Cinética Enzimática

CURSO:
ESTRUCTURA Y FUNCIN CELULAR Y

TISULAR II
DOCENTE:
DRA. Q.F VIOLETA MORN GARRIDO
ALUMNOS:
HERNNDEZ PACHERRES, ARTURO
JIMNEZ NEZ, DALIA

AO DE LA PROMOCIN DE LA
INDUSTRIA RESPONSABLE Y
DEL COMPROMISO CLIMTICO

ENZIMAS: CINTICA Y REGULACIN DE ACTIVIDADES

1

NDICE

1. CINTICA ENZIMTICA
1.1. ESTUDIO LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES QUMICAS QUE SON
CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS
1.2. PRINCIPIOS GENERALES
1.3. ENSAYOS ENZIMTICOS
1.4. FACTORES FSICO-QUMICOS QUE PUEDEN MODIFICAR LA
ACTIVIDAD ENZIMTICA
1.5. CINTICA DE MICHAELIS-MENTEN
1.5.1. REPRESENTACIN DE LA ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN
1.6. SIGNIFICADO DE LAS CONSTANTES CINTICAS
1.7. CINTICAS NO MICHAELIANAS
1.8. CINTICA DEL ESTADO PRE-ESTACIONARIO
1.9. GRAFICO DE LINEWEAVER-BURKE
1.10. INHIBICIN ENZIMTICA
1.10.1. Isosterica
1.10.1.1. Reversible
1.10.1.1.1. INHIBIDOR COMPETITIVO
1.10.1.1.2. INHIBIDOR NO COMPETITIVO
1.10.1.1.3. INHIBIDOR ACOMPETITIVO
1.10.1.2. No Reversible
1.10.2. Alosterica

2. ENZIMAS REGULADORAS
2.1. Importancia Biomdica
2.2. Regulacin del flujo metabolito
2.3. CLASIFICACIN
2.3.1. ENZIMAS ALOSTRICOS
2.3.1.1. ALOSTERISMO
2.3.1.2. MODIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
2.3.1.3. SISTEMAS MULTIENZIMTICOS
2.3.1.4. CINTICA DE LOS ENZIMAS ALOSTRICOS
2.3.1.5. ASPARTATO TRANSCARBAMILASA: CINTICA E
2.3.1.6. INHIBICIN
2.3.1.7. MECANISMOS DE LA ACTIVIDAD REGULADORA DE
2.3.2. MODULACIN COVALENTE DE LOS ENZIMAS
2.3.3. REGULADORAS
2.3.4. ACTIVACIN COVALENTE DE LOS ZIMGENOS
2.3.5. ISOZIMAS


2

CINTICA ENZIMTICA
ESTUDIA LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES QUMICAS QUE SON
CATALIZADAS POR LAS ENZIMAS
El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima permite explicar
los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es
controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por
frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas.
Los mecanismos enzimticos pueden ser divididos en mecanismo de nico sustrato o
mecanismo de mltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a cabo en
enzimas que solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden
medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo
transforma en producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios
sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cintica enzimtica puede mostrar
tambin el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos
son liberados.
Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas
proteicas. Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y
los ribosomas, esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARNm,
respectivamente. La principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas radica
en el limitado nmero de reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque
sus mecanismos de reaccin y sus cinticas pueden ser estudiados y clasificados
por los mismos mtodos.
PRINCIPIOS GENERALES
La velocidad de la reaccin va aumentando a medida que aumenta la concentracin
de sustrato hasta que la enzima se satura.
La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y
genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que
ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio
de la reaccin entre sustrato y producto.

Sin embargo, al contrario que las
reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de
sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que
incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios
posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de


3

saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la
eficiencia.
Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que
tarda en saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin
que pueda alcanzar.
El conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del
comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder
frente a un cambio de esas condiciones.
ENSAYOS ENZIMTICOS
Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio,
mediante el cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las
enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos
suelen medir los cambios experimentados bien en la concentracin de sustrato (que
va decreciendo), bien en la concentracin de producto (que va aumentando).
Existen diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra
permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del
producto (segn la concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o
liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por
tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten
medir la velocidad de la reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos
radiomtricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos
discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y
permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimtica. Tambin se puede
utilizar la espectrometra de masas para detectar la incorporacin o liberacin de
istopos estables cuando el sustrato es convertido en producto.
Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de un
microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando
catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la
fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catlisis o bien
unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan
detectar movimientos ocurridos durante la catlisis. Estos estudios estn dando
una nueva visin de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en
oposicin a los estudios de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa
y se mide el comportamiento de una poblacin de millones de molculas de enzima.


4

Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un
comportamiento lineal. A medida que avanza la reaccin, se va agotando la cantidad
de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de
tiempo (disminuye la velocidad de la reaccin), lo que se manifiesta en forma de
curva asinttica en la grfica.
Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el perodo inicial
puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimticos suelen estar
estandarizados para que el perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a
cabo las medidas ms fcilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla
rpida de lquidos permiten llevar a cabo medidas cinticas de perodos iniciales
cuya duracin puede llegar a ser inferior a un segundo. Este tipo de ensayos
rpidos son esenciales para medidas de la cintica del estado estacionario,
discutida ms abajo.

Curva de progreso de una reaccin enzimtica. La pendiente representa, en el
perodo inicial, la velocidad de la reaccin. La zona de la meseta representa el
equilibrio de la reaccin (no confundir con la saturacin).
La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo inicial,
es decir, en la zona lineal de la reaccin enzimtica. Sin embargo, tambin es
posible medir toda la curva de la reaccin y ajustar estos datos a una ecuacin no
lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimticas es denominada anlisis de la
curva de progreso. Esta aproximacin es muy til como alternativa a las cinticas
rpidas, cuando el perodo inicial es demasiado rpido para ser medido con
precisin.


5

FACTORES FSICO-QUMICOS QUE PUEDEN MODIFICAR LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA
- Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse
modificada su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas
ptimos pueden llegar a variar sustancialmente de unas enzimas a otras.
Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima ver
incrementada su actividad hasta el momento en que comience la
desnaturalizacin de la misma, que dar lugar a una reduccin progresiva de
dicha actividad.
- pH: el rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes
enzimas. Si el pH del medio se aleja del ptimo de la enzima, esta ver
modificada su carga elctrica al aceptar o donar protones, lo que modificar
la estructura de los aminocidos y por tanto la actividad enzimtica.
- Concentracin salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados,
la concentracin de sales del medio es crucial para una ptima actividad
enzimtica. Una elevada concentracin o una ausencia de sales en el medio
pueden impedir la actividad enzimtica, ya que las enzimas precisan de una
adecuada concentracin de iones para mantener su carga y su estructura.
REACCIONES CON UN SUSTRATO
Las enzimas que presentan un mecanismo de nico sustrato incluyen isomerasas,
tales como la triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liasas
intramoleculares, tales como la adenilato ciclasa o la ribozima ARN-liasa. Sin
embargo, existen ciertas reacciones enzimticas de nico sustrato que no
pertenecen a esta categora de mecanismos, como es el caso de la reaccin
catalizada por la catalasa. La catalasa reacciona inicialmente con una molcula de
perxido de hidrgeno (agua oxigenada) y queda en un estado oxidado tras liberar
el producto (agua), y, posteriormente, es reducida por una segunda molcula de
sustrato. Aunque durante la reaccin solo participa un sustrato, la existencia de un
intermediario enzimtico modificado permite incluir al mecanismo de la catalasa en
la categora de mecanismos de ping-pong, un tipo de mecanismo discutido ms
adelante.

