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CAPTULO 12
PLSMIDOS Y TRANSMISIN HORIZONTAL DE GENES
Baltasar Mayo, Claudia Snchez y Pablo lvarez-Martn.
Instituto de Productos Lcteos de Asturias, Consejo Superior de Investigaciones Cientficas,
Villaviciosa, Asturias.
NDICE.

1.- INTRODUCCIN GENERAL.

1.-MECANISMOS DE REPLICACIN.
1.1.- Mecanismo de replicacin RCM.
1.2.- Mecanismo de replicacin tipo Theta.
1.3.- Replicacin por desplazamiento de cadena.

2.- PLSMIDOS DE BACTERIAS LCTICAS Y BIFIDOBACTERIAS.
2.1.- Plsmidos de las bacterias lcticas
2.1.1.- Plsmidos que replican en RCM.
2.1.2.- Plsmidos que replican en Theta.
2.2.- Plsmidos de bifidobacterias.

3.- PROCESOS DE TRANSFERENCIA GENTICA ASOCIADA A PLSMIDOS.
3.1.- Conjugacin.
3.1.1.- Plsmidos conjugativos.
3.1.2.- Transposones conjugativos.
3.2.- Transferencia horizontal de genes entre bacterias lcticas.
3.3.- Transferencia horizontal desde otros tipos microbianos.
3.4.- Intercambio gnico entre cromosoma y plsmidos.

4.- CONCLUSIN.
5.- AGRADECIMIENTOS.
6.- BIBLIOGRAFA.
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1.- INTRODUCCIN GENERAL.
La mayor parte de los genes bacterianos estn codificados en una larga molcula
generalmente circular de ADN en doble cadena denominada cromosoma bacteriano o, ms
apropiadamente, genforo. En un gran nmero de especies o de cepas, junto al cromosoma
aparecen una o varias molculas menores denominadas plsmidos. Los plsmidos son
tambin molculas de ADN de doble cadena y la mayora de las veces circulares. En este
caso, la configuracin del ADN plasmdico suele estar ms enrollada que la del ADN
principal, propiedad que se utiliza para su aislamiento selectivo. El genoma bacteriano se
completa con los bacterifagos integrados en el cromosoma (profagos), los transposones y las
secuencias o elementos de insercin (ISs).
La caracterstica definitoria de los plsmidos es una replicacin controlada e
independiente de la replicacin del cromosoma. A pesar de su independencia, la replicacin
requiere del concurso de la maquinaria metablica celular. Otras caractersticas tpicas de los
plsmidos son su pequeo tamao (en comparacin con el tamao del cromosoma) y la de
codificar propiedades no esenciales para el desarrollo celular normal. Suelen codificar
actividades importantes para la adaptacin o supervivencia en determinados ambientes o en
determinadas condiciones ambientales como resistencia a antibiticos y metales pesados,
utilizacin de azcares u otras fuentes de carbono, produccin de toxinas, pigmentos, factores
de adherencia, etc. (Reanney, 1976; Eberhard, 1989). Se denominan plsmidos crpticos a
aquellos que solo codifican la parte esencial de la maquinaria replicativa, de control y otras
funciones relacionadas con su diseminacin.
El conocimiento de la existencia de elementos extracromosomales como el Factor F
de Escherichia coli es anterior incluso al descubrimiento de la estructura del ADN. De hecho,
el trmino plsmido lo introdujo Lederberg en 1952 para referirse a los determinantes
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hereditarios transmisibles (Lederberg et al., 1952). En la actualidad, se han detectado
plsmidos en la mayora de los gneros bacterianos, en varios eucariotas inferiores como
hongos y levaduras y en los orgnulos (mitocondrias y cloroplastos) de algunos eucariotas
superiores. De forma ms especfica, se han encontrado plsmidos en todos los gneros de las
bacterias del cido lctico (o bacterias lcticas). Su fcil manejo y una organizacin
relativamente sencilla convierten a los plsmidos en modelos adecuados para los estudios
moleculares. As, el estudio de algunos de los cientos de plsmidos descritos ha contribuido
de forma significativa al desarrollo de diversas disciplinas de la Gentica y la Biologa
Molecular. Analizando la replicacin plasmdica y su control, se han descubierto aspectos
destacados de los mecanismos de replicacin del ADN y las interacciones moleculares de la
expresin gnica (Cohen, 1993).

1.-MECANISMOS DE REPLICACIN.
Los plsmidos deben de portar obligatoriamente las seales y los elementos necesarios para el
inicio de su replicacin. De forma tpica suelen contener uno o ms orgenes de replicacin
(ori) y uno o ms elementos de regulacin en un segmento pequeo de ADN (entre 1 y 4
kbp). La mayora de los plsmidos albergan un gen que codifica una protena necesaria para la
replicacin (Rep); otros codifican una molcula de ARN que acta como cebador (primer)
en la iniciacin de la sntesis de las nuevas copias de ADN (Actis et al., 1998; del Solar et al.,
1998). La replicacin del ADN plasmdico ha de producirse acoplada al ciclo celular de la
bacteria hospedadora. De forma que en un hospedador determinado y bajo unas condiciones
de crecimiento dadas, todo plsmido tiene un nmero de copias caracterstico. Para definir y
mantener ese nmero de copias, los plsmidos utilizan diversos mecanismos de regulacin
negativa (del Solar et al., 1998; del Solar and Espinosa, 2000). Los mecanismos de control
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pueden mediarse a travs de protenas represoras, ARN antisentido (counter-transcript
RNA, ctRNA) y/o secuencias de ADN repetidas (iterones). Las protenas represoras suelen
actuar en trans inhibiendo la transcripcin del gen esencial rep. Los ctRNAs se encuentran en
cis con las secuencias ori aunque funcionan tambin en trans, inhibiendo el procesamiento del
cebador o influyendo en la transcripcin y/o en la traduccin del ARN mensajero de Rep. En
el caso de los iterones (dispuestos en tndem dentro o prximos al origen de replicacin) la
inhibicin se produce por la unin a ellos de la protena Rep, lo que conlleva una titulacin de
la protena iniciadora y, cuando su concentracin es demasiado elevada, el apareamiento de
las molculas plasmcas (handcuffing), lo que dificulta una replicacin eficiente. De esta
forma, Rep regula su propia expresin. El control se puede ejercer mediante uno slo de estos
mecanismos, mediante la accin de un mecanismo principal y otro auxiliar, o por la accin
conjunta y simultnea de todos ellos (Kittel and Helinski, 1992; Khan, 1997; del Solar et al.,
1998; Chattoraj, 2000).
Muchos plsmidos portan, adems, genes dispensables (a pesar de que algunos pueden
participar activamente en la replicacin, en su control o en la interaccin del plsmido con el
hospedador: reparto de molculas en la progenie, estabilidad plasmdica, transferencia a
nuevas clulas, etc.). As, los plsmidos de bajo nmero de copias codifican diversos
mecanismos para evitar la prdida segregacional durante la divisin celular. Entre stos,
podemos citar sistemas para la resolucin de multmeros, sistemas para la muerte de las
clulas libres de plsmidos y mecanismos de particin activa (Nordstrm and Austin, 1989;
Williams and Thomas, 1992; Gerdes et al., 2000). Entre los genes plasmdicos accesorios a la
replicacin, habr que incluir tambin todos aquellos que en las bacterias lcticas codifican
los fenotipos tiles para su aplicacin industrial y que hemos enumerado anteriormente.
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Basndose en la comparacin de secuencias y en la organizacin de las regiones de
replicacin, se han encontrado cuatro mecanismos de replicacin bien definidos en los
plsmidos de las bacterias Gram-positivas: el tipo crculo rodante (rolling circle
mechanism, RCM) y el tipo Theta de los plsmidos circulares, y los dos mecanismos
distintos de los plsmidos lineales de Streptomyces y Borrelia (Hinnebusch and Tilly, 1993;
Actis et al., 1998; del Solar et al., 1998). Dado que hasta el momento pocos han sido los
plsmidos lineales observados en las bacterias lcticas (Roussel et al., 1993; B. Mayo,
resultados no publicados) y que los plsmidos circulares son los que presentan mayores
posibilidades de manejo, en lo sucesivo nos vamos a ocupar nicamente de stos.

