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7 GENTICA

La transferencia de ADN entre microorganismos puede ocurrir bsicamente por


cuatro procesos : a) transformacin, b) conjugacin, c) transduccin y d) sexduccin. Mediante
estos mecanismos los microorganismos pueden incorporar material gentico o donar material
gentico dando lugar a formas recombinantes.
Transformacin
Podemos definir el proceso de transformacin bacteriana como la capacidad que presenta una
bacteria para incorporar un fragmento de ADN que se encuentra en el medio externo. Este
mecanismo fue descubierto en el ao 1928 por F, Griffith en Streptococcus pneumoniae
(transformacin de cepas rugosas no patgenas a cepas lisas patgenas). Posteriormente Avery,
Mac Leod y Mc Carty (1944) demuestran que el principio transformante era el ADN
(experiencia que muestra por primera vez que la informacin gentica estaba codificada en las
molculas de ADN).
En el proceso de transformacin natural el ADN a ser captado debe encontrarse en estado de
doble cadena y el nmero de molculas de ADN que puede captar una bacteria es limitado
existiendo una cintica de saturacin.
El fenmeno de transformacin ocurre en varias etapas, y la bacteria que va a recibir el ADN
exgeno debe encontrarse en estado "competente" (estado en el cual la bacteria es capaz de
incorporar ADN del medio e integrarlo al cromosoma bacteriano).
El estado de competencia depende de varios factores y es diferente para cada especie
bacteriana. Los factores que influyen son varios como la densidadcelular del
cultivo, temperatura, pH, nutrientes (fuente de carbono o de nitrgeno). Las bacterias pueden
llegar al estado de "competencia" cuando se acercan al final de la fase de crecimiento
exponencial y entran en la fase estacionaria. En el estado de "competencia" en general se
encuentran entre un 10% a 20% de la poblacin bacteriana aunque esto puede variar segn la
especie bacteriana. Por ejemplo el Streptococcus pneumoniae el estado competente afecta al
100% de las clulas
durante la etapa exponencial mientras que el Bacillus subtilis solo entre el 1 y el
20% se encuentran en estado competente y este se manifiesta en la etapa estacionaria. El
primer paso de la transformacin consiste en la unin de la molcula de ADN a la superficie
de la clula bacteriana. Por ejemplo el Streptococcus pneumoniae presenta entre 20 y 50
puntos de unin. Una vez que el ADN se une, sufre una serie de cortes en las dos cadenas
mediante la accin de endonucleasas. Cuando los fragmentos de ADN entran a la clula,
pierden una de las dos cadenas. En el interior de la clula, el ADN forma un complejo
con protenas quedando protegido de la ADNasa I.
Existe en este momento un estado denominado fase de eclipse cuando el ADN que entr por
transformacin (exogenote) si sale de la clula no va apoder ejercer el efecto transformante.
Este ADN posteriormente se integra al cromosoma bacteriano en zonas de homologa de
secuencias.
Conjugacin
Lederberg y Tatum en 1946 descubren un proceso por el cual las clulas de E. coli
pueden intercambiar material gentico mediante un contacto fsico entre ellas (fig
1). Hoy da este fenmeno tiene gran importancia evolutiva y ecolgica puesto que la
transferencia de ADN puede establecerse no solo entre clulas de la misma cepa bacteriana
sino entre especies distintas y alejadas evolutivamente. El plsmido F conocido originalmente
como factor de fertilidad fue el primero que se descubri que poda pasar de una bacteria
donante a una receptora mediante el mecanismo de conjugacin (fig 2).
El plsmido F es de tipo conjugativo y tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma
bacteriano e integrarse en l (forma denominada "episoma")
El contacto fsico se establece mediante la formacin de un "pelo" o "pili" sexual constituido
por protenas. Para la formacin del "pili" intervienen no menos de 16 productos gnicos.
Dentro de las bacterias donantes se pueden diferenciar tres
+
tipos 1) las F
, que presentan al plsmido F y pueden transferirlo, 2) las Hfr
(clulas de alta frecuencia de recombinacin) que contienen al factor F integrado en su propio
cromosoma bacteriano, y lo pueden transferir junto con genes bacterianos, y 3) las F' (F-prima)
que son clulas Hfr que portan el genoma del factor F pero este tiene la capacidad de excindirse
y recircularizarse (forma de plsmido) llevando consigo genes bacterianos. El primer factor F-
prima (F') fue aislado por Jacob & Adelberg y llevaba genes del opern Lac . A este fenmeno
de transferencia de F' de una bacteria donante a una receptora se le conoce con
-
el nombre de sexduccin. A las bacterias receptoras se le denomina F
, ellas no
contienen al plsmido F y lo reciben de las bacterias donantes . Previo al proceso de
conjugacin, el Plsmido F se replica y transfiere su informacin a la clula F- convirtindola
en F+ sin perder ella misma dicha capacidad.