CINTICA DE MICHAELIS-MENTEN
Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de
catlisis no muestra un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la


6

concentracin de sustrato. Si la velocidad inicial de la reaccin se mide a una
determinada concentracin de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la
reaccin (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S],
como se puede ver en la figura abajo. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la
enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad mxima (Vmax), que no
sobrepasar en ningn caso, independientemente de la [S].

Mecanismo de unin de nico sustrato para una reaccin enzimtica. k1, k-1 y k2
son las constantes cinticas para cada una de las etapas de la reaccin.
El modelo de cintica michaeliana para una reaccin de nico sustrato se puede ver
en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reaccin qumica
bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formndose el complejo enzima-
sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimtico para una reaccin unimolecular puede
ser bastante complejo, existe una etapa enzimtica limitante que permite que el
mecanismo sea simplificado como una etapa cintica nica cuya constante es k2.

(Ecuacin 1)
k2 tambin llamado kcat o nmero de recambio, hace referencia al mximo nmero
de reacciones enzimticas catalizadas por segundo.
A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio
constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la
[S] tambin aumentamos la [ES] a expensas de la [E], desplazando el equilibrio de
la reaccin hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reaccin depende de la
[ES], la velocidad es sensible a pequeos cambios en la [S]. Sin embargo, a altas
[S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas
condiciones, la velocidad de la reaccin (v k
2
[E]
tot
= V
max
) deja de ser sensible a
pequeos cambios en la [S]. En este caso, la concentracin total de enzima ([E]
tot
)
es aproximadamente igual a la concentracin del complejo ES:


7

La ecuacin de Michaelis-Menten describe como la velocidad de la reaccin
depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud
Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1 (aproximacin del equilibrio)
se puede deducir la siguiente ecuacin:
(Ecuacin 2)
Esta famosa ecuacin es la base de la mayora de las cinticas enzimticas de
sustrato nico.

La constante de Michaelis Km se define como la concentracin a la que la velocidad
de la reaccin enzimtica es la mitad de la Vmax. Esto puede verificarse
sustituyendo la concentracin de sustrato por dicha constante ([S] = Km). Si la
etapa limitante de la velocidad de la reaccin es lenta comparada con la disociacin
de sustrato (k2 <<< k1), la constante de Michaelis Km ser aproximadamente la
constante de disociacin del complejo ES, aunque sea una situacin relativamente
rara.

La situacin ms comn, donde k2 > k1, es denominada cintica de Briggs-Haldane.
La ecuacin de Michaelis-Menten an se mantiene bajo estas condiciones ms
generales, como puede derivarse de la aproximacin del estado estacionario.
Durante el perodo inicial, la velocidad de la reaccin es ms o menos constante,
indicando que la [ES] tambin se mantendr constante:


8

De esta forma, la concentracin de ES viene dada por la siguiente expresin:

donde la constante de Michaelis Km se define as:

Con lo cual, despus de operar todos los factores, obtenemos una frmula general
para la velocidad de la reaccin que coincide con la ecuacin de Michaelis-Menten:

La constante de especificidad kcat / Km mide la eficiencia con la que una enzima
convierte un sustrato en producto. Utilizando la definicin de la constante de
Michaelis Km, la ecuacin de Michaelis-Menten podra escribirse de la siguiente
forma:

Donde [E] es la concentracin de enzima libre. As, la constante de especificidad
se convierte en una constante bimolecular efectiva de la enzima libre que reacciona
con sustrato libre para formar producto. Esta constante viene definida por la
frecuencia con la que el sustrato y la enzima se encuentran en una solucin, y ronda
aproximadamente un valor de 10
10
M
-1
s
-1
a 25 C. Curiosamente, este mximo no
depende del tamao del sustrato o de la enzima. La proporcin de las constantes de
especificidad para dos sustratos es una comparacin cuantitativa de la eficiencia


9

de la enzima para convertir en productos dichos sustratos. La pendiente de la
ecuacin de Michaelis-Menten a bajas concentraciones de sustrato (cuando [S] <<
Km) tambin proporciona la constante de especificidad.
REPRESENTACIN DE LA ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN
La grfica de Lineweaver-Burke o del doble recproco muestra el significado de los
puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la
velocidad.

La grfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a
bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que
aumenta la concentracin de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que
permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, poda llegar a ser
realmente difcil estimar los valores de la Km y la Vmax en las grficas no lineales.
Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en
desarrollar linearizaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten, dando como
resultado la grfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el
siguiente tutorial de la cintica de Michaelis-Menten realizado en la Universidad
de Virginia, se puede simular el comportamiento de una enzima variando las
constantes cinticas.
La grfica de Lineweaver-Burk o representacin de doble recproco es la forma
ms comn de mostrar los datos cinticos. Para ello, se toman los valores inversos a
ambos lados de la ecuacin de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la
figura de arriba, el resultado de este tipo de representacin es una lnea recta
cuya ecuacin es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de
ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de
abscisas equivalente a -1/Km.


10

Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para 1/[S]; el mnimo valor
posible es 1/[S] = 0, que correspondera a una concentracin infinita de sustrato,
donde 1/v = 1/Vmax.
El valor del punto de corte entre la recta y el eje x es una extrapolacin de datos
experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las grficas de
Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de
sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la Vmax y de la
Km. Un modelo lineal mucho ms exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en
las investigaciones cientficas actuales, todo este tipo de linearizaciones han
quedado obsoletos y han sido sustituidos por mtodos ms fiables basados en
anlisis de regresin no lineal. Para analizar los datos es conveniente la
normalizacin de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de
trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del anlisis.
SIGNIFICADO DE LAS CONSTANTES CINTICAS
La importancia del estudio de la cintica enzimtica reside en dos principios
bsicos. En primer lugar, permite explicar cmo funciona una enzima, y en segundo
lugar, permite predecir cmo se comportar esa enzima in vivo. Las constantes
cinticas definidas anteriormente, Km y Vmax, son los pilares fundamentales a la
hora de intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del
metabolismo.
Sin embargo, llevar a cabo estas predicciones no es trivial, incluso en los sistemas
ms simples. Por ejemplo, la malato deshidrogenasa sintetiza, en el interior de la
mitocondria, oxalacetato, el cual puede ser sustrato de diversas enzimas como la
citrato sintasa, en el ciclo de los cidos tricarboxlicos, la fosfoenolpiruvato
carboxiquinasa, en la gluconeognesis, o la aspartato aminotransferasa, en la
biosntesis de cido asprtico. Para ser capaz de predecir cunto oxalacetato ser
desviado por cada una de las rutas es necesario saber tanto la concentracin del
oxalacetato como la concentracin y los parmetros cinticos de cada una de las
enzimas. Este ejemplo denota la complejidad que podemos llegar a encontrar al
intentar predecir el comportamiento de rutas metablicas completas o de
organismos enteros, por medio de modelos matemticos. Aunque estos objetivos
an no se han alcanzado en eucariotas, se han obtenido ciertos progresos en
bacterias, utilizando modelos del metabolismo de Escherichia coli.


