CHU

Abdelkader HASSANI
SIDI BEL ABBES

M. Benhalima, Y. Meddour
 Introduction (1)
rejet de l’organe greffé = Obstacle majeur à la transplantation allogénique

Rejet: résultat de la réponse immune du receveur à des molécules de surface polymorphes portées
par le greffon et différentes de celles du receveur

Ces molécules = Antigènes majeurs de transplantation ou d’histocompatibilité

codées par les gènes du complexe majeur d’Histocompatibilité =CMH

Complexe HLA chez l’homme (Human Leucocyte Antigen)

J Dausset 1958 décrit le premier Ag sur les leucocytes =Ag Mac (Ag HLA A2 ) suite à la mise en évidence
de leucoagglutinines dans le sérum de patients transfusés et de femmes multipares en 1952.

Majeur : -Rapidité du rejet

- Forte réponse humorale et cellulaire (production d’Ac et de CTL ) en cas d’incompatibilité
HLA entre D et R

Histo : Reconnaissance des molécules du CMH détermine la compatibilité ou l’incompatibilité entre les
tissus

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 Introduction (2)

Autres alloantigènes :

• Antigènes ABO: Exprimés sur l’endothélium vasculaire  forte réponse humorale

• Antigènes mineurs d’Histocompatibilité  rejet aigu cellulaire

• Antigènes spécifiques des monocytes et des cellules endothéliales

 cibles des Ac préformés ou induit par la greffe.

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 Le Complexe HLA
chromosome 6

Région I Télomérique : Gènes classe I : classiques A,B,C Non classiques E,F,G

Région II Centromérique : Gènes DR, DQ, DP

Région III Intermédiaire : plusieurs Gènes dont C2 ,C4, TNF

Seuls gènes A,B,C ,DR, DQ, DP impliqués dans:

le rejet de greffe d’organes ou de tissus
la présentation de peptides antigéniques aux lymphocytes T initiant la réponse immune.

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 Gènes HLA

Gène A et B codant pour la chaînes α et ß Chaîne α

Cellules Molécules de Classe II Molécules de Classe I

Distribution restreinte (CPA) Distribution ubiquitaire
Ly T - ++++
Ly B +++ ++++
Ly T activés ++ +++
Plaquettes - +++++
Monocytes, MΦ ++++ ++++

Cellules dendritiques +++++ +++++

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 Gènes HLA classe II

                                 
DP DQ     DR    
           
β1 α1 β1 α1 β1 β3 β4 β5 α
           
                                     

                                 
                                     
DP DQ                 DR 51

1à6 1à9                   DR 53
                    DR 52
                      DR 1 à 18

Locus DR
-DRA non polymorphique : Chaînes α
-DRB en nombre variable :
DRBI chez tous les individus
DRB3, 4 ou 5 variable
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 Liaison étroite
Transmission des gènes HLA en bloc des parents aux enfants (sauf rares recombinaisons ≈ 0,8 à 1%)

Père Mère

A1 B8 DR3 a A29 B44 DR2 c

A3 B7 DR4 b A2 B51 DR5 d

 
 
 
 
   A1 B8 DR3 a A1 B8 DR3 a A3 B7 DR4 b A3 B7 DR4 b
A29 B44 DR2 c A2 B51 DR5 d A29 B44 DR2 c A2 B51 DR5 d
 
E1 E2 E3 E4
E5
La probabilité pour deux enfants d’une même fratrie de :

- partager deux haplotypes en commun est de 25% : HLA génoidentique E1 et E5

- partager 1 haplotype en commun est de 50 % : HLA haploidentique E2 et E3

- ne partager aucun haplotype est de 25%  : HLA différent E4

 

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 Expression Codominante
Chaque enfant hérite des deux haplotypes parentaux dont l’expression est codominante.

DR4 DR5

B8

DQ DP1
2
A A3 B7 DR 4 DQ2 DP1
B A2 B8 DR5 DQ3 DP2
A2
DQ3

A3 B7

DP2

 chaque individu exprime 2 molécules A, 2B, 2C, 2 à 4 DR, 2DQ 2DP

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 Polymorphisme extrême

100 Antigènes 6 9 19 46 10 21

Plus de 1700 111 59 463 617 179 388

allèles

B38(16) B*38 01 B*38 15

B16 splits sérologiques splits alléliques
B39(16) B*39 01 B*39 041

En terme de transplantation ce polymorphisme se traduit par la difficulté à apparier deux individus HLA
compatibles en dehors de la fratrie

