Validacin de mtodos

y determinacin de la
incertidumbre de la medicin:
Aspectos generales sobre la
validacin de mtodos













































GUA TCNICA N 1 1













Comit Editor

Boris Duffau
Fabiola Rojas
Isabel Guerrero
Luis Roa
Luis Rodrguez
Marcelo Soto
Marisol Aguilera
Soraya Sandoval

Se agradece la colaboracin prestada por el Sr. Leonardo Merino de la National Food
Administration de Suecia, para la elaboracin de esta Gua

Coordinacin Edicin

Soraya Sandoval
Seccin Metrologa Ambiental y de Alimentos
Departamento de Salud Ambiental

Edicin
Ao 2010




Santiago, Diciembre de 2010.





GUA TCNICA N 1 2



I: INTRODUCCION



El Instituto de Salud Pblica de Chile, como Laboratorio Nacional y de Referencia colabora
continuamente con la Red de Laboratorios del Ambiente de las SEREMIs de Salud.

La presente gua tiene como objetivo, entregar recomendaciones a los laboratorios para realizar
la validacin de los mtodos analticos e introducir a estos en el concepto de incertidumbre de
la medicin.































GUA TCNICA N 1 3
C CO ON NT TE EN NI ID DO O


I: INTRODUCCION 2

II: TERMINOLOGA 4

II: ESTADISTICA BASICA 8

IV: VALIDACION 21

A) establecer plan de validacin 24
B) Desarrollo de pruebas de parmetros de validacin 25
C) Evaluacin de resultados de la validacin 25
D) Informe de validacin 26

SELECTIVIDAD 27
LINEALIDAD 28
SENSIBILIDAD 33
LIMITES 34
EXACTITUD 37
ROBUSTEZ 45
APLICABILIDAD 49

V: INCERTIDUMBRE 50

VI: ANEXOS 54

VII: BIBLIOGRAFA 66
















GUA TCNICA N 1 4
II: TERMINOLOGA:

Adecuacin al propsito: Es el grado en que la aplicabilidad de un mtodo se ajusta a los criterios o
requerimientos acordados entre el analista y el usuario final (cliente) que hace uso de los informes o
datos generados a travs de un mtodo de ensayo. Es decir es la adaptacin de un mtodo para un fin
previsto.

Analito: Sustancia (qumica, fsica o biolgica) buscada o determinada en una muestra, que debe ser
recuperada, detectada o cuantificada por el mtodo.

Aplicabilidad: Los analitos, matrices y concentraciones para los cuales puede utilizarse
satisfactoriamente un mtodo de anlisis con el fin de determinar su conformidad con una norma.
(Referencia: Manual Codex Alimentarius 16 Ed.)

Nota: La declaracin de aplicabilidad (mbito o campo de aplicacin), adems de una declaracin
del margen de funcionamiento satisfactorio para cada factor, puede incluir tambin advertencias
acerca de la interferencia conocida de otros analitos, o de la inaplicabilidad a determinadas
matrices y situaciones. (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18 Ed.)

Blanco matriz: Matriz que no contiene el analito de inters u objetivo para el mtodo seleccionado.

Calibracin: Operacin que, en condiciones especificadas, establece primero una relacin entre los
valores con incertidumbres de medicin proporcionados por las normas de medicin y las indicaciones
correspondientes con las incertidumbres de medicin asociadas, y utiliza luego esta informacin para
establecer una relacin a fin de obtener un resultado de medicin a partir de una indicacin.
(Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Nota1 : La calibracin se puede expresar por medio de una declaracin, una funcin, un diagrama,
una curva o una tabla. En algunos casos puede consistir en una correccin aditiva o multiplicativa
de la indicacin con la incertidumbre de medicin asociada. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Nota 2: La calibracin no debe confundirse con el ajuste de un sistema de medicin que a menudo
se denomina errneamente autocalibracin, ni tampoco con la verificacin de la calibracin.

A menudo se percibe como calibracin solamente el primer paso mencionado en la definicin
anterior. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Es decir, es un procedimiento de comparacin entre lo que indica un instrumento y su "valor
verdadero" de acuerdo a un patrn de referencia con valor conocido.

Componente de la Incertidumbre: Cada una de las contribuciones a la incertidumbre.

Criterios de aceptabilidad: Exigencias de una caracterstica de funcionamiento o comportamiento en
funcin de las cuales se puede determinar que un mtodo analtico es adecuado para la finalidad
perseguida y ofrece resultados confiables.

GUA TCNICA N 1 5
Ensayo: Operacin tcnica realizada de acuerdo a un procedimiento especifico, que consiste en la
determinacin cualitativa y/o cuantificacin de una o ms caractersticas (propiedades o analitos) en un
determinado producto, proceso o servicio.

Error aleatorio: Es aquel error inevitable que se produce por eventos nicos imposibles de controlar
durante el proceso de medicin. Se contrapone al concepto de error sistemtico. Las fuentes de los
errores aleatorios son difciles de identificar o sus efectos no pueden corregirse del todo. Son
numerosos y pequeos. Este error ocurre o esta dado por el azar. Ejemplo: Errores de apreciacin, tales
como el paralaje, que depende del observador y su capacidad en cuanto al lmite separador del ojo.

Error Sistemtico: Es aquel que se produce de igual modo en todas las mediciones que se realizan de
una magnitud. El error sistemtico esta condicionado por algn factor distinto al azar. Ejemplo: el error
de las masas patrn del laboratorio se transfiere sistemticamente al momento de calibrar la balanza.
El VIM, lo define como componente del error de medicin que al reiterar las mediciones se mantiene
constante o bien varia de manera predecible.

Idoneidad para el fin previsto: La medida en que los datos obtenidos en un proceso de medicin
permiten al usuario adoptar decisiones correctas, tanto desde el punto de vista tcnico como
administrativo, para alcanzar un fin establecido.

Incertidumbre: Parmetro asociado al resultado de una medicin que caracteriza la dispersin de los
valores que podran razonablemente ser atribuidos al mensurando.

Incertidumbre de la medicin: Parmetro no negativo que caracteriza la dispersin de la cantidad de
valores que se atribuyen a una mensurando, basndose en la informacin utilizada. (Referencia: VIM,
JCGM 200:2008)

Nota: La incertidumbre de medicin comprende, en general, muchos componentes. Algunos de
estos pueden ser evaluados por tipo de una evaluacin de: la distribucin estadstica de la cantidad
de valores de una serie de mediciones y se pueden caracterizar por las desviaciones.

Intervalo de trabajo: Es el intervalo entre el nivel ms bajo y ms alto de concentracin que ha sido
demostrado que puede ser determinado con la precisin y exactitud requeridas para una determinada
matriz.

Limite mximo permitido ( (( (LMP) )) ): Nivel mximo o tolerancia establecida para un analito en una
reglamentacin.

Limite mximo Residual (LMR): Concentracin mxima de residuos de una sustancia (plaguicida o
medicamento) que se permite legalmente su uso en la superficie o parte interna de un producto
alimenticio.

Matriz: Es el tipo de sustancia compuesta (liquida, slida, gaseosa) que puede o no contener al analito
de inters, ejemplo: matriz de alimento, matriz ambiental, etc.




GUA TCNICA N 1 6
Material de Referencia Certificado (MRC): Material de referencia acompaado de documentacin,
emitida por un rgano autorizado, en la que se indican uno a ms valores de propiedades especificadas
as como la incertidumbre y rastreabilidad asociadas, con el uso de procedimientos vlidos. (Referencia:
VIM, JCGM 200:2008)

Es decir, es un material de referencia, al que se le ha asignado un contenido de analito especificado
en un certificado a travs de un mtodo trazable.

Material de Referencia (MR): Material suficientemente homogneas y estables con propiedades
especificadas, que se ha establecido es idneo para uso en la medicin o en el anlisis de las
propiedades nominales. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Nota: Material homogneo que tiene definidas sus propiedades, a travs de un mtodo validado
que puede usarse para fines analticas (calibracin de equipos, comprobacin de un mtodo, etc.).

Mensurando: Cantidad destinada a la medida. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Mtodo de ensayo validado: Mtodo de ensayo aceptado para el que se han llevado a cabo estudios
de validacin (desempeo) con el fin de determinar su precisin y fiabilidad para un propsito
especfico. (Referencia: ICCVAM Guidelines for the nomination and submission of new, revised and
alternative test methods, 2003).

Mtodo oficial: Es el mtodo especificado por los organismos reglamentarios de un pas, con fines de
aplicaciones de normas (ejemplo; reglamento sanitario de alimentos) o estipulados por organizaciones
comerciales (Referencia: FAO).

Mtodo normalizado: Mtodo apropiado para el ensayo dentro de su alcance, publicado por
organismos de normalizacin internacional, nacional o regional (ISO, EN, NM, ASTM, BS, DIN, IRAM,
etc.) o por organizaciones reconocidas en diferentes mbitos ( AOAC, FIL-IDF, EPA, USP etc.)

Mtodo cualitativo: Mtodo que permite determinar la presencia o ausencia de un analito en una
muestra o matriz.

Mtodo cuantitativo: Mtodo que permite determinar la concentracin de un analito presente en una
muestra o matriz.

Metrologa: Ciencia de la medicin y su aplicacin. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008), es decir, es la
ciencia de las mediciones o campo de los conocimientos relativos a las mediciones. Incluye cualquier
tipo de medicin del campo cientfico o tecnolgico.

Nivel: Es la concentracin de una sustancia de inters en una solucin estndar o matriz..
generalmente, se habla en trminos de nivel de concentracin.

Plan de Validacin: Documento tipo protocolo en el cual se definen las pruebas o parmetros de
validacin necesarios y el diseo experimental a desarrollar en base a los requerimientos del mtodo.

Requerimiento del mtodo: Corresponde a aquellas caractersticas del mtodos que son esenciales
para poder aplicarlo para el fin previsto. Cuando no estn establecidas por el cliente o usuario, debe
definirlas el responsable del ensayo de manera confiable y cientfica.
GUA TCNICA N 1 7
Resolucin: Parmetro cromatogrfico que permite determinar la capacidad de separacin entre 2
picos, de manera que se puedan diferenciar adecuadamente de la cromatografa los analitos de inters.

Resultado de un ensayo (X): El valor final notificado de una cantidad medida o calculada, tras aplicar un
procedimiento de medicin, incluidos todos los procedimientos secundarios y las evaluaciones.
(Referencia: Manual Codex Alimentarius 16 Ed.)

Sistema Internacional de Unidades (SI): Sistema de unidades, basado en el Internacional Sistema de
cantidades, sus nombres y smbolos, incluyendo una serie de prefijos y sus nombres y smbolos, as
como las normas para su uso, aprobada por la Conferencia General de Pesas y Medidas (CGPM).
(Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Sub-muestra: Porcin de una muestra para anlisis.

Testigo reactivo o blanco: Es la solucin que contiene todos los reactivos usados en los mismos
volmenes y concentraciones, que son utilizados en el procesamiento de la muestra. Este blanco debe
seguir todos los pasos indicados en la tcnica y ayuda a detectar trazas de contaminacin provenientes
del material o reactivos usados.

Trazabilidad metrolgica: Propiedad de un resultado de medicin, mediante el cual el resultado puede
estar relacionado con una referencia a travs de un cadena continua y documentada de calibraciones,
cada que contribuyen a la incertidumbre de medicin. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Propiedad del resultado de una medicin o del valor con su incertidumbre, que puede a travs de
una cadena ininterrumpida de comparacin relacionarse a una referencia establecida,
generalmente patrones de referencia nacionales o internacionales. (Referencia: IUPAC-
Nomenclature In Evaluation Of Analytical Methods Including Detection And Quantification
Capabilities).

Validacin: Verificacin de determinados parmetros de un mtodo en la que los requisitos
especificados para estos, demuestran que el mtodo es idneo para un uso previsto. (Referencia: VIM,
International Vocabulary for Basic and General Terms in Metrology: 2007)

Valor verdadero: El grado de concordancia entre la media de un nmero infinito de valores reiterados
de cantidad y un valor de cantidad de referencia.

Veracidad: El grado de concordancia entre la expectativa relativa al resultado de un ensayo o de una
medicin y el valor verdadero. (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18 Ed.)

