Espectroscopia de fluorescencia

La espectroscopia de fluorescencia , tambin llamada espectrofotometra o fluometra; es

un tipo de espectroscopia electromagntica, la cual analiza la fluorescencia de una muestra.
Esto involucra el uso de un haz de luz comnmente de luz ultravioleta, que excita a los
electrones en las molculas de ciertos componentes y causa entonces la emisin de luz;
tpicamente, pero no necesariamente, luz visible. Su tcnica complementaria es el espectro de
absorcin . El equipamiento que mide la fluorescencia es llamado fluormetro o fluormetro.
ndice
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1 Teora
2 Instrumentacin
3 Anlisis de datos
4 El Triptfano fluorescente
5 Aplicaciones
6 Referencias
7 Enlaces externos
Teora[editar]
Las molculas tienen varios estados referidos a los niveles de energa. La espectroscopia de
fluorescencia se preocupa fundamentalmente de estados electrnicos y vibratorios.
Generalmente las especies estudiadas poseen un estado fundamental electrnico o estado
estacionario(un bajo estado electrnico) de inters, y un estado electrnico excitado de una
energa superior. Dentro de cada uno de estos estados electrnicos hay varios estados
vibratorios. En espectroscopia de fluorescencia, las especies son las primeras en ser
excitadas mediante la absorcin de un fotn, desde su de estado electrnico fundamental, a
uno de los diversos estados vibratorios en el estado electrnico excitado. Las colisiones con
otras molculas causan a la molcula excitada la perdida de energa vibratoria hasta que
alcanza el menor estado vibratorio del estado electrnico excitado. Este proceso es a menudo
visualizado con el diagrama de Jablonski. La molcula luego vuelve a declinar a uno de los
varios niveles de vibracin del estado electrnico fundamental emitiendo un fotn en el
proceso. Como las molculas pueden decaer en cualquiera de los varios niveles vibratorios en
el estado fundamental, los fotones emitidos tendrn entonces diferentes energas, y de este
modo diferentes frecuencias. Por tanto , por el anlisis de las diferentes frecuencias de luz
emitidas en la espectroscopia de fluorescencia junto con sus intensidades relativas , la
estructura de los diferentes niveles vibratorios puede ser determinada . Para especies
atmicas, el proceso es similar, sin embargo desde especies atmicas no se poseen niveles
vibratorios de energa, los fotones emitidos estn con frecuencia con la misma longitud de
onda que la radiacin incidente. Este proceso de re-emitir el fotn absorbido es llamado
resonancia de fluorescencia y aunque es caracterstica de la fluorescencia atmica , se
observa en la fluorescencia molecular.
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En un experimento tpico , las diferentes longitudes de
onda de luz fluorescente emitidas por una muestra se miden usando un monocromador ,
sosteniendo la luz excitada en una longitud de onda constante . Esto es llamado espectro de
emisin . Un espectro de excitacin es lo contrario, en este la luz emitida se mantiene
constante en una longitud de onda , y la luz de excitacin es leda a travs de diferentes
longitudes de onda ( mediante un monocromador ). Un mapa de emisin es medido mediante
el registro del espectro de emisin resultante de una gama de excitacin de longitudes de
onda en la combinacin de todas estas juntas. Esta es una superficie tridimensional de datos:
la intensidad de emisin como una funcin de la excitacin y emisin de longitudes de onda, la
cual es tpicamente representada como un mapa de contorno.
Instrumentacin[editar]
Existen dos tipos generales de instrumentos:
Fluormetro de filtro: El uso de estos filtros sirve para aislar la incidencia de luz y
la fluorescencia de la luz.
Espectrofluormetros: Utiliza una red de difraccin de monocromador es para aislar la
incidencia de la luz y la florescencia de la luz.