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 Polymorphisme HLA

A B DR DQ

A1 B5 B50(21) DR1 DQ1

A2 B7 B51(5) DR2 DQ2
A3 B8 B52(5) DR7 DQ7(3)
A23(9) B16 B53 DR3 DQ3
A9 B12 B54(22) DR4 DQ4
A10 B13 B55(22) DR5 DQ5(1)
A11 B14 B56(22) DR6 DQ6(1)
A19 B15 B56(17) DR8 DQ8(3)
A24(9) B17 B58(17) DR9 DQ9(3)
A25(10) B18 B59 DR10
A26(10) B21 B60(40) DR11(5)
A28 B22 B61(40) DR12(5)
A29 B27 B62(15) DR13(6)
A30 B35 B63(15) DR14(6)
A31 B37 B63(15) DR17(3)
A32 B38(16) B64(14) DR18(3)
A33 B39(16) B65(14) DR15(2)
A34(10) B40 B67 DR16(2)
A36 B41 B70
A43 B42 B72(70)
A66(10) B44(12) B73
e s
A68(28) B45(12) B75(15) u
A69(28) B46 B76(15) g iq
o
A74 B47 B77(15)
r ol
A80 B48 B78
s é
B49(21) B81
é s
B82
i t
B83
ci f ic
é
HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour Sp
 Molécules HLA
 Glycoprotéines membranaires : superfamille des immunoglobulines.
Gènes Molécule Classe I Molécule Classe II Gènes

α1 α2 α1 β1
E2
E2

E3

E3
α3 β2m α3 β2
E4

membrane cytoplasmique
Gène A, B, C Gène B Gène A
8 exons 6 exons 5exons

Polymorphisme chaine Béta ++

DRA monomorphe
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 Molécules HLA
Structure tridimensionnelle

Domaine α 1 α 2 : cavité du peptide Domaine α1β1 : cavité du peptide

fond: feuillet béta fond: feuillet béta
Bord: hélice alpha Bord: 2 hélices alpha
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 Fonction des molécules HLA
• Contribution à la réponse immunitaire par la sélection, le transport et la présentation de peptides
immunogènes au TCR  trio moléculaire (TCR-Peptide-CMH) impliqué dans la réponse immunitaire

Ly TCD 8 Ly TCD 4

Cα Cβ Cα Cβ Cα Cβ Cα Cβ

Vα Vβ Vα Vβ
Vα Vβ Vα Vβ
Peptide Peptide
Peptide du soi endogène éxogène
(viral, tumoral)

α1 α2 α1 α2 α1 β1
α1 β1

β2m β2m
α3 α3 α2
α2 β2 β2

Toutes cellules
CPA

Tolérance RI : CTL RI T helper

Ctk + Ac

Le TCR reconnait l’ensemble CMH-Peptide restriction par CMH

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 Molécules HLA dans la réponse allogénique
Ly TCD 4 Receveur
Ly TCD 8 Receveur

Cα Cβ Cα Cβ

Peptides allogénique Vα Vβ Vα Vβ Peptides allogénique

+ +
CMH allogénique CMH allogénique

α1 α2 α1 β1

β2m
α3 α2 β2

Cellule Dendritique Donneur

Allo-reconnaissance directe

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 IMPLICATIONS

Rôle dans l’immunosurveillance lors

-Transformation malignes
-Infections

Réactions allogénique de rejet en transplantation

Lors du rejet les Ag HLA II induisent la réaction immunologique de prolifération d’où

l’importance des Ag HLA DR entre D/R.

Les Ag HLA I constituent la cible des anticorps anti HLA et des cellules cytotoxiques

La connaissance de l’histocompatibilité entre D/R est primordiale

soulignant la place du bilan immunologique dans tout programme
de transplantation

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 Techniques de typage HLA

DR4 DR5 Sérologique spécificités

Microlymphocytotoxicité (LCT)

B8

DQ DP1
2
A A3 B7 DR 4 DQ2 DP1
B A2 B8 DR5 DQ3 DP2
A2
DQ3

A3
Biologie moléculaire : ADN  allèles
DP2 - PCR-SSO (PCR-sequence specific probes)
- PCR-SSP (PCR-sequence specific primers)
- PCR- SBT (Sequence Based Typing)

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 TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE

La technique de référence : Microlymphocytotoxicité = LCT (Terasaki et Mac Clelland 1964).

Détecte des Ac IgG et IgM.
trouve son application :

Typage HLA de classe I Typage HLA de classe II

Recherche d’anticorps anti-HLA de classe I Recherche d’anticorps anti-HLA de classe II

Cross Match anti-classe I Cross Match anti-classe II

Cellules mononucléaires: CMN

Lymphocytes T Lymphocytes B

Typage HLA: Ag inconnu, Cross Match: Ac inconnus…

Les plaquettes, peuvent être utilisées pour l’adsorption des anticorps anti-HLA de classe I.

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 LE TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE

Principe:

Cellule vivante
=
Réaction négative

+ colorant
Batterie d’Anticorps
anti-HLA (I, II) connus Complément
Cellules a typer
de lapin

Cellule morte
=
Réaction positive

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 TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE

Résultat : Score selon l’échelle standard ASHI

“1” Reaction “2” Reaction “4” Reaction

0–10% Cells 11–20% Dead Cells 21–50% Dead Cells

“6” Reaction “8” Reaction

51–80% Dead Cells 81–100% Dead Cells
L’interprétation du phénotype HLA se fait
grâce aux plans de batteries indiquant la
localisation et la spécificité des sérums.

