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N
Temperatura (C)
Picnmetro
Vacio
(P
0
)
Picnmetro
+ H
2
O
(P
W
)
Picnmetro
+ Muestra
(P
M
)
Volumen
(mL)
Densidad
(g/mL)
Agua Muestra
1
2
3
Todas las medidas se realizaron por triplicado. La densidad se obtuvo a partir de la
siguiente ecuacin:
P
Donde:
P
M
: peso del picnmetro lleno de zumo (g)
P0: peso del picnmetro vaco (g)
Pw: peso del picnmetro lleno de agua (g)
: densidad del zumo (g/cm3)
30
6.4.5 Determinacin de cido ascrbico por titulacin con 2,6 -
diclorofenolindofenol (AOAC 967.21: 1998)
a. Valoracin del 2,6 diclorofenolindofenol.
Se prepara una solucin estndar de cido ascrbico con 50 mg de cido
ascrbico que se transfieren a un matraz de 50 ml y se afora con una solucin
de cido oxlico actico. Se transfieren 2 ml de la solucin estndar a un
matraz de 50 ml y se agregan 5 ml de una solucin de cido oxlico actico. Se
valora con una solucin de 2,6 diclorofenolindofenol mediante una bureta,
hasta que se observe la aparicin de un tono rosa plido que persista por lo
menos 5 segundos. Esto se hace por triplicado. De la misma manera se lleva a
cabo la valoracin de tres referencias que contienen 7 ml de la solucin de
cido oxlico-actico ms un volumen igual al gastado en la titulacin del
estndar; el valor obtenido se resta al volumen promedio requerido para valorar
el estndar. La concentracin de indofenol se expresa como mg de cido
ascrbico equivalentes a un ml de indofenol.
b. Determinacin del contenido de cido ascrbico en la muestra.
Se homogenizan 5 g de muestra con 30 ml de una solucin al 5% de cido
oxaloactico. El homogenizado y los lavados se traspasan a un matraz aforado
de 50 ml, y se lleva a volumen con la misma solucin. El extracto se filtra
primero a travs de una membrana de 0.45 micras. Se toma una alcuota de 10
ml del filtrado y se titula con la solucin de indofenol ya valorada. Se resta el
volumen requerido para valorar la muestra, y se hacen los clculos necesarios
para expresar los resultados como mg de cido ascrbico por 100 g de
muestra.
6.4.6 Determinacin de Fenoles Totales (Kuskoski et al, 2005)
El mtodo espectrofotomtrico desarrollado por FOLIN y CIOCALTEAU, para la
determinacin de fenoles totales, se fundamenta en su carcter reductor y es el
31
ms empleado. Se utiliza como reactivo una mezcla de cidos fosfowolfrmico
y fosfomolibdco en medio alcalino (reactivo Folin Ciocalteu), que se reducen
al oxidar los compuestos fenlicos, originando xidos azules de wolframio
(W
8
O
23
) y molibdeno (Mo
8
O
23
).
Se mezclar 20l de muestra, 1L solucin Folin & Ciocalteau (0,2 N) y 500 l
de Na
2
CO
3
(75 g/l). La mezcla ser homogenizada y calentada a 45 C. La
absorbancia del color azul desarrollado se medir a 765 nm. La absorbancia
final de cada muestra ser comparada con una curva estndar de cido glico
(40-200 mg/l).Los resultados sern expresados como mol equivalentes de
cido glico (GAE) por gramo de muestra mg de cido glico por 100 g de
muestra.
6.4.7 Determinacin de la Capacidad Antioxidante Total (Re et al, 1999)
Para determinar la actividad antioxidante total (TAC) se utiliz el mtodo de
ABTS [2,2'-azinobis (cido 3-etilbenzotiazolina-6- cido sulfnico)], el
compuesto estndar que se utilizar ser el trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-cido de
tetrametilcroman-2-carboxlico). Para las lecturas de la absorbancia se utilizar
un espectrofotmetro marca Perkin Elmer, modelo: Lamda 25 UV / VIS,
Spectrometer.