Ambos tipos de filtros usan el siguiente esquema: La luz procedente de una fuente de
excitacin pasa a travs de un filtro o un monocromador y golpea la muestra. Una porcin de
la luz incidente es absorbida por la muestra y algunas de las molculas en la muestra
fluorescente. La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Algunas de estas luces
fluorescentes pasan a travs de un segundo filtro o un monocromador y alcanzan un detector,
el cual es usualmente colocado a noventa grados de la incidencia del haz de luz para
minimizar el riesgo de la transmisin o reflejo de la incidencia de la luz buscada en el detector.
Varias fuentes de luz pueden ser usadas como fuentes de excitacin, incluyendo lseres,
fotodiodos y lmparas; faros de xenn y lmpara de vapor de mercurio, en particular. Un lser
solo emite luz de gran irradiacin a una longitud de onda muy estrecha, tpicamente por
debajo de 0.01 nm, el cual hace una excitacin del monocromador o filtro necesario. La
desventaja de este mtodo es que la longitud de onda del lser no puede ser cambiada por
una muy grande. Una lmpara de vapor de mercurio es una lnea de lmpara, esto significa
que emite luz cerca del pico de la longitud de la onda. Por el contrario un arco de xenn tiene
continua emisin del espectro con poca intensidad en el rango de 300-800 nm y suficiente
irradiacin para la medida justo un poco ms por encima del de 200 nm.
Los filtros y/o monocromadores pueden ser utilizados en fluometra. Un monocromador
transmite luz con longitud de onda ajustable con su respectiva tolerancia. El monocromador
ms comn utiliza una rejilla de difraccin, que es la luz colocada para iluminar la rejilla y sale
con un diferente ngulo dependiendo de la longitud de la onda. El monocromador puede ser
ajustado seleccionando la longitud de onda a transmitir. Para permitir la medicin de
anisotropa de dos filtros polarizados son necesarios: uno despus de la excitacin del
monocromador o el filtro, y uno antes de la emisin del monocromador o filtro.
Como se mencion anteriormente, la fluorescencia pude ser medida con un ngulo de 90 con
respecto a la excitacin de la luz. Esta geometra se usa en vez de colocar el sensor en la
lnea de excitacin de la luz a un ngulo de 180, evitando la interferencia de la trasmisin de
la excitacin de la luz. Un monocromador no es perfecto y podra trasmitir alguna luz perdida o
dispersa, es decir, la luz con otras longitudes de onda que las del destino. Un nico ideal
monocromador sera el que transmita la luz en un rango especfico y que tenga una gran
longitud de onda independiente de la transmisin. Cuando se mide un ngulo de 90, la luz es
dispersada por simples causas de luz difusa.
Estos resultados dan una mejor relacin seal-ruido y disminuye el lmite de deteccin
aproximadamente en un factor de 10.000,
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cuando se compara con la geometra del ngulo de
180. Adems, la fluorescencia puede ser tambin medida desde adelante, con el cual es
algunas veces, o bien, turbia o muestras opacas.
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El detector puede ser uni-canalizado o multi-canalizado. El detector uni-canalizado puede
detectar solamente una longitud de onda a la vez, mientras que el multi-canalizador detecta la
intensidad de todas las longitudes de ondas simultneamente, haciendo la emisin del
monocromador o del filtro, innecesaria. Los diferentes tipos de detectores tienen ventajas y
desventajas. La mayora de los fluormetros son verstiles con un par de monocromadores y
una fuente de excitacin de luz continua, estos pueden grabar la excitacin de espectro y la
fluorescencia del espectro, la longitud de onda de la excitacin de la luz se mantiene
constante, preferiblemente como una gran longitud de onda de absorcin, y la emisin del
monocromador explorar el espectro. Para medir la excitacin del espectro, la longitud de
onda pasa a travs de la emisin del filtro o el monocromador es explorado. La excitacin del
espectro generalmente es idntica a la absorcin del espectro, como la intensidad de la
fluorescencia es proporcional a la absorcin.