1.1.- Mecanismo de replicacin RCM.
Un gran nmero de plsmidos multicopia replica segn el mecanismo de crculo rodante
(RCM) observado originalmente en los bacterifagos de ADN de cadena sencilla de E. coli.
La replicacin RCM se detect pronto en plsmidos de bacterias Gram-positivas aunque en la
actualidad se ha visto que es corriente en plsmidos de todos los tipos bacterianos. Este tipo
de replicacin lo utilizan tambin los virus animales de la familia de los parvovirus, varios
viroides vegetales y algunos plsmidos mitocondriales de plantas superiores (Khan, 1997).
En trminos de su organizacin estructural y funcional, los plsmidos RCM forman un
grupo muy homogneo cuyo tamao oscila entre un poco ms de 1 y 10 kpb. Poseen
estructuras compactas y en la mayora de los casos todos sus genes se transcriben en la misma
direccin. Su caracterstica ms tpica es la formacin de intermediarios replicativos de ADN
de cadena sencilla (single-stranded DNA, ssDNA). De hecho, la deteccin de molculas
de ssDNA en extractos celulares se utiliza como prueba de este tipo de replicacin. La
replicacin es unidireccional y asimtrica, ya que la sntesis de la cadena lder (leading
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strand) y la de la cadena retrasada (lagging strand) no estn acopladas (para revisin ver,
Gruss and Ehrlich, 1989; del Solar et al., 1993; Espinosa et al., 1995; Khan, 1996; Khan,
1997; del Solar et al., 1998).
La organizacin estructural de estos plsmidos es muy similar y consiste en varios
mdulos intercambiables. El primer mdulo -el nico estrictamente esencial- comprende el
ori, el gen rep y algunos elementos de control. En la Figura 1 se representa de manera
esquemtica la regin del inicio de replicacin de los plsmidos RCM del grupo
pMV158/pE194 y su control. La figura se complementa con la secuencia nucleotdica de la
regin de inicio de pBM02, sobre la que se han representado los elementos del esquema. El
origen de replicacin de la cadena doble (double-strand origin, dso) consta de una
secuencia de reconocimiento en la molcula de ADN para la protena iniciadora Rep [que
puede estar constituda por repeticiones directas (direct repeat, DR), como en el caso de
pMV158, o de una repeticin invertida (inverted repeat IR), como en pT181] y de una
secuencia de corte (nick) situada tambin en una IR. En un segundo mdulo situaramos
una o ms regiones con fuerte simetra axial, IRs, que constituyen el punto de inicio de la
sntesis de la cadena retrasada a partir del intermediario de cadena sencilla. A estas secuencias
se las denomina origen de replicacin de la cadena sencilla (single-strand origin, sso). Los
mdulos restantes incluyen todos los elementos que no estn involucrados de forma directa en
la replicacin (Khan, 1997; del Solar et al., 1998). En funcin de la homologa de las
secuencias de ADN del ori y de la secuencia aminoacdica de las protenas Rep, en las
bacterias Gram-positivas se han identificado cinco familias principales de plsmidos RCM,
representadas respectivamente por los plsmidos pT181, pC194, pMV158/pE194, pNS2 y
pTX14-3 (Khan, 1997). Todos guardan una gran homologa estructural y funcional, pero las
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secuencias nucleotdicas slo se conservan dentro de las familias (sobre todo en la regin
nick).
En los plsmidos RCM la replicacin consta de cuatro etapas distintas. La primera
implica la unin de la protena Rep a la molcula de ADN. Esta unin se produce
frecuentemente en la DR del dso prxima al sitio de corte de la cadena lder. Tras la unin, en
un segundo paso, se produce el corte en un punto del bucle de la IR, de forma que queda libre
un extremo 3-OH que se utiliza como cebador para la sntesis de una nueva cadena lder. En
muchos plsmidos la protena Rep permanece unida covalentemente al extremo 5de la
cadena cortada y, de alguna forma, se asocia despus a la cadena retrasada (Thomas, 1988).
En los plsmidos de la familia de pMV158/pE194, el punto de corte se sita en una IR con la
secuencia consensus 5-TACTACGAC-3 en el bucle, y el corte se produce entre los
nucletidos G y A (Figura 1B). La tercera fase consiste en la elongacin de la cadena y el
consiguiente desplazamiento de la cadena lder inicial. La elongacin contina hasta que Rep
reconoce el dso recin sintetizado y corta y cierra la nueva cadena, mientras que la cadena
lder desplazada (original) se separa como una molcula circular de ssDNA. En aquellos
plsmidos en los que la protena Rep se une de forma covalente al DNA, la protena iniciadora
queda inactivada por unin a un pequeo segmento de ADN que sobrepasa el dso. En la
ltima fase, se produce la sntesis de la cadena retrasada; es decir, la molcula de ssDNA se
convierte en una forma de ADN de cadena doble (double-stranded DNA, dsDNA). El
inicio de la sntesis se produce en el sso. Los factores de replicacin de ADN del hospedador
reconocen la o las IRs y sintetizan un cebador de ARN a partir del cual se contina la
elongacin. Finalmente, las molculas resultantes adquieren el superenrollamiento
caracterstico por accin de las ADN-girasa celulares.
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La regulacin de la replicacin en los plsmidos RCM est controlada
fundamentalmente por dos mecanismos distintos (Figura 1A). El primero de ellos involucra a
una protena represora (Cop), codificada en una pauta abierta de lectura inmediatamente
anterior a la que codifica Rep (desde el promotr Pcr, Figura 1A y 1B). Los genes cop y rep se
co-transcriben, y Cop actuara como regulador negativo de la replicacin mediante la unin a
su propio promotor/operador. La unin al operador se realizara con la lmina beta del motivo
ribbon-helix-helix que las protenas Cop presentan. Un segundo mecanismo de control se
efecta a travs de un ctRNA (sintetizado desde el promotor PctRNA, Figura 1A y 1B). Esta
molcula (de unos 50 nucletidos en los plsmidos de las bacterias lcticas) se transcribe en
sentido inverso al mensajero rep y se unira a la regin complementaria del ARNm gracias a
su antiparalelismo, impidiendo su traduccin. La funcionalidad del promotor PctRNA,
presente en la secuencia de todos los plsmidos, se ha demostrado experimentalmente (Duan
et al., 1998). En algunos plsmidos, como ocurre en pT181, existe la posibilidad de que haya
dos molculas ctRNA (Kumar and Novick, 1985).

1.2.- Mecanismo de replicacin tipo Theta.
Replicones de este tipo se describieron en primer lugar en plsmidos de bacterias Gram-
negativas aunque, al igual que los plsmidos RCM, estn extendidos en todos los grupos
microbianos. Una de las diferencias ms relevantes de los plsmidos de tipo Theta respecto a
los de tipo RCM es que las molculas intermediarias de la replicacin son ADN de cadena
doble. Otro criterio importante para su identificacin es el tamao, ya que todos los plsmidos
con un tamao superior a 12 kpb cuyo mecanismo de replicacin se conoce pertenecen a este
grupo. No obstante, el tamao vara notablemente, desde las 2,6 kpb del plsmido Theta ms
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pequeo (pRJF1) (Hefford et al., 1993), hasta ms de 100 kpb (Seegers et al., 1994; Prvots
et al., 1994).
La organizacin estructural y funcional de los plsmidos de tipo Theta es muy
heterognea, a diferencia de lo que ocurre con los de tipo RCM. Los plsmidos varan en
tamao -como hemos visto-, en el fenotipo que presentan, en la direccin de replicacin, en
los requerimientos de factores plasmdicos y celulares y en los elementos de control.
Basndose en estas distintas organizaciones y en los elementos que requieren del hospedador,
se distinguen tres clases de replicones (denominadas A, B y C).
Los replicones de la clase A poseen un ori que consiste en una regin rica en A-T,
adyacente a un nmero varible de iterones (excepto en algn caso, como R1) que son
esenciales en cis para el inicio de la replicacin. Estos replicones requieren de una protena
Rep codificada por el plsmido; lo que implica la existencia en el ori de secuencias
especficas con las que Rep interacta. En la zona del origen son tpicos tambin uno o ms
motivos de unin para DnaA, la protena iniciadora de la replicacin del cromosoma
(denominados cajas dnaA: 5-TTATCCACA-3) (Bramhill and Kornberg, 1988; Kornberg
and Baker, 1992). A esta clase pertenecen la mayora de los plsmidos de lactococos con tipo
Theta de replicacin; los ms estudiados de las bacterias lcticas. En la Figura 2 se representa
de forma esquemtica la regin del origen de replicacin del grupo plasmdico mayoritario de
los lactococos. Complementando la figura, se incluye tambin la secuencia nucleotdica del
origen de replicacin de pBL1 (Figura 2B). La unin de DnaA a su secuencia de
reconocimiento implica la formacin con sta de un complejo ncleo-proteico capaz de
separar las dos hebras parentales de ADN en la zona rica en A-T. En esta situacin las
protenas requeridas para la sntesis pueden ensamblarse y crear una regin de ADN de
cadena sencilla. A continuacin se sintetiza un cebador de ARN (pARN) que se utilizar para
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la extensin covalente de la cadena de ADN (Kornberg and Baker, 1992). El papel exacto de
la protena Rep en el complejo de iniciacin no se conoce. Podra estabilizar el complejo
ARN/ADN que se forma con el pARN para un correcto procesado por la RNAsa H celular; o,
alternativamente, reconocer al hbrido y procesarlo ella misma generando el cebador maduro.
La sntesis de ADN es continua en una de las cadenas (cadena lder) y discontinua en la otra
(cadena retrasada) aunque, a diferencia de lo que ocurre en el modo RCM, la sntesis de las
dos cadenas est acoplada (Kelman and ODonnell, 1995). La sntesis puede comenzar en uno
o varios puntos y la replicacin puede ser uni- o bi-direccional, aunque se desconocen los
mecanismos que determinan estas caractersticas. En las bacterias Gram-positivas, la
replicacin de stos plsmidos es independiente de la ADN polimerasa I del hospedador.
Las clases B y C carecen de la regin ori tpica y requieren la actuacin de la ADN
polimerasa I celular para su replicacin. La diferencia entre los replicones de la clase B y los
de la clase C es que los primeros no codifican protena iniciadora. La replicacin de los
plsmidos de la clase B se inicia con la sntesis de un cebador de ARN por la ARN polimerasa
del hospedador (Itoh and Tomizawa, 1980). Esta clase de replicones est representada por los
plsmidos del tipo ColE1 de E. coli. De la clase C, por su parte, slo se conocen los plsmidos
emparentados ColE2 y ColE3 tambin de E. coli (Itoh and Horii, 1989). El inicio de la
replicacin en este ltimo tipo de plsmidos requiere del ensamblaje en el ori de toda una
compleja maquinaria que incluye el holoenzima de la ADN polimerasa III, la helicasa DnaB y
la ADN-primasa (Takechi et al., 1995)
Los detalles de la regulacin slo se conocen en unos pocos plsmidos. En bacterias
Gram-positivas los plsmidos ms estudiados son pAM1 de Enterococcus faecalis y
pSM19035 de Streptococcus pyogenes (del Solar et al., 1998). En la mayora de los plsmidos
slo se dispone de la homologa de secuencia con stos y con otros plsmidos de bacterias
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Gram-negativas de la clase A (con una organizacin similar del ori en DRs y IRs)
(Nordstrm, 1990; Chattoraj and Schneider, 1997; del Solar et al., 1998; Chattoraj, 2000; del
Solar and Espinosa, 2000). Los iterones parecen jugar en muchos casos un papel destacado en
el inicio y en el control de la replicacin. Suelen estar organizados en estructuras de tipo
tndem y se sitan a una distancia mltiplo de 11 (11 bases equivalen a una vuelta de hlice
en la doble cadena de ADN). Las DRs sirven como sitio de unin para las protenas Rep, de
forma que copias adicionales de los iterones en cis reducen la frecuencia de replicacin,
resultando en un menor nmero de copias por clula. Algunos plsmidos poseen fuera del
origen de replicacin iterones extra no esenciales (como F, P1 y RK2); cuando se eliman se
incrementa el nmero de copias.
Los mecanismos y funciones de estabilidad distintos de los directamente implicados
en la replicacin tampoco se conocen con exactitud. Ni est claro el mecanismo por el que
varios plsmidos pueden coexistir de manera compatible y estable en una misma clula. A
pesar del alto grado de similitud, las claves quiz se encuentren en las pequeas diferencias.
As, por ejemplo, las secuencias de los iterones varan entre los diversos plsmidos, de forma
que las protenas Rep, aunque tambin parecidas, pueden tener distinta especificidad. Sin
embargo, an no se han llevado a cabo experimentos de complementariedad entre las
estructuras y los elementos de plsmidos distintos.