Segn la metodologa desarrollada por RE, et al (1999), el radical ABTS+ se
obtiene tras la reaccin de ABTS (7 mM) con persulfato potsico (2,45 mM,
concentracin final) incubados a temperatura ambiente (25C) y en la
oscuridad durante 16 h. Este reactivo se mantiene estable por 2 a 3 das si se
guarda en la oscuridad. Una vez formado el radical ABTS+ se diluye con
etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0,70 (0,1) a
754 nm (longitud de onda de mxima absorcin). Las muestras se diluyen con
etanol hasta que se produce una inhibicin del 20 al 80%, en comparacin con
la absorbancia del blanco, tras aadir 20 L de la muestra. A 980 L de dilucin
32
del radical ABTS+ as generado se le determina la A754 a 30C, se aade 20
L de la muestra y se mide de nuevo la A754 pasado 1 minuto. La absorbancia
se mide de forma continua transcurridos 7 minutos.
La disminucin de la coloracin es expresada como el porcentaje de inhibicin
de ABTS, la cual es comparada con una curva estndar del antioxidante
sinttico de referencia, Trolox a una concentracin de 0-15 M (concentracin
final) en etanol, en las mismas condiciones, lo que se hace tambin con cido
ascrbico (0-20 mg/100 mL). Los resultados se expresan en TEAC (actividad
antioxidante equivalente a Trolox) mol de Trolox equivalente por gramo de
muestra, y en VCEAC (actividad antioxidante equivalente a vitamina C) por
tratarse de un alimento.
6.4.8 Recuento de Aerobios Mesfilos (Mtodo de pelculas secas
rehidratables - Petrifilm. AOAC 990.12, 2005)
a. Preparacin de las Muestras
Se pesaran 10 ml de la muestra y se agregaran a 90 ml de agua peptonada al
0.1% contenido en un matraz de 250 ml, agitndose manualmente.
Posteriormente se realizaran diluciones seriadas en base 10, obtenindose
diluciones 10
-2
y 10
-3
.
b. Siembras en placas Petrifilm 3M AC
Se dispondr de la placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada.
Se levantar la pelcula superior y usando una pipeta se incorporara 1ml de
cada una de las diluciones en el centro de la pelcula, realizndose el
anlisis por triplicado.
Se dejar caer la pelcula superior sobre la muestra cuidando que no se
formen burbujas.
33
Se colocara suavemente el dispersor plstico por el lado de la pestaa
hacia abajo sobre la lamina superior, cubriendo el inoculo.
Se levantara el dispersor y se dejara reposar por dos minutos para que
solidifique el gel.
Se incubaran las placas boca arriba en grupos de mximo 20 placas a 35
2 C durante 48 horas.
Posteriormente se realizara el recuento de unidades formadoras de
colonias que presentaron color rojizo.
Se reportara los resultados en unidades formadoras de colonias por
mililitros (ufc/ml) considerando el factor de dilucin utilizado.
6.4.9 Recuento de Hongos y Levaduras (Mtodo de pelculas secas
rehidratables - Petrifilm. AOAC 997.02, 2005)
a. Preparacin de las Muestras
Se pesaran 10 ml de la muestra y se agregaran a 90 ml de agua peptonada al
0.1% contenido en un matraz de 250 ml, agitndose manualmente.
Posteriormente se realizaran diluciones seriadas en base 10, obtenindose
diluciones 10
-2
y 10
-3
.
b. Siembras en placas Petrifilm 3M Mohos y Levaduras
Se dispondr de la placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada.
Se levantar la pelcula superior y usando una pipeta se incorporara 1ml de
cada una de las diluciones en el centro de la pelcula, realizndose el
anlisis por triplicado.
Se dejar caer la pelcula superior sobre la muestra cuidando que no se
formen burbujas.
Se colocar suavemente el dispersor plstico correspondiente sobre la
lmina superior, cubriendo el inculo.
34
Se levantara el dispersor y se dejara reposar por dos minutos para que
solidifique el gel.
Se incubaran las placas boca arriba en grupos de mximo 20 placas a 22
2 C durante 3 5 das.
Posteriormente se realizara el recuento de hongos quienes se observaran
como colonias grandes, difusas y de color variable, mientras que las
levaduras forman colonias pequeas con borde definido y de color azul-
verdoso.
Se reportara los resultados en unidades formadoras de colonias por
mililitros (ufc/ml) considerando el factor de dilucin utilizado.
6.4.10 Recuento de Coliformes Totales (Mtodo de pelculas secas
rehidratables - Petrifilm. AOAC 991.14, 2005)
c. Preparacin de las Muestras
Se pesaran 10 ml de la muestra y se agregaran a 90 ml de agua peptonada al
0.1% contenido en un matraz de 250 ml, agitndose manualmente.