Valor de Referencia: Valor cuantitativo que se utiliza como base para la comparacin con valores
cuantitativos del mismo tipo. (Referencia: VIM, International Vocabulary for Basic and General Terms in
Metrology: 2007)

Verificacin: Suministro de prueba(s) objetiva(s) de que un elemento dado satisface el (los) requisito(s)
especificado(s) . (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)

Es decir, es la comprobacin experimental de que un mtodo establecido funciona de acuerdo con
las especificaciones, en las condiciones disponibles en el laboratorio usuario. Se entiende como
verificacin a las pruebas realizadas por un laboratorio en la rutina de trabajo que permiten
comprobar y documentar la aplicabilidad y uso adecuado del mtodo por parte del laboratorio.
GUA TCNICA N 1 8
II: ESTADISTICA BASICA

Para los fines de una validacin, se utilizan normalmente ciertas mediciones estadsticas, que nos
ayudan a establecer si el mtodo se encuentra dentro de un parmetro aceptable, normalmente se
determinan las siguientes:

Media: Conocida tambin como media aritmtica o promedio, es la cantidad total de la variable
(muestra o medida) distribuida a partes iguales entre cada observacin. En trminos matemticos, es
igual a la suma de todos sus valores dividida entre el nmero de sumandos

X =
n
xi
n
Siendo:
x
i
= valor de una lectura.
n = nmero de lecturas

Desviacin estndar ( , S): Es el promedio de lejana de los valores obtenidos (lecturas) respecto del
promedio.

S =
n

i=1
(xi-X)
2

n-1
Siendo:
x
i
= valor de una lectura.
X= promedio de la totalidad de lecturas.
n = nmero de lecturas

Coeficiente de Variacin (CV): Desviacin estndar dividida por la media. Tambin es conocida como
desviacin estndar relativa (RSD). El coeficiente de variacin puede ser expresado en porcentaje:


%CV = S x100
X
Siendo:
S = desviacin estndar de las lecturas.
X = promedio de la totalidad de lecturas.

Varianza: Es una medida de dispersin definida como el cuadrado de la desviacin estndar.


S
2
=
n

i=1
(xi-X)
2

n-1
Siendo:
x
i
= valor de una lectura.
X= promedio de la totalidad de lecturas.
n = nmero de lecturas

GUA TCNICA N 1 9
Coeficiente de Variacin de Horwitz (CV
h
): Es el coeficiente de variacin definido por W. Horwitz, a
travs de la ecuacin obtenida de un estudio estadstico. En dicho estudio, Horwitz despus de reunir
una serie de datos (provenientes de 150 ensayos de interlaboratorios organizados por AOAC), observ
que el coeficiente de variacin de los valores medios dados por los diferentes laboratorios aumentaban
a medida que disminua la concentracin del analito. Comportndose como muestra la siguiente
grfica, conocida como la trompeta de Horwitz.


La ecuacin de Horwitz, esta definida como:

CV
h
= 2
(1-0.5.log c)

H
= 0.02 x c
0,8495

Dnde:
CV
h
= Coeficiente de variacin de Horwitz

H
= Desviacin estndar calculada conforme al modelo de precisin de Horwitz.
C= concentracin del analito expresado en potencia de 10 (Ver tabla N 1).

Este coeficiente de variacin (CV
h
) esta expresado en potencia de 2, y la concentracin media del
analito expresado como potencia de 10, de esta forma independiente del analito y el mtodo utilizado
se puede estimar el CV esperado para la precisin.

Tabla N 1:
Concentracin Razn
(Potencia de 10)
Unidad
100 1 100% (100 g/100 g)
> 10 10
-1
> 10 % (10 g/100 g)
> 1 10
-2
> 1 % (1 g/100g)
> 0,1 10
-3
> 0,1 % (1 mg/g 0,1 g/100 g)
0,01 10
-4
100 mg/kg
0,001 10
-5
10 mg/Kg
0,0001 10
-6
1 mg/Kg
0,00001 10
-7
100 g/Kg
0,000001 10
-8
10 g/Kg
0,0000001 10
-9
1 g/Kg
GUA TCNICA N 1 10
Distribucin Normal: Distribucin continua conocida tambin como distribucin Gaussiana, la
distribucin de una variable normal est completamente determinada por dos parmetros, su media y
su desviacin estndar, denotadas generalmente por y . La distribucin normal se caracteriza por
tener una nica moda, que coincide con su media y su mediana. Su expresin grafica es una curva
normal, cuya forma es similar a los histogramas con forma de campana, es conocida como campana de
gauss que es simtrica respecto a su media y asinttica al eje de abscisas, esto hace que cualquier valor
entre y es tericamente posible. El rea total bajo la curva es, por tanto, igual a 1. Para este
tipo de variables existe una probabilidad de un 50% de observar un dato mayor que la media, y un 50%
de observar un dato menor.

- 3 - 2 - + +2 +3

La probabilidad de que X
o
caiga en el intervalo comprendido entre + es aproximadamente 0,687
68,27%.
La probabilidad de que X
o
caiga en el intervalo comprendido entre + 2 es aproximadamente
0,9545 95,45%.
La probabilidad de que X
o
caiga en el intervalo comprendido entre + 3 es aproximadamente
0,9973 99,73%.

Nivel de significancia (Alfa, ): Es el nivel de significacin utilizado para calcular el nivel de confianza. El
nivel de confianza es igual a 100% (1 - ), es decir, un alfa () de 0,05 indica un nivel de confianza de
95%.

Factor de cobertura: Nmero mayor que uno por lo que una combinacin de incertidumbre en la
medicin estndar se multiplica a obtener una incertidumbre expandida de medida. Un factor de
cobertura suele ser simbolizada k. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)


GUA TCNICA N 1 11
Pruebas de Significancia
Es frecuente utilizar pruebas de significancia estadsticas durante el proceso de validacin de los mtodos
analticos en este sentido, se aplican comnmente las siguientes:

1. Prueba t- student para identificar errores sistemticos (sesgo).
2. Prueba F-Fisher para identificar errores aleatorios (precisiones).

Al hacer una prueba de significancia se comprueba la veracidad de una hiptesis experimental, llamada
hiptesis alternativa (H
1
, si hay diferencia,) con respecto a la hiptesis nula (H
0
, no hay diferencia).

Es la hiptesis alternativa la que determina el nmero de colas. Si la hiptesis alternativa contiene la
frase mayor que menor que, la prueba es de una-cola. Si la hiptesis alternativa contiene la frase
no es igual que, la prueba es de dos-colas. (Fuente: National Food Administration of Sweden)


1. La media es igual al valor dado (H
0:
= x
0
) versus la media no es igual al valor dado (H
1
: x
0
) dos-colas

2. La media es igual al valor dado (H
0:
= x
0
) versus la media es menor que el valor dado (H
1
: < x
0
) una-cola

3. La media es igual al valor dado (H
0:
= x
0
) versus la media es mayor que el valor dado (H
1
: > x
0
) una-cola

Una forma practica de decidir es respondiendo a dos preguntas:

t-Test
1. Son las medias iguales? Dos-colas
2. Son las medias diferentes (puede una media ser mayor o menor a la otra)? Una-cola

F-Test
1. Son las varianzas diferentes? Dos-colas
2. Es la varianza 1 mayor que la varianza 2? Una-cola

GUA TCNICA N 1 12
Prueba t-Student
Esta prueba permite comparar las medias de dos grupo de datos y determinar si entre estos parmetros
las diferencias son estadsticamente significativas.
En la prueba t , se procede a determinar el valor t de student calculado, obtenido de la experiencia
analtica, y este valor posteriormente se compara con el llamado valor crtico, este valor critico se obtiene
de la tabla de t-student para un determinado porcentaje de confiabilidad (normalmente se utiliza el 95%
de confianza, es decir, un valor de 0,05). Si no existen diferencias significativas entre 2 grupos, el t
calculado debera ser inferior al t critico (o conocido tambin como t de tabla).
El siguiente ejemplo, trata de explicar la afirmacin realizada anteriormente: Un atleta desea realizar un
salto con garrocha, para lo cual, l realiza un calculo de con que velocidad y con que fuerza (t calculado)
debe realizar la prueba de atletismo, a fin de saltar correctamente la altura establecida para la
competencia (t critico).

Si el t calculado es inferior al t crtico, entonces, no existir una diferencias significativa que permita
superar al t critico, y el atleta no podr realizar el salto.


GUA TCNICA N 1 13
Si el valor t calculado es superior al t crtico, entonces, existir una diferencia significativa que
permitir superar al t crtico, y el atleta podr realizar el salto.

Para explicar de mejor manera la prueba de t-Student, hemos incluido los siguientes ejemplos:
EJEMPLO 1: Prueba t-Student para 2 variables independientes
Se realiza el anlisis de una muestra de flor en agua bajo el mtodo de cromatografa inica en
Laboratorio 1 y por EIS en Laboratorio 2. Los resultados obtenidos en mg/L de F
-
, fueron:
Nivel Grupo/Experiencia
Observaciones 1 2
1 4,5 5,3
2 5,2 6,8
3 5,0 6,9
4 6,4 7,1
5 6,0 7,7
6 7,1 ---

Experiencia 1: n
1
=6 Media X
1
=5,70 Desviacin estndar S
1
= 0,9716 grados de libertad gl
1
= 5
Experiencia 2: n
2
=5 Media X
2
= 6,76 Desviacin estndar S
2
= 0,8877 grados de libertad gl
2
= 4

Se determina el valor t calculado (t
calc
):

t
calc
= X
1
- X
2
.


S
1
2
(n
1
-1) + S
2
2
(n
2
-1) . 1 + 1
n
1+
n
2
-2 n
1
n
2





GUA TCNICA N 1 14
t
calc
= 5,70 - 6,76 .

(0,9716)

2
(6-1) + (0,8877)

2
(5-1) . 1 + 1
6
+
5 - 2 6

5

t
calc
= -1,06 .

(0,93524) . (0,1667 + 0,2)

t
calc
= 1,06 = 3,09.
0,34292

Se desea determinar si son iguales las medias de la experiencia 1 y 2. Para esto se procede luego a
determinar el t critico en la tabla t-student para =0,05.
En la interseccin se lee: valor crtico para t, que es t
crit
= 2,262.

2 colas 80% 90% 95%
/2
v
0.10 0.05 0.025
1 3.078 6.314 12.706
2 1.886 2.920 4.303
3 1.638 2.353 3.182
4 1.533 2.132 2.776
5 1.476 2.015 2.571
6 1.440 1.943 2.447
7 1.415 1.895 2.365
8 1.397 1.860 2.306
9 1.383 1.833 2.262
10 1.372 1.812 2.228
Se procede a comparar el t crtico y el t calculado, t
calc
= 3,09.
Se observa. t
calc
> t
crit
.Concluimos que existen diferencias significativas. Por lo cual el resultado se
acepta.






GUA TCNICA N 1 15
EJEMPLO 2: Prueba t-student para 2 variables correlacionadas o pareadas
Se realiza el anlisis de una muestra de turbiedad en agua, el mtodo utilizado es el turbidimtrico, la
experiencia se realiza en 2 das diferentes:
Nivel Grupo/Experiencia
Observaciones A B
x


1 4 3 1
2 5 2 3
3 6 1 5
4 6 2 4
5 4 3 1

Experiencia : observaciones pareadas n=5
Media X

= 2,8
Desviacin estndar S = 1,789
grados de libertad gl= 4

Se determina el valor t calculado (t
calc
):

X
=
( x
A
x
B
) t
calc
= X
.

n (S/n)

Se calcula: X
=
1 +3 +5+ 4+1 = 2,8 y luego se determina el t calculado;
5
t
calc
= 2,8 .= = 3,48
1,789/ 5

Se desea demostrar si existen diferencias significativas entre la experiencia A y B. Entonces, se procede
luego a determinar el t critico en la tabla t-student para =0,05 para 2 colas.

En la interseccin se lee: valor crtico para t, que es t
crit
= 2,776.

2 colas 80% 90% 95%
/2
v
0.10 0.05 0.025
1 3.078 6.314 12.706
2 1.886 2.920 4.303
3 1.638 2.353 3.182
4 1.533 2.132 2.776
5 1.476 2.015 2.571
Se procede a comparar el t crtico y el t calculado, t
calc
= 3,48. Se observa que t
calc
> t
crit
. Concluimos que
existen diferencias significativas. Por lo cual no es aceptable.

GUA TCNICA N 1 16
EJEMPLO 3: Prueba t-student para comparacin de muestreal versus un valor de referencia
Se analiza de un material de referencia certificado de hierro en cereal, se realizan 4 replicas, el mtodo
utilizado es absorcin atmica llama, los resultados obtenidos en mg/Kg son:
Observaciones Valor obtenido
1 5,8
2 6,1
3 6,4
4 6,2

El valor asignado, informado en el certificado del MRC es; = 6,3 mg/Kg

Experiencia :

Observaciones pareadas n=4 Media X = 6,05
Desviacin estndar S = 0,387 grados de libertad ( o gl)= 3

Se determina el valor t calculado (t
calc
):

t
calc
= X -
.