11

CINTICAS NO MICHAELIANAS
Algunas reacciones enzimticas dan lugar a curvas sigmoideas, al ser
representadas en una curva de saturacin, lo que suele indicar una unin
cooperativa del sustrato al centro cataltico de la enzima. Esto quiere decir que la
unin de una molcula de sustrato influye en la unin de las molculas de sustrato
posteriores. Este comportamiento es el ms comn en las enzimas multimricas,
que presentan varias zonas de interaccin con el sustrato. El mecanismo de
cooperacin es semejante al observado en la hemoglobina. La unin de una molcula
de sustrato a una de las zonas de interaccin altera significativamente la afinidad
por el sustrato de las dems zonas de interaccin. Las enzimas con este tipo de
comportamiento son denominadas alostricas. La cooperatividad positiva tiene
lugar cuando la primera molcula de sustrato unida incrementa la afinidad del resto
de zonas de interaccin. Por el contrario, la cooperatividad negativa tiene lugar
cuando la primera molcula de sustrato unida reduce la afinidad de la enzima por
nuevas molculas de sustrato.
Como ejemplos de enzimas con cooperatividad positiva tenemos la aspartato
transcarbamilasa bacteriana y la fosfofructoquinasa y con cooperatividad negativa,
la tirosil ARNt-transferasa de mamferos.
La cooperatividad es un fenmeno bastante comn y puede llegar a ser crucial en la
regulacin de la respuesta enzimtica a cambios en la concentracin de sustrato.
La cooperatividad positiva hace que la enzima sea mucho ms sensible a la
concentracin de sustrato, con lo que su actividad puede llegar a variar en gran
medida aunque se mueva en rangos muy estrechos de concentracin de sustrato.
Por el contrario, la cooperatividad negativa hace que la enzima sea insensible a
pequeos cambios en la concentracin de sustrato.
La ecuacin de Hill suele ser utilizada para describir cuantitativamente el grado de
cooperatividad en cinticas no michaelianas. El coeficiente de Hill (n) indica
cuntas de las zonas de unin de sustrato de una enzima afectan a la afinidad de la
unin del sustrato en el resto de las zonas de unin. El coeficiente de Hill puede
tomar valores mayores o menores que 1:
- n < 1: indica cooperatividad negativa.
- n > 1: indica cooperatividad positiva.


12

Curva de saturacin de una enzima alostrica, donde se puede apreciar una cintica
sigmoidea.

CINTICA DEL ESTADO PRE-ESTACIONARIO
Al realizar un ensayo enzimtico y mezclar la enzima con el sustrato, existe un
breve perodo inicial en el que no se produce ni sntesis de producto, ni estado
intermedio de la enzima. El estudio de los milisegundos siguientes a la mezcla es
denominado cintica del estado pre-estacionario y est relacionado con la
formacin y consumo de los intermediarios enzima-sustrato (ES o E*) hasta el
momento en el que se alcanzan ciertas concentraciones y comienza el estado
estacionario.
La primera enzima en la que se estudi este proceso, durante la reaccin de
hidrlisis, fue la quimiotripsina. La deteccin de intermediarios suele ser la
principal evidencia necesaria para saber bajo qu mecanismo acta la enzima. Por
ejemplo, al realizar un ensayo de cintica rpida de una reaccin enzimtica
gobernada por un mecanismo de ping-pong, podremos hacer un seguimiento de la
liberacin de producto P y medir la formacin de intermediarios enzimticos
modificados E*. En el caso de la quimiotripsina, el intermediario enzimtico se
produce por un ataque nucleoflico del sustrato sobre una serina del centro
cataltico, lo que genera una forma intermediaria acilada de la quimiotripsina.
En la figura de abajo, se puede observar como la enzima pasa rpidamente a un
estado intermedio E* durante los primeros segundos de la reaccin.
Posteriormente, cuando es alcanzado el estado estacionario, la velocidad disminuye.
Esta primera fase de la reaccin proporciona la tasa de conversin de la enzima.


13

Por lo tanto, la cantidad de producto liberado durante esta fase (que puede
obtenerse prolongando la recta correspondiente al estado estacionario hasta
cortar el eje y) tambin da la cantidad de enzima funcional presente en el ensayo.

Representacin grfica del estado pre-estacionario de una reaccin enzimtica
donde se puede apreciar la fase inicial rpida.

MECANISMO QUMICO

Uno de los objetivos ms importantes en los estudios de la cintica enzimtica es
determinar el mecanismo qumico que subyace en la reaccin enzimtica, por
ejemplo, determinar la secuencia ordenada de sucesos que transcurren en la
transformacin de sustrato en producto. Las aproximaciones cinticas discutidas
anteriormente pueden proporcionar informacin relacionada con la velocidad de
reaccin de los intermediarios enzimticos formados, pero no permitirn
identificar qu intermediarios son exactamente.

Con el fin de determinar la etapa limitante de la reaccin o los intermediarios que
se forman durante la misma, se pueden llevar a cabo ensayos enzimticos en
diversas condiciones con enzimas o sustratos ligeramente modificados, que aporten
datos al respecto. Un ejemplo caracterstico de etapa limitante de una reaccin es
aquella en la que se rompe un enlace covalente dando lugar a un tomo de
hidrgeno. Si intercambiamos cada tomo de hidrgeno por su istopo estable,
deuterio, podremos saber cual de los posibles hidrgenos transferidos es el que


14

determina la etapa limitante. La velocidad sufrir una variacin cuando el
hidrgeno crtico sea reemplazado, debido al efecto isotpico cintico primario,
cuyo origen se encuentra en la mayor estabilidad de los puentes de deuterio, ms
difciles de romper que los puentes de hidrgeno.
Tambin es posible medir efectos similares por medio de otras sustituciones
isotpicas, tales como 13C/12C 18O/16O, pero los efectos producidos en estos
casos son ms difciles de detectar.
Los istopos tambin pueden ser utilizados para obtener informacin acerca del
destino de diversas partes de la molcula de sustrato cuando este es
transformado en producto. Por ejemplo, a veces es difcil de determinar el origen
de un tomo de oxgeno en el producto final, ya que puede provenir del agua o de la
molcula de sustrato. Esto puede resolverse mediante la sustitucin sistemtica de
los tomos de oxgeno de las molculas que participen en la reaccin, por su istopo
estable 18O, llevando posteriormente a cabo una bsqueda del istopo en el
producto obtenido. El mecanismo qumico tambin puede ser elucidado estudiando
los efectos cinticos e isotpicos bajo diferentes condiciones de pH, alterando los
niveles de iones metlicos u otros cofactores, por mutagnesis dirigida de
aminocidos conservados, o mediante el estudio del comportamiento de la enzima
en presencia de anlogos del sustrato.
GRAFICO DE LINEWEAVER-BURKE
Cuando se grafica la velocidad de la reaccin, v
0
, contra la concentracin de
substrato, |S|, no siempre es posible determinar la condicin en que se ha llegado
a la velocidad mxima, Vmax, debido al incremento de la pendiente en la hiprbola
a concentraciones de substrato elevadas.

Figura: experimento cintico para la actividad enzimtica.


15

Se presentan los valores experimentales y los resultados del ajuste al
modelo de Michaelis.
An as, si se grafica una doble recproca, es decir, el inverso de la
velocidad (1/v
0
) contra el inverso de la concentracin de substrato (1/|S|), se
obtiene una lnea recta. El regrfico de Lineweaver-Burke, tambin se denomina de
dobles recprocas y se utiliza para calcular la Km y la Vmax as como para
determinar el mecanismo de accin de los diversos tipos de inhibidores.
La ecuacin que describe a la grfca de Lineweaver-Burke es:
(3)
que describe una recta en donde el intercepto con el eje de las abscisas es igual a
1/Km y el intercepto con el eje de las ordenadas es igual a 1/Vmax.

Figura: experimento cintico para la actividad enzimtica. Regrfico de
Lineweaver-Burke
| | Vmax
1
S Vmax
Km
v
1
0
+ =


16

Se presentan los valores experimentales y los resultados del ajuste al modelo.
INHIBICIN ENZIMTICA
Los inhibidores enzimticos son molculas que reducen o anulan la actividad
enzimtica. Estos inhibidores pueden unirse a las enzimas de forma reversible (la
desaparicin del inhibidor restaura la actividad enzimtica) o irreversible (el
inhibidor inactiva permanentemente a la enzima).