Fig 1: Observacin al microscpio electrnico del mecanismo de
Conjugacin.

Fig 2 : Mapa fsico y funcional del plsmido F (100 Kb).
Transduccin
Este mecanismo se puede definir como la transferencia de material gentico no vrico de una
bacteria a otra por intermedio de un bacterifago. Estos fagos llevan la informacin gentica de
la bacteria en el interior de su cpsida (partculas transductoras) (fig 3).
Originalmente este fenmeno se describi en Salmonella aunque hoy se conoce en distintas
especies bacterianas. Varios fagos presentan capacidad transductora como el P1, T4, Mu y el
fago ?. Existen dos tipos de transduccin:, a) la transduccin generalizada en la cual el fago
puede portar un fragmento cualquiera del genoma bacteriano, b) la transduccin especializada
en la cual el fago lleva informacin de regiones especficas del cromosoma bacteriano (ej el
opern gal de E.coli en el fago ? ) pudiendo transducir e infectar.

Fig 3: Esquema general del proceso de transduccin.
TRANSPOSONES
Se conocen tambin con el nombre de elementos genticos mviles, genes saltarines, casetes,
etc. Los primeros genes saltarines los descubri Barbara McClintock en la dcada del 40
cuando estudiaba la gentica del maz y en 1967 se descubren en organismos procariotas
(E.coli). Son secuencias de ADN que tienen la capacidad de saltar de un lugar a otro del
genoma. Los transposones
ms simples se denominan elementos IS (secuencias de insercin) y presentan una regin
central de 700 a 1500 bp rodeados de una secuencia invertida de 10 a
30 bp. En la regin central se encuentran los genes encargados de realizar el salto o
transposicin. Tambin se encuentran los llamados transposones compuestos que presenta una
regin central rodeada por dos elementos IS, estos transposones llevan informacin gentica
adicional. En el mecanismo del salto o transposicin intervienen enzimas tales como la
transposasa (produce cortes) y la resolvasa (acta en el proceso de recombinacin).
En algunos casos el elemento mvil puede replicarse antes de saltar dejando una copia en el
lugar original mientras que otras veces puede saltar sin dejar copia e insertarse en otra regin
del genoma. Estos elementos genticos mviles los podemos encontrar tanto en el cromosoma
bacteriano como en plsmidos y pueden ser transferidos entre bacterias por los mecanismos de
conjugacin, transduccin y transformacin.
MUTACIN EN MICROORGANISMOS
El material gentico de un microorganismo puede alterarse por factores endgenos (origen
espontneo) o exgenos (origen inducido). Existen distintos niveles mutacionales, por ejemplo
cuando la mutacin tiene un efecto puntual en un gen se denomina mutacin gnica mientras
que si esta afecta a diversas partes del genoma, la denominamos mutacin genmica. Si la
mutacin afecta la estructura del cromosoma (en bacterias) o de
los cromosomas(microorganismos eucariotas; levaduras) las denominamos mutaciones
cromosmicas. Al hablar de mutaciones en microorganismos debemos tener en cuenta la
variabilidad microbiana existente as como el tamao de sus genomas (Tabla 1).
Microorganismo s
Tamao del genoma
(Mb)
Proporcin del genoma
codificante de protenas
Nmero de protenas
por genoma
E. coli 4.64 88 4288
H. influenzae 1.83 85 1703
H. pylori 1.70 91 1590
Mycoplasma pneumoniae 0.82 89 677
Saccharomyces cerevisie 12.1 72 5885
Tabla 1: Comparacin de genomas de distintos microorganismos
Las mutaciones que afectan al fenotipo del microorganismo nos permiten diferenciarlo en
algn carcter en particular respecto del microorganismo con fenotipo "normal" que sirve de
referencia (fenotipo silvestre).
En ltima instancia los fenmenos mutacionales tienen su efecto a nivel de la molcula de ADN
y pueden verse alteradas secuencias o elementos necesarios para la expresin de un gene o de
varios genes (promotores, secuencias reguladoras, terminadores, etc.). Por otro lado las
mutaciones pueden afectar secuencias moduladoras tales como operadores.
Las clulas bacterianas crecen y se dividen d tal forma que en uno o dos das una clula
origina millones de ellas, todas genticamente idnticas (clones). Las clulas que derivan de
una de ellas se mantienen juntas formando la colonia bacteriana (visible al ojo humano,
aproximadamente 10 millones de bacterias). Por lo tanto la colonia constituye la unidad ms
importante para la identificacin de clulas mutantes. Uno de los desafos del genetista
microbiano consiste en disear estrategias experimentales para el reconocimiento de colonias
mutantes; a tales efectos se emplean los procesos de rplica, seleccin y contraseleccin (Fig 4).
Actualmente existe tecnologa adecuada y costosa para poder identificar clulas mutantes en
forma separada o sea que mediante estos mtodos, la clula pasara a ser la unidad de
identificacin de fenotipos mutantes.
Una de las tcnicas de anlisis reciente de clulas es la citometra de flujo; que consiste en
tratar a una poblacin celular con un agente mutagnico y luego se hace pasar por un tubo
capilar iluminado por un rayo de luz que analiza varios parmetros celulares (tamao,
transparencia celular, emisin de fluorescencia). Posteriormente mediante
un sistema separador es posible obtener clulas aisladas con diferentes caractersticas. La
posibilidad de marcar a las clulas con compuestos fluorescentes aumenta las posibilidades de
separacin de las mismas en un citmetro de flujo.