1.3.- Replicacin por desplazamiento de cadena.
Una clase especial de replicacin de tipo Theta es la replicacin por desplazamiento de
cadena. En este tipo de replicacin tambin se generan como intermediarias molculas de
ssDNA (como ocurra en los plsmidos RCM). Los plsmidos con este mecanismo requieren
de la accin de tres protenas plasmdicas, denominadas RepA, RepB y RepC. El concurso de
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las tres es suficiente para iniciar el proceso sin la participacin de los factores celulares. La
replicacin se produce en ambas direcciones por un mecanismo de desplazamiento de las
cadenas. El producto final es una mezcla de crculos de ssDNA desplazados y crculos de
dsDNA superenrollados. Los ejemplos mejor conocidos de esta clase son los plsmidos
promiscuos de la familia IncQ (Sakai and Komano, 1996). La independencia de los factores
celulares para su replicacin parece ser la causa de su amplio rango de husped.

2.- PLSMIDOS DE BACTERIAS LCTICAS Y BIFIDOBACTERIAS.
2.1.- Plsmidos de las bacterias lcticas.
La inestabilidad de la capacidad de utilizacin de la lactosa y las casenas de la leche en
diversas cepas de lactococos se conocen desde hace muchos aos (referenciada de manera
excelente en McKay, 1983). La constatacin sistemtica de la prdida espontnea en diversas
cepas de estas caractersticas se remonta a los aos 30. La observacin de que su tratamiento
con agentes que interfieren en la replicacin del ADN como los colorantes de acridina o el
crecimiento a elevadas temperaturas aumentaba la frecuencia de prdida sugera que los
determinantes genticos se localizaban en elementos inestables. Sin embargo, la propuesta de
que la inestabilidad podra estar asociada a plsmidos no llega hasta el ao 1971 (Pearce and
Skipper, 1971, citado en Cords et al., 1974), cuando la presencia de elementos genticos
extracromosomales estaba ya bien documentada en varias cepas de la familia
Enterobacteriaceae, en cepas de Staphylococcus aureus y en algunas especies de
Pseudomonas y Bacillus. La primera demostracin concluyente de la presencia de plsmidos
en cepas de lactococos la realizaron Cords y colaboradores (Cords et al., 1974). Al ao
siguiente, la prdida de la actividad proteinsica se asoci con la prdida de un plsmido
concreto en la cepa Lactococcus lactis C2 (McKay and Baldwin, 1975). Desde entonces la
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descripcin de plsmidos en los gneros y especies de bacterias lcticas y su asociacin con
diferentes fenotipos ha sido una constante (para revisin, McKay, 1983; Gasson and Davies,
1984; Hill and Ross, 1998; Tabla 1).
Las cepas de lactococos suelen ser especialmente abundantes en estas molculas de
ADN extracromosmico. De forma frecuente, se encuentran entre 4 y 7 tipos plasmdicos
distintos por clula, pudiendo llegar a 12 o ms (McKay, 1983; Gasson and Davies, 1984;
Mills et al., 2006;). El rango de tamao vara entre las 2 y las 70-80 kpb, aunque se han
descrito plsmidos de ms de 130 kpb (Harmon and McKay, 1987; Prvots et al., 1994). Los
plsmidos son tambin abundantes en algunas especies del gnero Lactobacillus como Lact.
plantarum y Lact. pentosus (Mayo et al., 1989; Ruiz-Barba et al., 1991). Por el contrario, son
ms escasos en otras especies, como ocurre en las cepas de Streptococcus thermophilus y
Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus (Somkuti and Steinberg, 1988; Mercenier, 1990).
En las bacterias lcticas se han asociado con plsmidos fenotipos tan diversos como la
actividad proteinsica extracelular, la utilizacin de la lactosa (tanto a travs del sistema de la
permeasa como del transportador PEP-PTS), la utilizacin de citrato, diversos mecanismos de
resistencia a bacterifagos, la produccin de polisacridos extracelulares, la produccin de
bacteriocinas, la resistencia al estrs trmico y a la acidez, la resistencia a diversos
antibiticos y metales pesados, y otros (McKay, 1983; Gasson and Davies, 1984; David et al.,
1992; Pouwels and Leer, 1993; Vaughan et al., 1995; Wang and Lee, 1997; Hill and Ross,
1998). En muchos casos, un solo plsmido puede codificar ms de una, lo que indica que en
una sola molcula se reclutan diversas caractersticas (Akcelik, 1999; Siezen et al., 2005).
Como fcilmente se desprende de la enumeracin anterior, gran parte de estas
propiedades son esenciales en la aplicacin industrial de las bacterias lcticas. La prdida de
alguna de ellas durante las fermentaciones causa la descalificacin de los productos, con las
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consiguientes prdidas materiales; de ah la importancia del estudio de los plsmidos en que
se asientan. Adems, en los ltimos aos, el conocimiento de la biologa de los plsmidos y
sus interacciones con las clulas hospedadoras ha posibilitado el desarrollo de herramientas
biotecnolgicas (clulas libres de plsmidos, vectores de clonacin, de expresin, de
integracin, etc.) que se utilizan para el estudio molecular de las propiedades ms relevantes
y, llegado el caso, para su manipulacin (Kok, 1991; de Vos and Simons, 1994; de Vos, 1999;
Mills et al., 2006). La finalidad de estos estudios es reproducir las fermentaciones
tradicionales de manera ms fiable y eficiente, as como utilizar a las bacterias lcticas en
otras aplicaciones ms novedosas (elaboracin de nuevos productos fermentados, expresin
de compuestos de inters mdico-farmacetico, inmunizacin oral, etc.).
En los ltimos aos, gracias a la generalizacin de las tcnicas de secuenciacin, se
han determinado las secuencias nucleotdicas de las regiones de replicacin de un buen
nmero de plsmidos procedentes de los distintos gneros y especies de las bacterias lcticas,
y en muchos casos de los plsmidos completos (Tabla 1). La aplicacin de las tcnicas de
secuenciacin genmica ha permitido la secuenciacin de plsmidos de gran tamao como
pMRC01 de 60,2 kpb (Dougherty et al., 1998) y pNP40 de 65,0 kpb (ODriscoll et al., 2006),
o la secuenciacin del complemento plasmdico completo de diversas cepas (van Kranenburg
et al., 2005; Desmond et al., 2005; Siezen et al., 2005).

2.1.1.- Plsmidos que replican en RCM.
Los primeros plsmidos de bacterias lcticas en los que se estudiaron los mecanismos de
replicacin y su estructura molecular fueron los plsmidos pSH71 (de Vos, 1986), pDI25 (Xu
et al., 1991) y pWV01 (Leenhouts et al., 1991). Curiosamente, las regiones de replicacin de
los tres plsmidos resultaron ser prcticamente idnticas y operativas en tipos bacterianos tan
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distintos como Bacillus subtilis y E. coli. Todos replican mediante un mecanismo RCM,
pertenecen a la familia pMV158/pE194 y su organizacin funcional se representa en la Figura
1. Debido a que fueron los primeros que se conocieron a nivel molecular y a su gran
promiscuidad, estos plsmidos han sido ampliamente utilizados en la construccin de vectores
bifuncionales (Kok, 1991; de Vos, 1999). En la actualidad se han secuenciado dos replicones
ms de esta familia (pBM02 y pSRQ700; Tabla 1). El replicn parece estar bastante extendido
entre los lactococos, ya que muchas cepas presentan un plsmido con un mdulo de
replicacin homlogo. El plsmido pSRQ700 es un caso singular, puesto que el replicn
RCM est integrado en un plsmido con otro replicn de tipo Theta (Boucher et al., 2001).
Los plsmidos de lactococos presentan, sin embargo, un sso diferente a los de los
plsmidos pMV158 (que tiene un ssoA y un ssoU) y pE194 (que slo tiene ssoA). El sso de
pWV01, denominado ssoW, ha sido estudiado a nivel molecular con cierto detalle (Seegers et
al., 1995; Jeong et al., 1997). A este mismo tipo pertenece el sso del plsmido pBM02, con
nicamente cuatro sustituciones nucleotdicas en un segmento de ms de 200 pb (Snchez and
Mayo, 2003). En esta regin aparece una extensa IR de 140 pb, seguida de una IR menor
(Figura 1B). En el bucle de la IR mayor aparece la secuencia consensus que presentan muchos
ssos del tipo ssoA (del Solar et al., 1987), que guarda semejanza con el sso del fago X174,
por lo que funcionar como lugar de ensamblaje de la maquinaria replicativa celular
(primosome assembly site). La IR menor es, probablemente, el lugar de reconocimiento de
la ARN polimerasa (el sitio RS
B
) (Kramer et al., 1997). El dso de pBM02 es tpico, con una
IR (IR3) seguida a cierta distancia de una DR imperfecta repetida tres veces (Figura 1B).
Estas estructuras y la organizacin posterior de los genes copG y repB son semejantes a las
que aparecen en los miembros de la familia pMV158/pE194. Merece destacarse que la
homologa aminoacdica de las proteas RepB y CopG de pBM02 fue mxima con dos
16
plsmidos de la misma familia identificados en especies distintas de lactobacilos (pLB4 de
Lact. plantarum y pLF1311 de Lact. fermentum) (Tabla 1).
En otra cepa de L. lactis se ha detectado un plsmido (pWC1) con homologa
nucleotdica y aminoacdica mayor con los plsmidos de la familia de pC194 (Pillidge et al.,
1996). Este replicn, sin embargo, no parece tan extendido entre las cepas de lactococos como
el de pWV01, aunque se han encontrado plsmidos relacionados en otras bacterias lcticas.
En la Figura 3A se muestran las relaciones filogenticas entre los diversos plsmidos RCM
secuenciados de lactococos en funcin de las secuencias de sus protenas Rep.
En estos momentos, se encuentran secuenciados un buen nmero de plsmidos RCM
procedentes de todos los gneros de bacterias lcticas (Tabla 1). Con alguna honrosa
excepcin, como es el caso del plsmido p353-2 de Lact. pentosus (Pouwels et al., 1994), el
estudio de estos plsmidos se encuentra ms retrasado que el de los lactococos. En la mayora
de los casos, slo se conocen las secuencias nucleotdicas y su homologa con las de los
plsmidos tipo. Los parientes ms prximos de algunos plsmidos son plsmidos de otras
especies o, incluso, de gneros distintos a los de las bacterias lcticas. Como es el caso de los
plsmidos pLB4 y pLF1311 ya citados. De igual forma, el plsmido pLA106 de Lact.
acidophilus es prcticamente idntico a pTE15 de Lact. reuteri. Los plsmidos del grupo de
pST1 de S. thermophilus (pER16, pER35, pER36 y pCI65st) son ms parecidos a plsmidos
de Streptococcus pneumonie que a otros de S. thermophilus (como pER13 y pSMQ172). Los
estudios filogenticos indican que, en general, dentro de cada familia hay una buena
conservacin nucleotdica en el ori y homologa aminoacdica en las protenas Rep.
La gran mayora de los plsmidos RCM de las bacterias lcticas no codifican ninguna
caracterstica fenotpica, aunque varios portan secuencias y factores relacionados con su
movilizacin (sitio oriT y protena Mob) (Tabla 1). La excepcin podramos encontrarla en
17
varios plsmidos de lactobacilos que codifican genes de resistencia a antibiticos (como
pLEM3 y p121BS) o en los escasos plsmidos detectados en S. thermophilus que codifican
protenas relacionadas con la resistencia al estrs trmico (calor) y sistemas de restriccin-
modificacin que dificultan la infeccin fgica; caractersticas importantes para su aplicacin.
En esta especie, todos los plsmidos analizados son todos de tipo RCM.