1. Inhibidores reversibles
Los inhibidores enzimticos reversibles pueden ser clasificados como
competitivos, acompetitivos, no competitivos y mixtos, segn el efecto que
produzcan en las constantes cinticas Km y Vmax. Este efecto depender
de que el inhibidor se una a la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES o a
ambos, como se puede observar en la figura de abajo y en la tabla inferior.
Para clasificar correctamente un inhibidor pueden llevarse a cabo estudios
de su cintica enzimtica en funcin de la concentracin de inhibidor. Los
cuatro tipos de inhibicin dan lugar a diagramas de Lineweaver-Burke y de
Eadie-Hofstee que varan de diferente forma con la concentracin de
inhibidor. Para abreviar, se usan dos smbolos:

y

Donde Ki y K'i son las constantes de disociacin para unirse a la enzima y al
complejo enzima-sustrato, respectivamente. En presencia de un inhibidor
reversible, los valores aparentes de la Km y la Vmax pasan a ser (/')Km y
(1/')Vmax, respectivamente, como se puede apreciar en la tabla inferior
para los casos ms comunes.


17

Tipo de inhibicin Km aparente Vmax aparente
solo Ki ( ) competitiva

solo Ki' ( ) acompetitiva

Ki = Ki' ( ) no competitiva

Ki Ki'
( )
mixta

Los ajustes por regresin no lineal de los datos de cintica enzimtica pueden
proporcionar estimaciones muy precisas de las constantes de disociacin Ki y Ki'.

Esquema de una reaccin enzimtica en presencia de un inhibidor enzimtico de
unin reversible.

2. Inhibidores irreversibles
Los inhibidores enzimticos tambin pueden unirse e inactivar una enzima
de forma irreversible, generalmente por medio de modificaciones
covalentes de residuos del centro cataltico de la enzima. Estas reacciones
decaen de forma exponencial y suelen ser saturables. Por debajo de los
niveles de saturacin, mantienen una cintica de primer orden con respecto
al inhibidor


18

MECANISMOS DE CATLISIS

El modelo de ajuste inducido es el ms utilizado al realizar estudios de interaccin
enzima-sustrato. Este modelo propone que las interacciones iniciales entre la
enzima y el sustrato son relativamente dbiles, pero suficientes para producir
ciertos cambios conformacionales en la enzima, que estabilizan e incrementan la
fuerza de la interaccin. Estos cambios conformacionales implican a una serie de
aminocidos catalticos del centro activo, en los cuales se producen los enlaces
qumicos correspondientes entre la enzima y el sustrato. Despus de la unin, uno o
ms mecanismos de catlisis disminuyen la energa del estado de transicin de la
reaccin, por medio de una ruta alternativa a la reaccin. Los mecanismos de
catlisis se clasifican en base a diferentes criterios: catlisis covalente, catlisis
por proximidad y alineacin de orbitales, catlisis cido-base general, catlisis por
iones metlicos y catlisis electrosttica.

Los estudios de cintica enzimtica no permiten obtener el tipo de catlisis
utilizada por una enzima. Sin embargo, algunos datos cinticos pueden proporcionar
una serie de indicios que lleven a realizar otro tipo de estudios dirigidos a
determinar dicho tipo de catlisis. Por ejemplo, en un mecanismo de ping-pong la
cintica del estado pre-estacionario puede estar sugiriendo una catlisis de tipo
covalente. Por otro lado, variaciones en el pH pueden producir efectos drsticos en
la Vmax pero no en la Km, lo que podra indicar que un residuo del centro activo
precisa un estado concreto de ionizacin para que se pueda llevar a cabo la catlisis
enzimtica.


19

La variacin de energa como funcin de una coordenada de reaccin muestra la
estabilizacin del estado de transicin cuando dicha reaccin es llevada a cabo por
una enzima.

ENZIMAS REGULADORES

Todos los enzimas exhiben diversas caractersticas ,que puede pensarse que
contribuyen elementos de la regulacin de sus actividades en las clulas vivas.
Todos ellos poseen un pH ptimo caracterstico, que hace posible la alteracin de
sus velocidades catalticas con los cambios de pH intracelulares.
Las velocidades de todas las reacciones enzimticas dependen tambin de la
concentracin del sustrato ,que puede variar significativamente en las condiciones
que prevalecen en el interior de las clulas .Adems ,muchos enzimas precisan de
iones metlicos como Mg 2+ o K+, o de coenzimas para su actividad ,indicando que
las fluctuaciones en la concentracin de estos metales o coenzimas en la clula
pueden regular la actividad del enzima. Sin embargo ,adems de estas propiedades
comunes a todos los enzimas ,algunos de ellos poseen otras ,que les confieren
especficamente papeles reguladores del metabolismo. Estas formas, mucho ms
especializadas ,se denominan enzimas reguladores .Existen dos tipos principales
de enzimas reguladores: 1)los enzimas alostricos ,cuya actividad cataltica es
modulada por la unin no covalente de un metabolito especfico a un centro de la


20

protena distinto del centro cataltico , y 2) los enzimas modulados
covalentemente, con formas activas e inactivas interconvertidas por la accin de
otros enzimas. Algunos de los enzimas de esta segunda clase responden tambin a
moduladores alostricos no covalentes .Ambos tipos de enzimas reguladores son
responsables de alteraciones en el estado metablico de la clula o tejido en un
intervalo de tiempo relativamente corto( los enzimas alostricos en un intervalo de
segundos ,y los regulados covalentemente en unos minutos).Examinaremos a
continuacin las propiedades de estas clases de enzimas reguladores.

CLASIFICACIN

ENZIMAS ALOSTRICOS

Los enzimas alostricos ,cuya actividad cataltica es modulada por la unin no
covalente de un metabolito especfico a un centro de la protena distinto del
centro cataltico.
ALOSTERISMO
No se deben confundir los efectores alostricos con el efecto de los
activadores e inhibidores que pueden ser molculas o iones que alteran la velocidad
de la reacin enzimtica. Estos activadores e inhibidores actan sobre el sitio
activo de la enzima. El activador incrementa la velocidad de reaccin y el inhibidor
decrece.

MODIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
Este mecanismo de regulacin es muy comn. Se presenta por lo general en aquellas
enzimas que estn formadas por varias sub-unidades o polipptidos. Consiste en
que una molcula diferente al sustrato o efector alostrico, se une a la enzima en
un sitio diferente al sitio activo o de catlisis (que es donde es modificado el
sustrato), de manera que se altera la conformacin de la enzima polimrica y
resulta una nueva conformacin espacial de ella. El efector alostrico puede
resultar estimulador de la catlisis por lo que se le nombra efector alostrico
positivo o bien un inhibidor de la catlisis o efector alostrico negativo. En las
rutas metablicas no falta la presencia de este tipo de enzimas que presentan
alosterismo.
Un ejemplo es el de la enzima alostrica fosfofructocinasa que se en uno de los
pasos de la va glucoltica y cuyos efectores positivos son el


21

AMP o el ADP y el efector negativo es el ATP. En otras palabras, cuando hay
presencia abundante de el AMP o del ADP quiere decir que hay poca energa
disponible en la clula y por lo tanto, la va glucoltica, que es la transformacin de
glucosa a piruvato con la produccin neta de 2 molculas de ATP, se ve acelerada
en ese sentido. Sin embargo, si hay abundancia de ATP el uso de la va glucoltica
disminuye, inhibiendo alostricamente la enzima fosfofructocinasa. Esto determina
que esta enzima sea considerada como la ms importante enzima regulatoria de
esta va o ruta metablica.

