. J Clin Endocrinol Metab mayo de 2013; 98 (5) : 2153-2159.

. Publicado en Internet el 12 de marzo 2013 doi: 10.1210/jc.2013-1149

PMCID: PMC3644605
A Funciones de molcula pequea antagonista inhibe la tirotropina Receptor
Antibody-Induced Orbital fibroblastos involucrado en la patognesis de la
oftalmopata de Graves
Adina F. Turcu , Seema Kumar , Susanne Neumann , Michael Coenen , Seethalakshmi Iyer , Pamela Chiriboga ,
Marvin C. Gershengorn y Rebecca S. Bahn
Divisin de Endocrinologa, Diabetes, Metabolismo y Nutricin (AFT, MC, SI, PC, RSB) y de la Divisin de Endocrinologa Peditrica y Metabolismo
(SK), Mayo Clinic, Rochester, Minnesota 55905; y el Laboratorio de Endocrinologa y Receptor Biology (SN, MCG), Instituto Nacional de Diabetes
y Enf ermedades Digestivas y Renales de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland 20892-8029
Autor para correspondencia.
Toda correspondencia y las solicitudes de reimpresiones a:. Rebecca S. Bahn, MD, Divisin de Endocrinologa, Diabetes, Metabolismo y
Nutricin de la Clnica Mayo, 200 Calle Primera Southwest, Rochester, Minnesota 55902 E-mail: bahn.rebecca @ mayo.edu .
Recibido 16 de enero 2013; Aceptado el 22 de f ebrero de 2013.
Derechos de autor 2013 por la Sociedad de Endocrinologa
Abstracto
Contexto:
Oftalmopata de Graves (IR) es un trastorno autoinmune que se caracteriza por el aumento de la
adipognesis y cido hialurnico (HA) de produccin por los fibroblastos orbitales. Autoanticuerpos
circulantes (anticuerpos estimulantes de la tiroides [TSAbs]) dirigidos hacia el receptor de la tirotropina
(TSHR) en estas clulas estimulan o aumentan estos procesos celulares. Una pequea agonista inverso
recientemente desarrollada como droga molcula de TSHR, NCGC00229600, denominado 1 , se une a
TSHR y bloques basal y estimulada de transduccin de seales.
Objetivo:
El propsito de este artculo es determinar si 1 puede inhibir la produccin de HA y vas de sealizacin
pertinentes en fibroblastos orbitales cultivadas en presencia de TSAbs monoclonales o TSH bovina
(bTSH).
Diseo:
Los cultivos primarios de fibroblastos orbitales indiferenciado IR (n = 13) fueron tratados o tratados con
un TSAb (M22 o MS-1) o bTSH en medio libre de suero, con o sin 1 o un antagonista neutral TSHR,
NCGC00242595, denominado 2 , que no inhibe la sealizacin basal, pero no inhibir la sealizacin
estimulada.
Principales medidas de resultado:
la produccin de cAMP, se analiz la fosforilacin de Akt (Ser473pAkt en medios de comunicacin y la
inmunotransferencia para pAkt / Akt total), y la produccin de HA.
Resultados:
Compuesto 1 inhibi basales de AMPc, pAkt, y la produccin de HA y que estimulado por M22 en
fibroblastos orbitales indiferenciadas. La inhibicin de la produccin de HA era dependiente de la dosis,
con una dosis inhibidora de la mitad de la mxima de 830 nM. Este compuesto tambin inhibe de MS-1-
y bTSH-estimul la produccin de cAMP, pAkt, y HA. Compuesto 2 no inhibi la produccin de HA
basal, pero inhibi la produccin de HA-estimul la M22.
Conclusiones:
Debido a que la produccin de cAMP, pAkt, y HA son funciones de fibroblastos que se activan a travs
de sealizacin de TSHR y son importantes en la patognesis de IR, antagonistas de molculas
pequeas de TSHR pueden demostrar ser eficaces en el tratamiento o la prevencin de la enfermedad en
el futuro.