(S/n)


t
calc
= 6,05 6,3 .= = 1,292
0,387/ 4

Se procede luego a determinar el t critico en la tabla t-student para =0,05.
En la interseccin se lee: valor crtico para t, que es t
crit
= 3,182.
2 colas 80% 90% 95%
/2
v
0.10 0.05 0.025
1 3.078 6.314 12.706
2 1.886 2.920 4.303
3 1.638 2.353 3.182
4 1.533 2.132 2.776
Se procede a comparar el t crtico y el t calculado, t
calc
= 1,292.
Se observa que: t
calc
< t
crit
. Concluimos que no existen diferencias significativas. Por lo cual el
resultado se acepta.

GUA TCNICA N 1 17
Prueba F (de Fisher)
Prueba en la que el estadstico utilizado sigue una distribucin F si la hiptesis nula no puede ser
rechazada. En estadstica aplicada se prueban muchas hiptesis mediante el test F, entre ellas: La
hiptesis nula=Ho de que las medias de mltiples poblaciones normalmente distribuidas y con la misma
desviacin estndar son iguales. Esta es, quizs, la ms conocida de las hiptesis verificada mediante el
test F y el problema ms simple del anlisis de varianza. Y la hiptesis de que las desviaciones estndar de
dos poblaciones normalmente distribuidas son iguales.
Para explicar de mejor manera la prueba de Fischer, hemos incluido el siguiente ejemplo:
Se realiza la medicin de sulfatos en una muestra de agua en dos das diferentes.
Nivel Grupo/Experiencia
Observaciones 1 2
1 C
1,1
C
2,1

2 C
1,2
C
2,2

3 C
1,3
C
2,3

4 C
1,4
C
2,4

5 C
1,5
C
2,5

6 C
1,6
C
2,6

7 C
1,7
C
2,7

8 C
1,8
C
2,8

9 C
1,9
C
2,9

10 C
1,10
C
2,10

11 --
C
2,11
12 --
C
2,12
13 --
C
2,13
14 --
C
2,14

Experiencia 1: n
1
=10 Media 1=14,9 Varianza 1= 26,4
Experiencia 2: n
2
=14 Media 2= 16,2 Varianza 2 = 12,7
Si se intenta un test de t-student con estos valores hay que verificar si las 2 varianzas no son
significativamente diferentes; por que si son diferentes, el test de t-student no podr ser utilizado. Que
se hace?
1) Determinar los grados de libertad de la experiencia 1: n-1 = 10-1=9

2) Determinar los grados de libertad de la experiencia 1: n-2 = 14-1=13




GUA TCNICA N 1 18
3) Dividir la varianza ms grande por la ms pequea:

F= Varianza mayor = Varianza 1 = 26,4 = 2.079
Varianza menor Varianza 2 12,7

4) Para saber si 2,079 indica que la varianza obtenida en la experiencia 2 es menor que la obtenida en la
experiencia 1, uno va a la Tabla F (Ver Anexo n 4) y coloca los grados de libertad (gl) del numerador (9)
en la fila horizontal, y del denominador (13) en la columna, para un valor de = 0,05, 1 cola:

gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424
240.54316
2 18,51 19,00 19,16
19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474
3 10,13 9,55 9,28
9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232
4 7,71 6,94 6,59
6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880
5 6,61 5,79 5,41
5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246
6 5,99 5,14 4,76
4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901
7 5,59 4,74 4,35
4.12031 3.97152 3.86598 3.78705 3.72572 3.67667
8 5,32 4,46 4,07
3.83785 3.68750 3.58058 3.50046 3.43810 3.38812
9 5,12 4,26 4,07
3.63309 3.48166 3.37376 3.29274 3.22959 3.17890
10 4,96 4,10 3,86
3.47805 3.32584 3.21718 3.13547 3.07166 3.02038
11 4,84 3,98 3,71
3.35669 3.20388 3.09461 3.01233 2.94798 2.89622
12 4,75 3,89 3,59
3.25916 3.10587 2.99612 2.91335
2.84857
2.79638
13 4,67 3,81 3,49
3.17912 3.02543 2.91527 2.83210 2.76691 2.71436
En la interseccin se lee: valor crtico para F, que es F
crit
= 2,71.
Se procede a comparar el F crtico y el F calculado, F
calc
= 2,079,
Se observa. F
crit
> F
calc
.
Concluimos que las dos varianzas no son significativamente diferentes. Por lo tanto, hacer el test de t
es una decisin legtima.














GUA TCNICA N 1 19
Anlisis de Varianza

El anlisis de varianza, tambin conocido como ANOVA, es el anlisis estadstico en el cual se compara
ms de dos medias entre s.

Para ese fin, se debe proceder a comparar las diferencias entre cada grupo y las observaciones
realizadas.

Ejemplo:

Experiencia n
n= Observaciones Mtodo A Mtodo B Mtodo C
1 8,5 9,9 7,4
2 9,2 10,0 8,0
3 7,8 11,1 8,6

N= nmero de observaciones totales = 3 x 3 = 9

Se procede a calcular la sumatoria de las observaciones de experiencia (o grupo):

Calculo Mtodo A Mtodo B Mtodo C

xi
25,5 31,0 24,0
xi = 25,5 + 31,0+24,0= 80,5
xi
2

217,73 321,22 192,72
xi
2
= 217,73 + 321,22 +192,72= 731,67

Suma total de los cuadrados es:

SC
T
= xi
2
( x)
2
= 731,67 (80,5)
2
= 11,642
N 9

Grados de libertad totales = gl
total
= N-1 =9-1 =8

Suma cuadrados entre grupos:

SC
B
= ( x
A
)
2
+ ( x
B
)
2
+ ( x
C
)
2
- ( x)
2
= (25,5)
2
+ (31,0)
2
+ (24,0)
2
(80,5)
2
= 9,0553
n
A
n
B
n
C
N 3 3 3 9

Grados de libertad entre grupos (ej.: mtodos) = gl
B
= n-1 = 3-1 = 2






GUA TCNICA N 1 20
Suma cuadrados residuales o dentro del grupo, es decir , dentro de los mtodos:

Se realiza por simple resta, es decir:

SC
w
= SC
T
- SDC
B
= 11,642 9,05553 = 2,58647

Grados de libertad dentro del grupo = gl
total
- gl
B
= 8- 2 = 6

Resumiendo obtuvimos:


Origen de la Varianza Grados de libertad (gl) Sumas cuadrticas (SC) Cuadrados medios (CM)
Entre grupos (B) 2 9,0553 4,5278
Dentro del grupo (W) 6 2,58647 0,4311
Total (T) 8 11,642 -----


Aplicando la prueba F, se obtiene:

F
calc
= ( SC
B
/gl
B
) = ( 9,05553/2) = 4,5278 = 10,5
(SC
w
/ gl
w
) ( 2,58647/6) 0,4311

Se determina el valor F crtico de Tabla F (Ver Anexo n 4) y coloca los grados de libertad (gl) del
numerador (2) en la fila horizontal, y del denominador (6) en la columna, para un valor de = 0,05, 1
cola:

gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 161.44622
199.49948
215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316
2 18,51 19,00 19,16
19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474
3 10,13 9,55 9,28
9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232
4 7,71 6,94 6,59
6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880
5 6,61 5,79 5,41
5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246
6 5,99 5,14 4,76
4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901
En la interseccin se lee: valor crtico para F, que es F
crit
= 5,14.
Se procede a comparar el F critico y el F calculado. F
calc
= 10,50
Se observa que F
calc
> F
crit
. Se concluye que hay diferencias significativas entre los 3 mtodos.

GUA TCNICA N 1 21
IV: VALIDACION

La validacin de un mtodo analtico es un paso fundamental para asegurar que los resultados
entregado por dicho mtodo son confiable. Cuando se realiza la validacin de un mtodo por parte del
laboratorio, lo que se busca es poder determinar con fundamento estadstico que el mtodo es
adecuado para los fines previstos.

En este sentido, es importante que para el proceso de validacin se asigne a un responsable de realizar
dicha tarea. De manera que, la validacin se efecte en forma metdica, ordenada, trazable y
confiable.

Es importante que el laboratorio tenga claridad antes de iniciar la validacin de cuales son los
requerimientos del mtodo para establecer el alcance de la validacin.

Es esencial, entonces conocer el mtodo a validar y su aplicabilidad, es decir, el analito, su
concentracin (nivel, LMP, LMR, etc.) y la matriz (o matrices) en las cuales se desea utilizar.

En general, se establece que el laboratorio DEBE validar:

1. Mtodos no normalizados: Corresponden a mtodos desarrollados por el laboratorio o mtodo
nuevos (ejemplo: publicado en revista cientfica), o bien, a mtodos que tradicionalmente se
han utilizado en el laboratorio pero que no estn normalizados.
2. Mtodo normalizado con una modificacin significativa.

Cuando se trata de un mtodo empleado tradicionalmente por el laboratorio que no este normalizado,
se puede realizar una Validacin Retrospectiva, es decir, en base a los datos experimentales que el
laboratorio dispone, para la cual se realizar la recopilacin de la mayor cantidad de datos histricos
disponibles, para luego realizar un proceso de ordenamiento y seleccin de los datos recopilados, estos
datos pueden ser: curvas de calibracin, resultados de ensayos, cartas de control, ensayos de aptitud,
etc. A travs de estos, se debern determinar los parmetros de validacin, y evaluar si los resultados
obtenidos para los fines de la son aceptable.

En caso de ser un mtodo nuevo (o uno antiguo del que no se dispongan de datos suficientes) se debe
realizar una Validacin Prospectiva, generando a travs de anlisis datos experimentales.

En algunos casos se puede realizar lo que se conoce como validacin menor o verificacin cuando se
trate de:

1. Mtodos normalizados.
2. Mtodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo: uso en otra matriz.
3. Ampliaciones y modificaciones menores de mtodos normalizados. Ejemplo: uso en otros
analitos.
4. Cuando se trate de mtodos previamente validados, que haya sufrido alguna alteracin
significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones pueden ser; cambio de
equipo, cambio de componentes de equipo como columnas, detectores, cambio analista,
cambio de la matriz que contiene la muestra o de nivel de concentracin del analito de
inters, entre otros.

GUA TCNICA N 1 22

La verificacin, tiene generalmente como objetivo, el comprobar que el laboratorio domina el mtodo
de ensayo normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un mtodo normalizado
modificado para la verificacin se requiere solo realizar aquellas pruebas que indiquen que la variacin
realizada no afecta el ensayo.

En ocasiones, lo que se busca a travs de una validacin es demostrar que un mtodo es equivalente a
otro.

El objetivo de la validacin y la verificacin, es demostrar que el mtodo utilizado por un laboratorio es
adecuado para la aplicacin en la que se propone utilizar, as, como tambin demostrar que las
modificaciones que pudieron haberse realizado no afectan su desempeo, ni la confiabilidad de los
resultados por este entregado.


GUA TCNICA N 1 23


Definicin del mtodo a Validar:
Cuali o Cuantitativo-Analito-matriz-Concentracin-Principio
Tipo de Mtodo
Normalizado Normalizado
Modificado
No Normalizado
Tradicional :
usado por el
Laboratorio hace
aos
Validacin Prospectiva
Validacin
Retrospectiva
Verificacin
Establecer Parmetros a Evaluar
Establecer Pruebas Experimentales
Establecer Criterios de Aceptabilidad
S No
Se trata de un mtodo normalizado?
Tiene una modificacin
significativa?
No
S
No Normalizado:
Nuevo o
Desarrollado por el
laboratorio
recientemente
Desarrollar Pruebas Experimentales
Evaluar resultados
INFORME DE VALIDACIN
REVISIN DE INFORME
Comparar resultados
versus criterios
GUA TCNICA N 1 24
En relacin a los parmetros de validacin o verificacin estos debern determinarse de acuerdo al tipo
de mtodo. Para este fin la siguiente tabla puede ser utilizada como gua:

Tabla N 2

METODO CUANTITATIVO
PARAMETRO
A EVALUAR

CARACTERISTICA(S)
METODO
CUALITATIVO
NORMALIZADO MODIFICADO NUEVO

SELECTIVIDAD
Identificacin analito
Interferencia de
matriz
S No S S
LINEALIDAD
Rango lineal

No S S S
SENSIBILIDAD
Pendiente

No S o No S S
LIMITES
Critico (LC)
Deteccin (LOD)
Cuantificacin (LOQ)
S
S o No

S S
PRECISION
Repetibilidad
Reproducibilidad
No S S S
VERACIDAD
Sesgo (s)
Recuperacin (R)
No S o No
S o No

S
ROBUSTEZ
Test de Youden y
Steiner
No No
S o No

S
APLICABILIDAD -------------
S

S S S

De acuerdo a los antecedentes anteriormente mencionados, el responsable de la validacin o
verificacin deber as elaborar el Plan de Validacin que se va a realizar.

a) ESTABLECER PLAN DE VALIDACIN

Se entiende como Plan de Validacin, a un documento (tipo protocolo) en el cual se definen
previamente a la experiencia; las pruebas o parmetros de validacin necesarios y el diseo
experimental a desarrollar en base a los requerimientos del mtodo.