SISTEMAS MULTIENZIMTICOS
En muchos sistemas multienzimticos el producto final de la secuencia de
reacciones puede actuar como un inhibidor especfico de un enzima situado al
comienzo de la secuencia o muy prximo a l, lo cual determina la velocidad de la
secuencia completa de reacciones resulte condicionada por la concentracin de
producto final, en el estado estacionario el ejemplo clsico es la secuencia
multienzimtica que cataliza la conversin de L-treonina en L-isoleucina que
procede en cinco etapas catalizadas enzimticamente (Fig.9-18).


22

Retroinhibicin de la formacin de la Isoleucina a partir de la Treonina

El primer enzima de la secuencia, la Ltreonin-deshidartasa, es fuertemente
inhibida por la L- isoleucina ,que es el producto final pero no lo es por ningn otro
producto intermedio de la secuencia. Las caractersticas cinticas de la inhibicin
por la isoleucina son atpicas; la inhibicin no es competitiva con el sustrato ,la L-
treonina ,ni tampoco no competitiva o acompetitiva .La isoleucina es muy especfica
como inhibidor ,sin embargo otros aminocidos o compuestos relacionados no
inhiben .Este tipo de inhibicin se designa de diversas maneras : inhibicin por el
producto final, inhibicin feed back y retroinhibicin. El primer enzima de esta
secuencia el cual es inhibido por el producto final, se llama enzima alostrico,
nombre propuesto por J. Monod, J.P. Changeux y F. Jacob, del instituto Pasteur de
Pars ,que fueron los primeros que desarrollaron una amplia teora para la funcin
de este tipo de enzimas reguladores. El trmino alostrico significa otro espacio
u otra estructura ; los enzimas alostricos poseen , adems del centro
cataltico ,el otro espacio al que se enlaza de modo reversible y no covalente el
efector o modulador .


23

En general, el centro alostrico es tan especfico para la unin del modulador, como
el centro cataltico lo es para la unin del sustrato. Algn modulador
por ello se les denomina moduladores inhibidores o negativos .Otros enzimas
alostricos pueden tener moduladores positivos o estimuladores. Cuando un enzima
alostrico posee solamente un modulador especfico, se dice que es monovalente.
Algunos enzimas alostricos responden a dos o ms moduladores especficos, cada
uno de ellos unido a un centro especfico del enzima; se dice entonces que son
polivalentes. Adems un mismo enzima alostrico puede poseer tanto moduladores
positivos como negativos .Dos o ms sistemas multienzimticos pueden estar
conectados mediante uno o ms enzimas polivalentes, constituyendo una red de
control


24

La primera etapa en una secuencia de reaccin multienzimtica, es decir, la etapa
catalizada por el enzima alostrico ,por lo general, irreversible en las condiciones
intracelulares. Con frecuencia se la designa como reaccin determinante ;una vez
que se ha producido, se verifican todas las dems reacciones subsiguientes de la
secuencia .Desde luego ,constituye una estrategia por parte de la clula al regular
una ruta metablica en la etapa inicial, para conseguir as las mxima economa de
metabolitos.
Los enzimas alostricos poseen ,generalmente ,pesos moleculares muchos mayores,
son ms complejos y con frecuencia ms difciles de purificar que las enzimas
ordinarios, debido a que casi todos los enzimas alostricos conocidos son
oligmeros y poseen ,por tanto dos o ms subunidades constituidas por cadenas
polipeptdicas ,por lo general en nmero par ; hay algunos que contienen muchas
cadenas .Los enzimas alostricos muestran cierto numero de propiedades anmalas
.Algunos son inestables a O C pero estables a temperatura ambiente o a la del
cuerpo; en ellos se diferencian de los enzimas unicatenarios, que no muestran
inestabilidad frente al fro .La mayor parte de los enzimas alostricos exhiben una
dependencia atpica de la velocidad inicial de reaccin frente a la concentracin del
sustrato y no cumplen la clsica relacin de Michaelis-Menten. Adems, la
inhibicin producida por el metabolito modulador no se ajusta siempre a los bien
conocidos prototipos de inhibicin competitiva, no competitiva y acompetitiva Los
enzimas alostricos muestran dos tipos de control diferentes : heterotrpico y
homotrpico ,segn la naturaleza de la molcula moduladora. Los enzimas
heterotrpicos son estimulados o inhibidos por la molcula de un modulador o
efector distinta de la de sus sustratos. El sustrato de la treonin-deshidratasa es
la treonina, mientras que su modulador es la L-isoleucina .Por otra parte, en los
enzimas homotrpicos , el sustrato acta tambin como modulador .Estos enzimas
homotrpicos contiene dos o ms centros de unin para el sustrato ; la modulacin
de estos enzimas depende de cuntos sean los centros del sustrato que estn
ocupados sin embargo, una gran parte de los enzimas alostricos son del tipo
mixto homotrpico-heterotrpico sobre los cuales pueden actuar como
moduladores ,tanto el sustrato como algn otro metabolito ( o varios).

Cintica de los enzimas alostricos
Los enzimas alostricos no muestran generalmente la clsica relacin cintica de
Michaelis-Menten entre la concentracin del sustrato, V
mx.
y k
M
.Porque su
comportamiento cintico est muy alterado por las variaciones de concentracin
del modulador alostrico .


25

Fig. A : Enzima no regulador que obedece a la ecuacin de Michaelis Menten
(hiprbole rectangular) .Se necesita un incremento de 81 veces en S( ,para que la
actividad pase desde el 10 al 90 por ciento de la mxima.

Muchos enzimas alostricos , especialmente los homotrpicos, muestran una curva
sigmoide al relacionar grficamente la velocidad inicial con la concentracin del
sustrato , en lugar de la hiprbole que aparece en la relacin de Michaelis-Menten
.La curva sigmoidal implica que la unin de la primera molcula de sustrato con el
enzima intensifica la unin de las molculas de sustrato subsiguientes a los otros
centros a los que se fija el sustrato ,del mismo modo como la unin de una molcula
de oxgeno a la hemoglobina intensifica la unin de nuevas molculas de oxgeno
.Las curvas sigmoidales son a veces muy inclinadas de suerte que un pequeo
incremento de la concentracin del sustrato puede provocar una aceleracin muy
grande de la velocidad de catlisis , mucho mayor incluso que el exhibido por un
enzima sencillo no regulador que obedezca a la relacin hiperblica de Michaelis-
Menten. Tal relacin sigmoidal constituye un ejemplo de cooperatividad positiva ,ya
que el enlace de una molcula de sustrato en un centro incrementa la unin de las
molculas subsiguientes en los dems centros. Debe aclararse sin embargo, que no
todos los enzimas alostricos exhiben curvas sigmoidales al representar V
O
frente
a S( ; adems ,no todos los enzimas que muestran tales curvas son necesariamente
alostricos .


26

FIG. B : Enzima regulador que muestra una curva sigmoidal (cooperatividad
positiva ) .Solamente de necesita que S( aumente nueve veces ,para que se
incremente la actividad desde el 10 al 90 por ciento de la mxima.

Algunos enzimas alostricos muestran un comportamiento opuesto : la unin de una
molcula de sustrato provoca un descenso en la unin de las molculas de sustrato
subsiguientes.El hecho se designa por el nombre de cooperatividad negativa, la cual
da por resultado una curva ms aplanada en la representacin de la velocidad inicial
frente a la concentracin del sustrato y se aproxima a la saturacin mucho ms
lentamente que los enzimas no reguladores o que los de cooperatividad positiva.