Fig 4: Procedimientos para la bsqueda de colonias mutantes. Mediante la rplica se comparan
copias idnticas de colonias en dos o ms cajas de Petri con distintos medios de cultivo (por
ejemplo: medio completo y medio mnimo para identificar mutantes auxtrofos) o tambin con
igual medio de cultivo pero distintas
condiciones de temperatura (por ejemplo: cultivos a 30 C y cultivos a 40 C, para identificar
microorganismos termosensibles). El sistema de seleccin utiliza el agregado de sustancias que
matan a unas clulas mientras que otras no se ven afectadas. El sistema de contraseleccin se
utiliza para la identificacin y anlisis de las colonias mutantes ya que se eliminan primero las
que crecen y posteriormente se dejan crecer en condiciones ptimas a las colonias
supervivientes.
Prottrofo: Cepa de microorganismo capaz de crecer en un medio mnimo definido a partir del
cual puede sintetizar la totalidad de las molculas biolgicas complejas que requiere.
Auxtrofo: Cepa de microorganismo incapaz de sintetizar una molcula orgnica determinada
necesaria para su crecimiento. Se produce su crecimiento cuando se
suministra en el medio de cultivo el compuesto requerido.
Son frecuentes las mutaciones?
En general las mutaciones espontneas son poco frecuentes. Para cuantificar las mutaciones se
suelen usar dos parmetros a) tasa de mutacin, y b) frecuencia de mutacin.
La tasa de mutacin nos mide la tendencia que tiene un gen de sufrir mutaciones, y se expresa
como el nmero de mutaciones que ocurren por cada unidad que mida la oportunidad de
mutar. Dicha unidad puede ser el tiempo de generacin celular o de divisin celular (tiempo
biolgico).
Por frecuencia de mutacin se entiende como la frecuencia de aparicin de un mutante en la
poblacin final de bacterias.

Ejemplo: Tasa de mutacin ser el cociente entre un evento mutacional (M) en 7 divisiones
celulares reales. Mientras que la frecuencia mutacional se calcular como el cociente entre la
frecuencia de clulas mutadas en el total final de la poblacin (2/8= 0.25).

Test de AMES
Dicho test fue desarrollado por el microbilogo Bruce Ames con la finalidad de poder
determinar el poder mutagnico de determinadas sustancias qumicas. Este nos permite en
forma rpida evaluar aquellas sustancias qumicas que pueden tener poder carcinognico.
En este tipo de anlisis se parte de la premisa de que si una sustancia qumica ocasiona dao en
el ADN con un efecto mutagnico, tambin pueden llegar a tener un efecto carcinognico. A
pesar de esto existen sustancias que causan cncer en animales de laboratorio y son negativas
al mismo.
En el test de Ames se emplean diferentes cepas de la bacteria Salmonella typhimurium de las
cuales se le conocen los tipos de mutaciones que presentan. Estos mutantes han perdido la
capacidad de sintetizar el aminocido histidina (His) por lo tanto se dice que son histidina
auxotrficos (His-) pues solo crecen en medios de cultivo a los que se les adiciona dicho
aminocido. Las cepas salvajes de Salmonella typhimurium contienen todas las enzimas
necesarias para fabricar el aminocido His (cepas prototrficas, His +).
Por lo tanto se evaluara la capacidad o habilidad que presentan determinados compuestos
qumicos para producir mutaciones revertientes (back mutation) o sea que las cepas mutantes
histidina auxotrficas reviertan a cepas salvajes de Salmonella typhimurium (prototrficas)
(Fig 5).
Los principales tipos de mutaciones observadas son a) de cambio del marco de lectura de
genes, que traen como consecuencia una traduccin errnea de los mismos y b) mutaciones
puntuales con sustitucin de una base produciendo un cambio en la secuencia aminoacdica de
la protena codificada por dicho gen.
Las cepas de Salmonella typhimurium que se utilizan en el test han sido seleccionadas
basndose en la sensibilidad a sufrir mutaciones. Estas cepas presentan una serie de
caractersticas: a) un aumento de la permeabilidad de la pared celular para permitir el ingreso
rpido de la sustancia a testar (mutantes rfa), b) mutaciones en el sistema de reparacin de
daos en el ADN (mutantes uvrB)
,c) plsmidos R y plsmidos multicopias que agregan errores durante la accin del sistema
reparador de daos del ADN. Estas cepas se conocen con el nombre de TA97A, TA98, TA100,
TA102 y TA1535.
Con el correr de los aos se observ que existan sustancias que si bien no eran mutagnicas
pero que al ser metabolizadas en organismos superiores producan metabolitos intermediarios
que si tenan capacidad mutagnica y podan ser potenciales carcnogenos. Para solucionar
parcialmente este problema; al medio de cultivo empleado en el test de AMES se le adicion
una mezcla de enzimas de hgado de rata para simular el metabolismo que sufre la sustancia en
un organismo superior. Este sistema que simula al hgado de un mamfero se conoce
con el nombre de S-9 y nos permite detectar metabolitos intermediarios posiblemente
carcinognicos.
Las ventajas del empleo de dicho test son muchas: es rpido (las bacterias crecen y se dividen
rpidamente), es muy simple (El tiempo aproximado para obtener un resultado final en este
test es de 30 das), tiene bajo costo econmico, es posible testar varias sustancias al mismo
tiempo, utilizando las mismas condiciones es repetible el resultado obtenido.