El Plan de Validacin deber contener a lo menos:

Alcance de la validacin (mtodo, analito, matrices y requerimientos del mtodo

Diseo experimental:
Establecer la(s) muestra(s) a ser analizada(s): testigos reactivos, blanco matriz, material
certificados, material control, material(es) de referencia certificado, matrices de las muestras,
muestras sin fortificar, muestras fortificadas, etc.
El (los) parmetro(s) y pruebas a desarrollar, en caso, de que la prueba no sea una
convencional, sino diseada por el responsable, tambin deber indicarse en el documento.
Nmero de anlisis requeridos para cada prueba y/o parmetro.
Criterios de aceptabilidad para cada parmetro de validacin.
Analista(s) responsable de realizar la(s) prueba(s) analtica(s).

GUA TCNICA N 1 25
Materiales, insumos y equipos necesarios para desarrollar la validacin.

Responsable de la Validacin, fecha o tiempo programado para realizar la validacin y fecha de
elaboracin del plan.

Cualquier modificacin realizada al plan de validacin, durante el proceso, debe quedar debidamente
documentada.

En anexo N 1, Se muestra un formato de plan de validacin. En el anexo N 6, se incluye un ejemplo de
esquema de trabajo de cmo se desarrolla un plan de validacin para un mtodo normalizado.

b) DESARROLLO DE PRUEBAS DE PARMETROS DE VALIDACIN

Para el desarrollo de las pruebas de validacin, los analistas a cargo debern conocer el procedimiento
de mtodo de ensayo y el nmero de ensayos o mediciones a realizar de acuerdo a lo establecido en el
plan de validacin.

(IMPORTANTE: El personal responsable de realizar los anlisis se encuentre debidamente calificado, y
los equipos asociados al mtodo deberan encontrarse calibrados o controlados antes de su uso.)

Los resultados obtenidos en cada prueba deben ser debidamente registrados y almacenados.

Los ensayos o mediciones realizadas sern con el fin de poder realizar las siguientes pruebas de
parmetros de validacin:

Selectividad
Linealidad
Sensibilidad
Limites
Exactitud
Precisin
Robustez
Aplicabilidad

El analista o responsable de la validacin deber con los resultados obtenidos de cada prueba realizar
los clculos matemticos, comparativos y/o estadsticos correspondientes a cada ensayo para lo cual
podr utilizar para ese fin un software estadstico, calculadora o una planilla de clculo (ejemplo: Excel).

C) EVALUAR RESULTADOS DE LA VALIDACIN

Se deber evaluar para cada parmetro de validacin, si los resultados de las pruebas son
satisfactorios, es decir, si cumplen con los criterios de aceptabilidad establecidos en el plan, se
considera que el mtodo es aceptable.






GUA TCNICA N 1 26
D) INFORME DE VALIDACIN

El responsable de la validacin, deber realizar un informe en el cual presentar los resultados
obtenidos y conclusiones. El informe debe contener la declaracin de la aplicabilidad del mtodo.

En el anexo N 2, se entrega un modelo tipo de informe de validacin.

El laboratorio debe tener disponible el procedimiento usado para la validacin, y una declaracin
acerca de que el mtodo se ajusta para el uso propuesto.

Este informe deber ser revisado por una tercera persona que tenga conocimiento en el rea, y que no
haya formado parte del proceso de validacin. En dicha revisin se deber establecer si los criterios de
aceptabilidad establecidos en el plan son aceptables, y si el mtodo es idneo para el fin previsto.


































GUA TCNICA N 1 27
SELECTIVIDAD

La selectividad es el grado en que un mtodo puede cuantificar o cualificar al analito en presencia de
interferentes. Estos interferentes normal o frecuentemente se encuentran en la matriz de inters.

La prueba de selectividad puede disearse de acuerdo al mtodo, en el caso de cromatografa la
resolucin entrega informacin sobre la selectividad del mtodo, en el caso de espectrofotometra el
espectro de absorcin o un espectro de masas entrega informacin al respecto, en especial cuando es
comparado en presencia de una interferencia.

Una prueba de Selectividad comnmente utilizada, consiste en analizar un mnimo de tres testigo
reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estndares de concentracin conocida del analito de
inters.

Se deben comparar las lecturas (seales de medicin) obtenidas para cada caso, y observar si existen
variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estndares o muestras con analito. Si se
encuentran diferencias significativas debern ser identificadas y en lo posible eliminadas.





















GUA TCNICA N 1 28
LINEALIDAD


La linealidad es la capacidad de un mtodo de anlisis, dentro de un determinado intervalo, de dar una
respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad del analito que se habr
de determinar en la muestra de laboratorio.

Con el fin de determinar el rango lineal se puede realizar mediante un grfico de concentracin versus
respuesta, que se conoce como Funcin Respuesta (normalmente llamada recta de calibrado). sta se
establece cada da con una cierta cantidad de valores formados por un blanco y los patrones de
trabajos limpios de valor terico conocido, que cubran el intervalo de trabajo. En este sentido se
recomienda abarcar valores desde cercano al cero y valores superiores al LMP o al valor de inters. El
nmero de puntos a analizar deber ser establecido por el analista (en general, se utiliza un mnimo de
4 valores).

Luego de realizar el grafico se puede observar el comportamiento de la curva y establecer
cualitativamente el rango lineal (fig.1). Despus de establecer el comportamiento lineal del mtodo se
deber realizar la Curva de trabajo o curva de calibracin (fig.2). Graficar los datos de concentracin de
los estndares de calibracin estimados (X) v/s la lectura observada (Y).




Fig. 1 Fig.2


Evaluar los estimadores de regresin lineal del grfico: la pendiente (m), el coeficiente de correlacin (r
) y el punto de corte (intercepto) con el eje de las Y (L
0
).


Y= X x m + L
o




GUA TCNICA N 1 29

En general el criterio de aceptacin cualitativo que se usa para determinar la linealidad es el coeficiente
de correlacin:

El coeficiente de correlacin indica el grado de relacin entre la variable concentracin (X) y la variable
respuesta (Y) de la curva de calibracin. Los valores mximos que puede alcanzar son 1 y 1. El valor
mximo de 1 indica una correlacin positiva perfecta (entre X e Y) con una pendiente positiva. Cuando
r=0, no existe correlacin alguna, independencia total de los valores X e Y

En la prctica si r tiene un valor cercano a uno (1), esto significa que existe correlacin con una
probabilidad elevada. Para una curva de calibracin o trabajo, es recomendable que el coeficiente de
correlacin obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el caso de trazas se admite un valor igual
o mayor que 0.99.

r = _S
x y

S
x
S
y


S
x y
=
i = 1

n
x
i
y
i
- ( x
p r o m
y
prom
)
n

S
x
=

( ( x
i
2
/ n) - ( x
p r o m
2
) )

S
y
=

( ( y
i
2
/ n) - ( y
p r o m
2
) )


Coeficiente de correlacin ( o r): r > 0.99

Coeficiente de correlacin al cuadrado r
2
> 0.99.

Se puede realizar una evaluacin de curva de calibracin global (construida con ms de una curva de
calibracin de las mismas caractersticas) en la cual se puede realizar una evaluacin estadstica de
prueba t-Student, como un mejor indicador del modelo lineal.

Se calcula un valor de t con n-2 grados de libertad y se compara con el valor tabulado de t para el nivel
de confianza requerido ( = 0.05), dos-colas, en este caso para un n que depende de los niveles de
calibracin.

Se desea probar si existe entonces una correlacin significativa: La hiptesis nula H
0
es que no existe
correlacin entre X e Y. Si el valor observado de t
r
es mayor que t
cri
, se rechaza la hiptesis nula H
0
,
siendo la correlacin lineal significativa con la probabilidad calculada.

t
r
= | r | (n-2)
(1- r
2
)
Donde:
t
r
= Valor del estimador t Student obtenido para

el coeficiente de correlacin
| r | = Valor absoluto del coeficiente de correlacin
n 2 = Nmero de grados de libertad
r
2
= Valor del coeficiente de determinacin
GUA TCNICA N 1 30
Ejemplo:


Nivel Conc
mg/L
rea
1
rea
2
rea
3
A
Promedio
Desviacin
Estndar
S
CV %

Varianza

1
13,4 43,8 44,2 44,1 44,0 0,2 0,4 0,0
2
26,6 86,2 86,1 87,6 86,7 0,8 1,0 0,7
3
40,8 131,2 132,7 133,6 132,5 1,2 0,9 1,4
4
54,7 181,7 180,7 178,6 180,3 1,6 0,9 2,5
5
68,6 221,6 224,2 221,8 222,5 1,4 0,6 2,0




n= N de niveles= 5
r= coeficiente de correlacin= 0,99985
r= coeficiente de determinacin= 0,9997

sustituyendo los valores:

t
r
= | r | (n-2) = I 0,99985 I*(5-2)= I 0,99985 I*3 = 99.985
(1- r
2
) (1-0,9997) 0,0003







GUA TCNICA N 1 31

El valor t critico obtenido de la tabla para: 3 grados de libertad, un = 0.05 y 2 colas es:

2 colas 80% 90% 95%
/2
v
0.10 0.05 0.025
1 3.078 6.314 12.706
2 1.886 2.920 4.303
3 1.638 2.353 3.182
4 1.533 2.132 2.776

t
crit
= 3,182
Se observa que el valor observado de t
r
(es decir el t calculado) es mayor que t
crit
(99,85 > 3,182),
por lo cual se rechaza la hiptesis nula H
o
, siendo la correlacin lineal significativa con la
probabilidad calculada.
En cuanto al rango de aplicabilidad, el Codex Alimentarius ha establecido que respecto al LMP el
Intervalo mnimo aplicable es:

Respecto de un LMP 0,1 ppm, [LMP - 3 S
R
, LMP + 3 S
R
].

Respecto de un LMP < 0,1 ppm, [LMP - 2 S
R
, LMP + 2 S
R
].

Siendo S
R
la desviacin estndar de la reproducibilidad.

Ejemplo:

El LMP para mercurio en sal es de 0,1 mg/Kg, por lo cual se aplicara la ecuacin de Horwitz para
determinar la S
R
prevista a este nivel que es igual a 10
-7


CVR (%) = 100 S
R
= 2 C
0,1505

c

Al despejar la ecuacin obtendramos lo siguiente:

S
R
= c 2 C
0,1505

100

c= Es el LMP en mg/Kg es decir; 0,1
C= Es cociente de concentracin es decir la concentracin expresada en potencia de 10.





GUA TCNICA N 1 32
Sustituyendo obtendramos:

S
R
= 0,1 2 (0,0000001)
0,1505
= 0,0233
100


Entonces:

Para un LMP 0,1 ppm se aplica el criterio: [LMP - 3 S
R
, LMP + 3 S
R
].

Es decir: LMP + 3 S
R
= 0,1 + (30,0233) = 0,1 + (0,07)
0,1 + 0,07 = 0,17 mg/Kg
0,1 0,07 = 0,03 mg/kg

Entonces el rango que se requera del mtodo para que fuera aceptable debera estar a lo menos entre
0,03 y 0,17 mg/Kg.

Para coeficientes de concentracin < 10-7, se aplica la teora de Thompson, esto es, CV
R
% = 22 %
por lo tanto, S
R
= 0,22 LMP

Ejemplo:

El Codex Alimentarius seala que para un LMP = 0,01 mg/kg , es decir, para una concentracin de 10
-8
,
es decir < 10
-7
:

El rango de aceptabilidad seria:

LMP + 2 S
R
= 0,01 2 S
R
= 0,01 2 (0,22 LMP) = 0,01 0,44 0,01 = 0,01 0,0044 mg/kg

El rango mnimo aplicable para un LM de 0,01 mg/kg es, por lo tanto, 0,006-0,014 mg/kg.

















GUA TCNICA N 1 33
SENSIBILIDAD

La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicacin de un sistema de medicin y el cambio
correspondiente en el valor de la cantidad objeto de la medicin.

En una regresin lineal la sensibilidad corresponde a la pendiente (m) de la recta de calibracin.

Se calcula como:

m = X
i
Y
i
- ( X
i
Y
i
/ n)
X
2

i
- ((X
i
)
2
/n)


El valor de sensibilidad obtenido [m] debe permitir una adecuada discriminacin de los valores de
concentracin en base a la lectura.

En figura N 3, se puede observar que mientras ms prxima al eje de las Y est la recta, significa que a
ligeros cambios en las concentraciones esperadas habr grandes variaciones en los resultados de las
lecturas observadas [m
2
] En el caso de [m
3
] grandes cambios en la concentracin no son significativos
para la lectura.