Graves oftalmopata (GO) es una enfermedad autoinmune de la rbita que se caracteriza por la
inflamacin y la expansin de los tejidos adiposos orbitales y los msculos extraoculares. Fibroblastos
orbitales son las clulas diana de este proceso autoinmune, y la expansin de los tejidos orbitales es en
parte atribuible a un aumento de la adipognesis y la produccin de cido hialurnico (HA, cido
hialurnico) por estas clulas ( 1 , 2 ). Nuestros estudios recientes sugieren que un anticuerpo
monoclonal estimuladora del receptor de tirotropina (TSHR) de autoanticuerpos (anticuerpos
estimulante de la tiroides, TSAb), denominado M22, se acopla con el receptor expresado en fibroblastos
orbitales y mejora tanto la adipognesis ( 3 ) y la produccin de HA ( 4 ) principalmente a travs de la
activacin de la fosfoinositol 3-quinasa (PI3K) / target phospho-Akt/mammalian de rapamicina
cascada de sealizacin. Otros investigadores han demostrado de manera similar el aumento de la
produccin de HA en fibroblastos orbitales diferenciadas activados por la inmunoglobulina G de los
sueros de pacientes con enfermedad de Graves (GD-IgG) ( 5 ) o transfectadas con un mutante de TSHR
activacin ( 6 ).
Antagonistas de molcula pequea de TSHR se unen dentro de la regin transmembrana del receptor,
que actan de una manera alostrica para bloquear la sealizacin, pero no la unin de TSH o TSAb ( 7
). Estos compuestos estn surgiendo como una nueva clase de agentes teraputicos, que tiene un gran
potencial en el tratamiento de pacientes con GD o GO ( 8 , 9 ). En contraste con las opciones de
tratamiento ya existentes, antagonistas de TSHR pueden dirigirse especficamente a los mecanismos
patognicos subyacentes. Tanto nuestro grupo ( 10 ) y el de van Zeijl et al ( 11 ) han demostrado
previamente que M22 estimula la produccin de cAMP por fibroblastos orbitales ir y que esta
estimulacin puede ser inhibida por TSHR antagonistas de molculas pequeas ( 11 , 12 ). Se realiz el
presente estudio para determinar si la TSH u otra TSAb podran estimular la produccin de cAMP, la
fosforilacin de Akt, o la produccin de HA en fibroblastos orbitales indiferenciadas. Tambin se
investig si la molcula pequea antagonista de TSHR NCGC00229600 ( 13 ), denominado 1 , puede
inhibir estas funciones orbitales de fibroblastos inducida TSAb-piensa que son importantes en el
desarrollo de IR.
Materiales y Mtodos
Cultivo celular
Especmenes orbitales de tejido adiposo se obtuvieron de pacientes eutiroideos con GO someterse a una
ciruga de descompresin orbital para la enfermedad grave (n = 13). De estos pacientes, 5 fueron
tratados con corticosteroides antes de someterse a la ciruga de descompresin orbitaria. Siete pacientes
recibieron tratamiento radiactivo yodo, 3 haban tomado medicamentos antitiroideos, 1 tiroidectoma se
sometieron, y 2 recibieron ningn tratamiento para el hipertiroidismo. Siete pacientes eran fumadores
actuales. Experimentos individuales utilizan las clulas derivadas de 1 de 2 diferentes conjuntos de
pacientes (ya sea n = 6 o n = 7). Los tejidos se trituraron y se colocan directamente en placas de cultivo
de plstico, lo que permite fibroblastos de preadipocitos a adherirse y proliferar como hemos descrito
anteriormente ( 14 ). Las clulas se cultivaron inicialmente en un humidificado 5% de CO incubadora
a 37 C en medio 199 que contiene suero bovino fetal al 20% (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc, Logan,
Utah), gentamicina (20 mg / ml), y la penicilina (100 U / ml). Ellos se mantuvieron posteriormente en
75 mm de frascos en medio 199 que contienen antibiticos y 10% de FBS, sin los nutrientes necesarios
para la diferenciacin de adipocitos. La junta de revisin institucional de la Clnica Mayo ha aprobado
estos estudios, que se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices oficiales.