Figura 5: Se observa una versin cualitativa del test de Ames. En la placa de Petri se sembraron
cepas de Salmonella typhimurium que requieren His para su crecimiento (auxotrficas, His- ).
El disco de papel blanco esta impregnado con una sustancia carcinognica (2-aminofluorine).
Dicha sustancia produce un efecto mutagnico en dicha cepa y se observa crecimiento de
diversas colonias alrededor del disco (los mutantes His- mutan a cepas prototrficas que crecen
en un medio carente de His).
Resistencia Microbiana a sustancias antibiticas
En los ltimos aos el avance de la industria farmacutica permiti generar nuevos antibiticos
artificiales para el tratamiento de enfermedadesinfecciosas.
Por otra parte esto genero una adaptabilidad de los
microorganismos producto del desarrollo de resistencia. Durante los aos de 1940 al 1950 el
uso de las sulfamidas y penicilinas produjo el surgimiento de cepas bacterianas resistentes a
esas drogas constituyendo un serio problema.
En Inglaterra el uso de penicilina G produjo en los staphylococcus aureus un aumento de la
frecuencia de cepas resistentes del 10% al 60%. Existe una fuerte base gentica que permite
explicar la resistencia bacteriana a determinadas drogas. Dentro de los mecanismos genticos-
moleculares podemos citar: 1) la capacidad de que se generen nuevas mutaciones en genes
localizados en el cromosomas bacteriano, 2) introduccin de plsmidos R. Estos pueden pasar
de una cepa bacteriana a otra mediante conjugacin.
Los plsmidos R presentan una serie de ventajas adaptativas: a) han evolucionado como
respuesta a la presin selectiva del ambiente como ser, los distintos antibiticos utilizados por
humanos, b) presentan genes de resistencia a mltiples sustancias antibiticas, c) pueden
trasladarse entre bacterias de la misma especie o de especies diferentes, d) presentan
elementos genticos mviles o transposones, e) al no existir presin selectiva (utilizacin de
antibiticos) las clulas bacterianas los van perdiendo como una forma de "economa" f) no
interfieren con otros genes bacterianos por lo cual las bacterias se desarrollan normalmente
mostrando todo su potencial fenotpico.
En el tema de la resistencia, los seres vivos ms abundantes del planeta (las bacterias) nos
permiten comprobar la teora "Darwiniana" de la supervivencia de los ms aptos. Como
mecanismos bioqumicos implicados en el fenmeno de la resistencia podemos citar :
disminucin en la permeabilidad a absorber el antibitico, inactivacin enzimtica de la
sustancia antibitica, modificacin del "blanco" o "diana" sobre la que acta el
antibitico, sntesis de una enzima de resistencia.
La disminucin de la permeabilidad puede estar dada por: modificaciones a nivel de la
membrana externa (barrera natural), por la existencia de mecanismos de bomba de expulsin
que enva al exterior al antibitico luego de su entrada, alteraciones en el mecanismos, por
alteraciones en el mecanismo de transporte del antibitico.
En el caso de las tetraciclinas por ejemplo hay bacterias que presentan transposones tipo el
Tn10 o el Tn1721 que codifican protenas con la funcin de expulsar al antibitico desde el
interior al exterior de la clula. En el caso de los antibiticos beta-lactmicos (penicilina,
cefalosporina) los plsmidos R presentan genes que codifican para enzimas beta lactasas
(penicilasas, cefalosporinasa) que abren el anillo lactmico y hacen que el antibitico pierda su
accin. En el caso de la resistencia generada al cloranfenicol , esta viene dada por una enzima
inactivante del mismo, denominada cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT). Uno de los genes
que codifica para la CAT forma parte del transposn Tn9 . La presin selectiva contnua va
generando nuevos mecanismos de resistencia como la creacin de nuevas enzimas resistentes.
RESISTENCIA BACTERIANA Y SU RELACIN CON LA
BIOTECNOLOGA
La construccin biotecnolgica a gran escala de plantas modificadas genticamente (plantas
transgnicas) plantea una serie de problemticas. Una de ellas es la posibilidad de generar
resistencia a los antibiticos por parte de las bacterias que habitan el mismo ecosistema. Este
fenmeno podra producirse mediante la migracin de genes de resistencia antibitica desde la
planta transgnica a las bacterias.
Este efecto boomerang (retorno de los genes hacia las bacterias) podra generar bacterias con
alta resistencia a los antibiticos, patgenas para el hombre y los animales (Fig 6).
El proceso de transgnesis supone la introduccin de un gen extrao, llamado transgn en el
genoma de un organismo vivo. Este transgn aportar una ventaja
ecolgica, nutricional, farmacutica, o permitir avanzar en las investigaciones sobre
regulacin gnica en eucariotas. Para la realizacin de este proceso en los laboratorios
de biologa molecular es necesario manipular los genes para obtener la clonacin de los
mismos. Esta tcnica exige el uso devectores de clonacin
portadores de genes de resistencia a sustancias antibiticas (tabla 2).
Nombre del gen Confiere resistencia a:
Planta transgnica
portadora del gen
Bla TEM-1 Penicilina G, ampicilina, amoxycilina Maz
aph 3'-2 (NPTII) Kanamicina, neomicina Tomate
Aph 3'-3 Amikacina Tomate
Aad 9 Estreptomicina, espectinomicina Algodn
Tabla 2: genes de resistencia a sustancias antibiticas ms frecuentemente utilizados en los
procedimientos de transgnesis en vegetales.
Actualmente se ha demostrado que las transferencias de ADN pueden establecerse
entre reinos muy alejados como el procariota (bacterias) y el reino vegetal. En este caso
estaramos hablando de transferencia entre un organismo eucariota (planta transgnica) y un
organismo procariota (bacteria). Dicho proceso se muestra favorecido por el cultivo intensivo
de una planta que porta un gen de resistencia a un antibitico provocndose un aumento del
nmero de copias de este gen en el ecosistema. En teora este proceso es totalmente viable de
ah la preocupacin de las empresas biotecnolgicas destinadas a la produccin de plantas
mejoradas por estas tcnicas.
La transferencia horizontal de informacin gentica se efecta en tres etapas: a) transferencia
del ADN, b) estabilizacin del mismo en un nuevo ser vivo (husped receptor), c) expresin del
gen en dicho husped.