Fig. 3

Se dice, que un mtodo es sensible cuando una pequea variacin de concentracin determina una
gran variacin de respuesta. La sensibilidad permite observar la capacidad de respuesta instrumental
frente a una determinada cantidad de analito. En el tiempo, visualiza como se comporta el
instrumento.


GUA TCNICA N 1 34
LIMITES

Se debe tener en consideracin los siguientes parmetros: Valor critico, limite deteccin (LOD) y limite
de cuantificacin (LOQ).

Valor critico (LC): El valor de la concentracin o cantidad neta que en caso de superarse da lugar, para
una probabilidad de error dada , a la decisin de que la concentracin o cantidad del analito presente
en el material analizado es superior a la contenida en el material testigo (Referencia: Codex
Alimentarius).

Se recomienda para su clculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz o testigo reactivo.

LC = t (1-;) x S
o
S : t ( 0.05,) 1,645 LC = 1,645 x S
o


Donde:
t = t-Student
1-= probabilidad b
v= Grados de libertad
S
o
= Desviacin estndar de las lecturas del blanco matriz o testigo reactivo.

Un resultado inferior al LC que determine la decisin no detectado no deber interpretarse como
demostracin de que el analito est ausente. No se recomienda notificar tal resultado como cero o
como < LOD. Deber hacerse constar en todo los casos el valor estimado y su incertidumbre.

Lmite de deteccin (LOD): Concentracin o cantidad real del analito presente en el material objeto de
anlisis que llevar, con una probabilidad (1-), a la conclusin de que la concentracin o cantidad del
analito es mayor en el material analizado que en el material testigo (Referencia del Manual del Codex
Alimentarius ).

Se recomienda para su clculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo o
concentracin estimada cercana al blanco.

LOD = 2 t
(1-;)
x S
o
S : t ( 0.05,) 1,645 LOD = 3,29 x S
o


LOD = 3,29S
o
, cuando la incertidumbre del valor medio (esperado) del material testigo es insignificante,
= = 0,05 y el valor estimado tiene una distribucin normal con una varianza constante conocida.

Un criterio de aceptacin adecuado es LC < LOD < LMP. En general tambin se sugiere, para un LMP >
0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOD < 1/5 LMP.

Lmite de cuantificacin (LOQ): Una caracterstica del funcionamiento del mtodo que suele expresarse
como seal del valor (verdadero) de la medicin que producir estimaciones con una desviacin
estndar relativa (RSD) generalmente de 10 % (o 6 %). El LOQ se calcula mediante la siguiente frmula:

LOQ = 10 S
o


GUA TCNICA N 1 35
Se recomienda para su clculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo o
concentracin estimada cercana al blanco.

En este caso, el LOQ es exactamente 3,04 veces el lmite de deteccin, dada la normalidad y = =
0,05. En el LOQ es posible lograr una identificacin positiva con un nivel de confianza razonable.

Un criterio de aceptacin adecuado es LC < LOD<< LOQ <LMP. En general tambin se sugiere, para un
LMP > 0,1 ppm un LOQ < 1/5 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOQ < 2/5 LMP.

Ejemplo ejercicio de lmites:

Para el analito mercurio en marisco fresco el limite mximo permisible es 0,5 mg/Kg. Se realiza la
experiencia de medir 10 veces el blanco matriz:

Medicin
Resultado
mg/Kg
1 0,05
2 0,05
3 0,03
4 0,04
5 0,05
6 0,03
7 0,01
8 0,05
9 0,05
10 0,04

La desviacin estndar obtenida para los blancos: S
o
= 0,013

Por lo cual el LC seria: LC = 1,645 x 0,013 = 0,022 mg/Kg

Por lo cual el LOD seria: LOD = 3,29 x 0,013 = 0,044 mg/Kg

Se puede observar que se cumple que el LC es inferior al LOD, ya que 0,022 < 0,044.

El LMP establecido por el analito es de 0,5 ppm es decir es > 0,1 ppm, por lo cual el LOD debe ser <
1/10 del LMP, es decir, debe ser inferior o igual a una dcima parte de 0,5.


(0,5 mg/L/10) = 0,05 mg/Kg


0,044 mg/L es inferior a 0,05 mgKgL , por lo cual se estara aceptando el LOD calculado de acuerdo al
criterio de aceptacin establecido.


Si el LOQ seria: LOD = 10 x 0,013 = 0,13 mg/Kg
GUA TCNICA N 1 36



Para un LMP de 0,5 ppm un LOQ < 1/5 LMP , es decir , se debe determinar el (LMP/5) , que es : 0,5/5
de 0,1 mg/Kg.

Por lo cual no se estara cumpliendo el criterio pues 0,13mg/Kg es mayor 0,1 mg/Kg. El LOQ no sera
aceptable para el campo de aplicabilidad que le quiere dar al mtodo.

En este sentido se pude tomar la decisin de buscar otro mtodo que cumpla con estos requisitos para
este fin previsto o aceptar su aplicabilidad, considerando en la declaracin de la aplicabilidad estas
reservas u observaciones en cuanto a su LOQ.

Es importante realizar posteriormente la experiencia analtica de la determinacin del analito en el
nivel de concentracin determinado para el LOD o LOQ, es decir evidenciar resultados experimentales,
que demuestren la validez del resultado obtenido.






























GUA TCNICA N 1 37
EXACTITUD

El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de concordancia entre el resultado
de un ensayo y el valor de referencia.

El trmino exactitud, esta aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone una
combinacin de componentes aleatorios y un componente comn de error sistemtico o sesgo.

Cuando se aplica a un mtodo de ensayo, el trmino exactitud se refiere a una combinacin de
veracidad y precisin. En el siguiente esquema de Tiro al Blanco, ampliamente utilizado para
ejemplificar esto, los punto u orificios equivaldran a los resultados analticos y el circulo rojo al centro
el rango en el cual se espera este el valor de referencia (o verdadero).




Como se puede observar entre ms veraz y preciso sea un resultado analtico, es ms exacto.


GUA TCNICA N 1 38
VERACIDAD: Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una serie
de resultados y un valor de referencia aceptado.

La veracidad puede ser determinada por sesgo o recuperacin.

a) Sesgo (s): La diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una
medicin y el valor verdadero. En la prctica el valor convencional de cantidad puede sustituir el valor
verdadero. El sesgo es el error sistemtico total en contraposicin al error aleatorio.

Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material fortificado, material control,
material ensayo de aptitud: Para este fin, se debe medir un analito de concentracin conocido y se
determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido. Una
diferencia sistemtica importante en relacin al valor de referencia aceptado se refleja en un mayor
valor del sesgo, cuanto ms pequeo es el sesgo, mayor veracidad indica el mtodo.


s= X -X
a



Donde:
s= sesgo
X = lectura obtenida o valor promedio de las lecturas obtenidas.
X
a
= valor asignado, valor certificado del material de referencia o valor esperado.

Para evaluar el sesgo, se debe realizar la prueba t, en la cual el t
obs
< t
crit
:


t
calc
= [ X
a
X]
S x n


Donde :
t
calc
= t observado o calculado
X
a
= Valor esperado o valor certificado en concentracin
X= Promedio de valores ledos u observados en concentracin
S= Desviacin estndar
n= Nmero de lecturas o valores observados.

Buscar t- Student terico en tabla ( Anexo II) para grados de libertad (v) y el porcentaje de seguridad
deseado ( 1-) para un error . Usualmente se trabaja con un valor de 0,05.








GUA TCNICA N 1 39
Ejemplo ejercicio de sesgo:

Para un valor asignado de un material de referencia certificado de 20,1 mg/L de N-NO2, los
valores obtenidos son:

Lectura

Resultado
mg/L
(X-Xa)
Sesgo
s
1 20,4 20,4-20,1 0,3
2 20,8 20,8-20,1 0,7
3 20,6 20,6-20,1 0,5
4 20,0 20,0-20,1 -0,1
5 20,4 20,4-20,1 0,3
6 20,6 20,6-20,1 0,5
7 20,5 20,5-20,1 0,4
8 19,9 19,9-20,1 -0,2
9 20,3 20,3-20,1 0,2
10 20,3 20,3-20,1 0,2

Desviacin estndar S = 0,27 Promedio de las lecturas X= 20,38
Valor asignado a la muestra Xa= 20,1 Nmero de lecturas n= 10 n = 10 = 3,162

t
calc
= [ X
a
X] = [20,1-20,38] = 0,32
0,27 x 10

Se desea establecer si existe una diferencia significativa entre el valor obtenido de la experiencia
analtica y el valor de referencia. Entonces, para determinar el t terico o critico para grados de libertad
de n-1 ( es decir de 10-1=9) , un valor =0,05 y 2 colas, se extrae de tabla el t critico que es de 2,262,
cumplindose que t
calc
< t
crit ,
ya que 0,32 < 2,262. Es decir; no hay diferencias significativas.

2 colas 80% 90% 95%
/2
v
0.10 0.05 0.025
1 3.078 6.314 12.706
2 1.886 2.920 4.303
3 1.638 2.353 3.182
4 1.533 2.132 2.776
5 1.476 2.015 2.571
6 1.440 1.943 2.447
7 1.415 1.895 2.365
8 1.397 1.860 2.306
9 1.383 1.833 2.262
10 1.372 1.812 2.228

A travs del ejercicio se puede observar que para la medicin de Nitritos en agua el sesgo obtenido
para el mtodo utilizado es aceptable, y por lo tanto su veracidad es aceptable.


GUA TCNICA N 1 40
b) Recuperacin (R): Es la fraccin de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del
anlisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar.

La recuperacin permite ver el rendimiento de un mtodo analtico en cuanto al proceso de extraccin
y la cantidad del analito existente en la muestra original. Por lo cual, la recuperacin esta
intrnsecamente relacionada a las caractersticas de la matriz de la muestra.

Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno en lo posible en tres niveles. Se debe
considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de calibracin del mtodo, el LOD y el LMP
establecido. De manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor informacin posible
respecto a la capacidad de recuperacin del mtodo, en cuanto a estos valores criticos.

Se calcula de la siguiente manera:


R = C
e
C
o

C
a



Siendo:
R= Recuperacin
C
e
= es la concentracin de analito de la muestra enriquecida.
C
0
= es la concentracin de analito medida en la muestra sin adicionar.
C
a
= es la concentracin de analito adicionado a la muestra enriquecida.

Se puede igualmente expresar en porcentaje de recuperacin (%R): se calcula de la siguiente manera:


%R = [ R ] x 100


En caso de evaluar la recuperacin, se deber realizar prueba t , en la cual el t
calc
<t
crit
:


t
calc
= [ 100 %R]
S x n

Donde :
t
calc
= t observado o calculado
R= Recuperacin
S= Desviacin estndar de las lecturas del porcentaje de recuperacin
n= N de lecturas o valores observados

Buscar t-Student terico en tabla ( Anexo II) para grados de libertad (v) y el porcentaje de seguridad
deseado ( 1-) para un error de 0,05, es decir con un 95% de confianza.

Si el t
calc
> t
crit
(hay diferencia estadsticamente significativa), los resultados reportados debern ser
corregidos.
GUA TCNICA N 1 41

Si el t
calc
t
crit
(no hay diferencia estadsticamente significativa), no es necesario ninguna correccin.

El Criterio de aceptacin en base al valor obtenido para el porcentaje de recuperacin puede utilizarse
los criterios de AOAC. En caso de utilizar criterio de AOAC ( Ver Anexo III), se debe buscar en tabla de
acuerdo a la concentracin esperada del analito y si el % R obtenido de la experiencia analtica, se
encuentra dentro del rango de %R tericos esperados.

En caso que se cuente con un MRC utilizar el rango de aceptabilidad sealado en el certificado como
criterio de aceptabilidad. Es decir, el valor determinado analticamente deber encontrase dentro del
rango de tolerancia establecido a travs de certificado, es decir, del limite superior (LS) o limite inferior
(LI).

Cabe sealar que el Codex Alimentarius seala que existen directrices relativas a los intervalos previstos
de recuperacin en reas especficas de anlisis, como por ejemplo: Residuos de plaguicidas (RP) o
residuos de medicamentos veterinarios (RMV). En casos en los que se haya demostrado que la
recuperacin es una funcin de la matriz, podrn aplicarse otros requisitos especificados.

Ejemplo de Ejercicio de Recuperacin:

Se utilizo fortific una muestra de carne de marisco a una concentracin 15 mg/100g de Cadmio y se
analizo por fotometra de absorcin atmica.

