Enzima de restriccin

Un enzima de restriccin (o endonucleasas de restriccin) es aquella que puede

reconocer una secuencia caracterstica de nucletidos dentro de una molcula de ADN y
cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restriccin, o en un sitio
no muy lejano a este. Los sitios de restriccin cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con
las que son reconocidos.
El mecanismo de corte de DNA se realiza a travs de la ruptura de dos enlaces fosfodister
en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. stos pueden ser romos (cuando
los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos ltimos tienen tendencia a
volver a unirse de modo espontneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos
coincidentes que pueda haber en la cercana (Apareamiento de Watson & Crick).


Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos.


Restriccin de SmaI dejando extremos romos.
Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas
ligasas.
Las enzimas de restriccin que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies,
tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no
cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizmeros. Por ejemplo, estn los
isoesquizmeros Asp718 y KpnI.
El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbilogos Werner Arber,
Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin
lo que condujo al desarrollo de la tecnologa de ADN recombinante. El primer uso prctico
de su trabajo fue la manipulacin de la bacteria E. coli para producir insulina humana para
los diabticos.
Uno de los campos en los que las enzimas de restriccin han tenido mayor implicacin ha
sido el diagnstico de enfermedades genticas relacionadas con cambios en la secuencia del
ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si stas se
producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin, al producirse
eliminarn o agregarn nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona
sana y una enferma se deberan observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso
en una electroforesis.
Sistemas de restriccin-modificacin (M-R)
El sistema de restriccin-modificacin (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse
de ataques de DNA exgenos (normalmente vricos) que ingresen en la bacteria,
eliminando las secuencias ajenas al genoma de estas. El ADN propio no sufre delecin por
parte de las enzimas de restriccin del organismo que las produce, puesto que previamente
ha sido modificado por metilacin a travs de la accin de una metiltransferasa, enzima que
transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases especficas. Este
sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infeccin del
fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas K12 y B). Este
sistema consta de dos partes:
Restriccin: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exgenos para
evitar la promiscuidad en los intercambios genticos. Esto le confiere inmunidad
frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad gentica o
incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a travs de cortes mediante
endonucleasas de restriccin a los DNA exgenos que ingresen a la bacteria.
Modificacin: Consiste en la introduccin de grupos metilo (CH
3
-) en determinadas
bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual est catalizado por una
metilasa especfica.
Existen varios mecanismos de accin generales de estos sistemas, de los cuales destacan el
tipo I y el tipo II:
M-R tipo I: Fueron los primeros en ser descritos. Lo caracterstico de los sistemas
M-R de tipo I es que las actividades de modificacin y las de restriccin estn
producidas por un complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades.
Algunas caractersticas son:
Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetras.
La actividad de restriccin (de las subunidades R) corta lejos del sitio de
reconocimiento (del orden de unos 1000 pb), y en lugares inespecficos.
La restriccin requiere de ATP.
La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM)
como donador de los grupos metilo.
M-R tipo II: Aqu cada subunidad del dmero reconoce la misma secuencia,
presente en cada una de las partes especulares del palndromo, y realiza un corte en
un lugar especfico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena de la
otra mitad del palndromo. Ms de la tercera parte de las cepas bacterianas
presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a
partir de genes situados en plsmidos. Algunas caractersticas que tiene este
mecanismo son:
Las dos actividades las realizan dos protenas distintas que no forman
complejos multiproteicos.
No utilizan ATP. Slo necesitan iones Mg
++
para funcionar. La metilasa usa
SAM como donador de metilos.
Cada miembro de la pareja de modificacin y restriccin reconoce la misma
secuencia especfica de ADN.
El sitio de reconocimiento consta de 4 6 pb que constituyen una secuencia
palindrmica.
La metilasa suele ser una protena monomrica, que introduce grupos metilo
en una A o en una G (segn la metilasa en cuestin), en ambas cadenas,
dentro del sitio de reconocimiento.
La enzima de restriccin suele ser una protena formada por dos subunidades
del mismo tipo, ensambladas simtricamente. Pueden dejar extremos
cohesivos o extremos romos. Algunas enzimas de restriccin dejan extremos
sobresalientes 5', mientras que otras dejan extremos sobresalientes 3'.
Tipos de enzimas de restriccin
Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restriccin:
Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restriccin (corta) y
modificacin (metila). Al reconocer la secuencia especfica de DNA corta al azar en
sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo.
El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA,
desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases
aproximadamente), adems de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg
++
como
cofactores.
Tipo 2: Solo tienen actividad de restriccin. Otras enzimas llevan a cabo la
metilacin. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de l,
por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta caracterstica es que son muy
utilizadas para clonacin de genes, ya que al cortar en sitios especficos se pueden
recuperar secuencias conocidas. Slo requieren Mg
++
como cofactor, no necesitan
de ATP...
Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomrica que realiza todas las actividades
enzimticas. Tienen funcin de restriccin y modificacin. Cortan de 25 a 27 pares
de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren
dos secuencias de reconocimiento en orientacin opuesta en la misma cadena de
DNA. Necesitan ATP, Mg
++
y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.
Hay otros sistemas de restriccin descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E.
coli (Eco571) que consta de una sola enzima que corta nicamente DNA metilado en una
secuen
Las enzimas de restriccin: las "tijeras moleculares" de los ingenieros genticos