Fig 6: Bacterias patgenas (Staphylococcus aureus) que desarrollan una resistencia cada vez
mayor a los antibiticos de uso frecuente. Problema preocupante en hospitales de salud
humana y salud animal.
Cmo puede transferirse un gen de resistencia antibitica desde una planta transgnica a una
bacteria?
El efecto boomerang del cual hablamos puede producirse por dos mecanismos. El primero de
ellos podra ocurrir en el tubo digestivo de animales o seres humanos que ingieren una planta
transgnica o un derivado de la misma. Pensemos que en el tubo digestivo encontramos una
gran variedad de cepas bacterianas comensales que se encuentran en distintos estados
fisiolgicos. Algunas bacterias podran encontrarse en estados de competencia donde por
permeabilidad pueden recibir un gen codificador de resistencia antibitica liberado por la
planta durante la digestin (ej. gen bla TEM-1 de 858 bp). A su vez el contacto ntimo entre las
bacterias podra favorecer el intercambio de este material gentico dentro del tubo digestivo
(transferencia horizontal entre distintas especies bacterianas) generndose cepas resistentes.
El segundo mecanismo mediante el cual puede generarse el efecto boomerang sera el pasaje de
genes desde la planta transgnica en descomposicin (races) hacia bacterias del suelo. Este
mecanismo se ve favorecido por la resistencia y estabilidad de la molcula de ADN en
los suelos y por la eficacia de las bacterias del suelo para incorporar material hereditario.
Cmo puede estabilizarse el o los genes de resistencia incorporados?
La estabilizacin de dichas secuencias de ADN puede realizarse por la llamada recombinacin
homloga entre secuencias que estn a ambos lados del gen de resistencia y el ADN de la clula
bacteriana receptora. Holliday en 1964 propone un modelo de recombinacin mediante el
proceso de rotura-reunin donde se constituye un ADN hbrido e intervienen una serie de
protenas (RecA, RecBCD, ligasas) (fig 7). En este proceso de estabilizacin, el gen se
incorporar al cromosoma bacteriano y se transmitir a la descendencia de manera estable.
Otro de los procesos de estabilizacin de material gentico extrao puede darse a travs de
elementos genticos mviles (transposones) o plsmidos no
integrativos. En estos casos la transmisin puede ser vertical (a la descendencia)
u horizontal (entre bacterias).
Qu alternativas existen para evitar estos problemas?
Si bien los genes de resistencia a sustancias antibiticas son los ms utilizados como
marcadores de seleccin en las tcnicas de ingeniera gentica, una de las alternativas viables
sera sustituir a dichos marcadores por otros menos problemticos. Actualmente se empez a
utilizar un gen de resistencia a un herbicida que sera de mayor utilidad en los procesos de
seleccin de plantas transgnicas.
Otra solucin sera realizar construcciones separadas o sea el gen marcador y el gen
de inters (transgn) e integrarlos en sitios diferentes del genoma para posteriormente realizar
cruzamientos entre estas plantas transgnicas y seleccionar aquellas que solo heredan el
transgn y no el gen marcador.
La tercer alternativa consistira en colocar a ambos lados del gen marcador secuencias
especiales que posteriormente con la utilizacin de enzimas de restriccin se podran cortar y
eliminarlas junto con el gen marcador.


