. Le taux de croissance maximum est atteint dans les premires heures de
la fermentation. Ensuite, le taux de croissance ne cesse de diminuer pour sarrter autour de
100 g.l
-1
dthanol (cf. figure 28). On observe ensuite le dbut de la seconde phase pendant
laquelle la croissance cellulaire est arrte mais la production dthanol se maintient encore
Partie IV
138
pendant plusieurs heures. Cette dernire phase est appele la phase de dcouplage
croissance-production .
Quatre fermentations seront exploites dans le cadre de cette thse. Les quatre fermentations
ont t conduites de manires trs similaires. Le mode dapport de glucose est le seul
paramtre avoir chang :
- Fermentation 1 : apport continu pour maintenir la concentration autour de 50 g.l
-1
dans
le racteur
- Fermentation 2 : apport discontinu en trois ajouts de 100 g.l
-1
et trois ajouts de 50 g.l
-1
- Fermentation 3 : apport discontinu identique la fermentation 2
- Fermentation 4 : apport discontinu en cinq ajouts de 100 g.l
-1
et un ajout de 50 g.l
-1
Il est remarquer que les fermentations 2 et 3 sont censes avoir t conduites de la mme
manire, or elles conduisent des performances trs diffrentes (cf. figures 27 et 28 et
tableaux 22 et 23). La productivit de la fermentation 2 est de 3,3 g.l
-1
.h
-1
pour un titre final de
147 g.l
-1
alors que pour la fermentation 3, le titre final est de 120 g.l
-1
pour une productivit de
2,7 g.l
-1
.h
-1
. Cette tude ne permet donc pas de mettre en vidence une influence du mode
dapport de substrat sur la performance. Par contre, elle rvle des problmes de
reproductibilit au niveau du procd. Nous nous sommes donc focaliss sur les
caractristiques dune bonne performance alcoolique.
La performance de ce type de procd se caractrise dun point de vue cintique par la
productivit et dun point de vue plus globale par la concentration finale en thanol obtenue.
Jai choisi de prsenter dabord laspect cintique de ces fermentations afin de donner une vue
densemble des diffrentes tapes du procd. Puis, je me focaliserai sur les performances de
ces fermentations au bout de 45h et les performances finales, cest--dire quand la production
dthanol sarrte.
I.1. Suivi cintique des fermentations alcooliques de type fed-batch
Les cintiques de fermentations sont reprsentes ici par deux types de figures. La
reprsentation classique consiste tracer lvolution des concentrations en substrats et
produits de la fermentation en fonction du temps (cf. figure 27). La deuxime reprsentation,
plus spcifique notre tude, consiste tracer lvolution des vitesses de production en
fonction de la concentration en thanol (cf. figure 28).
Partie IV
139
Figure 27
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2
7
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Partie IV
140
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1 (cf. figure 11). Il sagit dun

1 est rajout et mlang la suspension de levure, puis le tout est

Partie II : Matriel et mthodes