Algunos de los experimentos fueron diseados para evaluar el impacto de la pequea molcula
antagonista TSHR 1 ( 13 ) sobre la guanilato ciclasa o sealizacin PI3K/Akt en cultivos celulares
orbitales GO tratados con el monoclonal TSAb M22 o MS-1 o con TSH bovina (bTSH) (T8931, Sigma-
Aldrich, St Louis, Missouri). M22 se obtuvo de Kronus (M22-1b; Boise, Idaho) ( 15 ). MS-1 fue
suministrado amablemente por el Dr. Terry Davies (Mount Sinai School of Medicine, Nueva York,
Nueva York) ( 16 ). Debido a que 1 tiene propiedades agonistas inversos sobre la sealizacin de TSHR,
como control se utiliz el antagonista de TSHR pequea molcula neutra NCGC00242595 ( 17 ),
denominado 2 , que tambin inhibe de TSHR dependiente de agonista de sealizacin, pero no tiene
efecto sobre TSHR constitutiva de sealizacin en tirocitos. El uso de ambos ligandos en comparacin
nos ha permitido demostrar que la inhibicin de la actividad basal por 1 es especfico y causada por las
propiedades agonistas inversos. Los compuestos 1 y 2 se disolvieron inicialmente como una solucin 10
mM en dimetil sulfxido (DMSO). Por consiguiente, los medios de cultivo se ajustaron para contener la
misma concentracin de DMSO como estaba presente en los cultivos paralelos tratados con las
diferentes dosis de 1 o 2 . Para estos estudios, las clulas IR orbitales se hicieron crecer hasta confluencia
en medio 199 que contiene 10% de FBS en placas de 24 pocillos. Las clulas se sembraron en placas de 6
pocillos, cultivadas a la confluencia, y suero de hambre durante 24 horas. Los cultivos se trataron
previamente con 1 (1,0 nM-30 mM), 2 (1,0 a 30 mM), o vehculo (0,1% -0,3% de DMSO) durante 30 a
60 minutos para permitir la unin al receptor y a continuacin se incubaron durante entre 10 y 60
minutos en medio libre de suero que contiene 1 , 2, o vehculo y M22 (100 ng / ml; 0,667 pM), EM-1
(10 mg / ml), o bTSH (10 U / L). Algunos experimentos tambin contenan la IgG2 de control de
isotipo (10 mg / ml; BD Biosciences, San Diego, California).
Otros experimentos miden el efecto de 1 en la produccin de HA en cultivos tratados con M22, MS-1, o
bTSH. Para estos estudios, las clulas IR orbitales se hicieron crecer hasta confluencia en medio 199 que
contiene 10% de FBS en placas de 24 pocillos. Los cultivos se ven privados de suero durante 24 a 48
horas antes del inicio de los experimentos, con pozos de recepcin de 1 , 2, o vehculo a las
concentraciones indicadas para las ltimas 24 horas de preincubacin. Las clulas se cultivaron durante
48 horas en medio libre de suero que contienen M22, MS-1, o bTSH, con o sin las mismas
concentraciones de 1 , 2, o vehculo. Algunos experimentos tambin contenan la IgG2 de control de
isotipo (10 mg / ml).
Medicin de la produccin de cAMP
Los niveles extracelulares de AMPc se midieron mediante un ensayo de AMPc (KGE002B, R & D
Systems, Minneapolis, Minnesota) utilizando un anticuerpo policlonal que se une competitivamente
cAMP en las normas o sobrenadantes de la muestra. Los resultados se expresan como veces el cambio
(aumento o inhibicin) en la produccin de cAMP con respecto a que en los controles apropiados.
La medicin de la fosforilacin de Akt
La fosforilacin de la protena Akt se evalu utilizando un kit ELISA comercial [DuoSet IC Humano
fosfo-Akt (S473) Pan especfica ELISA; R & D Systems]. Este kit basado en clulas cuantifica activado
(serina 473 fosforilada) protena fosfo Akt (pAkt) con relacin a la protena Akt total. Los resultados se
expresan como veces el cambio (aumento o inhibicin) en la relacin relativa a que en el control
paralelo o culturas de comparacin-pAkt-a Akt.