2.1.2.- Plsmidos que replican en Theta.
Los replicones de tipo Theta de las bacterias Gram-positivas caracterizados a nivel molecular
pertenecen mayoritariamente al grupo de pAM1, con las caractersticas estructurales y
funcionales de los plsmidos Theta de la clase A. As, codifican una protena Rep esencial y
presentan una regin ori con la organizacin tpica (Figura 2). Sin embargo, su replicacin es
unidireccional en todos los casos y requieren, por algn motivo, la actuacin de la DNA
polimerasa I celular. Por esta razn, se los suele incluir tambin en una clase aparte
denominada clase D. La gran mayora de los replicones de tipo Theta de los lactococos
pertenecen a este grupo y presentan un alto grado de conservacin en los diversos elementos.
Los plsmidos tienen un nmero de copias pequeo y un rango de husped limitado;
caractersticas interesantes para el desarrollo de vectores de tipo alimentario. En estos
momentos, este grupo cuenta con ms de 35 replicones secuenciados (Tabla 1). A pesar de la
similitud en sus mdulos de replicacin, los plsmidos son extraordinariamente variables en
tamao y fenotipo. Adems, en una misma clula husped pueden coexistir varios plsmidos
del mismo grupo. De hecho, algunas cepas poseen ms de cuatro replicones estrechamente
emparentados (Seegers et al., 1994; Snchez, 2002; Siezen et al., 2005). Es sorprendente
tambin la organizacin del plsmido de L. lactis pNZ4000 (de unas 40 kpb y que codifica la
18
sntesis de un polisacrido extracelular), ya que incluye en su molcula cuatro replicones
funcionales de este tipo y muy similares (van Kranenburg and de Vos, 1998).
El modo Theta de replicacin se demostr experimentalmente en dos plsmidos:
pWV02 y pUCL22 (Kiewiet et al., 1993 y Frre et al., 1993, respectivamente); algo que ya
resultaba evidente de la homologa de las secuencias con otras de plsmidos de bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas en las que ya se haba demostrado este tipo de replicacin.
La regin del ori consiste en un segmento de ADN capaz de actuar en cis y situado por
delante de la ORF que codifica la protena de replicacin Rep. sta puede actuar en trans
sobre el ori. Al gen rep le sigue una ORF, acoplada traduccionalmente, que codifica una
protena con un motivo de unin a ADN. La funcin de esta protena no se conoce, pero en
algunos casos participa en la estabilizacin de los plsmidos. Sin embargo, no es esencial y en
ocasiones, como ocurre en pWV02 y en otros plsmidos, se encuentra delecionada de forma
natural. El dominio del ori, por encima de rep, presenta diversos elementos con estructuras
muy conservadas entre los replicones del grupo (Figura 2A y 2B). En primer lugar aparece
una DR de 10 pb separada por una zona rica en A-T de una segunda DR de 22 pb repetida de
forma tpica tres veces y media (iterones), y con homologa parcial con la secuencia que
reconoce la protena DnaA. En el caso del plsmido pCIC305 se ha comprobado que la
introduccin de iterones suplementarios en un replicn compatible tiene el mismo efecto
inhibidor que el que se observa en los plsmidos de bacterias Gram-negativas (Foley et al.,
1996). La repeticin final truncada forma parte adems de una IR, IR1, que incluye parte de la
regin -35 del promotor putativo de rep. IR1 se presume como el operador del gen rep. La
protena Rep podra encontrarse en dos estados: monmero o dmero. El monmero se unira
a los iterones, mientras que el dmero parece unirse al operador actuando como represor
(Figura 2A y 2B). Adyacente a IR1 se encuentra la posicin -10 del promotor seguida de una
19
segunda IR, IR2, y de una tercera, IR3, situadas entre la regin del promotor, la secuencia de
Shine-Dalgarno y el codn de iniciacin. IR1 presenta homologa parcial con las repeticiones
de 22 pb, y en el caso de pIC305 constituye el sitio principal de unin de Rep (Foley et al.,
1996). Se desconoce la funcin que pueden tener IR2 e IR3, aunque su extrecha organizacin
sugiere una interrelacin entre ellas y su participacin en la regulacin para la transcripcin y
en el control del nmero de copias.
La homologa de las protenas Rep entre los plsmidos de este grupo es muy alta, con
porcentajes de identidad aminoacdica mayores del 50% (Figura 3B). En ocasiones presentan
tambin identidad a nivel nucleotdico tanto en las secuencias traducidas como en las no
traducidas, tal es el caso de los plsmidos pCIC305, pAH33, pCI605 y pCIS3. Los replicones
de los plsmidos pBL1 y pIL2614 son tambin muy similares y parecidos al de pJW563, etc.
Recientemente, se ha identificado en Bacillus natto una nueva clase de plsmidos,
representada por el plsmido pLS32, con similitudes con los de la clase A pero con notables
diferencias. No presentan, por ejemplo, ninguna regin rica en A-T que pueda funcionar como
ori. Aunque, dentro de la ORF que codifica Rep, se han encontrado varios iterones con una
organizacin parecida a los de la clase A. La replicacin es independiente de la ADN
polimerasa I del hospedador, como tambin ocurre con los plsmidos de la clase A de las
bacterias Gram-negativas, (Tanaka and Ogura, 1998). A esta familia parecen pertenecer los
plsmidos de lactococos pIC2000 (Kearney et al., 2000) y pNP40 (ODriscoll et al., 2006).
En estos plsmidos es novedosa tambin la presencia de mecanismos de particin activa
(ParA), sistemas poco descritos en bacterias Gram-positivas (Jannire et al., 1996; de la Hoz
et al., 2000). A la misma familia de pLS32 podran pertenecer tambin los plsmidos pLJ1,
pSAK1 y pLH1 identificados en diferentes especies del gnero Lactobacillus (Tabla 1).
20
El plsmido pCRL291.1 formara un tercer grupo de replicones de tipo Theta poco
frecuente en lactococos. Como puede verse en la Figura 3B, el replicn no est relacionado
con los del grupo de pWV02 ni con el de pIC2000. Presenta homologa, sin embargo, con
plsmidos del gnero Lactobacillus (especialmente con pLA103) (Kanatani et al., 1995).
En estos momentos se han secuenciado al menos 15 plsmidos de diversas especies
del gnero Lactobacillus que podran replicar mediante el modo Theta (Tabla 1). La principal
limitacin para el estudio de los replicones plasmdicos de este grupo viene dada por la
necesidad de utilizar hospedadores homlogos libres de plsmidos en los que aislar los
replicones de inters, dado su estrecho rango de hospedador. Por si esto fuera poco, los
procesos de transferencia (incluida la electrotransformacin) son ineficientes en un gran
nmero de especies. Una aproximacin novedosa podra ser la clonacin y secuenciacin al
azar de los complementos plasmdicos. Esta tcnica, que ha dado buenos resultados en el
anlisis de otros tipos microbianos (Fraser et al., 1997), ya se ha utilizado en alguno de los
proyectos de secuenciacin genmica (Kleerebezem et al., 2003). Dada la gran diversidad de
especies poco relacionadas que se incluyen en este gnero, el nmero de plsmidos
secuenciados es todava reducido para sacar conclusiones generales. En general, no parecen
guardar gran homologa de secuencia con los plsmidos del grupo mayoritario de los
lactococos. Como excepcin, el plsmido pLA103 de Lact. acidophilus presenta una cierta
homologa estructural en con el grupo mayoritario de los lactococos, con DRs de 22 pb en
tndem por delante de la protena de replicacin capaz a su vez de actuar en trans sobre la
zona del origen (Kanatani et al., 1995).
De forma reciente, se ha caracterizado el plsmido de bajo nmero de copias p256 en
una cepa de Lact. plantarum que podra presentar un mecanismo nuevo de replicacin de tipo
Theta (Sorvig et al., 2005). La regin esencial de replicacin de este plsmido, de tan slo
21
700 pb, no codifica ninguna protena de replicacin. Tambin ha resultado novedosa la
presencia en el plsmido de un sistema de mantenimiento adictivo (toxina-antitoxina).

2.2.- Plsmidos de bifidobacterias.
Aunque poseen algunas caractersticas comunes con las bacterias del cido lctico, las
bifidobacterias no estn emparentadas evolutivamente con ellas sino que pertenecen a la clase
Actinobacteria caracterizada por un alto contenido CG en su genoma (Scardovi, 1986). En los
ltimos tiempos, sin embargo, se las incluye en el mismo grupo con motivo de encontrarse en
los mismos hbitats y tener aplicaciones industriales similares, incluyendo su abundante
utilizacin como probiticos (Lehay et al., 2005).
A pesar de que la presencia de plsmidos en especies el genero Bifidobacterium ha
sido descrita desde el ao 1982 (Sgorbati et al., 1982) su incidencia es mucho menor que en
otras especies del mbito intestinal. Hasta la fecha tan solo 18 plsmidos han sido
completamente secuenciados, de los que 11 pertenecen a cepas de Bifidobacterium longum
(Tabla 1). El rango de tamao vara entre las 1,8 kpb de pMB1 y las 10,2 kpb de pNAC3
(Tabla 1). El significado de la presencia de estos elementos de replicacin autnoma en el
gnero Bifidobacterium sigue siendo confuso puesto que slo codifican la maquinaria
replicativa y secuencias relacionadas con la movilizacin. La excepcin pudiera ser un
plsmido no caracterizado de B. bifidum que codifica una bacteriocina (Yildirim et al., 1999).
Asimismo, en nicamente tres cepas de B. longum se ha econtrado ms de un plsmido (Park
et al., 1997; Corneau et al., 2004; Lee and OSullivan, 2006).
La mayora de los plsmidos descritos en bifidobacterias se postula que replican
mediante un mecanismo RCM, sin embargo solamente se ha demostrado experimentalmente
para los plsmidos pKJ50 (Park et al., 1997), pCIBb1 (ORiordan and Fitzgerald, 1999),
22
pNAC1 (Corneau et al., 2004) y pDOJH10L (Lee and OSullivan, 2006). En funcin de la
similitud de secuencias, otros tres plsmidos se sospecha que replican mediante el sistema
Theta: pMB1 (Rossi et al., 1996), pDOJH10S (Lee and OSullivan, 2006) y pBC1 (lvarez-
Martn et al., 2006). Un caso especial es el del plsmido pDOJH10L que contiene replicones
de tipo RCM y Theta (Lee and OSullivan, 2006). En ambos tipos de plsmidos son
frecuentes en el ori diversas estructuras de iterones (DRs de unas 22 pb), secuencias ricas en
ATs e IRs. En los plsmidos de tipo Theta, acoplado al gen de la replicasa se ha identificado
una pauta abierta de lectura (orfX) similar a la que presentan los plsmidos de lactococos con
la misma funcin desconocida. En la Figura 4 se presenta la organizacin gentica y funcional
del plsmido pBC1 (Figura 4A) (lvarez-Martn et al., 2006), aislado de la cepa B.
catenulatum L48, junto con la estructura molecular de la regin del ori (Figura 4B).