Lectura C
o
C
a
C
e
R %R
1 0,1 15,0 15,0
0,993
99,3
2 0,0 15,0 14,0
0,933
93,3
3 0,1 15,0 13,0 0,860 86,0
4 0,1 15,0 16,0
1,060
106,0
5 0,0 15,0 14,0
0,933
93,3
6 0,2 15,0 13,0
0,853
85,3

El promedio obtenido del porcentaje de recuperacin es de : %R = 93,9

i) De acuerdo a tabla de AOAC al nivel de 10 ppm el valor aceptable es de 80 a 110 %R por lo cual el
valor obtenido en la experiencia seria aceptable para el nivel medido en la matriz analizada.

ii) En caso de utilizar como criterio de aceptabilidad la prueba t, entonces, la determinacin del valor
de t calculado, sera:


Desviacin estndar del % R, S
%R
= 7,90

Mediciones, n=6
t
calc
= [ 100 93,9] =0,315
7,90 x6



GUA TCNICA N 1 42


Se desea determinar si existe diferencia significativa entre el valor de % recuperacin determinado y el
10% de Recuperacin. Para determinar el t critico para grados de libertad de = n-1 ( es decir de 6-
1=5), 2 colas y un valor =0,05 , se extrae de tabla t-student:

2 colas 80% 90% 95%
/2
v
0.10 0.05 0.025
1 3.078 6.314 12.706
2 1.886 2.920 4.303
3 1.638 2.353 3.182
4 1.533 2.132 2.776
5 1.476 2.015 2.571
6 1.440 1.943 2.447

El t terico o critico es de 2,015, cumplindose que t
calc
< t
crit ,
ya que 0,315 < 2,571. Es decir no existen
diferencias significativas.

PRECISION: La precisin podr establecerse en trminos de repetibilidad y reproducibilidad. El
grado de precisin se expresa habitualmente en trminos de imprecisin y se calcula como
desviacin estndar de los resultados (Referencia: Manual Codex Alimentarius 18 Ed.).

a) Repetibilidad: Es la precisin bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones donde
los resultados de anlisis independientes se obtienen con el mismo mtodo en tems de anlisis
idnticos en el mismo laboratorio por el mismo operador utilizando el mismo equipamiento
dentro de intervalos cortos de tiempo.

Se puede determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas condiciones (mismo
operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de tiempo) de un analito en un
Material de Referencia. Calcular la Desviacin Estndar (S
r
) y el porcentaje de coeficiente de
variacin (CV
r
%).

b) Reproducibilidad: Es la precisin bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones
donde los resultados de los anlisis se obtienen con el mismo mtodo en tem idnticos de
anlisis en condiciones diferentes ya sea de laboratorio, diferentes operadores, usando distintos
equipos, entre otros.

Para determinar la precisin de la reproducibilidad intralaboratorio (Ri) ( es decir, la precisin
dentro de un laboratorio), se sugiere realizar 3 mediciones de un Material de Referencia (MRC o
material control) una vez por cada semana o el comportamiento de la curva de calibracin en 3
das distintos.

Tambin, se puede determinar registrando a lo menos 10 mediciones en das distintos, o en un
mismo da cambiando a lo menos una condicin analtica (ejemplo: operador, aparato, reactivos
y largo intervalo de tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la desviacin
estndar (S
Ri
)y el porcentaje de coeficiente de variacin (CV
Ri
%).

GUA TCNICA N 1 43

Cuando se desea determinar la reproducibilidad interlaboratorios para fines de validacin de un
mtodo, deben participar diferentes laboratorios, se debe tener en consideracin que estos
utilicen el mismo mtodo y misma muestra, en un intervalo de tiempo preferentemente
establecido, se determina de este modo la desviacin estndar de los resultados obtenidos por
los diferentes laboratorios (S
R
).

El criterio de aceptabilidad para la precisin se puede hacer en base a coeficiente de variacin de
Horwitz :

CV
h
% = 2
(1-0.5)log C
tambin se expresa como; CV
h
%= 0,02 x c
0.8495


Donde:
C= valor nominal del analito expresado en potencia de 10, ejemplo 1ppm = 1mg/L =10
-6


En este sentido se establece para la repetibilidad, el CVr% obtenido debe ser < (CV
h
%/2).

En el caso de la reproducibilidad interlaboratorio el CV
R
% <CV
h
%, para la reproducibilidad interna
(intralaboratorio) CV
Ri
% < (2CV
h
%/3).

El Codex menciona que para coeficientes de concentracin < 10
-7
, se aplica la teora de Horwitz-
Thompson, esto es, CV
T
= 22%.

En cuanto a la repetibilidad podramos sealar el siguiente ejemplo:

Se realiz la medicin simultnea (mismo da) de 10 sub-muestras para el analito
(organofosforados) de un material de referencia de tomate de 1,2 mg/Kg, obtenindose los
siguientes resultados:

Lectura
C obtenida
mg/kg
1 1,08
2 1,07
3 0,84
4 0,83
5 0,94
6 0,87
7 1,02
8 1,06
9 0,95
10 0,88

Promedio obtenido X= 0,95 mg/Kg

La desviacin estndar obtenida es de Sr = 0,099 mg/Kg

El coeficiente de variacin porcentual obtenido es CV% =10,41%

GUA TCNICA N 1 44
Si el valor asignado es de 1 mg/Kg , para el calculo de Coeficiente de variacin porcentual de horwitz ,
el valor nominal del analito es equivalente a 0,00000120, es decir a 1,2 x 10-6. y el CV%
hr
para
repetibilidad es la mitad del valor calculado del CV%
h
.

CV
h
% = 2
(1-0.5)log 0,0000012
= 7,78%
2

De acuerdo a Horwitz el CV% para repetibilidad es de 7,78%. Por lo cual se cumple el criterio de
aceptabilidad establecido.

En caso que se desee se puede realizar el estudio de reproducibilidad y repetibilidad, a travs de un
anlisis de varianza (ver anexo N III). El estudio ANOVA (de factores totalmente anidados y
homogneos) consiste en el anlisis simple de varianza de las desviaciones estndar para cada uno de
los niveles de ensayo, para su determinacin se podr utilizar si se dispone de un software estadstico o
una planilla Excel.

Ejemplo de estudio de reproducibilidad:

Se realiz el anlisis de varianza a 10 muestras de sulfatos en aguas 1 mg/L en un total de 10
experiencias.

Lectura Fecha C obtenida mg/L
1 da 1 1,08
2 da 1 1,07
3 da 2 1,00
4 da 3 1,10
5 da 4 0,99
6 da 5 1,00
7 da 6 1,02
8 da 8 1,05
9 da 8 1,06
10 da 8 1,09

Promedio obtenido X= 0,95 mg/Kg

La desviacin estndar obtenida es de S
Ri
= 0,041 mg/Kg

El coeficiente de variacin porcentual obtenido es CV
Ri
% =3,88%

El coeficiente de variacin porcentual de Horwitz es:

CV
hRi
% = 2 x 2
(1-0.5)log 0,0000010
= 10,67%
3
De acuerdo a Horwitz el CV% para reproducibilidad es de 10,67%. Por lo cual se cumple el criterio de
aceptabilidad establecido, ya que . CV
Ri
% < CV
hRi
%
GUA TCNICA N 1 45
ROBUSTEZ

La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analtico de no ser afectado por
variaciones pequeas pero deliberadas de los parmetros del mtodo; proporciona una indicacin de la
fiabilidad del procedimiento en un uso normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es
optimizar el mtodo analtico desarrollado o implementado por el laboratorio, y describir bajo que
condiciones analticas ( incluidas sus tolerancias), se pueden obtener a travs de este resultados
confiables.

Un mtodo de ensayo es ms robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una
modificacin de las condiciones analticas.

Entre las condiciones analticas que podran afectar a un mtodo se encuentran:
Analistas
Equipos
Reactivos
pH
temperatura.
Tiempo de reaccin.
Estabilidad de la muestra.
Otros.

Para esta determinacin se aplica el Test de Youden y Steiner para la evaluacin de la robustez de un
mtodo qumico analtico. Este procedimiento permite evaluar el efecto de siete variables con slo
ocho anlisis de una muestra.

Para proceder a realizar el estudio de robustez se deben identificar aquellos factores del mtodo que
posiblemente afectaran los resultados finales obtenidos a travs de este.

Estas factores estn presentes habitualmente en el mtodo (ejemplo: temperatura, composicin de
fase mvil o soluciones reactivas, pH de solucin, tamao de celda espectrofotomtrica, flujo gas
carrier, split, etc.). Para estudiar la robustez se procede a exponer a cada factor a un estudio de
variable, es decir se expone a una variacin respecto de la establecida en el mtodo, es decir, cada
variable se estudia mediante un valor alto (A, B,...,G) y otro bajo (a,b,...,g). Una vez establecidos estos
valores se disean ocho pruebas de ensayo como, por ejemplo, muestra la tabla N 3.
Los factores a estudiar no deben ser necesariamente siete; puede considerarse un nmero menor de
variables. Esto no afectar el balance del diseo del experimento, pero es importante considerar que
siempre se den llevar a cabo los ocho pruebas de ensayo indicado.
Los resultados de la experiencia analtica obtenidos con las variaciones realizadas en estas 8 pruebas se
representan con las letras s hasta la z.





GUA TCNICA N 1 46
A partir de los resultados puede calcularse el efecto de cada una de las variables haciendo la media de
los cuatro anlisis que contienen la variable en su valor ms alto (mayscula) y aquellas que
corresponden al valor ms bajo (minscula). As, para evaluar el efecto de la primera variable obsrvese
que:

(s + t +u +v) = 4A = A y (w + x + y +z) = 4a = a
4 4 4 4


Es decir, la media de los resultados (s + t + u + v) equivalen a A porque las seis restantes variables
presentes en estos cuatro resultados se anulan entre s como consecuencia de que existen siempre dos
maysculas y dos minsculas de cada variable. Anlogamente, la media de los resultados (w + x + y + z)
equivalen a a.

Para cualquier otra variable se puede proceder de manera similar, tal como muestra la tabla siguiente:

Tabla N 3: Prueba de Robustez de Younden y Steiner

Se deben establecer las siete comparaciones posibles, es decir las diferencias entre la variable de mayor
valor versus la de menor valor:

(A a), (B b), (C c), (D d), (E e), (F f) y (G g)

De este modo se puede conocer el efecto de cada variable. En este sentido, cuanto mayor sea la
diferencia de los resultados entre el valor mayor y el valor menor ( = X-x), mayor influencia tendr
dicha variable en el mtodo analtico.

Como criterio de aceptacin para la robustez del mtodo se considera que la diferencia entre el valor
alto y el valor bajo sea superior a 2 de la desviacin estndar de la precisin del mtodo (S), es decir:

( X-x ) < 2 S.


ANALISIS Valor de la
condicin
variable
1 2 3 4 5 6 7 8
A,a A A A A a a a a
B,b B B B b B b b b
C,c C c C c C c C c
D.d D D d d d d D D
E,e E e E e e E e E
F,f F f f F F f f F
G,g G g g G g G G g
RESULTADOS s t u v w x y z
GUA TCNICA N 1 47
Una informacin adicional de este test de Youden es que la desviacin estndar de los resultados s a z
constituye una medida excelente de la imprecisin previsible del mtodo cuando se utiliza para el
anlisis de rutina, ya que este procedimiento introduce deliberadamente el tipo de variacin en las
variables que puede esperarse que ocurra durante el empleo normal del mtodo.
Ejemplo: Robustez para turbiedad.

CONDICIN VARIABLE ANALISIS
Tipo Clave
Valor
Alto X
Valor
Bajo x 1 2 3 4 5 6 7 8
Temperatura, C A,a 22 15 22 22 22 22 15 15 15 15
Cubeta, tipo B,b 1 2 1 1 2 2 1 1 2 2
Tiempo Agitacin, seg C,c 60 30 60 30 60 30 60 30 60 30
Tiempo Lectura, seg D,d 30 0 30 30 0 0 0 0 30 30
Siliconado E,e si no si no si no no si no si
Volumen, mL F,f 30 25 30 25 25 30 30 25 25 30
Estabilizacin equipo, h G,g 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0
s t u v w x y z
RESULTADOS (NTU)
20,1 20,7 22,0 21,3 22,3 22,2 20,6 21,1

Para las variables A y a :

Donde el promedio de A se calcula: 20,1 + 20,7 + 22,0 + 21,3 = 21,0
4

Donde el promedio de a se calcula: 22,3 + 22,2 + 20,6 + 21,1 = 21,6
4

Para las variables B y b :

Donde el promedio de B se calcula: 20,1 + 20,7 + 22,3 + 22,2 = 21,3
4

Donde el promedio de b se calcula: 22,0 + 21,3 + 20,6 + 21,1 = 21,3
4

Condicin Variable Resultados Diferencia Comparacin
Valor Alto X Valor Bajo x Promedio X Promedio x (X-x) < 2 DS
A a 21,0 21,6 0,525 No Sensible a Variable
B b 21,3 21,3 0,075 No Sensible a Variable
C c 21,3 21,3 0,075 No Sensible a Variable
D d 20,6 22,0 1,325 Sensible a Variable
E e 21,4 21,2 0,125 No Sensible a Variable
F f 21,2 21,4 0,175 No Sensible a Variable
G g 21,1 21,5 0,475 No Sensible a Variable

GUA TCNICA N 1 48
S: 0,813 2 S: 1,150

Por lo tanto las variables sensibles, no debern modificarse las variables que se establecieron como
sensibles en el estudio de robustez, y se deber mantener el valor nominal establecido en el mtodo,
para dicha condicin.












































GUA TCNICA N 1 49
APLICABILIDAD


Se utiliza el trmino de Aplicabilidad, cuando un mtodo de anlisis puede utilizarse satisfactoriamente
para los analitos, matrices y concentraciones previstas. La declaracin de aplicabilidad (o mbito de
aplicacin), adems de una declaracin del margen de funcionamiento satisfactorio para cada factor,
puede incluir tambin advertencias acerca de la interferencia conocida de otros analitos, o de la
inaplicabilidad a determinadas matrices y situaciones.