7.1 El genoma microbiano.

El genoma microbiano comprende la secuencia completa de los genes de un
microorganismo. Su conocimiento permite una mejor comprensin de la patogenia, con
aplicacionesen la prevencin, en el diagnstico y en el tratamiento de las enfermedades
infecciosas. Conocidas la dinmica de los mecanismos de invansin, produccin de
toxinas, capacidad de adaptacin aecosistemas adversos y otras mltiples posibilidades
de variacin, pueden disearse nuevas vacunas ms especficas, as como establecer
combinaciones interespecies, o utilizarse bacterias avirulentas de muyfcil cultivo para
producir en forma industrial antgenos de grmenes de crecimiento fastidioso. En el
campo de los antibiticos, se abren perpectivas hacia lneas absolutamente distintas, con
drogascapaces de bloquear determinados pasos en cadenas metablicas vitales. Ya
existen mltiples aplicaciones de la gentica en diagnstico microbiolgico, con tcnicas
que indudablemente se irnsimplificando y perfeccionando con el conocimiento de la
entera secuencia del genoma bacteriano: hibridacin, reaccin de polimeras en cadena,
etc. Por ltimo, el conocimiento del genoma tambin permitir lautilizacin benfica, a
escala industrial, de algunos microorganismo en la produccin de hormonas, vitaminas,
aminocidos y antibiticos

7.1.1 Organizacin de los genes diferencias entre procariotas y eucariotas.

Clula eucariota: La regulacin gentica de los eucariotas, especialmente en los multicelulares se
complica por el proceso de diferenciacin que ocurre en los organismos multicelulares. Cada
organismo multicelular comienza como una sola clula llamada cigoto que se divide por mitosis.
Las clulas se diferencian en variados tipos funcionales utilizando algunos genes e ignorando
otros.
Los genes hometicos (Homeobox genes) dirigen la organizacin general del cuerpo y la posicin
de los rganos en respuesta a un gradiente de molculas regulatorias.

El momento("timing") en que se expresa un determinado gen parece seguir una secuencia, tal
como la produccin de hemoglobina fetal en los glbulos rojos de los mamferos, que cambia a
hemoglobina adulta poco antes del nacimiento. Claramente la inactivacin de ciertos genes ocurre
en cada adulto y ello esta relacionado con el cancer, la prolongacin de la vida y tanto otros
Clula procariota: El sistema gentico de los procariotas en mucho ms sencillo de estudiar que el
de los eucariotas y condujo a conclusiones fundamentales proveyendo las actuales herramientas
de la "ingeniera gentica".