3.- PROCESOS DE TRANSFERENCIA GENTICA ASOCIADA A PLSMIDOS.
La transmisin gnica horizontal se define como la transferencia entre clulas o genomas por
mecanismos distintos a los de la reproduccin (divisin) normal. La transferencia horizontal
de genes ha tenido y tiene un papel destacado en la adaptacin de los organismos a nuevos
ambientes. Sin duda, uno de los procesos ms documentados es la propagacin de la
resistencia a antibiticos entre las bacterias (Maiden, 1998). La transferencia horizontal,
adems, no est restringida a los procariotas y se piensa que, en trminos evolutivos, ha sido
importante tambin en plantas y animales superiores (Syvanen, 1985).

3.1.- Conjugacin.
Los procesos mediante los que se pueden llevar a cabo la transferencia son la transformacin
natural, la conjugacin y la transduccin, seguidos de una recombinacin con el material
23
gentico residente. La introduccin de ADN desnudo en el interior celular (transformacin) es
un mecanismo comn de transferencia gnica que puede intercambiar cualquier fragmento de
ADN. Numerosos gneros presentan transformacin natural (Streptococcus, Haemophilus,
Bacillus, Neisseria etc.) y el proceso se conoce con bastante precisin (Woodall, 2003). De
forma tpica, por este mecanismo slo se intercambian fragmentos cortos de ADN. La
conjugacin, por su parte, requiere un contacto fsico entre las clulas y puede llevarse a cabo
entre bacterias no relacionadas evolutivamente. Por medio de este mecanismo, adems, se
pueden transferir largos segmentos de ADN. La transduccin, por ltimo, requiere que
receptor y donador compartan los mismos receptores celulares para los fagos que llevan a
cabo el proceso. ste slo se produce, por tanto, entre bacterias muy relacionadas. La longitud
del ADN que se puede transferir est limitada por tamao de la cabeza del fago.
En las bacterias lcticas la transformacin natural tan slo se ha descrito en una cepa
de Leuconostoc carnosum (Helmark et al., 2004). Hay que mencionar, sin embargo, la
presencia en los genomas de L. lactis y de Lact. plantarum de un set completo, y
posiblemente operativo, de los genes tardos de competencia; sugiriendo la posibilidad de que
la competencia pueda alcanzarse de alguna forma todava desconocida (Bolotin et al., 2001;
Kleerebezem et al., 2003). Por otro lado, los procesos de transduccin se comentarn en el
captulo de bacterifagos, as que en lo que sigue nos centraremos en los plsmidos y
transposones conjugativos y en los intercambios que stos promueven.

3.1.1.- Plsmidos conjugativos.
Plsmidos que codifican sistemas de transferencia con los cuales dirigen su transmisin a
clulas que no los poseen fueron descritos pronto en varias especies bacterianas; baste
mencionar nuevamente el caso del Factor F de E. coli (Lederberg et al., 1952). Las primeras
24
reseas de transferencia conjugativa en las bacterias lcticas involucraban el paso de los genes
necesarios para la utilizacin de la lactosa entre distintas cepas de L. lactis subsp. lactis
(Kempler and McKay, 1979; Gasson and Davies, 1980). Desde entonces, se ha comprobado
que muchos de los plsmidos que codifican la capacidad de utilizacin de la lactosa y/o la
actividad proteinsica son conjugativos (para revisin ver, Fitzgerald and Gasson, 1988;
Gasson, 1990). La transferencia ocurre a baja frecuencia (alrededor de 10
-7
transconjugantes
por receptor); aunque tambin se han encontrado cepas capaces de transferir plsmidos a una
frecuencia mucho mayor (por encima de 10
-1
transconjugantes por receptor). En estas cepas,
la transferencia est asociada a la capacidad de las clulas para adherirse unas a otras
formando agregados. Los agregados podran atrapar a las clulas receptoras de modo que se
asegure el contacto esencial entre donador y receptor (Gasson and Davies, 1980). La
conjugacin tiene una enorme importancia desde el punto de vista aplicado, ya que se ha
utilizado repetidamente forma corriente para la diseminacin entre las cepas starter de
varias caractersticas tecnolgicas deseables encontradas en otras cepas. Podemos citar la
transferencia de los genes para la produccin y resistencia a bacteriocinas (Davey and Pearce,
1982; Neve et al., 1984; Scherwitz et al., 1983), la produccin y resistencia a nisina (Gasson,
1983) y la dispersin entre cepas o la concentracin en una sola de un buen nmero de
sistemas de resistencia a bacterifagos (para revisin ver, Daly et al., 1996; Forde and
Fitzgerald, 1999).
Los mecanismos moleculares del proceso de conjugacin entre las cepas de lactococos
se desconocen. En estos momentos se ha secuenciado la regin conjugativa (regin Tra) de
los plsmidos pMRC01 (Dougherty et al., 1998) y pNP40 (ODriscoll et al., 2006) de L. lactis
y la de pWCFS103 de Lact. plantarum (van Kranenburg et al., 2005). Estas regiones tienen
un tamao de 18-20 kbp y codifican alrededor de 16-19 genes organizados en operones. En
25
pMRC01 tanto la regin Tra como la regin codificadora de la bacteriocina estn flanqueadas
por secuencias de insercin, como ocurre con muchos otros fenotipos plasmdicos. La
organizacin y los productos gnicos presentan similitudes con los que aparecen en las
regiones conjugativas de los plsmidos de estafilococos pSK41 y pGO1, as como con los de
un segmento secuenciado del plsmido conjugativo pIP501 de Streptococcus agalactiae. Las
similitudes estructurales indican, posiblemente, semejanzas funcionales; si bien la presencia
de genes nicos en cada sistema podra resultar en marcadas diferencias.
La transferencia conjugativa de caractersticas tecnolgicas en otras bacterias lcticas
parece ser un fenmeno menos frecuente que en los lactococos. Como excepciones notables
podemos citar la transferencia de un plsmido de la lactosa entre cepas de Lact. casei (Chassy
et al., 1978) y la resistencia y produccin de una bacteriocina entre cepas de Lact. acidophilus
(Muriana and Klaenhammer, 1987). Esto quiz sea debido a una codificacin cromosmica de
las caractersticas o, nuevamente, a la falta de cepas libres de plsmidos capaces de actuar
como receptoras sin la interferencia de los plsmidos residentes. Ya que la transferencia
conjugativa de plsmidos de resistencia a antibiticos con amplio rango de husped, como
pAM1 o pIP505 no parece presentar problemas, ni siquiera cuando donador y receptor
pertenecen a distinta especie o gnero (para revisin ver, Gasson, 1990). Como tampoco
parece haberlos para la introduccin de los transposones Tn916 y Tn919 (Fitzgerald and
Gasson, 1988; Gasson, 1990).
En algunos casos la transferencia de una determinada propiedad precisa de una
cointegracin previa del plsmido portador con el verdadero plsmido conjugativo (Walsh
and McKay, 1981). En este caso se habla de plsmidos movilizables. La cointegracin est
mediada nuevamente por secuencias de insercin (Walsh and McKay, 1982; Anderson and
Mckay, 1984). En esta categora encontramos plsmidos que codifican la maquinaria
26
completa (sitio de reconocimiento y corte de una de las cadenas, sitio oriT, y diversas
protenas involucradas en la transferencia) y otros que nicamente presentan en su molcula el
sitio fsico oriT. En estos casos los plsmidos slo pueden transferirse cuando en la clula
donadora se encuentran los dems componentes del sistema. Pero, dado que muchas especies
albergan un buen nmero de plsmidos de diversos tipos, no es extrao que uno o ms porten
la maquinaria de transferencia completa. Adems, existen ciertas cepas de L. lactis que
presentan en su cromosoma un factor sexual (Gasson et al., 1992). Este factor participa
frecuentemente en la transferencia conjugativa del plsmido de la lactosa y parece que es
capaz tambin de movilizar genes cromosmicos (Bringel et al., 1992). La existencia de un
factor de movilizacin similar al Factor F de E. coli podra explicar las grandes
reorganizaciones genmicas que, como en otros grupos microbianos, parecen ser frecuentes
en las cepas de lactococos (Daveran-Mingot et al., 1998; Le Bourgeois et al., 2000).
En los lactococos y en diversas especies de Lactobacillus algunos de los fenotipos
tecnolgicamente ms relevantes para su empleo en las fermentaciones lcticas (genes de
utilizacin de la lactosa, proteinasa, produccin de nisina y otras bacteriocinas, resistencia a
fagos, produccin de exopolisacridos, etc.), y otros como hemos visto, estn asociados
comnmente con ISs (para revisin ver, Romero and Klaenhammer, 1993; Davidson et al.,
1996). En este sentido, en el anlisis genmico de la cepa L. lactis subsp. lactis IL1403 se han
encontrado 43 ISs (con una distribucin no aleatoria, lo que sugiere que el cromosoma actual
es el resltado de una recombinacin reciente entre dos genomas relacionados) (Bolotin et al.,
2001). En el genoma de Lact. plantarum WCFS1 han aparecido, al menos, 12 ISs
pertenecientes a dos clases distintas (Kleerebezem et al., 2003). Las ISs son tambin
abundantes tambin en los plsmidos de gran tamao (Dougherty et al., 1998; Siezen et al.,
2005; ODriscoll et al., 2006). La posicin y el nmero de ISs sugieren que juegan un papel
27
importante en la captacin desde el entorno de los genes necesarios para su adaptacin al
medio lcteo (Siezen et al., 2005; ODriscoll et al., 2006).