Le génotype est déterminé à travers

HLA et Transplantation Rénale, M. Benhalima, Y. Meddour l’étude de la famille.
 TYPAGE HLA PAR SEROLOGIE

Inconvénients:
Non expression des antigènes HLA dans certaines proliférations malignes

• Antisérums utilisés reconnaissent des épitopes essentiellement conformationnels privés ou

publics

• Réactivités croisées sur de nombreuses molécules HLA(CREG) rendent nécessaire

l’utilisation de plusieurs sérums monospécifiques

• Difficulté d’obtenir des sérums monospécifiques

• Rareté de certaines spécificités  Un seul antigène détecté

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 Typage HLA par biologie moléculaire

Deux niveaux de résolution:

Typage HLA : niveau générique ou basse résolution (2 digits)

Donne l’équivalent du résultat obtenu par sérologie.

Typage HLA de niveau allélique ou de haute résolution ( 4 digits)

détermine les sous variants alléliques

HLA B* 27 05 

Motif allélique (BM)

Motif générique (Sérologie ou BM)

Gène étudié

Le typage de niveau générique des gènes HLA –A, B et DRB1 : Suffisant en transplantations d’organes

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 TYPAGE HLA PAR BIOLOGIE MOLECULAIRE

La connaissance des séquences spécifiques des allèles HLA permet le génotypage directement au niveau de
l’ADN après son amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction)

La mise en évidence du polymorphisme peut se faire par deux techniques principales :

PCR-SSP (Sequence Specific Primer) : TYPAGE HLA générique et allélique classe I et II

PCR-SSO/SSO reverse (PCR Sequence specific Oligoprobe) : TYPAGE HLA générique classe I et II

PCR SSO/SSO REVERSE

Techniques basées sur l’analyse du profil d’hybridation de sondes oligogonucléotidiques

spécifiques complémentaires à certains motifs polymorphiques portés par un produit PCR contenant par le
ou les exons polymorphique du géne :
-exon 2 + 3 typage HLA I
-exon 2 typage HLA I
Les sondes peuvent être libres dans un tampon d’hybridation et le produit PCR fixé: PCR-SSO
Le produit PCR est libre dans le tampon d’hybridation et les sondes fixéés sur un support bandelettes de
nitrocellulose/ Billes :PCR SSO reverse

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 Technique PCR - SSO reverse
Basée sur l’hybridation de sondes spécifiques fixées sur un support solide avec le produit
d’amplification marqué : ( Dynal®, LIPA)

Avantages : systéme automatisable rapide

ADN pure
100ng/ml
Séquences amplifiées et Produit de Séquences complémentaires
marquées au cours de la PCR marqué fixées sur des Bandelettes
PCR par incorporation de (strip) de Nitrocellulose
nucléotides biotinylés.

Streptavidine marquée à la
Lecture au scanner Phosphatase Alcaline
Numérisation des résultats permet la détection
Interprétation colorimétrique (LIPA)
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 Luminex:
Nouvelle technologie de cytométrie de flux = PCR SSO Réverse en milieu liquide
Sur chaque type de microsphére est fixé une sonde unique( jusqu’à 100 types de microsphères par
puits)

Une amplification réalisée à

le produit d’amplification est
l’aide d’amorces spécifiques
dénaturé pendant 10 minutes à
biotinylées
température ambiante

Marquage des fragments fixés sur les billes

par la SAPE puis analyse de la fluorescence Le produit d’amplification dénaturé est mis en
émise par la phycoérythrine exitée au contact avec le mélange de billes contenant les
cytométre de flux sondes fixées. Après lavage , seul persistent les
fragment hybridés sur leur sonde spécifique

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 Etapes:

La lecture en tubes ou en microplaques de 96 puits

La positivité des réactions graduée de 1 à 8 correspond à une fluorescence plus ou moins

importante

Avantages :

Lecture automatisée et adaptée aux grandes séries comme au typage ponctuel

Un seul tube ou puits réactionnel par locus

On peut tester en même temps dans une seule plaque de 96 puits 32 typages A+ B +
ou 24 typages A+B+DR+DQ

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 Technique PCR - SSP
• Technique non basée sur l’hybridation d’oligosondes
• Amorces spécifiques d’un Allèle ou d’un groupe d’Allèles à étudier
• Discrimination entre les différents allèles pendant la PCR
• Le typage est déterminé par la présence ou l’absence du produit de PCR visualisé sur gel
d’agarose avec Ethidium bromide sous UV

ADN pure Placer dans le

100ng/ml Préparation des mélanges: thermocycleur et
ADN + amorces + dNTP + Taq polymérase+ Mg Cl2 couvrir pour éviter
l’évaporation

Photo d’archivage Lecture sous lampe à UV

Et Interprétation Amplification
≈ 1h40mn

Méthode -simple rapide adaptée à l’urgence

-ne détecte pas de nouveaux allèles
- inadaptée aux typages en séries
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