FIG C: Enzima regulador que muestra cooperatividad negativa .La concentracin
del sustrato debe aumentarse unas 6000 veces para que la actividad se eleve
desde el 10 al 90 por ciento de la mxima.


27

Algunos enzimas alostricos responden a la unin de un modulador con un cambio en
el valor de la K
M
aparente para el sustrato sin que vare la V
MX
(fig. 9-20). Un
modulador negativo producir entonces un incremento en la K
M
aparente y un
modulador positivo un descenso de dicho valor .(Se emplea aqu el trmino K
M

aparentepara designar nicamente la concentracin de sustrato con la que se
obtiene la mitad de la velocidad mxima este valor no puede emplearse para
calcular la velocidad inicial de un enzima alostrico , ya que la representacin de V
O

frente a (S( no es una hiprbole rectangular tal como requieren la hiptesis y
ecuaciones de Michaelis-Menten . Por tanto , un modulador negativo disminuir la
velocidad de reaccin a una concentracin de sustrato no saturante y constante,
mientras que un modulador positivo producir un incremento de la velocidad .Los
enzimas alostricos que responden a los moduladores positivos o negativos con un
cambio en el valor de la K
M
aparente , pero sin que vare el valor de V
MX
reciben, a
veces, el nombre de enzimas K .

FIG. A.- Enzimas K. Estos enzimas responden a las concentraciones crecientes de
los moduladores acelerantes ,con un descenso de la K
M
aparente ,y al incremento de
las concentraciones de los moduladores inhibidores ,con un incremento de la K
M
aparente ,de modo que a una concentracin fija no saturante del sustrato ,la
velocidad de reaccin aumenta en presencia de un modulador acelerante y
disminuye en presencia de un modulador inhibidor. La V
MX
de los enzimas K
permanece constante.


28

Inversamente,los enzimas alostricos que muestran un cambio en la V
MX
en
respuesta al modulador sin que vare el valor de la K
M
aparente, se llaman enzimas
M ; existen menos ejemplos de esta clase . Sin embargo , no todos los enzimas
alostricos pueden situarse en una de estas dos clases .Desde un punto de vista
general ,la interpretacin de las propiedades reguladoras de los enzimas
alostricos deducida de las representaciones de la velocidad inicial frente a la
concentracin del sustrato , slo es biolgicamente significativa , en el intervalo
ms inferior de concentraciones de sustrato , ya que las concentraciones de los
metabolitos en las clulas intactas estn muy por debajo de los niveles de
saturacin de los enzimas que actan sobre ellas.

FIG. B.- Enzimas M. Estos enzimas experimentan cambios en su V
MX
,pero no en el
valor de su K
M
aparente ,en presencia de moduladores aceleradores o inhibidores.
Los trminos K
M
Y V
MX
no pueden aplicarse en rigor a los enzimas que no obedecen
a la relacin hiperblica de Michaelis Menten; se emplean aqu solamente para
designar la concentracin de sustrato con la que se obtiene la mitad de la velocidad
mxima y dicha velocidad , mxima respectivamente.


29

La capacidad de un enzima alostrico para ser activado, o inhibido , por sus
moduladores especficos puede ser abolida , a veces, sin que se lesione su actividad
cataltica, muchas veces por medio de la calefaccin suave , por exposicin a la
rea o bien tratando el enzima como un agente que se produzca una modificacin
qumica del centro modulador.Se dice entonces que el enzima se ha desensibilizado
.Un enzima alostrico desensibilizado no solamente pierde su sensibilidad frente a
los moduladores , sino que puede incluso mostrar una cintica normal de Michaelis-
Menten .Las mutaciones genticas producen, en ocasiones, la biosntesis de un
enzima alostrico defectuoso no sensible frente a su modulador normal
probablemente por haberse producido una sustitucin no funcional de un resto
aminocido crtico.

Aspartato trancarbamilasa- cinetica e inhibicin
La Aspartato Transcarbamoilasa o carbamoil transferasa es una enzima importante
en la biosntesis de nucletidos de pirimidina. La estructura y las propiedades
alostricas de la enzima de la bacteria E. Coli han sido extensamente estudiadas.
Ella cataliza una reaccin entre el cido asprtico y el carbamoil fosfato para
generar N-carbamoil aspartato con la liberacin de fosfato inorgnico.


30

La enzima completa y activa (abreviada ATCasa) consta de no menos de 12
diferentes cadenas proteicas o subunidades. Ella contiene dos componentes
catalticas hechos de tres subuniddes idnticas. Uno de estos componentes
catalticos se muestra en el diagrama con las subunidades en diferentes tonos
de azules. Estos componentes se arreglan uno al lado del otro y efectivamente
formando las dos caras principales de la enzima completa.
El resto de la enzima se compone de trescomponentes regulatorios cada uno de
dos subuniddes. Estos componentes forman las esquinas de la enzima la cual es
mas o menos de forma triangular. Una de las esquinas es mostrada en diagrama
y las dos subuniddes se muestran en diferentes tonos de verde.

Los componentes catalticos y reguladores pueden ser separados. Si ellos
seencuentran separados entonces los componentes catalticos sern an capaces
de catalizar la reaccin en la forma usual, excepto que no tendrn ninguna de las
propiedades alostricas. No muestran signos de cooperatividad de substrato y
no reaccionan con los Efectores alostricos.
Los Componentes Regulatorios no pueden levar a cabo la catlisis, pero pueden
unirse a las Efectores usuales de la ATCasa tales como el CTP (un inhibidor) y el
ATP (un activador)


31

RETROALIMENTACIN

Este mecanismo de regulacin metablica en ocasiones es confundido con la
inhibicin y la activacin.
La inhibicin o activacin da cuando una molcula acta sobre el sitio activo de
una enzima modificandosu velocidad de reaccin enzimtica, ya sea
incrementndola (activacin) o decrecindola (inhibicin).
Tambien hay una retroalimentacin, positiva (activadora) y una
retroalimentacin negativa (inhibitoria). Se presenta alterando no slo una sino
ms reacciones enzimticas secuenciales de una ruta metablica.
Por ejemplo, en la ruta de biosntesis de bases pirimdicas las clulas
procariticas como E.coli presentan retroalimentacin negativa.
La retroinhibicin (que tambin as se le conoce) se presenta cuando los niveles
de CTP son altos y puede retroinhibir a la enzima aspartato transcarbamilasa o
primer paso de la va de biosntesis de bases pirimdicas.
La retroalimentacin positiva o la negativa, se presenta en la ruta de biosntesis
de bases pricas.

MODULACIN COVALENTE DE LAS ENZIMAS REGULADORAS
Una caracterstica que diferencia las enzimas de los catalizadores qumicos
convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede
ser ms o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulacin:
- Nivel de sntesis: que haya ms o menos molculas de la enzima (ya lo
veremos).
- Nivel de actividad: que las molculas de enzima existentes estn ms o
menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrnsecos a la enzima,
Ph, T,
hablamos de enzimas reguladoras, enzimas que por su propia naturaleza
tienen mecanismos especiales de regulacin. Estn especializadas en
regularse respondiendo de forma muy sensible a seales externas.