Posteriormente se realizaran diluciones seriadas en base 10, obtenindose
diluciones 10
-2
y 10
-3
.
d. Siembras en placas Petrifilm 3M Coliformes
Se dispondr de la placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada.
Se levantar la pelcula superior y usando una pipeta se incorporara 1ml de
cada una de las diluciones en el centro de la pelcula, realizndose el
anlisis por triplicado.
Se dejar caer la pelcula superior sobre la muestra cuidando que no se
formen burbujas.
Se colocara suavemente el dispersor plstico por el lado liso sobre la
lamina superior, cubriendo el inoculo.
35
Se levantara el dispersor y se dejara reposar por dos minutos para que
solidifique el gel.
Se incubaran las placas boca arriba en grupos de mximo 20 placas a 35
2 C durante 24 horas.
Posteriormente se realizara el recuento de unidades formadoras de
colonias que presentaron color rojo con presencia de gas.
Se reportara los resultados en unidades formadoras de colonias por
mililitros (ufc/ml) considerando el factor de dilucin utilizado.
6.5 TECNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS
6.5.1 Elaboracin de la bebida experimental
Las etapas y operaciones unitarias para la elaboracin de la bebida
experimental se detallan en la Fig. N1.
a) Obtencin de la Infusin de T verde.
Para la obtencin de la infusin de T verde, se seleccionar e higienizar
la materia prima. Para la extraccin se considerar una proporcin de 1 a 25
en relacin T verde: agua; dicha extraccin se realizara a 95 98 C por 5
10 minutos. Posteriormente se filtrar y almacenar en refrigeracin hasta
su uso.
b) Obtencin de Zumo de Camu-camu
El Camu-camu recepcionado ser seleccionado e higienizado, para
posteriormente se realice el pulpeado en una Pulpeadora semi-industrial con
malla 1.5 mm. Seguidamente se realizar el refinado con una malla de 0.5
mm.
36
El zumo de Camu-camu e infusin de T verde obtenidos sern destinados
para realizar las diluciones respectivas, de acuerdo al diseo experimental de
la investigacin.
c) Estandarizacin de la Bebida
La estandarizacin de la bebida se realizar en una Marmita con agitador.
En esta etapa se considerar la regulacin de la acidez con acido ctrico (pH
3.5 3.8), Regulacin de slidos solubles (Brix 1 2 13) para lo cual se
considerar una sustitucin parcial de la sacarosa por edulcorante natural en
polvo (Stevia). Adems de la adicin de otros aditivos permitidos.
d) Pasteurizacin y operaciones finales
La pasteurizacin de la bebida estandarizada se realizar en una Marmita
con agitador, a una temperatura de 82 85 C por 1 0 15 minutos o en un
intercambiador de calor por placas a 82 85 C por 8 15 segundos.
Posteriormente, se envasar en caliente (85 90 C) para que permita la
formacin del vaco en el envase. Finalmente se enfriar mediante choque
trmico y se almacenar a 8 2 C, con la intenci n de garantizar la
estabilidad de las propiedades antioxidantes de bebida elaborada.
6.5.2 Formulacin de las bebidas experimentales
La formulacin de la bebida ser realizada considerando las variables
independientes del estudio, quedando diseado las siguientes
formulaciones experimentales:
37
Insumo
Formulaci
n
1
Formulaci
n
2
Formulaci
n
3
Formulaci
n
4
Infusin de T verde 9700 9700 9500 9500
Zumo de Camu-camu 300 300 500 500
Sacarosa (Azcar blanca) (*) 50 %
60 % 50 % 60 %
Edulcorante (Stevia en polvo) (**) Sustitucin Sustitucin Sustitucin Sustitucin
Acido Ctrico (***) BPF BPF BPF BPF
Estabilizante (CMC) (****) 0.05% 0.05% 0.05% 0.05%
Conservante (Sorbato de K) (****) 0.025% 0.025% 0.025% 0.025%
(*) % de sustitucin de la sacarosa requerida para alcanzar 12-13 Brix de la bebida.
(**) Cantidad necesaria para sustituir la sacarosa en la formulacin (en relacin al poder
edulcorante, Stevia: Sacarosa de 1:100)
(***) Cantidad necesaria para regular el pH de la bebida (pH: 3.5 3.8)
(****) Porcentaje en relacin al total de la bebida elaborada.