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Anlisis de datos[editar]
A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia va a ser generalmente proporcional a
la concentracin de fluorforo. En oposicin a la espectroscopia UV / visible estndar , los
espectros indistintamente del dispositivo, no son fciles de conseguir. Varios factores influyen
y distorsionan el espectro, y son necesarias correcciones para conseguir espectros
verdaderos , es decir, espectros, obtenidos indistintamente del dispositivo. Los diferentes
tipos de distorsiones van a ser clasificados aqu como cualquier instrumento o pariente de la
muestra. Primeramente, la distorsin raz del instrumento es discutida. Para empezar, la
intensidad de luz de la fuente y caractersticas de la longitud de onda varan con el tiempo
durante cada experimento y entre cada experimento. Adems, la no lmpara tiene una
intensidad constante en todas las longitudes de onda. Para corregir esto, un disociador de
rayo llamado monocromador o filtro puede ser aplicado despus de la excitacin, el cual se
utiliza para dirigir una porcin de luz a un detector referencia.
Adicionalmente, el rendimiento de transmisin de monocromadores y filtros tiene que ser
tomado en cuenta. Este puede tambin cambiar a lo largo del tiempo. El rendimiento de la
transmisin del monocromador tambin vara dependiendo de la longitud de onda. Este es el
motivo por el cual un detector de referencia opcional debe ser ubicado despus del
monocromador de excitacin o filtro. El porcentaje de fluorescencia adquirido por el detector
es tambin supeditado al sistema. Adems, el rendimiento del detector cuntico, es decir, el
porcentaje de fotones detectados, vara entre diferentes detectores, con longitud de onda y
con el tiempo, como el detector inevitablemente se deteriora.
Dos otros temas que deben ser considerados incluyen la ptica utilizada para controlar la
radiacin y los medios de retener o contener el material de la muestra (llamada cubeta o
celda). Para ms mediciones UV visible, y NIR , el uso de cubetas de precisin de cuarzo es
necesario. En los dos casos, es importante seleccionar materiales que tienen relativamente
una pequea absorcin en la gama de longitudes de onda de inters. El cuarzo es ideal,
porque este transmite desde 200 nm-2500 nm; un cuarzo de mayor grado puede incluso
transmitir hasta ms de 3500 nm, mientras que las propiedades de absorcin de otros
materiales pueden enmascarar la fluorescencia de la muestra.
La correccin de todos estos factores instrumentales para obtener un espectro estndar es
un proceso tedioso, el cual solamente es aplicado en prctica cuando es estrictamente
necesario. Este es el caso de mediciones del rendimiento cuntico o cuando se encuentra la
longitud de onda con la mayor intensidad de emisin.
Como fue mencionado previamente, se presentan distorsiones de la muestra. Por tanto
tambin se deben tener en cuenta algunos aspectos de la muestra. Primeramente, la
fotodescomposicin puede decrecer la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo. La
dispersin de la luz debe tenerse tambin en cuenta. En este contexto, los tipos ms
significativos de dispersin son, dispersin de Rayleigh y dispersin Raman. La luz disipada
por la dispersin de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras
que en la dispersin Raman la luz disipada cambia usualmente la longitud de onda a
longitudes de onda ms largas. La Dispersin Raman es el resultado de un estado electrnico
virtual que fue inducido por la excitacin de la luz. Desde este estado virtual, las molculas
pueden relajarse de nuevo a un nivel vibratorio que no sea el estado fundamental de
vibracin.
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En espectro de fluorescencia, se ve invariablemente un nmero distinto de onda
constante en comparacin al nmero de onda de excitacin, por ejemplo el punto ms alto
aparece en un nmero de onda igual a 3600 cm
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ms pequeo que la luz excitada en agua .
Otros aspectos de tener en cuenta son los efectos internos del filtro. Estos incluyen la
reabsorcin. La reabsorcin sucede porque otra molcula o parte de una macromolcula
absorbe las longitudes de onda en las cuales el fluorforo emite radiacin. Si este es el caso,
algunos o todos los fotones emitidos por el fluorforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro
efecto interno del filtro ocurre debido a concentraciones elevadas de molculas absorbentes,
incluyendo el fluorforo. El resultado es que la intensidad de la luz excitada no es constante en
toda la solucin. Y, derivadamente, slo un pequeo porcentaje de la luz de excitada alcanza
los fluorforos que son visibles por el sistema de deteccin. Los efectos internos del filtro
cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y por lo tanto esto debe ser considerado
cuando se analiza el espectro de emisin de luz fluorescente.