2
2
pAkt tambin se midi utilizando transferencia Western. Los cultivos confluentes se privaron de suero
durante 24 horas y luego se dejaron sin tratar o tratado previamente durante 30 minutos con 1 (30
mM). Las clulas se cultivaron a continuacin durante 30 minutos en medio libre de suero, con o sin 1 ,
que contiene M22 (100 ng / ml) o control. Protena celular fue extrado por medio de una completa
lisis-M, el protocolo libre de EDTA (Roche, Indianapolis, Indiana) para extraer una protena
citoplasmtica y nuclear total. Los extractos se sometieron a electroforesis en 4% a 12% Bis-Tris gel, se
electrotransfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno, y se transfirieron con anticuerpo
primario contra Akt total, Ser473pAkt, o gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (9272, 9271, y 2118,
respectivamente; clula Signaling Technology, Danvers, Massachusetts) a una dilucin 1:1000. Se
aplic en una dilucin 1:2000, seguido por la deteccin de quimioluminiscencia; La peroxidasa ligada
conjugado apropiado secundario IgG-rbano picante (Cell Signaling Technology 7074). Los resultados
se expresan visualmente por un inmunoblot representativo y mediante anlisis densitomtrico de las
bandas producidas (pAkt / Akt total).
Medicin de la produccin de HA
La produccin de HA se ensay segn las instrucciones del fabricante, utilizando un kit ELISA
comercial de HA (K-1200; Echelon Biosciences Inc, Salt Lake City, Utah) mediante la medicin de la
cantidad de HA liberado en el medio de cultivo durante la incubacin de 48 horas. Los resultados se
expresan como veces el cambio (aumento o inhibicin) en comparacin con la de los controles
paralelos.
Los anlisis estadsticos
El emparejado t test fue utilizado para evaluar diferencias en las medias de las variables continuas, con
los valores que se presentan como la media SEM. Las diferencias entre los valores se consider
significativo un valor de P <0,05. Se utiliz la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney para
evaluar las diferencias entre los grupos.
Resultados
Inhibicin por antagonistas de TSHR de la produccin de AMPc estimulados por M22
Encontramos estimulacin significativa de la produccin de cAMP en los fibroblastos orbitales GO (n =
6) tratados durante 30 minutos con M22 (aumento del 43,0% 2,25% [media SEM], P = 0,001) (
Figura 1 A). Se observaron resultados similares a los 10 minutos (datos no mostrados). Tambin se
examinaron los efectos dependientes de la dosis de M22 o bTSH en la produccin de AMPc y observ
estimulacin significativa por M22 en 1,0, 5,0, 10, o 100 ng / ml y por bTSH en 0,1, 1,0, o 10 U / L
(Figura complementarias que se publican en el sitio web Journals Online La Sociedad de Endocrinologa
en http://jcem.endojournals.org ).
La adicin de 1 a los cultivos GO disminuy significativamente constitutiva (independiente de ligando)
y la produccin de cAMP inhibe la produccin de cAMP estimulada por M22 a niveles por debajo de los
niveles de control y al mismo nivel que inhibe la produccin de cAMP constitutiva ( Figura 1 A). En
contraste, como se esperaba, el antagonista neutro 2 no disminuy la produccin de cAMP constitutiva
en los cultivos de control y no inhibi M22 estimulacin de la produccin de cAMP en estos cultivos.
Inhibicin por antagonistas de TSHR de la fosforilacin de Akt estimulados por M22
Se encontr que la fosforilacin de Akt (como se evalu por ELISA) se increment significativamente
cuando los cultivos orbitales GO se expusieron durante 30 minutos a M22 (aumento de 91,0% 5,7%, P
= 0,002) ( Figura 1 B). Se observaron resultados similares en 10 minutos.
La adicin de 1 a los cultivos GO inhibi significativamente la fosforilacin de Akt inducida por M22
para controlar los niveles a los 30 minutos como se evalu por ELISA ( Figura 1 B). Se observaron
resultados similares en 10 minutos. Una tendencia hacia niveles ms bajos de la fosforilacin de Akt se
observ cuando 1 se aadi a los cultivos de control, pero este efecto no fue estadsticamente
significativa. Como era de esperar, el antagonista neutro 2 no disminuy la fosforilacin de Akt
constitutiva en los cultivos de control. En contraste, la inhibicin esperado por 2 de la produccin pAkt
estimulado-M22 no alcanz significacin pero mostr una tendencia en esa direccin. Esta falta de
significacin se puede explicar tanto por el relativamente pequea magnitud de la disminucin y por la
gran variabilidad en los niveles de HA producidas entre las distintas cepas de pacientes.
Experimentos de transferencia Western (n = 3) con la cuantificacin densitomtrica confirmaron estos
resultados, que muestran un aumento en la fosforilacin de Akt (Ser473pAkt/total Akt) en cultivos
tratados con M22 (doble cambio de 1,5 0,9, P = 0,003) con la inhibicin de esta por 1 a los niveles de
control ( P = 0.023) ( Figura 2 ).