3.1.2.- Transposones conjugativos.
La transferencia horizontal puede estar mediada tambin por transposones conjugativos. Ya
hemos mencionado la transmisin entre cepas de este grupo de los transposones heterlogos
Tn916 y Tn919. En las bacterias lcticas el transposn conjugativo ms caracterstico es el
que codifica la produccin de nisina en diversas cepas de L. lactis. La transmisin conjugativa
o la prdida en bloque de la produccin y resistencia a nisina (asociada frecuentemente con la
capacidad para fermentar la sacarosa y la resistencia a bacterifagos) sugera una codificacin
plasmdica en varias cepas de L. lactis subsp. lactis (Gasson, 1984; Gonzalez and Kunka,
1984; Steele and McKay, 1986). Sin embargo, finalmente se vio que el elemento responsable
de la transmisin en bloque de todos estos caracteres era un transposn conjugativo,
denominado Tn5276 y Tn5301 (Horn et al., 1991; Rauch and de Vos, 1992). Los
transposones de nisina contienen, con pocas excepciones, una copia en cada extremo de la
IS904. Aunque debido a frecuentes reorganizaciones, se encuentra una amplia variabilidad en
su organizacin gentica actual. Las variaciones incluyen el tipo de nisina que codifican
(NisA o NisZ), el nmero de copias de IS904 y el estado funcional o defectivo del transposn
(Rauch and de Vos, 1992; Rauch et a., 1994). La inestabilidad observada tradicionalmente en
los fenotipos que codifica el transposn parece relacionarse con el mecanismo de
transposicin a travs de intermediarios extracromosomales circulares (Rauch and de Vos,
1992; Rauch and de Vos, 1994).

3.2.- Transferencia horizontal de genes entre bacterias lcticas.
28
En estos momentos, parece claro que muchas caractersticas funcionales de las bacterias
lcticas se han diseminado de forma horizontal entre los diversos gneros y especies, siendo
los plsmidos los principales receptores del nuevo material gentico. As, es destacable la
diseminacin reciente del gen que codifica la proteinasa extracelular entre las cepas de L.
lactis y entre algunas cepas de Lact. casei (Kok and de Vos, 1994). El gen est presente
tambin en diversos gneros que no pertenecen a las bacterias lcticas con una organizacin
similar (Siezen, 1999). La adaptacin gnica a cada especie hace que, en algunos casos, slo
se conserve las secuencias aminoacdicas y, en otros, nicamente la estructura bsica de los
domios. Un caso peculiar lo constituye la proteinasa extracelular de Lact. delbrueckii subsp.
bulgaricus (PrtB) en cuya organizacin todava se aprecian restos de una estructura antigua
similar a la de L. lactis. Una reorganizacin gnica posterior cambi el dominio cataltico, con
lo que se independiz de la protena esencial de maduracin PrtM (Gilbert et al., 1996).
El mismo caso parece darse con los genes de incorporacin de la lactosa por la va
PEP-fosfotranferasa (sistema PEP-PTS) y su posterior desdoblamiento mediante la -fosfo-
galactosidasa, los cuales estn codificados en plsmidos en muchas cepas de lactococos y en
algunas de Lact. casei (Chassy et al., 1978; Shimizu-Kadota, 1988). Esta va de utilizacin de
la lactosa es ms eficiente que la va de la permeasa y es la va mayoritaria en las cepas
starter de lactococos. En las cepas de L. lactis la regin plasmdica de estos genes es muy
parecida a la regin cromosmica que presentan las especies S. aureus y Streptococcus
mutans, lo que sugiri enseguida una transferencia horizontal (de Vos et al., 1990; de Vos and
Vaughan, 1994). En Lact. casei la regin es tambin similar, aunque muestra cambios
posicionales respecto del orden gnico encontrado en las otras especies. En todo caso, las
secuencias de los diversos componentes son muy parecidas entre ellos tanto a nivel
aminoacdico (83% de similitud) como nucleotdico (74% de similitud). La regin plasmdica
29
de la cepa L. lactis MG1820 est delimitada en uno de sus extremos por una copia de ISS1,
que pudo haber participado en el proceso de diseminacin (de Vos et al., 1990). Lo mismo
sucede con la regin del plsmido pSK11L, delimitada por copias de IS981 y IS982 (Siezen et
al., 2005).
Los genes bicistrnicos que codifican la -galactosidasa de Lact. casei, Lact.
plantarum, Lact. sakei, Lact. helveticus y Leuconostoc lactis son tambin prcticamente
idnticos (de Vos and Vaughan, 1994). ). Los genes se encuentran en el cromosoma en las
especies Lact. sakei y Lact. helveticus (Zwhalen and Mollet, 1993; Obst et al., 1995) y en
plasmidos en Lact. casei (Chassy, 1987) y Leuc. lactis (David et al., 1992); indicando, en este
ltimo caso, una incorporacin ms reciente desde alguna otra especie. En Lact. plantarum
todas las cepas tienen una copia cromosmica y algunas tienen tambin copias plasmdicas,
con la misma organizacin gentica en ambos casos (Fernndez et al., 1999.
Los genes de la utilizacin de la lactosa de S. thermophilus y de Lact. delbrueckii
subsp. bulgaricus presentan tambin los mismos componentes, la misma organizacin y un
alto grado de homologa (ms del 60% de identidad en la secuencia de la protena
transportadora LacS) (Schmidt et al., 1990; Schroeder et al., 1991). Adems, los componentes
de este sistema no estn relacionados con los tipos anteriores y tienen mayor parecido con los
de bacterias Gram-negativas como E. coli (de Vos and Vaughan, 1994). Esta homologa es
ms clara an en el caso de la -galactosidasa de la cepa L. lactis ATCC7962, que se codifica
en un opern en el que tambin se encuentra una thiogalactosidasa con homologa a la que
aparece en el opern de E. coli, aunque el orden gnico es diferente (Vaughan et al., 1998).
Todo esto parece indicar que las bacterias lcticas han adquirido los genes necesarios
para la utilizacin de la lactosa de manera independiente en ms de una ocasin y de distintas
fuentes; genes que se han ido transfiriendo con posterioridad entre los miembros del grupo.
30

3.3.- Transferencia horizontal desde otros tipos microbianos.
Un caso espectacular de transferencia horizontal lo constituye el plsmido pK214 descubierto
recientemente en una cepa de L. lactis. Este plsmido, de unas 30 kpb, codifica resistencias a
diversos antibiticos mediadas por alguna de las seis ISs que posee (Perreten et al., 1997). En
el plsmido se han agrupado genes de resistencia a estreptomicina, cloranfenicol y
tetraciclina, adems de un sistema inespecfico de resistencia. A juzgar por la organizacin
gnica y la homologa de secuencia de ADN, los segmentos en los que se encuentran los
genes de resistencia a antibiticos parecen provenir de plsmidos de S. aureus, Listeria
monocytogenes y Streptococcus ssp. (Perreten et al., 1997). Las mismas conclusiones parecen
derivarse del anlisis del plsmido pMD5057 de Lact. plantarum, en el que parece haberse
insertado de forma reciente un gen de resistencia a tetraciclina (tetM) procedente de S. aureus
o Clostridium perfringens (Danielsen, 2002). Ambos plsmidos ejemplarizan el potencial de
la transferencia horizontal y el papel que sta juega en la adaptacin bacteriana a un ambiente
cada vez ms cargado de antibiticos.
Esto puede llegar a tener repercusiones importantes de salud pblica, dado que si los
genes de resistencia a antibiticos llegan a las bacterias de los alimentos, desde stas podrn
fcilmente extenderse en el sistema gastrointestinal a muchas otras, entre ellas a las bacterias
oportunistas o patgenas, como parece que ya est sucediendo en la actualidad (Teuber et al.,
1999; Eaton and Gasson, 2001; Franz et al., 2001). Estos genes parecen transferirse con
posterioridad a las bacterias que colonizan el tracto gastrointestinal (para revisin ver, Teuber
et al., 1999). Como ejemplo podemos citar los determinantes genticos de resistencia a
antibiticos que se han caracterizado en varias cepas de lactobacilos intestinales. stos
presentan una identidad total con los que se han caracterizado en otros tipos bacterianos. Tal
31
es el caso del gen de resistencia a eritromicina del plsmido pLEM3 de Lact. fermentum con
un 98,2% de identidad respecto del gen del transposn conjugativo Tn1545 (Fons et al.,
1997). Por su parte, la metilasa que confiere resistencia a eritromicina codificada en el
plsmido pGT633 de Lact. reuteri, parece provenir del plsmido de S. aureus pE194. Ambos
determinantes comparten las mismas seales de iniciacin de la transcripcin y la traduccin
y se expresan en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Tannock et al., 1994). Otro
ejemplo ms lo constituye el gen que determina la resistencia a cloranfenicol en el plsmido
de Lact. reuteri pTC82 que comparte un 95% de identidad nucleotdica con el gen de
resistencia a cloranfenicol del plsmido pC194 de S. aureus (Liu et al., 1996). Mencin aparte
merece la cepa Lact. fermentum ROT1 resistente a novobiocina, tetraciclina, eritromicina y
dalfopristn (Gfeller et al., 2003). En esta cepa la resistencia a los dos ltimos antibiticos est
codificada en un plsmido de 19,3 kpb.
En la era genmica se est comprobando que los procesos de intercambio horizontal
de material gentico son mucho ms frecuentes de lo que nunca se hubiera sospechado. Los
genomas microbianos estn formados por pequeas piezas de mosaico de procedencia diversa
(los genes) engarzadas primorosamente hasta conformar las eficientes y adaptadas especies
microbianas actuales (Nelson et al., 1999; Takami et al., 2000; Nlling et al., 2001). Aunque,
por su naturaleza, los procesos de adaptacin no son definitivos y, de hecho, en algunos casos
parecen encontrarse en pleno desarrollo (Schell et al., 2002).