32

En la clula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios
pasos enzimticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que
determina la velocidad de toda la ruta. La modulacin de las enzimas
reguladoras ocurre mediante diferentes mecanismos:
o Enzimas alostricas. Funcionan mediante la unin reversible no
covalente de compuestos regulatorios llamados moduladores. El
modulador puede ser una activador (modulacin positiva) o un
inhibidor (modulador negativo) y ser el propio sustrato de la reaccin
(alosterismo homotrpico) o ser otra sustancia (alsoterismos
heterotrpico). Normalmente se trata de enzimas multimricas y
normalmente el sito activo y el regulatorio se encuentran en
distintas subunidades.
o Enzimas interconvertibles Por modificacin covalente reversible,
como por ejemplo por fosforilacin/defosforilacin o modificacin
redox.
o Mediante protenas reguladoras que se unen a la enzima.
o Mediante la eliminacin proteoltica de pequeos segmentos
peptdicos (esto es irreversible).

EFECTO DE LA MODIFICACIN COVALENTE SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA
Otros enzimas pasan de una forma menos activa a otra ms activa unindose
covalentemente a un grupo qumico de pequeo tamao como el P
i
o el AMP.
Tambin se da el caso inverso, en el que un enzima muy activo se desactiva al
liberar algn grupo qumico.
En las enzimas de las vas degradativas del metabolismo, la forma fosforilada es
ms activa que la no fosforilada, mientras que en las vas biosintticas ocurre lo
contrario. En las figuras inferiores se ilustra la activacin de una protena por
fosforilacin.


33

Elementos de la reaccin El enzima no fosforilado es inactivo El enzima fosforilado es activo

MODULACIN ALOSTRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R
(relajada) y T (tensa). R es la forma ms activa porque se une al sustrato con ms
afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R > T (Figura inferior):

Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores
positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo. Las molculas que
favorecen la forma R pero que actan sobre una regin del enzima distinta del
centro activo son los activadores alostricos (Figura inferior izquierda).


34

Activador alostrico: favorece la unin
del sustrato
Inhibidor alostrico: impide la unin del
sustrato

Las sustancias que favorecen la forma T y disminuyen la actividad enzimtica son
los moduladores negativos. Si estos moduladores actan en lugares distintos del
centro activo del enzima se llaman inhibidores alostricos (Figura superior
derecha) .

ACTIVACION COVALENTE DE ZIMOGENOS

Ciertas protenas se fabrican y secretan en forma de protenas inactivas conocidas
como proproteinas. Cuando estas son enzimas , las proproteinas correspondientes
se llaman proenzima o zimogenos.
Cul es la razn de que ciertas protenas se secreten como su variante inactiva?
La razn de esto es para que sirvan de reserva y esto facilite su movilizacin
rpida en respuesta a la demanda fisiolgica o fisiopatologica.
Un tipo de regulacin de la actividad enzimatica algo diferente, es la activacin
catalizada enzimaticamente de los precursores inactivos de los enzimas
(zimogenos) para dar las formas cataliticamente activas. Los ejemplos clsicos son
los enzimas digestivos pepsina, tripsina y quimotripsina, que se sintetizan como
zimogenos inactivos pepsinogeno, tripsinogeno y quimotripsinogeno
respectivamente. Cuando estos enzimas son secretados al tracto gastrointestinal,
se transforman en sus formas activas mediante la escisin hidrolitica selectiva de
uno o varios enlaces peptidicos de la molcula del zimogeno . El pepsinogeno se
convierte en pepsina activa en el estomago por accin de la pepsina libre a Ph bajo,


35

que libera 42 restos aminocidos en forma de una mezcla de peptidos, procedentes
del extremo N-terminal del pepsinogeno:

pepsina
Pepsinogeno Pepsina + peptidos

El tripsinogeno se convierte en tripsina activa por eliminacin de un exapeptido del
extremo N-terminal, por la accion del enzima enteroquinasa:

enteroquinasa
Tripsinogeno Tripsina + Exapeptido

La conversin del quimotripsinogeno en quimotrpsina activa se produce por la
actuacin de la tripsina, la cual provoca la eliminacin de dos fragmentos
dipeptidicos, tal como se descrio con anterioridad

tripsina
Quimotrpsinogeno Qumotripsina + 2 dipeptidos

Estos zimogenos se ven impedidos de ejercer su actividad proteolitica sobre las
protenas intracelulares en tanto que permanecen en el interior de las clulas en
las que han sido sintetizados. Solamente se hallan en disposicin de generar la
forma activa cuando son secretados al tracto gastrointestinal. Sin embargo este
tipo de regulacin covalente solo se realiza en una sola direccin no se conocen
reacciones enzimas en sus formas zimogenas respectivas.

ISOENZIMAS

Las isoenzimas son distintas formas moleculares de una misma enzima que
presentan muestran especificidad por el mismo sustrato.


36

Las distintas formas moleculares de alcohol deshidrogenasa (ADH) se diferencian
en la carga elctrica neta, en el peso molecular o en ambas simultneamente, pero
todas ellas deshidrogenan el alcohol (sustrato) convirtindolo en aldehdo. La
principal caracterstica de las isoenzimas es quese producen por sustitucin de un
aminocido por otro de distinta polaridad, por ejemplo, cambio de un aminocido
cido por otro bsico o neutro.
Algunos autores opinan que solamente deben considerarse como isoenzimas
aquellas formas moleculares que estn presentes en el mismo rgano o tejido, que
tienen un origen gentico similar y actividades catalticas muy similares. Las
peroxidasas, las esterasas y las fosfatasas presentan distintas formas moleculares
en el mismo rgano o tejido, pero tienen una amplia especificidad de sustrato, de
manera que pueden transformar diferentes compuestos. Adems, pueden tener
diferentes orgenes y, por tanto, no se las considera como verdaderas isoenzimas.
La estructura cuaternaria activa de las isoenzimas puede ser fundamentalmente
de tres tipos:
1.- Monmeros: isoenzimas que poseen una sola cadena polipeptdica como
estructura cuaternaria activa.
2.- Dmeros: isoenzimas cuya estructura cuaternaria activa consiste en la unin
de dos polipptidos.
3.- Tetrmeros: la estructura cuaternaria activa de estas isoenzimas consta de
cuatro polipptidos.
Las isoenzimas dimricas y tetramricas pueden estar formadas por
subunidades o polipptidos iguales o diferentes.
1.- Homodmeros: isoenzima formada por dos polipptidos idnticos.
2.- Homotetrmero: isoenzima constituida por cuatro cadenas polipeptdicas
iguales.
3.- Homopolmeros: isoenzimas formadas por mltiples cadenas polipeptdicas
idnticas.
4.- Heterodmero: isoenzima constituida por dos polipptidos diferentes.
5.- Heterotetrmero: tetrmero constituido por la unin de cuatro polipptidos
diferentes, pudiendo ser los cuatro distintos o|o, ser tres diferentes ooo|, o
tener dos tipos distintos oo||.


37

No se han descrito, hasta el momento, isoenzimas cuya estructura cuaternaria
activa conste de tres cadenas polipeptdicas (trmeros).
Un trmino que se emplea con bastante frecuencia es el de Patrn Isoenzimtico
o Zimograma, conjunto de bandas pertenecientes al mismo sistema enzimtico que
se observan en el mismo individuo. Deseo destacar que he utilizado la palabra
banda en vez de la de isoenzima para indicar que una banda que se observa en un
gel, despus de llevar a cabo una electroforesis, puede ser una sola isoenzima o la
superposicin de varias isoenzimas diferentes con igual migracin electrofortica.
Otro trmino usado con mucha frecuencia es el de Alozimas o Alelozimas,
empleado para referirse a las distintas formas moleculares de una misma enzima
producidas por distintos alelos del mismo locus. Naturalmente, el vocablo
isoenzima es ms amplio, ya que se incluye tanto a las diferentes formas
moleculares de una misma enzima producidas por alelos de mismo locus, como a las
producidas por alelos de distintos loci.
La lactato desidrogenasa aparece en cinco formas isozimicas en los tejidos de rata
y de otros vertebrados.