La inhibicin por 1 de la produccin de HA estimulado por M22
Tratamiento de GO fibroblastos orbitales con M22 result en aumento de la produccin de HA
(aumento de 48,0% 2,6%, P = 0,001) con respecto a que con medios de control ( Figura 1 C). El
tratamiento de los cultivos estimulados-M22 con 1 (10 mM) result en una inhibicin significativa de la
produccin de HA a niveles por debajo de los niveles de control. Adems, 1 redujo constitutiva (agonista
independiente) la produccin de HA (inhibicin del 61,7% 8,5%) en comparacin con la de los medios
de control ( P = 0,008). En contraste, el antagonista neutro 2 (10 mM) no disminuy la produccin de
HA constitutiva en los cultivos de control. Sin embargo, como para 1, 2 inhibi significativamente la
produccin estimulada-M22 de HA para controlar los niveles en estas clulas.
Tambin se examinaron los efectos de diferentes concentraciones de 1 y 2 de ligando-independiente y la
produccin de HA-estimul la M22 en las clulas orbitales GO. Se encontr que 1 , inhibi la produccin
de HA constitutiva a 100 nm y las dosis ms altas (entre el 24,9% 10,9% y 61,7% 8,5%) en
comparacin con la de los medios de control ( Figura 3 A). En contraste, 2 (1,0 a 30 mM) no inhibe la
produccin de HA constitutiva en cualquier dosis. Se demostr adems que 1 inhibieron
significativamente la produccin de HA estimulado-M22 a niveles por debajo de los niveles de control a
100 nm y dosis ms altas y que 2 inhibi significativamente la produccin de HA estimulado-M22 a 10
M y dosis ms altas ( Figura 3 B).
Adems, se examinaron estos datos con respecto a los efectos de dosis de 1 en porcentaje de inhibicin de
la produccin de HA estimulado-M22 y se determin que la concentracin de 1 requerido para medio-
mximo de inhibicin (IC ) estimulado la produccin de HA-M22 era 830 nM ( Figura 3 B). La
inhibicin de la produccin de HA por debajo de los niveles de control fue evidente cuando las clulas
fueron tratadas con concentraciones ms altas de 1 , que representa la inhibicin de la actividad
constitutiva del receptor tambin.
La estimulacin de la produccin de AMPc, fosforilacin de Akt, y la produccin de HA por otros
agonistas de TSHR y su inhibicin por 1
Para determinar si la produccin de AMPc, fosforilacin de Akt, o la produccin de HA pueden ser
estimuladas por otros ligandos TSHR y si la estimulacin puede ser inhibida por 1 , se realiz otra serie
de experimentos (n = 7) usando bTSH (10 U / L) o la TSAb MS-1 (10 mg / ml) como un agonista.
Hemos demostrado que bTSH estimulado cAMP, pAkt, y la produccin de HA en fibroblastos orbitales
GO (incrementos del 102% 3,0%, P = 0,005; 144% 13,2%, p = 0,02, y el 31,0% 4,8%, P = 0,04,
respectivamente) como lo hicieron MS-1 (aumenta de 67,0% 5,6%, P = 0,002; 229% 23,0%, p =
0,046, y 28,0% 1,25%, P <0,001, respectivamente) ( la Figura 4 , A-C). Adems, 1 (30 mM) inhibi la
produccin de cAMP inducida por bTSH a los niveles de control de cerca y se inhibe la produccin de HA
con respecto a los niveles de control, con una tendencia hacia una disminucin de la TSH estimulada
por la fosforilacin de Akt que no alcanz significacin. Del mismo modo, 1 inhibi estimulada por MS-
50
1 y HA cAMP produccin a niveles por debajo de los niveles de control y pAkt a un nivel cercano a los
niveles de control.