3.4.- Intercambio gnico entre cromosoma y plsmidos.
Adems de servir como receptores de ADN del ambiente con el que afrontar las situaciones
nuevas, los plsmidos participan tambin de un intercambio gnico con el cromosoma del
husped, en un proceso denominado shuffling. ste sirve a los mismos propsitos que la
32
adquisicin de material gentico del exterior. De manera general, cuando un gen
cromosmico pasa a estar en un plsmido aumenta el nmero de copias. El aumento de copias
tiene dos consecuencias inmediatas. En primer lugar, el producto gnico aumenta debido al
aumento de copias y a un control de la expresin ms laxo del que existe en el cromosoma. En
segundo lugar, con el aumento del nmero de copias aumentan las posibilidades de mutacin,
lo que favorece la adaptabilidad.
Uno de los genes en los que se ha estudiado este fenmeno es el de la oligopeptidasa
PepF. En el plsmido que codifica la lactosa y la proteinasa en la cepa L. lactis subsp.
cremoris NCDO763 se encontr un gen especificando una oligopeptidasa que se denomin
PepF1 (Nardi et al., 1997). La secuencia del gen plasmdico pepF1p y las adyacentes son
idnticas a las de un segmento del cromosoma de la cepa L. lactis subsp. lactis IL1403. Por su
parte, la cepa NCDO763 presenta un gen cromosmico con un 80% de identidad respecto del
gen plasmdico y del gen cromosmico de IL1403. El gen plasmdico est flanqueado por una
copia de IS904 en un lado y una copia truncada de IS981 en el otro, lo que sugiere una
transferencia de pepF1 desde el cromosoma a un plsmido en L. lactis subsp. lactis IL1403 o
en una cepa equivalente. Dado que el plsmido que porta el gen es conjugativo, podra
haberse transferido posteriormente a diversas cepas entre ellas a NCDO763. El gen
cromosmico parece cotranscribirse con una metiltransferasa involucrada, posiblemente, en el
metabolismo de las protenas anmalas. La prdida del ligamiento y su inclusin en un
plsmido que codifica funciones esenciales para el crecimiento ptimo en leche sugieren una
funcin actual in vivo diferente para los dos enzimas (Nardi et al., 1997). En otras cepas de L.
lactis tambin se encuentra duplicado el gen que codifica la endopeptidasa PepO. La copia
adicional se encuentra localizada igualmente en el plsmido de la lactosa (Le Bourgeois et al.,
2000; Siezen et al., 2005). La ocurrencia independiente de estas duplicaciones indica que, de
33
alguna forma, son beneficiosas para las clulas en el entorno lcteo. El mismo beneficio
pudiera atribuirse a la duplicacin y transferencia a plsmidos del gen de la -galactosidasa en
diversas cepas de Lact. plantarum que hemos mencionado (Fernndez et al., 1999).
La posibilidad inversa, la integracin en el cromosoma de un gen plasmdico tambin
est documentada. As, se ha encontrado una cepa de L. lactis en la que el gen que codifica la
proteinasa extracelular est codificado en el cromosoma (Nissen-Meyer et al., 1992). La
consecuencia inmediata ms importante en este caso es la estabilizacin gentica del carcter,
lo que sin duda es un efecto positivo para aquellas caractersticas tecnolgicas deseables.

4.- CONCLUSIN.
Los plsmidos se revelan como un material gentico esencial al que se incorporan en primera
instancia los genes que las bacterias necesitan para responder a cambios rpidos en su
entorno; entorno del que sin duda toman los genes. El estudio de los plsmidos y de sus
propiedades, y su transferencia controlada a las cepas de nuestro inters, posibilitarn la
explotacin de las bacterias lcticas en toda su potencialidad como agentes transformadores y
conservadores de alimentos. Por otra parte, el desarrollo de herramientas biotecnolgicas de
ltima generacin permitir la manipulacin gentica en este grupo microbiano para la mejora
de las fermentaciones tradicionales y su aplicacin en procesos ms novedosos. Sin embargo,
en presencia de un ambiente hostil, como puede ser la presencia de antibiticos, los plsmidos
por su capacidad receptora pueden ponerse en nuestra contra.

5.- AGRADECIMIENTOS.
El trabajo en nuestro Laboratorio se ha financiado con un Proyecto FEDER del Ministerio de
Ciencia y Tecnologa (Referencia CICYT-1FD97-0339) y un Proyecto de la Fundacin para
34
el Fomento en Asturias de la Investigacin Cientfica Aplicada y la Tecnologa (Referencia
PB-AGR 99-01). Claudia Snchez ha sido becaria predoctoral de la Agencia Espaola de
Cooperacin Internacional. P. lvarez-Martn se ha beneficiado de un contrato del Programa
I3P del CSIC cofinanciado por el Fondo Social Europeo. Los autores agradecen sinceramente
a la Dra. Gloria del Solar, Centro de Investigaciones Biolgicas, CSIC, la lectura crtica del
manuscrito.

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46
47
Tabla 1.- Plsmidos de los gneros y especies ms tpicos de las bacterias lcticas y de las bifidobacterias cuyas regiones de replicacin o los plsmidos completos han
sido secuenciados.


Especie y cepa

Plsmido

Replicn
tipo
Kpb

Fenotipo relevante
a

N de secuencia
GeneBank
b



Lactococcus

L. lactis pCRL291.1 Theta 4,6 - AF380336
L. lactis DCH-4 pSRQ700 Theta/RCM 7,8 R/M U16027
L. lactis subsp. cremoris W10 pEW104 Theta - R/M LlaGI AF097471
L. lactis subsp. cremoris 2204 pWC1 RCM 2,8 - L75827
L. lactis subsp. cremoris HO2 pCI605 Theta 4,5 Sistema de R/M de tipo I AF142640
L. lactis subsp. cremoris HP pHP003 Theta 13,4 Proteinasa extracelular AF247159
L. lactis subsp. cremoris NCDO712 pSH71 RCM 2,1 - A09338
L. lactis subsp. cremoris P8-2-47 pBM02 RCM 3,8 Mov AY026767
L. lactis subsp. cremoris SK11 pSK11A Theta 10,4 Mov DQ149242
L. lactis subsp. cremoris SK11 pSK11B Theta 13,3 -acetolactato decarboxilasa DQ149243
L. lactis subsp. cremoris SK11 pSK11L Theta 47,2 Mov, Lactosa, PepO, PepF1, Opp DQ149244
L. lactis subsp. cremoris SK11 pSK11P Theta 75,8 Mov, Proteinasa, resistencia a Cu DQ149245
L. lactis subsp. cremoris UC503 pCI528 Theta 46 Resistencia a fagos L06274
L. lactis subsp. cremoris W12 pAW122 Theta - Especificidad R/M 1C AF097472
L. lactis subsp. cremoris W56 pJW563 Theta 11,5 Sistema de R/Mde tipo II X85168
L. lactis subsp. cremoris W60 pAW601 Theta - ABI S AJ132009
L. lactis subsp. cremoris Wg2 pWV01 RCM 2,2 - X56954
L. lactis subsp. cremoris Wg2 pWV02 Theta 3,8 - Z22704
L. lactis subsp. cremoris Wg2 pWV04 Theta 19 - Z25476
L. lactis subsp. cremoris Wg2 pWV05 Theta 27 Proteinasa Z25477
L. lactis subsp. lactis pND302 Theta 8,8 Resistencia a Cd U79032
L. lactis subsp. lactis pCIS3 Theta 6,1 R/M tipo I, transportador de Mg AF153414
L. lactis subsp. lactis 5136 pDI25 RCM 5,5 - X54310
L. lactis subsp. lactis CNRZ270 pUCL22 Theta 55 Lactosa y proteinasa X60454
L. lactis subps. lactis LL57-1 pND324 Theta 3,6 Termoestabilidad U44843
L. lactis subps. Lactis M14 pAR141 RCM 1,6 - DQ288662
L. lactis subsp. lactis diacetylactis pCT1138 Theta 8,3 Citrato permeasa L27067
48
L. lactis subsp. lactis diacetylactis Bu2 pSL2 Theta 7,8 Citrato permeasa X56550
L. lactis subsp. lactis diacetylactis CDR3 pNP40 Theta 65,0 Tra, R/M LlaJI, Abi, Cd resistencia DQ534432
L. lactis subsp. lactis diacetylactis DPC220 pAH33 Theta 6,1 Mov AF207855
L. lactis subsp. lactis diacetylactis DPC721 pAH82 Theta 20,3 R/M, PAI, resistencia a Cd, Mob AF243383
L. lactis subsp. lactis diacetylactis S50 pS7a Theta 7,3 Especificidad R/M AJ550509
L. lactis subsp. lactis diacetylactis S50 pS7b Theta 7,2 Especificidad R/M AJ550510
L. lactis subsp. lactis diacetylactis SSD207 pVS40 Theta 7,8 Citrato permeasa L02920
L. lactis subsp. lactis DPC3147 pMRC01 Theta 60 Lacticina 3147, ABI, Tra AE001272
L. lactis subsp. lactis IL2614 pIL2614 Theta - Sistema de R/M de tipo I U90222
L. lactis subsp. lactis IL594 pIL7 Theta 31 Sistema de R/M Z25475
L. lactis subsp. lactis IL964 pIL103 Theta - Sistema de R/M de tipo I, ABI AF013595
L. lactis subsp. lactis IL964 pIL105 Theta 6,5 ABI AF116286
L. lactis subsp. lactis IPLA972 pBL1 Theta 10,9 Lactococcina 972 AF242367
L. lactis subsp. lactis K214 pK214 Theta 29,8 Resistencia a Sm, Tc y Cm; Mob X92946
L. lactis subsp. lactis MJC15 pCD4 Theta 6,1 Especificidad R/M I AF306799
L. lactis subsp. lactis NCDO275 pCI2000 Theta 60 - AF154674
L. lactis subsp. lactis NIZO B40 pNZ4000 Theta (x4) 42,1 Sntesis de exopolisacrido, Mob AF036485
L. lactis subsp. lactis UC317 pCI305 Theta 8,7 - AF179848
L. lactis W-1 pRSQ800 Theta 7,8 ABI K U35629
L. lactis W-37 pRSQ900 Theta 10,8 ABI Q AF001314