Es decir, la aplicabilidad consiste en una declaracin de las especificaciones del rendimiento del
mtodo, que se entrega en el informe de validacin y que normalmente incluye la siguiente
informacin:

La identidad de la sustancia analizada, incluyendo en su caso, de especiacin (por ejemplo, "el
arsnico total",metil-mercurio).

El intervalo de concentraciones cubierto por la validacin (por ejemplo, "0-50 ppm")

Una especificacin de la gama de las matrices del material de prueba cubierto por la validacin (por
ejemplo,"marisco", productos lcteos, etc.).

La aplicacin prevista y de sus requisitos de incertidumbre crticos. (ejemplo: anlisis de residuos de
plaguicidas en frutas ctricas de acuerdo al reglamento sanitario de alimentos).


En este sentido, la prueba de aplicabilidad, consiste en el mbito de aplicacin del mtodo declarado
por el responsable de la validacin, una vez concluida esta.

En aquellos casos que se trate de un mtodo normalizado u oficializado, esta declaracin se realiza de
acuerdo a los antecedentes bibliogrficos o normativos del mtodo.
















GUA TCNICA N 1 50
V: INCERTIDUMBRE

La incertidumbre de una medicin es el parmetro asociado al resultado, es decir, caracteriza la
dispersin de los valores que razonablemente pueden ser atribuidos al mesurando.

En este sentido, es importante que para un mtodo validado o verificado por el laboratorio, se realice
la determinacin de las diferentes fuentes o componentes de la incertidumbre de la medicin
presentes:

a) Muestreo
b) Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, etc.
c) Sesgos Instrumentales: Las debidas a las caractersticas de los equipos utilizados para realizar las
medidas tales como: deriva, resolucin, magnitudes de influencia. Ejemplo: temperatura
d) Pureza de Reactivos: materiales de referencia, preparacin de estndares.
e) Analista: Las debidas a la serie de mediciones: variaciones en observaciones repetidas bajo
condiciones aparentemente iguales. Ejemplo: paralelaje
f) Condiciones de medicin: Las debidas al certificado de calibracin: en l se establecen las
correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un valor de k determinado, en las condiciones
de calibracin. Ejemplo: material volumtrico, etc.
g) Condiciones de medicin: temperatura, humedad, etc.
h) Otras: Mtodo (por ejemplo al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo las constantes), pesada,
alcuota, efectos computacionales, etc.

Generalmente para el anlisis de las fuentes de incertidumbre se utiliza el diagrama de espina de
pescado u otro tipo de diseo esquemtico que permita con facilidad identificar las fuentes de
incertidumbre presentes durante el proceso analtico. Ejemplo:





GUA TCNICA N 1 51
La incertidumbre de la medicin comprende, en general, muchos componentes. Algunos de estos
pueden ser evaluados por tipo.

Para este fin el laboratorio deber realizar una evaluacin de las incertidumbres tipo A y B que
estn presentes en el mtodo:

Evaluacin de incertidumbre tipo A: Evaluacin de un componente por un anlisis estadstico de los
valores de mediciones obtenidos en condiciones de medicin definidas. Ejemplo: realizar varias
mediciones en condiciones de repetibilidad.

Evaluacin de incertidumbre tipo B: Evaluacin de un componente incertidumbre de la medicin
realizada por otros medios distinto a los del tipo A. Ejemplos: La evaluacin basada en la informacin,
obtenidos a partir de un certificado de calibracin, obtenidos a partir de los lmites deducirse a travs
de personal la experiencia, etc.

En general, la incertidumbre esta dada por los errores sistemticos y aleatorios presentes en el ensayo
analtico.



Fuente: National Food Administration of Sweden.








GUA TCNICA N 1 52
La determinacin de la incertidumbre incluye generalmente 4 pasos, el primero como se ha dicho
anteriormente corresponde a la determinacin de las fuentes, el segundo en expresar los
componentes en una incertidumbre estndar , el tercero combinar las diferentes incertidumbres y el
cuarto paso es la determinacin de la incertidumbre expandida es decir, multiplicar la incertidumbre
combinada por un factor de cobertura de k = 2, a fin de entregar un 95% de confianza, y as establecer
el intervalo entorno al resultado de la medicin en el cual se puede esperar que se incluya la mayor
fraccin de la distribucin de los valores que se pueden atribuir razonablemente al mesurando.

Los resultados obtenido se expresaran como por ejemplo: 178 g/L + 14 g/L , que corresponde a 178
g/L + ( 2x7 g/L), es decir, el resultado entregado, corresponde a un intervalo de a 2u que
representa un nivel de confianza del 95 % dentro del cual se encontrara el valor real.

En algunos casos pueden existir mayores exigencias en cuanto al valor del factor de cobertura utilizado
para obtener la incertidumbre expandida, pudindose solicitar o requerir un k = 3, a fin de entregar un
99,7 % de confianza, esto generalmente se puede solicitar frente a determinados contaminantes o
residuos.




La determinacin de la incertidumbre realizada por el laboratorio debe estar debidamente
documentada.

Para demostrar que un mtodo analtico es adecuado para el fin previsto, el laboratorio deber
demostrar a travs de una evidencia objetiva que el mtodo analtico ha sido adecuadamente validado
o verificado.

En este sentido, el laboratorio debe demostrar que las caractersticas de desempeo del mtodo
analtico utilizado, son adecuadas para el uso destinado:

GUA TCNICA N 1 53


Fuente: National Food Administration of Sweden.





















GUA TCNICA N 1 54
VI: ANEXOS

ANEXO N 1: FORMATO TIPO DE PLAN DE VALIDACION


PLAN DE VALIDACION

N:_____

1) Alcance de la validacin:

Mtodo:

Analito:

Matrices:

Requerimientos del mtodo:

Tipo: Validacin retrospectiva Validacin prospectiva Verificacin

Procedimiento de validacin:

2) Diseo experimental:

[Sealar Matrices de las muestras:, Testigos reactivos, Blanco matriz, Material de
referencia y/o Material de referencia certificado, Muestras fortificadas y niveles de
fortificacin.

Indicar las prueba(s) y parmetro(s) de validacin a evaluar, nmero de anlisis
requeridos segn prueba(s) y criterios de aceptabilidad para cada parmetro de
validacin

Sealar analista(s) responsable de realizar la(s) prueba(s) analtica(s) y Fecha(s)
programadas]

pgina x de y


:


GUA TCNICA N 1 55
3) Materiales, insumos y equipos necesarios para desarrollar la validacin:









Plan de validacin elaborado por Firma Fecha Elaboracin
Nombre:
Cargo:

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Comentarios, observaciones o modificaciones al plan:

Fecha Firma

























Pgina x de y







GUA TCNICA N 1 56
ANEXO N 2: FORMATO TIPO DE INFORME DE VALIDACION


INFORME DE VALIDACION DE MTODO DE ENSAYO


N Validacin:__________

IDENTIFICACIN DEL MTODO DE ENSAYO VALIDADO

Nombre completo del mtodo:


Tipo Mtodo: Cualitativo Cuantitativo
Normalizado Normalizado modificado No Normalizado Nuevo
Analito:
Unidades:
Matriz (o matrices):
Responsable Validacin:

Firma:
Fecha:
IDENTIFICACIN DE MATERIALES, INSUMO O EQUIPOS EMPLEADOS

Equipos involucrados: (Nombre, marca, modelo, nmero de identificacin, tipo de columnas, tipo de detectores, etc.)





Soluciones estndares y/o patrones involucrados: (Nombre, marca, modelo, nmero de identificacin,
concentraciones, etc.)



Material de Referencia: (Nombre, marca, cdigo de identificacin, valores asignadas, unidades, etc.)


Material de Referencia Certificado: (Nombre, marca, Cd. identificacin, N certificado, valores asignadas, unidades,
trazabilidad , etc.)


pgina x de y




GUA TCNICA N 1 57

PARMETROS DE VALIDACIN

Pruebas realizadas:
Selectividad
Linealidad Sensibilidad Lmites
Exactitud: Veracidad Precisin
Robustez
Otros:

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS EXPERIMENTALES REALIZADAS
Linealidad
Descripcin : (Breve descripcin de la experiencia analtica).




Tipo de calibracin:
Calibracin externa Calibracin en matriz

Calibracin externa estndar interno (SI) Calibracin en matriz estndar interno (SI)

Ecuacin recta: Intervalos de confianza :
IC
m
mx.: min.:
IC
Lo
mx.: min.:
Valor obtenido Criterio de Aceptabilidad
Rango Lineal:
Coeficiente de Correlacin ( ):
Comentarios:



Sensibilidad
Descripcin : (Breve descripcin de la experiencia analtica).




Valor obtenido Criterio de Aceptabilidad
pendiente, m :
Concentracin caracterstica:
Comentarios:



pgina x de y
GUA TCNICA N 1 58
Limites:
Descripcin
(Breve descripcin de la experiencia analtica).



Valor obtenido (unidades) Criterio de Aceptabilidad
Limite critico, LC:
Limite deteccin, LOD:
Limite de cuantificacin, LOQ:
Comentarios:

SELECTIVIDAD
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).



Valor obtenido (unidades) Criterio de Aceptabilidad
Longitud de onda (mx.)
Longitud de onda (em)/ (ex)
Masa monitoreada
Transicion(es) monitoreda (s)
% Falsos positivos
% Falsos negativos
Interferencia(s) Conocida(s): Correccin(es) a Interferencias:


Comentarios:

EXACTITUD

Precisin

Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).



Precisin en condiciones de Repetibilidad
Nivel/concentracin (unidades)
SD
r
% CV
r

Criterio de Aceptabilidad





Comentarios:

pgina x de y


GUA TCNICA N 1 59


Precisin en Condiciones de Reproducibilidad
Nivel/concentracin (unidades)
SD
Ri
% CV
Ri

Criterio de Aceptabilidad





Comentarios:



Valor obtenido (unidades) Criterio de Aceptabilidad
Precisin del mtodo %RSD
Horrat
Comentarios:


Veracidad
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).



Valor obtenido (unidades) Criterio de Aceptabilidad
Lectura obtenida, X

Sesgo, s:
t-Student, t:
Comentarios:


Reproducibilidad
Nivel/concentracin (unidades)
R % R t
obs

Criterio(s) de Aceptabilidad





Comentarios:





pgina x de y


GUA TCNICA N 1 60
ROBUSTEZ
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).



Variables
A,a B,b C,c D.d E,e F,f G,g


Resultados
s t u v w x y z S
sz



(X-x) Valor obtenido (unidades) Criterio de Aceptabilidad
A,a

B,b

C,c

D.d

E,e

F,f

G,g

APLICABILIDAD
(Declaracin del campo de aplicacin del mtodo: analito, rango de trabajo, unidades, matrices y advertencias acerca de la interferencia
conocida en las cuales se ha demostrado la validacin).