La clave de la transgnesis, la obtencin de un organismo genticamente modificado, est
en extraer genes de inters de un organismo e introducirlos en otro, de modo de obtener un
producto con caractersticas mejoradas. Pero cmo se hace para "cortar" ADN de un
organismo e insertarlo en otro? Los genetistas necesitaban herramientas para hacerlo, y as
descubrieron las enzimas de restriccin, las tijeras moleculares que cortan el ADN. De
esta forma, es posible extraerlo del genoma de un organismo. Tambin descubrieron las
enzimas ligasas que "pegan" el fragmento de ADN aislado dentro del ADN del nuevo
organismo. Ambos tipos de enzimas son esenciales en las tcnicas de ingeniera gentica
(ver Cuadernos N 2, 4, 5, 54 y 67).
Las enzimas son protenas que cumplen una funcin esencial en el metabolismo celular:
son catalizadores biolgicos (aceleradores de reacciones qumicas) que hacen posible que
las reacciones se lleven a cabo en un tiempo adaptado a las necesidades vitales del
organismo (ver Cuaderno N 30). Entre sus caractersticas fundamentales se encuentra la
de ser especficas, es decir que cada tipo de enzima acta sobre un sustrato particular o una
secuencia particular de una molcula, y no sobre otra. Esta especificidad enzimtica resulta
fundamental en la actividad de las enzimas de restriccin que cortan secuencias
particulares y determinadas del ADN.

Las enzimas de restriccin
Las enzimas de restriccin son protenas cuya funcin es cortar las hebras de ADN. Se
podra decir que son tijeras moleculares que cortan ADN. Lo hacen en forma especfica.
Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir que reconoce
una secuencia particular de nucletidos. Esa secuencia especfica para cada enzima se
denomina sitio de restriccin. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se posiciona
sobre la molcula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia.
Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en:
Enzimas que generan extremos romos (parejos)
Enzimas que generan extremos cohesivos (desparejos). Estos extremos colgantes de
simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena simple que tengan la
secuencia complementaria. Las enzimas encargadas de unir los extremos de ambas
cadenas se denominan ligasas.


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Las enzimas de restriccin reconocen secuencias de 4, 6 o ms bases y cortan generando
extremos romos o extremos cohesivos.
Fuente: http://www.icampus.ucl.ac.be/

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Los extremos, generados en diferentes molculas de ADN, pueden sellarse con la enzima
ADN ligasa y generar as una molcula de ADN nueva, denominada recombinante (ver
Cuaderno N 4).

El origen de las enzimas de restriccin
Las enzimas de restriccin, conocidas tambin como endonucleasas, slo cortan el ADN si
reconocen en su interior una secuencia especfica de nucletidos. Estas enzimas fueron
descubiertas en microorganismos. De hecho, se encuentran slo en organismos procariotas
(bacterias). Por esto, se les dio una nomenclatura asociada al organismo de donde
provienen. Por ejemplo, las enzimas de restriccin que se descubrieron en la bacteria
Escherichia coli se denominan Eco. Existen diferentes tipos de enzimas Eco que se
diferencian en la secuencia que reconocen y cortan. Para diferenciarlas se les agregan
letras y nmeros romanos, por ejemplo: Eco RI (Eco erre uno). As, el sitio de
restriccin para EcoRI es la secuencia GAATTC, como muestra la ilustracin anterior.
Una vez que la enzima encontr ese sitio en el ADN, se acerca a la hebra de ADN y realiza
el corte entre la G y la A. Al investigar otras especies de bacterias se descubrieron cientos
de enzimas de restriccin distintas y cada una reconoce una regin especfica.
Estas enzimas fueron descubiertas en la dcada del 70 y hasta la fecha existen ms de 250
enzimas de restriccin. Se cree que la funcin natural de estas enzimas en las bacterias es
protegerlas contra ADN de virus que podran ingresar en sus clulas. De esta manera, la
bacteria utiliza estas tijeras moleculares para cortar en pedacitos el ADN viral que la
infecta. El ADN propio de la bacteria no se corta, pues lo tiene protegido contra sus
propias enzimas de restriccin.

Usos de las enzimas de restriccin
Las enzimas de restriccin tienen diferentes aplicaciones que son de gran importancia en
investigaciones en biologa molecular y en las tcnicas que emplea la biotecnologa
moderna:
1. Hacer mapa de restriccin de un plsmido o bacterifago. El ADN se corta con varias
enzimas de restriccin, solas y en parejas, para determinar el nmero de sitios de corte y
sus posiciones relativas en la molcula, el orden y la distancia entre ellos.
2. Fragmentar ADN para separacin por electroforesis. Los fragmentos obtenidos despus
de la actuacin de las distintas enzimas de restriccin, se pueden separar por tamaos
mediante la tcnica de electroforesis y as estudiar los distintos fragmentos. Por ejemplo:
para la tcnica de Southern blotting (ver cuaderno N 67) o en las usadas para identificar
polimorfismos de ADN en distintos individuos (RFLP, ver cuaderno N 69).
3. Generacin de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear ADN
recombinante. Se puede cortar una molcula de ADN con una enzima y, con el mismo tipo
de enzima, cortar el fragmento de ADN de inters para clonar. Se unen con ligasas estas
dos molculas de ADN, generando as una molcula de ADN recombinante. Este vector
recombinante puede usarse para transformar clulas que expresen el gen de inters clonado
(si se us un vector de expresin con el promotor adecuado) o puede usarse simplemente
para tener clonado (guardado) ese fragmento de ADN de inters. Por ejemplo: para los
proyectos de secuenciacin de genomas (ver cuaderno N 55
cia especfica, y que adems metila