Lactobacillus

L. acidophilus K8912 pLA105 - 3,2 - D49554
L. acidophilus TK8912 pLA103 Theta - - D55703
L. acidophilus TK8912 pLA106 RCM 2,8 Mov D88438
L. casei A23 pSMA23 RCM 3,5 - DQ116709
L. casei CRL705 pRC18 Theta 18 Bacteriocina Lac705 AF200347
L. casei NCIB4114 pLC88 - - Mov U31333
L. curvatus
pLC2.5 RCM 3,3 - AF546865
L. curvatus KLC140 pKLCA RCM 1,4 - AY188776
L. curvatus LTH683 pLC2 RCM 2,5 - Z14234
L. delbrueckii subsp. bulgaricus pLBB1 Theta 6,1 Mov AF236060
L. delbrueckii subsp. lactis CRL1212 pL1212 Theta 8,7 Especificidad R/M I AF109691
L. delbrueckii subsp. lactis JCL414 pJBL2 Theta 8,7 Especificidad R/M I AJ421486
L. delbrueckii subsp. lactis NCC88 pN42 Theta 8,1 Especificidad R/M I AJ421627
L. delbrueckii subsp. lactis WS58 pWS58 - 7,9 - Z50864
L. fermentum KC5b pKC5b Theta 4,4 - AF378372
49
L. fermentum LEM89 pLEM3 RCM 5,7 Resistencia a Em U48430
L. fermentum ROT1 pLME300 Theta 19,3 R/M, Mov, resistencia a Em- AJ488494
L. fermentum VKM1311 pLF1311 RCM 2,3 - X74860
L. johnsonii FI9785 p9785S RCM 3,5 - AY86214
L. helveticus ATCC15009 pLH1 Theta 19,3 - AJ222725
L. helveticus ATTC15009 pLH3 - 3,4 - X81979
L. helveticus LBL4 pLH4 - 2,5 - X81980
L. helveticus subsp. jugurti SBT2161 pLJ1 Theta 3,2 - J04240
L. hilgardii pLAB1000 RCM 3,3 - M55222
L. paracasei NFBC338 pCD01 - 19,8 MDR AY662330
L. paracasei NFBC338 pCD02 - 8,5 - AY662331
L. paraplantarum pC7 RCM 2,1 - AF459640
L. pentosus MD353 p353-2 RCM 2,4 - X62347
L. plantarum pC30i1 RCM 2,1 - J03319
L. plantarum pPSC22 RCM 7 - X95843
L. plantarum 5057 pMD5057 Theta 10,8 Resistencia a Tc AF44077
L. plantarum A112 pA1 RCM 2,8 - Z11717
L. plantarum AS1-2986 p2000 RCM 2,0 - AY096004
L. plantarum AS1-2986 p9000 RCM 9,2 Transportador de Mg AY096005
L. plantarum ATTC14917 pLF1 Theta 7,7 Protena de estrs al fro AF508808
L. plantarum ATTC8014 p8014-2 RCM 1,9 - X62346
L. plantarum BIFI-38 pPB1 RCM 2,9 - NC006399
L. plantarum CCM1904 pLP1 RCM 2,1 - M31223
L. plantarum L137 pLTK2 RCM 2,3 - AB024514
L. plantarum NCDO1088 pLB4 RCM 3,5 - M33531
L. plantarum NC7 p256 Theta nuevo 7,2 Sistema toxina-antitoxina NC006278
L. plantarum NGRI0101 pLKS RCM 2,0 Resistencia a bacterifagos AB035265
L. plantarum WCFS1 pWCFS101 RCM 1,9 - CR377164
L. plantarum WCFS1 pWCFS102 RCM 2,3 - CR377165
L. plantarum WCFS1 pWCFS103 Theta 36 Tra, resistencia a arsenato y arsenito CR377166
L. reuteri 100-23 pGT232 RCM 5,1 - U21859
L. reuteri AE78 pTE44 - 4,5 Resistencia a Em AY082384
L. reuteri G4 pTC82 RCM - Resistencia a Cm AF183511
L. reuteri N16 pTE15 - - - AF036766
L. sakei pRN500 Theta 12,9 Especificidad R/M AF438419
L. sakei LTH679 pSAK1 Theta 19 - Z50862
L. sakei RV332 pRV500 Theta 13 Sistema de R/M de tipo I- AF438419
Lactobacillus ssp. p121BS - 4,2 Resistencia a Em, Ty AF310974
50

Leuconostoc
-
L .citreum 22R p22R Theta 9,9 Mov, resistencia a Cm AJ493278
L .citreum IH3 pIH01 RCM 1,8 - NC006822
L. lactis NCDO533 pCI411 RCM 2,9 - L25529
L. mesenteroides subsp. mesenteroides FR52 pFR18 RCM 1,8 - Z99436
L. mesenteroides subsp. mesenteroides Y110 pTXL1 Theta 2,6 - AJ272077

Oenococcus
-
O. oeni
PRS1 RCM 2,5 Mov AJ006467
O. oeni
pRS2 RCM 2,5 Protenas de estrs al calor AJ310613
O. oeni pRS3 RCM 3,9 Mov, protenas de estrs al calor AJ310614
O. oeni 8413 pLo13 RCM 3,9 Mov, protenas de estrs al calor M95954
O. oeni bOg32 pOg32 RCM 2,5 Mov X86402
O. oeni CECT4028 p4028 - 4,4 - Z29976

Streptococcus thermophilus
S. thermophilus pST1 RCM 2,1 - X65856
S. thermophilus pSMQ172 RCM 4,2 - AF295100
S. thermophilus pER13 RCM 4,1 Sistema de R/M de tipo II AY033392
S. thermophilus
pSMQ173b RCM 4,4 - NC005323
S. thermophilus pSMQ308 Theta 8,1 NC005322
S. thermophilus pt38 RCM 2,9 Protena de estrs al calor AJ566638
S. thermophilus ER1 pER1-2 RCM 4,4 - AJ242478
S. thermophilus NDI-6 pCI65st RCM 6,5 Resistencia al calor AF027167
S. thermophilus No.29 pST1 RCM - S67974
S. thermophilus St0 pSt0 RCM 4,4 Sistema de R/M de tipo II AJ242480
S. thermophilus ST116 pER16 RCM 4,5 Especificidad R/M, prot. estrs AF177166
S. thermophilus ST134 pER341 RCM 2,8 Protena de estrs al calor AF019139
S. thermophilus ST135 pER35 RCM 9,5 R/M tipo IC, protena de estrs AF177167
S. thermophilus ST136 pER36 RCM 3,7 Protena de estrs AF177168
S. thermophilus ST137 pER371 RCM 2,6 - AF022180
S. thermophilus ST2-1 pND103 RCM 3,5 - AY250830
S. thermophilus ST371 pER371 RCM 2,6 - AF022180
51

Bifidobacterium
-
B. asteroides
pAP1 RCM 2,1 - Y11549
B. bifidum B80
pB80 RCM 4,8 Mov DQ305402
B. breve ATCC15698
pNBb1 RCM 2,2 - E17316
B. breve NCFB 2258 pCIBb1 RCM 5,7 Sistema de particin Par NC002133
B. catenulatum L48 pBC1 Theta 2,5 - NC007068
B. longum B2577 pMB1 Theta 1,8 - X84655
B. longum BK51 pTB6 RCM 3,6 Mov NC006843
B. longum DJ10A pDOJH10L RCM 10 Mov NC004252
B. longum DJ10A pDOJH10S Theta 3,6 Mov NC004253
B. longum KJ pKJ36 RCM 3,6 Mov NC002635
B. longum KJ pKJ50 RCM 4,9 Mov NC004978
B. longum NC2705 pBLO1 RCM 3,6 Mov NC004943
B. longum RW041 pNAC2 RCM 3,6 Mov NC004769
B. longum RW041 pNAC3 RCM 10,2 TraA NC004768
B. longum RW048 pNAC1 RCM 3,5 Posible sistema de R/M de tipo II NC004770


a
Distinto al de las funciones de replicacin. R/M, sistema o componente de un sistema de restriccin-modificacin; Mov, elementos de movilizacin; ABI, sistema de
infeccin abortiva; Tra, regin de transferencia conjugativa; MDR, multi drug resistance; Sm, estreptomicina; Tc, tetraciclina; Cm, cloranfenicol; Cd, cadmio; Em,
eritromicina, Ty, tilosina.
b
Las secuencias pueden obtenerse a travs de Internet en la direccin: http://www.ncbi.nlm.gov/PubMed/

55
LEYENDAS A LAS FIGURAS.
Figura 1.- A, Representacin esquemtica de la regin de replicacin de los plsmidos
RCM del grupo pMV158/pE194 y su control. B, Secuencia nucleotdica del origen de
replicacin del plsmido pBM02. En ambos paneles se representan los mismos
elementos, aunque en el panel A no se reproducen a escala. El sso est formado por dos
IRs, ambas necesarias para una actividad completa. El dso consta de una DR repetida tres
veces (zona de reconocimiento de Rep) y una IR (punto de corte). Pcr y PctRNA
representan los promotores a partir de los cuales se transcribe el RNAm de los genes cop y
rep y el ctRNA, respectivamente. La protena Rep inicia y activa la replicacin, mientras
que Cop la inhibe unindose al promotor Pcr. La traduccin de Rep se inhibe tambin por
el apareamiento de su RNAm con el ctRNA. Tras una ronda de sntesis de la cadena lder,
la sntesis de la cadena retrasada se inicia en el sso.

Figura 2.- A, Representacin esquemtica de la regin de replicacin del grupo
mayoritario de los plsmidos Theta de lactococos. B, Secuencia nucleotdica del
origen de replicacin del plsmido pBL1. El replicn mnimo comienza con una tpica
DR en tndem de 10-11 pb separada por una regin rica en A-T de las DRs de 22 pb
repetidas tres veces y media que constituyen los iterones. Separando estos elementos se
encuentran las denominadas pinzas GC, que impiden la separacin excesiva de las cadenas
durante el inicio de la replicacin. La DR final truncada se encuentra al extremo de la
regin que funciona en cis y forma parte tambin de una repeticin invertida, IR1, a la que
se une la protena RepB con mucha afinidad. IR1 contiene el putativo sitio -35 de la regin
promotora de repB. Otra IR importante se sita solapando parcialmente el posible RBS y el
56
triplete de iniciacin (IR3). La posicin de stas y otras IRs sugiere una participacin en la
regulacin de la replicacin y/o en el control del nmero de copias.

Figura 3.- Dendograma filogentico de las secuencias de las protenas Rep de
diferentes plsmidos de lactococos. Las distancias evolutivas se han medido como
porcentajes de identidad aminoacdica. A, Homologa de las secuencias de las protenas
Rep de los plsmidos de tipo RCM. Excepto para los plsmidos pSH71, pDI25 y pWV01,
prcticamente idnticos, la similitud de las secuencias aminoacdicas de sus protenas Rep
es escasa. An as, la organizacin estructural y funcional de todos ellos es muy similar. B,
Homologa de las protenas de los plsmidos de tipo Theta. Las secuencias de todas las
protenas Rep, con excepcin de las de pCRL291.1, pCI2000, y pNP40 pertenecen a una
sola clase y comparten ms del 50% de identidad aminoacdica.

Figura 4.- A, Esquema gentico y funcional de pBC1 de Bifidobacterium catenulatum
L48. B, Secuencia nucleotdica de su origen de replicacin. Se destaca la posicin,
orientacin y tamao de las distintas pautas abiertas de lectura y el punto de corte para
diversos enzimas de restriccin. En la secuencia, se han representado las DRs e IRs ms
representativas de la zona inmediatamente anterior al gen que codifica la protena de
replicacin. La numeracin sigue la de la secuencia del plsmido.