38
FIGURA N2
Diagrama de flujo para la elaboracin de una bebida a base de T verde y Camu-
camu (Myrciaria durbia) endulzado parcialmente con Stevia
Estandarizado
Pasteurizado
Envasado
Sellado
Enfriado
Etiquetado
Almacenado
Dilucin Infusin Te verde: Camu-camu
Acidez de 0.3 a 0.4%
12 - 13 Brix
Sacarosa / Edulcorante
Estabilizador
( 85 C/ 10 mi n)
(85 C)
Lavado
Extraccin
Filtrado
Camu-camu
Seleccin
(Metabisulfito de Na al 0.5%
por 10 min.)
( Mal l a de 0. 5 mm)
( Mal l a de 1. 5 mm)
Seleccin
T verde
Lavado
Remojado
Pulpeado
Refinado
(18 C)
(8 2 C)
T verde: Agua 1: 25
(90 - 95 C/ 5 - 10 min)
Fuente: Elaboracin propia.
39
6.5.3 Anlisis sensorial de las bebidas experimentales
Se evaluaran sensorialmente las cuatro formulaciones (bebidas experimentales).
Para la prueba se contara con 30 panelistas no entrenados, los cuales
calificaran las cuatro muestras debidamente codificadas a una temperatura de
20 C (temperatura ambiental), para esto se utiliza r una prueba de valoracin
con una escala hednica de siete puntos.
Escala Hednica de 7 Puntos
Puntaje Calificacin
1 Me disgusta extremadamente
2 Me disgusta mucho
3 Me disgusta ligeramente
4 Ni me gusta ni me disgusta
5 Me gusta un poco
6 Me gusta mucho
7 Me gusta extremadamente
Ver ficha de evaluacin sensorial (Anexo N1)
6.5.4 Evaluacin de las propiedades antioxidantes de la bebida
formulada
Para los anlisis respectivos se proceder a acondicionar la muestra. Para ello
se centrifugar la bebida experimental a fin de obtener una fraccin de suero, el
cual nos permitir la evaluacin de propiedades antioxidantes de las muestras
experimentales.
La evaluacin de las propiedades antioxidantes de la bebida formulada y
aceptada sensorialmente, consistir en la determinacin del contenido de acido
40
ascrbico, compuestos fenolicos totales (Fenoles Totales) y la determinacin
de la capacidad antioxidante, por los mtodos detallados en los Apartados
6.4.4, 6.4.5 y 6.4.6 respectivamente.
Evaluacin de las propiedades Antioxidantes del Producto Final
PARAMETROS R1 R2 R3 PROM
Contenido de c. 40scrbico
(mgr c. 40scrbico/ 100 g muestra)
Fenoles Totales
(mol Trolox / g muestra)
Capacidad Antioxidante Total
(mol cido glico /g muestra)
6.5.5 Evaluacin fisicoqumica y microbiolgica de la bebida
formulada
La evaluacin fisicoqumica de la bebida formulada consistir en la
determinacin de pH, acidez, Brix y Densidad del producto formulado. Los
mtodos se encuentran detallados en el Apartado 6.4.
Evaluacin Fisicoqumica del Producto Final
PARAMETROS R1 R2 R3 PROM
pH
Acidez (% c. Ctrico)
Brix
Densidad (g/mL)
La evaluacin microbiolgica de la bebida formulada consistir en el recuento
de Aerobios mesfilos, Mohos, Levaduras y Coliformes totales del producto
final (NTS N071 DIGESA, 2008), los cuales se en cuentran detallados en el
Apartado 6.4.
41
Recuento Bacteriolgico del Producto Final (ufc/g)
PARAMETROS R1 R2 R3 PROM
Aerobios Mesfilos
Mohos
Levadura
Coliformes Totales
6.6 TECNICAS DE ANALISIS DE DATOS
Los resultados de la evaluacin sensorial sern analizados con los test de
anlisis (prueba sensorial no paramtricas) de Friedman y Test de
comparacin de media LSD (Diferencia Media Significativa). El anlisis
aplicado de Friedman, determinar si existen diferencias significativas en el
grado de satisfaccin de las bebidas formuladas a un nivel de confianza del
95%. El LSD ayudar a determinar los grupos homogneos, encontrando si
existe o no diferencia entre las bebidas formuladas ( =0.05).