Discusin
Estudios de varios laboratorios apoyan un papel importante para la acumulacin de HA ( 18 ) y la
ampliacin de los tejidos adiposos dentro de la rbita en el desarrollo de IR ( 1 , 2 ). Nosotros y otros han
demostrado que la TSAb M22 ( 4 , 5 ), IgG estimulante obtenido a partir de los sueros de los pacientes
con hipertiroidismo de Graves ( 5 ), o clulas transfectadas con un mutante de TSHR estimulante ( 6 )
aumentar la produccin de HA, la expresin del gen de hialuronano sintasas , o la adipognesis ( 3 ) en
las clulas orbitales humanos. El presente estudio demuestra por primera vez que la EM-1, otro
monoclonal TSAb, aumenta la produccin de HA y ambos cAMP y la generacin pAkt en fibroblastos
orbitales GO, apoyando a nuestros hallazgos anteriores sobre M22 y TSH como activadores de G y
quizs G efectores y como estimuladores de la produccin de HA en clulas orbitales GO ( 3 , 4 ).
Nuestros hallazgos son similares a los de Morshed et al ( 16 ) que utiliza tirocitos de rata (FRTL-5) para
caracterizar diferentes cascadas de sealizacin activadas por la TSH y TSAbs.
La molcula pequea antagonista de TSHR 1 se ha demostrado que inhiben tanto constitutiva y GD-
IgG-o la produccin de cAMP estimulada por la TSH en clulas de modelo con la sobreexpresin estable
de TSHR humano (HEK-EM293) y en cultivos de clulas de la tiroides humana ( 13 ). Del mismo modo,
los estudios actuales mostraron una inhibicin significativa de la EM-1-o-M22 estimulado la produccin
de HA y la fosforilacin de Akt en los fibroblastos orbitales no diferenciadas por 1 a los niveles de control
o inferior y confirmaron nuestra demostracin anterior de la inhibicin de AMPc por este compuesto (
10 ). van Zeijl y colaboradores ( 11 ) reportaron recientemente que otro antagonista TSHR de bajo peso
molecular, Org-274179-0, bloquea completamente la produccin de cAMP inducida por TSH
recombinante humana, GD-IgG o M22 en la diferenciada GO fibroblastos orbitales en concentraciones
nanomolares. Recientemente hemos demostrado una inhibicin similar de 1 a 30 M de la produccin de
cAMP estimulada por M22 ( 10 ). En los estudios actuales, se demostr la inhibicin de la produccin
inducida-M22 AMPc, fosforilacin de Akt, y la produccin de HA usando 1 a una concentracin de 10
mM ( Figuras 1 , 2 , y 4 ). Aunque las dosis ms bajas de 1 no fueron estudiados en trminos de AMPc o
la produccin pAkt, hicimos determinar el impacto de las concentraciones de 1 a menos de 10 m con
respecto a la inhibicin de la produccin de HA inducida-M22. Hemos encontrado que las altas dosis de
1 inhibieron la produccin de HA estimulado-M22 hasta debajo de los niveles de control, que representa
la inhibicin de la actividad constitutiva del receptor tambin. El compuesto Org 274179-0 se ha
demostrado en experimentos que examinan la respuesta de cAMP a tener un IC en el intervalo
nanomolar baja (11 nM) ( 19 ). Nuestros datos muestran que el CI de 1 para la inhibicin de la
produccin de HA es 830 nM, lo que indica que la potencia de 1 es ms alto para la produccin de HA
que para la produccin de cAMP (2,0 M) ( 20 ).
Una diferencia entre nuestro estudio y el estudio de van Zeijl y sus colegas es que emplearon fibroblastos
orbitales GO que se haban sometido a la diferenciacin de adipocitos, mientras que nuestras clulas no
se diferencian. Debido a que los fibroblastos orbitales aumentan su expresin de TSHR medida que se
diferencian en adipocitos ( 21 , 22 ), es probable que las clulas orbitales utilizados por van Zeijl y colegas
tenan una mayor densidad de TSHR que hicieron nuestras clulas. Adems, van Zeijl et al ( 5 , 23 ) han
demostrado que los fibroblastos orbitales diferenciadas responden con una produccin ms robusta de
HA cuando estimulados por M22 o GD-IgG de que las clulas no diferenciadas. Estos hallazgos sugieren
que los fibroblastos orbitales diferenciadas pueden modelar en estadio intermedio de la fase final del IR,
mientras que los fibroblastos no diferenciados podran reflejar una etapa ms temprana de la
enfermedad. Otros estudios determinarn si antagonistas de molculas pequeas de TSHR tambin
inhiben la adipognesis en fibroblastos orbitales, un proceso que depende principalmente de la activacin
de PI3K/Akt ( 3 ).