ANEXOS
(Anexar al presente informe los documentos necesarios para respaldar la informacin, los registros o reportes entregados por el equipo y copia
de la planillas de clculos generadas en el proceso analtico):



-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Revisado por:
Validacin:
Firma Fecha
Nombre:
Cargo:
Aceptada
Rechazada

OBSERVACIONES
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

pgina x de y


GUA TCNICA N 1 61
ANEXO N 3: TABLA DE LA DISTRIBUCIN t-Student

2 colas

80% 90% 95% 98% 99%
/2
v
0.10 0.05 0.025 0,01 0,0015

1 cola

90% 95% 97.5% 99% 99,5%

v
0.10 0.05 0.025 0,01 0,0015
1 3.078 6.314 12.706 31.821 63.657
2 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925
3 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841
4 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604
5 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032
6 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707
7 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499
8 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355
9 1.383 1.833 2.262 2.821 3.250
10 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169
11 1.363 1.796 2.201 2.718 3.106
12 1.356 1.782 2.179 2.681 3.055
13 1.350 1.771 2.160 2.650 3.012
14 1.345 1.761 2.145 2.624 2.977
15 1.341 1.753 2.131 2.602 2.947
16 1.337 1.746 2.120 2.583 2.921
17 1.333 1.740 2.110 2.567 2.898
18 1.330 1.734 2.101 2.552 2.878
19 1.328 1.729 2.093 2.539 2.861
20 1.325 1.725 2.086 2.528 2.845
21 1.323 1.721 2.080 2.518 2.831
22 1.321 1.717 2.074 2.508 2.819
23 1.319 1.714 2.069 2.500 2.807
24 1.318 1.711 2.064 2.492 2.797
25 1.316 1.708 2.060 2.485 2.787
26 1.315 1.706 2.056 2.479 2.779
27 1.314 1.703 2.052 2.473 2.771
28 1.313 1.701 2.048 2.467 2.763
29 1.311 1.699 2.045 2.462 2.756
30 1.310 1.697 2.042 2.457 2.750
40 1.303 1.684 2.021 2.423 2.704
60 1.296 1.671 2.000 2.390 2.660
120 1.289 1.658 1.980 2.358 2.617
1.282 1.645 1.960 2.326 2.576


GUA TCNICA N 1 62
ANEXO N 4: TABLA F
F DISTRIBUCIN (= 0,05)

Grados de libertad del numerador
F crtico
2 3 4 5 6 7 8 9 10 20
1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316 241.88193
2 18.51276 19.00003 19.16419 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474 19.39588
3 10.12796 9.55208 9.27662 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232 8.78549
4 7.70865 6.94428 6.59139 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880 5.96435
5 6.60788 5.78615 5.40945 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246 4.73506
6 5.98737 5.14325 4.75706 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901 4.05996
7 5.59146 4.73742 4.34683 4.12031 3.97152 3.86598 3.78705 3.72572 3.67667 3.63653
8 5.31764 4.45897 4.06618 3.83785 3.68750 3.58058 3.50046 3.43810 3.38812 3.34717
9 5.11736 4.25649 3.86254 3.63309 3.48166 3.37376 3.29274 3.22959 3.17890 3.13727
10 4.96459 4.10282 3.70827 3.47805 3.32584 3.21718 3.13547 3.07166 3.02038 2.97824
11 4.84434 3.98231 3.58743 3.35669 3.20388 3.09461 3.01233 2.94798 2.89622 2.85362
12 4.74722 3.88529 3.49030 3.25916 3.10587 2.99612 2.91335 2.84857 2.79638 2.75339
13 4.66719 3.80557 3.41053 3.17912 3.02543 2.91527 2.83210 2.76691 2.71436 2.67102
14 4.60011 3.73889 3.34389 3.11225 2.95825 2.84773 2.76420 2.69867 2.64579 2.60216
15 4.54307 3.68232 3.28738 3.05557 2.90130 2.79046 2.70663 2.64080 2.58763 2.54371
16 4.49400 3.63372 3.23887 3.00692 2.85241 2.74131 2.65720 2.59109 2.53767 2.49351
17 4.45132 3.59154 3.19677 2.96471 2.81000 2.69866 2.61430 2.54796 2.49429 2.44992
18 4.41386 3.55456 3.15991 2.92775 2.77285 2.66130 2.57672 2.51016 2.45628 2.41170
19 4.38075 3.52189 3.12735 2.89511 2.74006 2.62832 2.54354 2.47677 2.42270 2.37793
20 4.35125 3.49283 3.09839 2.86608 2.71089 2.59898 2.51401 2.44707 2.39282 2.34787
21 4.32479 3.46679 3.07247 2.84010 2.68478 2.57271 2.48758 2.42046 2.36605 2.32095
22 4.30094 3.44336 3.04912 2.81671 2.66127 2.54906 2.46377 2.39650 2.34193 2.29669
23 4.27934 3.42213 3.02800 2.79554 2.64 2.52766 2.44223 2.37481 2.32011 2.27472
24 4.25968 3.40283 3.00879 2.77629 2.62065 2.50819 2.42263 2.35508 2.30024 2.25474
25 4.24170 3.38520 2.99124 2.75871 2.60299 2.49041 2.40473 2.33706 2.28210 2.23648
26 4.22520 3.36901 2.97516 2.74260 2.58679 2.47411 2.38831 2.32053 2.26545 2.21972
27 4.21001 3.35413 2.96035 2.72777 2.57189 2.45911 2.37321 2.30531 2.25013 2.20430
28 4.19598 3.34039 2.94668 2.71407 2.55812 2.44526 2.35926 2.29127 2.23598 2.19004
29 4.18297 3.32766 2.93403 2.70140 2.54538 2.43244 2.34634 2.27825 2.22288 2.17685
G
r
a
d
o
s

d
e

l
i
b
e
r
t
a
d

d
e
l

d
e
n
o
m
i
n
a
d
o
r

30 4.17089 3.31583 2.92228 2.68963 2.53355 2.42052 2.33435 2.26616 2.21070 2.16458









GUA TCNICA N 1 63
ANEXO N 4: TABLA DE % DE RECUPERACION


ANALITO UNIDAD

RECUPERACIN ESTIMADO (%)

100 100%

98 102

10 10%

98 102

1 1%

97 - 103

0,1 0,10%

95 105

0,01 100 ppm

90 107

0,001 10 ppm

80 110

0,0001 1 ppm

80 110

0,00001 100 ppb

80 110

0,000001 10 ppb

60 115

0,0000001 1 ppb

40 120



Fuentes: Manual del Codex Alimentarius








GUA TCNICA N 1 64
ANEXO N 5: TABLA DE HORWITZ



CONCENTRACIN REPETIBILIDAD
CV%r
REPRODUCIBILIDAD INTERNA
CV%R

1 ppt

1 / 10
12
1,00E-12 64,0 85,3

10 ppt

10 / 10
12
1,00E-11 45,3 60,3

100 ppt

100 / 10
12
1,00E-10 32,0 42,7

1 ppb

1 / 10
9
1,00E-09 22,6 30,2

10 ppb

10 / 10
9
1,00E-08 16,0 21,3

100 ppb

100 / 10
9
1,00E-07 11,3 15,1

1 ppm

1 / 10
6
1,00E-06 8,00 10,7

10 ppm

10 / 10
6
1,00E-05 5,66 7,54

100 ppm

100 / 10
6
1,00E-04 4,00 5,33

1000 ppm

1000 / 10
6
1,00E-03 2,83 3,77

1%

1 / 10
2
1,00E-02 2,00 2,67

10%

10 / 10
2
1,00E-01 1,41 1,89






GUA TCNICA N 1 65
ANEXO N 6: EJEMPLO DE ESQUEMA GENERAL PARA EL DESARROLLO DE UN PLAN DE
VALIDACION DE UN MTODO NORMALIZADO

El siguiente es un esquema que muestra un ejemplo de cmo se desarrollo el plan de validacin de un
mtodo y como se establecieron los correspondientes criterios de aceptabilidad.

Linealidad: Realizar 3 curvas de calibracin con 4 estndares incluido el blanco, determinar el valor de
coeficiente de correlacin promedio de las 3 curvas.
Criterio de aceptabilidad: r > 0,99

Limites: Realizar 10 ensayos de medicin de una matriz de muestra en un nivel de concentracin
cercano al LOD esperado, determinar la desviacin estndar de las concentraciones obtenidas (S
o
) ,
calcular el valor de LOD como LOD= 3,29 x S
o
.
Criterio de aceptabilidad: para un LMP > 0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOD
< 1/5 LMP.

Precisin:
a) Repetibilidad: Realizar en un mismo da 10 ensayos de medicin de una matriz de muestra en un
nivel de concentracin, en lo posible en el nivel medio de la curva, determinar el promedio de las
concentraciones obtenidas (X) y la desviacin estndar de las concentraciones obtenidas (S
r
).
Determinar el CV
r
%.
Criterio de aceptabilidad: CV
h
= (2
(1-0.5.log c)
)/2

, en el cual c es el valor de la concentracin del analito
expresado en potencia de 10 (Ver tabla N 1).
b) Reproducibilidad: Realizar en un total de 10 das 10 ensayos de medicin de una matriz de muestra
en un nivel de concentracin, en lo posible en el nivel medio de la curva, determinar el promedio de las
concentraciones obtenidas (X) y la desviacin estndar de las concentraciones obtenidas (S
Ri
).
Determinar el CV
Ri
%.
Criterio de aceptabilidad: CV
Ri
= 2x(2
(1-0.5.log c)
)/3, en el cual c es el valor de la concentracin del analito
expresado en potencia de 10 (Ver tabla N 1).

Veracidad:
Dependiendo a las caractersticas del mtodo y acceso a material de referencia determinar el sesgo o
la recuperacin.
a) Sesgo: Determinar en un mismo da a lo menos 6 mediciones (n) de un material de referencia o
material de referencia certificado, determinar el promedio (X) y desviacin estndar (S)de las
concentraciones obtenidas de las 6 mediciones, luego calcular el valor del sesgo del valor promedio (X)
respecto del valor asignado (X
a
), como s= X -X
a
, determinar el valor de t calculado para el sesgo,
comparar con el t critico
(5,95%)
que es 2,571.
Criterio de aceptabilidad: Si t
calc
< t
crit
, el sesgo es aceptable.
b) Recuperacin: Medir una matriz de muestra blanco, determinar el promedio de las concentraciones
obtenidas para C
o
. Posteriormente realizar un fortificado en dicha matriz blanco en un nivel de
concentracin (C
a
) cercano al LMP o punto medio de la curva de calibracin. Tomar 6 sub-muestras del
material fortificado y realizar el ensayo analtico, determinar el promedio de la concentracin del
analito en la muestra fortificada (C
e
). Calcular el % de recuperacin obtenido.
Criterio de aceptabilidad: Si el %R se encuentra dentro del rango de %R segn AOAC para el
nivel de fortificacin realizado (C
a
), es aceptable.

DECLARACION DE LA APLICABILIDAD DEL MTODO: El mtodo normalizado X es aplicable para el
anlisis del analito Y en la matriz(ces) Z en el rango de A a B unidades de concentracin.
GUA TCNICA N 1 66
VI: BIBLIOGRAFA

1. Aguirre L, et al. Validacin de mtodos analticos, Asociacin Espaola de Farmacuticos de
Industria, Barcelona, 2001, parte II

2. Diseo experimental del Estudio de Validacin de Mtodos Analticos. Swedish National
Food Administration. Research & Development Department. Leonardo Merino.

3. Estudio de Validacin de Mtodos Analticos (Una gua prctica para laboratorios
Qumicos). Swedish National Food Administration. 2007.

4. Estadstica y Quimiometra para Qumica Analtica. James N. Miller, Jane C. Miller.
Pearson. 4a Edition. 2002.

5. Guide to Quality in Analytical Chemistry An Aid to Accreditation. CITAC/EURACHEM
GUIDE. 2002.

6. Handbook for calculation of measurement uncertainty in environmental laboratories.
Edition 2. B. Magnusson et al. NT TECHN REPORT 537.

7. Manual de Procedimiento- Comisin del Codex Alimentarius- 19 Edicin- OMS/FAO.


8. Lloyd A. Currie, Nomenclature In Evaluation Of Analytical Methods Including Detection And
Quantification Capabilities. IUPAC. Vol. 67, No. 10, pp. 1699-1723, 1995.

9. M. Thompson, S.L.R. Ellison and R. Wood. Harmonized Guidelines For Single-
Laboratory Validation Of Methods Of Analysis Pure Appl. Chem., 74, (5) 835 855
(2002).

10. Official Methods of Analysis of AOAC International. 18 th Edition, 2005. Appendix E:
Laboratory Quality Assurance.

11. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM/CITAC Guide CG4.
Second Edition. QUAM:2000.1.

12. Validacin de Mtodos de anlisis qumicos Procedimiento NMKL No. 4 (1996). Versin
Espaol 1 , febrero 1997

13. VAM Project 3.2.1 Development and harmonization of measurement Uncertainty
Principles. Part (d): Protocol for uncertainty evaluation from validation data. January
2000. LGC/VAM/1998/088.



GUA TCNICA N 1 67


































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Comit Editor: Boris Dufau, Fabiola Rojas, Isabel Guerrero, Luis Roa, Luis Rodrguez, Marcelo Soto, Marisol Aguilera,
Soraya Sandoval.
Coordinacin Edicin: Soraya Sandoval