Los procariotas como Escherischia coli y los virus que los infectan fueron y siguen constituyendo
una herramienta fundamental para el estudio de la estructura y transmisin de los genes.
Entre las ventajas de trabajar con estos organismos encontramos:
Menor tamao y mayor nmero de organismos por rea de cultivo
Mayor velocidad de reproduccin: Escherischia coli duplica su poblacin en 20, todos los
descendientes son clones de la clula original.
Son haploides, por lo que cualquier cambio o mutacin se expresa inmediatamente.
7.1.2
FUNCIONES DE LOS PLSMIDOS

La presencia de plsmidos transmisibles confiere a las bacterias propiedades que
complementan su capacidad para colonizar ambientes adversos, favorece el
intercambio gentico intracelular, y garantiza la diseminacin horizontal de genes de
resistencia a antibiticos, y de otras funciones, entre gneros distintos.
Los plsmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios de gentica y
bioqumica, donde son comnmente usados para multiplicar (hacer muchas copias
de) o como genes particulares expresos. Muchos plsmidos estn disponibles
comercialmente para dichos usos.
El gen a ser replicado se inserta en copias de un plsmido el cual contiene genes que
hacen clulas resistentes a un antibitico en particular. En el paso siguiente el
plsmido es insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transformacin.
Luego, la bacteria es expuesta a un antibitico particular. Solo la bacteria que toma
copias del plsmido sobrevive al antibitico debido a que el plsmido lo hace
resistente. En particular, los genes protectores son expresados (usados para hacer
protena) y la protena expresada evita la accin del antibitico. De esta forma, los
antibiticos actan como un filtro que seleccionan nicamente la bacteria modificada.
Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas en largas cantidades, cosechadas y el
plsmido de inters puede ser aislado.
Otro uso importante de los plsmidos es fabricar grandes cantidades de protenas. En
este se deja crecer la bacteria que contiene el plsmido que encierra al gen de
inters. Solo como la bacteria produce la protena que le confiere si resistencia a los
antibiticos, este tambin puede ser usado para producir protenas en grandes
cantidades desde el gen insertado. Esta es una forma barata y fcil de producir genes
o protenas que este codifica de forma masiva, como por ejemplo insulina, o inclusive
antibiticos.

Se los clasifica por su funcin:

1) Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, ellos son capaces de
conjugarse.

2) Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir
resistencia contra antibiticos o venenos. Histricamente conocidos como Factores R,
antes de que se entendiera la naturaleza de los plsmidos.

3) Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican colinas y protenas que
pueden matar a otra bacteria.

4) Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias inusuales
como tolueno o cido saliclico.

5) Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno

Otra clasificacin en cuanto la funcin de que los plsmidos sean o no transmisibles
de una bacteria a otra por medio de contactos intercelulares, se pueden distinguir:

A. Plsmidos Conjugativos (auto transmisible): Que son aquellos que se transfieren
entre cepas por medio de fenmenos de conjugacin. Algunos de estos plsmidos no
slo se transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son capaces de hacerlo
entre especies y gneros muy diversos, recibiendo el muy apropiado nombre de
plsmidos promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo
transferencia horizontal de informacin gentica entre grupos bacterianos
filogenticamente alejados.

B. Plsmidos No Conjugativos: Carentes de esta propiedad de conjugacin. Dentro
de esta categora existe un subgrupo, el de los plsmidos movilizables: son aquel no
auto transmisible que pueden ser transferidos por la accin de un plsmido
conjugativo coexistente en la misma bacteria.

Los plsmidos no suelen ser indispensables para la viabilidad de la bacteria, y
muchos de ellos se pierden en ausencia de una presin selectiva. Una bacteria puede
ser curada de su(s) plsmido(s), es decir, se le pueden eliminar, bien de forma
espontnea, bien por una serie de tratamientos en el laboratorio (incubando las
bacterias a temperaturas cercanas a la mxima o por agentes qumicos como el
naranja de acridina, que se insertan entre las bases del ADN). La razn de esta
curacin de los plsmidos es que esos tratamientos interfieren con su replicacin sin
afectar a la replicacin del cromosoma. Esto hace que en sucesivas divisiones de una
bacteria, el plsmido se vaya diluyendo en la poblacin resultante.

Los plsmidos no suelen determinar productos esenciales para el crecimiento (por eso
son dispensables), pero en la naturaleza parece que resultan favorecidas las bacterias
con algn plsmido, quiz porque acarrean ventajas selectivas en determinados
ambientes o en determinadas condiciones. Existe una variedad de fenotipos y
funciones determinados por plsmido:

Resistencia a antibiticos (plsmidos R; los estudiaremos en la seccin de Gentica).
Resistencia a metales pesados (por ejemplo, resistencia a mercurio).
Plsmidos de virulencia: produccin de toxinas, factores de penetracin en tejidos,
adherencia a tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias patgenas.
Produccin de bacteriocinas (protenas txicas producidas por bacterias que matan
a otras de la misma especie).
Produccin de siderforos (quelatos para secuestrar iones Fe3+).
Utilizacin de determinados azcares.
Utilizacin de hidrocarburos, incluyendo algunos cclicos recalcitrantes (degradacin
de tolueno, xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas.
Induccin de tumores en plantas (plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens).
Interacciones simbiticas y fijacin de nitrgeno en ciertos Rhizobium.