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El Triptfano fluorescente[editar]
La fluorescencia de una protena plegada es una mezcla de la fluorescencia individual de los
residuos aromticos. La mayora de las emisiones fluorescentes intrnsecas de una protena
plegada es debido a la excitacin de los residuos de triptfano, con algunas emisiones debido
a la tirosina y fenilalanina; pero los enlaces de di-sulfuro tambin tienen una notoria absorcin
en este rango de longitud de onda. Usualmente, el triptfano tiene una longitud de onda de
mxima absorcin de 280 nm y un pico de emisin que es solvatocrmico va desde 300 to
350 nm dependiendo de la polaridad del medio ambiente
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Hence, protein fluorescence may be
used as a diagnostic of the conformational state of a protein.
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local. A partir de ah, la protena
fluorescente puede ser usada como un diagnstico del estado conformacional de una
protena.
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Adems, el triptfano fluorescente es fuertemente influenciado por la cercana de
otros residuos (es decir, cercanos grupos protonados tales como Asp o Glu puede
causar Quenching (fluorescencia) de Trp fluorencente). Tambin, es posible la energa de
trasferencia entre el triptfano y otros aminocidos fluorescentes, lo que afectara el anlisis,
especialmente, en casos donde el cido Frster es tomado. En adicin, el triptfano es un raro
aminocido; muchas protenas contienen solo uno o varios residuos de tirptfano. Por lo tanto,
la fluorescencia del triptfano puede ser muy sensible al ser medido de estado de composicin
de los residuos de triptfanos individuales. La ventaja en comparacin con las sondas
extrnsecas es que la propia protena no cambia. El uso de la fluorescencia intrnseca para el
estudio de la composicin de la protena es una prctica limitada a varios casos (o quizs solo
uno) residuos de triptfano, desde cada experiencias con diferentes ambientes locales, lo que
da a diferentes emisiones de espectros. El triptfano es una importante sonda fluorescente
intrnseca (aminocido), que puede ser usada para estimar la naturaleza de los
microambientes del triptfano. Cuando se realizan los experimentos con
desnaturalizantes, tensoactivo u otra molcula anfiflica, el microambiente del triptfano podra
cambiar. Por ejemplo, si una protena contiene un solo triptfano en su ncleo hidrofbico se
desnaturaliza con el incremento de temperatura, un desplazamiento en el espectro causara
que la emisin del rojo desapareciera. Esto es debido a la exposicin del triptfono a medio
acuoso como opuesto al interior de la protena hidrofbica. En contraste, la adicin de un
tensiactivo a una protena que contiene un triptfano el cual est expuesto al disolvente
acuoso podra causar un desplazamiento en la emisin del espectro azul, si el triptfano est
incrustado en el tensioactivo vescula o micela.
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Las protenas que carecen del triptfano
pueden ser acopladas a un fluorforo. A 295 nm, el espectro de emisin del triptfano es
dominante sobre el ms dbil la fluorescencia tirosina y la fluorescencia fenilalanina.
Aplicaciones[editar]
La espectroscopia de fluorescencia es usada en los campos de investigacin como el
bioqumico, mdico y qumico, entre otros, para el anlisis de compuestos orgnicos. Su uso
tambin ha sido reportado en la diferenciacin de tumores malignos y benignos en la piel. Las
tcnicas de espectroscopia atmica de fluorescencia son practicadas en otros tipos de
anlisis, y medicin de un compuesto presente en el aire, en el agua o en otro medio, como
CVAFS que es usado para la deteccin de metales pesados, como el mercurio. Tambin
puede ser usado para re direccionar fotones.