La presencia de efectos del uso de T verde, Camu-camu y Stevia sobre las
propiedades antioxidantes de las bebidas formuladas, se medir a travs del
aumento de la concentracin de Fenoles totales y un incremento de la
capacidad antioxidante. La semejanza o diferencia entre los tratamientos o
grupos experimentales, se establecer mediante el anlisis de varianza ANVA,
con un nivel de significancia p=0.05, utilizando las iteraciones realizadas.
La estimacin del mejor tratamiento que evidencie una mayor concentracin
de Fenoles Totales y Mayor Actividad Antioxidante, para los valores medios de
los tratamientos, se obtendrn por comparaciones mltiples que es posible con
3 unidades repetitivas para el diseo Factorial Simple de 2 x 2, aplicando en
primer lugar un diseo de Tuckey, y como segundo lugar el diseo de Duncan.
El procesamiento de los datos se realizar con el programa estadstico
XLSTAT 2012 complemento para Windows Office 2010.
42
CAPITULO VII
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
El presente cronograma muestra la duracin de las diferentes actividades:
ACTIVIDADES
SEMANAS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1
0
1
1
1
2
1
3
1
4
1
5
1
6
a. Revisin de
bibliografa
X X X X X X
b. Eleccin del
tema de
investigacin
X
c. Formulacin del
anteproyecto
X X
d. Elaboracin del
anteproyecto
X X X
e. Organizacin de
recursos
X X
f. Implementacin
del proyecto
X X
g. Ejecucin del
estudio
X X X X X X X
h. Procesamiento
de datos
X X X
i. Anlisis e
interpretacin de
los resultados
X X
j. Elaboracin del
informe final
X X
43
CAPITULO VIII
PRESUPUESTO DEL PROYECTO
ESPECIFICACIONES Meses Unidades
Valor
Unitario
Total Parcial
(S/.)
Honorarios
Investigadores 4 2 750 6000
Asistentes 2 1 375 750
Servicios y/o Alquileres
Planta piloto - Operaciones Unitarias 2
-
1200 2400
Laboratorios de Anlisis 2
-
1200 2400
Equipos e Instrumentos
Espectrofotmetro UV/VIS -
1
18500 18500
Micropipeta 10 -1000 L -
1
550 550
Materiales
Materias Primas e insumos -
-
600 600
Envases de vidrios (Botellas, Viales, etc) -
-
250 250
Reactivos para anlisis -
-
1500 3850
Otros suministros -
-
200 200
Suministros informticos y de Oficina
Papel de escritorio (Paquete de 500 und) -
2
15 30
Cartuchos de Tintas (B/N, Color) -
4
35 140
Otros (Ej. Mantenimiento y/o repuestos) -
-
100 100
Fotocopias, impresiones y anillados
Fotocopias -
1000
0.10 100
Impresin y anillados (proyecto) -
4
15 60
Empastados (informe final) -
4
25 100
Viajes y Movilidades
Pasajes 4
20
5 400
Otros gastos (reuniones, varios) 4
1
20 80
Imprevistos
Mximo 5 % del aporte DGI
1500
TOTALES 38010
44
CAPITULO IX
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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revisin. Maryland-USA.1998.
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VON STASZEWSKI, Mariana. Impacto de la interaccin entre polifenoles de t
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ZAPATA, Sergio. Posibilidades y potencialidad de la agroindustria en el Per en
base a la biodiversidad y los bionegocios. Comit Biocomercio Per. Lima-Per
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ZAVALA, Lili. El Camu-camu. Boletn Nutricional. Fundacin Universitaria
Iberoamericana. rea de Salud y Nutricin. Junio, 2010.
47
ANEXO N1
FICHA DE EVALUACIN SENSORIAL
Prueba Sensorial de Escala Hednica de 7 puntos
Producto: Bebida a base de T verde y Camu-camu endulzado parcialmente
con Stevia.
Cdigo: .
Nombre: .. Fecha:..
Pruebe por favor las muestras en el orden que se le dan, e indique su nivel de agrado
con cada muestra, marcando el punto en la escala que mejor describe su sentir con el
cdigo de la muestra. Por favor denos su razn para esta actitud.
Calificacin Sabor Dulzor Acidez Color AG
Me disgusta extremadamente
Me disgusta mucho
Me disgusta ligeramente
Ni me gusta ni me disgusta
Me gusta un poco
Me gusta mucho
Me gusta extremadamente
Observaciones:
Muchas gracias!
48
ANEXO N2
NTS N071- MINSA / DIGESA- V.01
NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE
CALIDAD SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO
HUMANO