Lactato + NAD
+
Piruvato + NADH + H
+

En esta reaccin el NAD y el NADH representan respectivamente a las formas
oxidada y reducida de di nucletido de nicotinamida y adenina. Las cinco isoenzimas
poseen el mismo peso molecular alrededor de 134,000 y todos ellos contienen
cuatro cadenas polipeptdicas cuyo peso molecular es de 33,500. los cinco
isoenzimas estn constituidas por cinco combinaciones diferentes de dos clases de
cadenas polipeptdica designadas como M y H. El isozima que predomina en el
msculo esqueltico posee cuatro cadenas M idnticas y se designa como M ; otro
que predomina en el corazn, posee cuatro cadenas H idnticas y se designa por H .
Los otros tres isozimas tienen la composicin M3 H, M2 H2 y MH3. Se han aislado
las cadenas sencilla M y H, y se ha comprobado que difieren significativamente en
su contenido en aminocidos y en su secuencia. Cuando las cadenas M y H sencillas,
inactivas por si solas se mezclan en proporciones adecuadas, pueden formarse
espontneamente ( in vitro) todos los isozimas de la lactato deshidrogenasa,
poseyendo todos ellos plena actividad cataltica.
La investigacin genetica indica que las secuencias aminocidos de las dos cadenas
polipeptidicas diferentes M y uyuyH dela lactato deshidrogenas se hallan
codificadas por dos genes diferentes. La Biosntesis de los dos tipos de cadenas y
por tanto, las cantidades relativas de los isozimas de la lactato deshidrogenasa
presentes en una determinada celula se encuentran bajo regulacin gentica .


38

Los isozimas de la lactato deshidrogenasa existen en diferentes proporciones en
los diferentes tejidos. Adems, las proporciones relativas de los isozimas de la
lactato deshidrogenasa en un tejido pueden cambiar durante el desarrollo
embrionario. Constituyen tambin un elemento importante para el diagnostico de
las enfermedades del corazn y del hgado .
E cuidadoso estudio cintico de los isozimas de la lactato deshidrogenasa a
demostrado que aunque todos ellos canalizan la misma reaccin , difieren
significativamente en sus valores de Km respecto a sus sustratos ,
particularmente respecto al piruvato, asi como en los valores de Vmax cuando el
sustrato es el piruvato. El isozima M
4
caracterstico del msculo esqueltico y de
los tejidos embrionarios, posee un valor relativamente bajo de Km para el,piruvato
y una velocidad relativamente elevada en la reduccin del piruvato a lactato. El
isozima H
4
es caracterstico del corazn y de otros msculos rojos, posee una Km
relativamente elevada para el piruvato y lo reduce a una velocidad relativamente
baja. Adems la desh hidrogenacin del lactato catalizado por el isozima H
4
es
fuertemente inhibida por el piruvato. Los dems isozimas de la lactato
deshidrogenasa poseen propiedades cinticas intermedias entre las los lisozimas
M
4
y H4 en proporcin a sus contenidos relativos de cadenas M y H .
Estas caractersticas cinticas, si se comparan con las caractersticas metablicas
de los tejidos en los que predominan los isozimas M
4
Yh
4
proporcionan cierta
comprensin a cerca de la funcin de los isozimas de la lactato deshidrogenasa. El
msculo esqueltico y el tejido embrionario tienden a utilizar la glucosa
anaerobicamente, degradndola hasta formar lactato en el proceso de la gluclisis .
La lactato deshidrogenasa cataliza la ultima etapa de la gluclisis, la reduccin del
piruvato a lactato. De este modo el msculo esqueltico en el que predomina el
isozima M4 que posee una Km bajo y una Vmax elevada para el piruvato, esta bien
adaptado para convertir rpidamente el piruvato en lactato. Por otra parte, el
msculo cardiaco no forma normalmente lactato a partir de la glucosa; oxida el
piruvato a dixido de carbono aerbicamente sen que tenga lugar la formacin
intermedia de lactato. El isozima M4 se halla bien adaptado para esta ruta
diferente del metabolismo de la glucosa ya que la Km para el piruvato es elevada y
la V max para la reduccin del piruvato a lactato es baja, y tambin resulta
inhibido por el exceso de piruvato; todos estos factores disminuyen en gran
medida, su actividad en l direccin de la formacin de lactato. Aunque el msculo
cardiaco no emplea, por lo general, lactato hidrogenasa en la oxidacin de la
glucosa, en casos de emergencia en que el suministro de oxigeno disminuye, lka
presencia de la lactato deshidrogenasa permite al corazn obtener su energa de la
conversin del glucogeno en lactato.


39

Hoy da conocemos isozimas en un gran numero de enzimas diferentes
generalmente estan constituidos por mezclas ntimamente asociadas de diferentes
clases de cadenas polipeptidicas en ls que estn combinadas las propiedades
cinticas y de enlace especificas aportadas por cada tipo de cadena.
Mucos enzimas alostericos se encuentran en forma de dos o mas isozimas que
varan en su sensibilidad respecto a sus moduladores alostericos .En otros casos
pueden encontrarse diferentes isozimas en los diversos compartimientos
intracelulares.
El estudio delos isozimas es de fundamental significacin en la investigacin de la
base molecular de la diferenciacin celular y de la morfognesis Muchas protenas
no solo las que tienen actividad cataltica pueden presentarse en formas mltiples
en las clulas.

CONCLUSION
Nuestro organismo requiere en si de muchos factores que mantengan la
homeostasis(normal funcionamiento de nuestro cuerpo o equilibrio) y uno de esos
factores son las enzimas reguladoras las cuales cumplen una funcin muy
importante en la sntesis de carbohidratos, lpidos , protenas esenciales para el
buen funcionamiento de nuestro cuerpo, es por eso que cuando se afecta este
equilibrio por una enfermedad como la muscular en el ejemplo empleado se altera el
numero de enzimas reguladoras y su funcionamiento, ahora el hallazgo del numero
anormal de estas enzimas reguladoras nos ayudaran en el diagnostico de la
enfermedad pues nos indicaran cual es el rgano afectado claro aparte de la clnica
respectiva que el medico har en su examen clnico.Es por eso que cuando se
sospecha de alguna enfermedad en los anlisis respectivos se piden por ejemplo
transaminasas para ver como esta el nmero y determinar si es que la enfermedad
produce una afeccin en las transaminasas y entonces esto ayudara a diagnosticar
que el problema es regular nuevamente la cantidad y el buen funcionamiento de esa
enzima.


40

BIBLIOGRAFIA

- http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima
- http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/propiedades%20enzimas.ht
ml
- http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz1.htm
- http://www.bcelular.fmed.edu.uy/Material/enzimas.pdf
- http://www.medicina.org.ar/.../173-enzimas-y-propiedades-
enzimaticas.html
- http://www.angelfire.com/magic2/bioquimica/enzimas9.htm
- http://html.rincondelvago.com/enzimas_13.html
- http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003497.htm
- http://www.mantra.com.ar/contenido/frame_bioenergetica.html - 6
- http://omega.ilce.edu.mx:3000/sites/
- http://ciencia/volumen2/ciencia3/092/htm/energia.htm - 3k
- http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/bioenergetica.html - 40k -
http://www.enbuenasmanos.com/articulos/muestra.asp?art=15 - 23k
- http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/bioenergetica/

Cinética Enzimática

Transféré par

Informations du document

Description originale:

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Cinética Enzimática

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

CURSO:

ESTRUCTURA Y FUNCIN CELULAR Y

Vous aimerez peut-être aussi