s
q
50
50
Estos estudios apoyan el concepto de que TSAbs juegan un papel central en la patognesis IR y vinculan
claramente TSHR ligadura en fibroblastos orbitales a la acumulacin de HA dentro de la rbita ( 2 ). La
inhibicin de esta patolgicamente importante funcin celular para controlar los niveles o menor por 1
representa la evidencia ms fuerte hasta la fecha, lo que sugiere que antagonistas de molculas
pequeas similares como las drogas de TSHR con mayor potencia pueden ser beneficiosos en el futuro
como un tratamiento para GO ( 8 , 9 ). La demostracin de este efecto en los fibroblastos orbitales
indiferenciadas, un modelo de la enfermedad en etapa temprana, sugiere que estos compuestos pueden
ser particularmente tiles a principios de GO para prevenir una amplia remodelacin del tejido
conjuntivo o para la prevencin de IR en pacientes con hipertiroidismo de Graves.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y
Renales (subvencin DK77814 ).
Disclosure: Los autores no tienen nada que revelar.
Notas al pie
Abreviaturas:
bTSH TSH bovina
DMSO sulfxido de dimetilo
FBS suero bovino fetal
GD La enfermedad de Graves
GD-IgG inmunoglobulina G de los sueros de pacientes con enfermedad de Graves
GO Graves oftalmopata
HA cido hialurnico
PI3K fosfoinositol 3-quinasa
TSAb anticuerpo estimulante de la tiroides
TSHR receptor de tirotropina.
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Figuras y Tablas
Figura 1.
Efecto del tratamiento con M22 (100 mg / ml) con o sin 1 o 2 (10 mM cada uno) sobre la produccin de cAMP
(A), la fosforilacin de Akt (B), o la produccin de HA (C) en indiferenciada GO cultivos de fibroblastos orbitales
(n = 6). Los resultados se expresan como media SEM cambio veces en relacin con los cultivos de control o en
paralelo cultivos tratados con M22. * P <0,05; ** P <0,001.
Figura 2.
Top, transferencias de Western representativas que muestran Akt total (Takt), Ser47 3 fosforilados Akt (pAkt), y
las bandas de gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa de protenas (GAPDH) en confluente indiferenciadas GO
cultivos de fibroblastos orbitales expuestos a 1 (30 M), M22 (100 mg / ml), ambos tratamientos, o el control. En
pocas palabras, la cuantificacin densitomtrica de intensidad neta de las bandas (pAkt / Takt) en
transferencias de Western (n = 3) se muestra.
Figura 3.
Impacto de la concentracin de 1 o 2 en la produccin de HA en ligando-independiente (A) y estimuladas con
M22 (b) los cultivos de fibroblastos orbitales GO indiferenciados (n = 6). Los cultivos se trataron con 1 () o 2
() a las concentraciones indicadas (A) o con M22 (100 mg / ml) ms 1 o 2 en las concentraciones indicadas (B).
Los medios de cultivo se ajustaron para contener la misma concentracin de DMSO como estaba presente en los
cultivos paralelos tratados con las diferentes dosis de 1 o 2 . ELISA resultados se expresan como porcentaje de
disminucin (media SEM) en HA produccin en relacin a la de los cultivos no tratados paralelos (A) o por
ciento de disminucin (media SEM) en HA produccin respecto a la de los cultivos tratados con M22 paralelas
(B). * P <0,05; ** P <0,001, para la inhibicin de la produccin de HA con respecto a la de cultivos paralelos no
tratadas o a la de los cultivos tratados con M22 paralelo sin 1 o 2 (* P <0,05).
Figura 4.
Efecto del tratamiento con bTSH (10 U / L) o MS-1 (10 mg / ml) con o sin 1 (30 mM) en la produccin de cAMP
(A), la fosforilacin de Akt (B), o la produccin de HA (C) en cultivos de fibroblastos orbitales GO no
diferenciado (n = 7 ). Los resultados se expresan como media SEM veces el cambio en relacin con la de las
culturas paralelas no tratados o con el de MS-1 o culturas TSH tratados paralelos. * P <0,05.
Artculos de la Revista de Endocrinologa Clnica y Metabolismo se ofrecen a continuacin por cortesa de la Sociedad
de Endocrinologa