Funciones celulares codificadas por plsmidos

A. POR TODOS LOS PLSMIDOS
1. Autorreplicacin

B. POR ALGUNOS PLSMIDOS
1. Autotransferencia.
2. Resistencia a agentes antimicrobianos
a) Antibiticos: por ejemplo, estreptomicina, penicilina, kanamicina, neomicina,
cloranfenicol, tetraciclina.
b) Agentes quimioteraputicos sintticos: por ejemplo, sulfamida y trimetoprima.
c) Metales pesados: por ejemplos, Ag, Hg y Cd.
3. Produccin de pigmentos.
4. Produccin de toxinas.
5. Funciones catablicas: por ejemplo, degradacin de lactosa, octano y alcanfor.
6. Sensibilidad y resistencia a los fagos.
7. Produccin de antibiticos
8. Produccin de bacteriocina
9. Induccin de tumores vegetales
10. Produccin de H2S
11. Restriccin y modificacin controlada por el hospedador

MECANISMOS DE INTERCAMBIO GENETICO

Aunque en nuestros conocimientos solo sepamos el intercambio genetico de un
mismo organismo, es de interes nuestro, saber que los genes tambien pasan en este
caso de estudio en bacterias, de unos a otros con mucha frecuencia, pues los genes
pueden introducirse en otras bacterias o incluso en otros organismos.

Rasgos generales de la transferencia gentica en bacterias:
a) La transferencia es unidireccional, es decir, tiene una determinada
polaridad, existiendo clulas donadoras y clulas receptoras.
b) La transferencia del genomio de una clula a otra no suele ser total,
sinoparcial.
c) Parte del material gentico, una vez introducido en la clula receptora, sufre
inmediatamente un fenmeno de recombinacin con el genomio de la receptora. El
resto del material de la donadora o no se replica, o se ve destruido.
d) Como se puede deducir, tras los procesos de transferencia gentica
bacteriana, no surge una diploida total (como es el caso en eucariotas), sino una
diploida parcial, que recibe el nombre de merodiploida. Las clulas bacterianas
diploides parciales reciben la denominacin de merodiploides o merozigotos.
Adems, la merodiploida suele ser transitoria.
Este tipo de intercambio gentico unidireccional, con diploida transitoria parcial, se
denomina meromixia, para distinguirlo de la reproduccin sexual de eucariotas.
El genomio de la clula receptora se suele denominar endogenote.
La porcin de genomio de la cl. donadora que se transfiere se
llama exogenote.

Los procesos de transferencia gentica en bacterias son de tres grandes tipos, ms
una variante adicional de uno de ellos:

TRANSFORMACIN: CAPTACIN Y ASIMILACIN DE ADN LIBRE
(DESNUDO), A PARTIR DEL MEDIO, POR PARTE DE UNA CLULA
RECEPTORA. SE PUEDE DEFINIR COMO LA VARIACIN HEREDITARIA DE
UNA CLULA BACTERIANA SUSCEPTIBLE, ORIGINADA POR LA CAPTACIN
DE ADN DESNUDO LIBRE EN EL MEDIO, CON LA POSTERIOR
RECOMBINACIN DEL EXOGENOTE CON EL GENOMIO DE LA CLULA EN
CUESTIN (ENDOGENOTE). TRAS LA TRANSFORMACIN, LA CLULA QUE
HA RECIBIDO EL ADN SE SUELE DENOMINAR TRANSFORMANTE
Se presenta cuando un gen se adquiere a travs de un plsmido o si se ha entregado
al cromosoma de una clula receptora como parte del fragmento de ADN. Al igual que
en bacterias Gram-negativas que en Gram-positivas esta transformacin requiere que
el ADN libre sea estable y que las clulas receptoras estn capacitados para
incorporarlo pues estas receptoras deben presentar en su superficie protenas
especializadas que se une al ADN y lo introduzcan al interior, es decir incorporar ADN
extracelular.

CONJUGACIN: transferencia directa de material gentico, promovida por un
plsmido, desde una clula donadora a otra receptora, por medio de contactos ntimos
entre ambas (puentes de unin) , con intervencin de estructuras superficiales
especializadas y de funciones especficas.
Una variante de la conjugacin es la SEXDUCCIN: en ella, un trozo definido de
material gentico de la donadora es transferido como parte de un plsmido
conjugativo.

TRANSDUCCIN: el material gentico es transportado desde la cl. donadora a la
receptora por medio de un virus bacteriano (o sea, un bacterifago o simplemente,
fago), que acta como vector.




7.2
Gentica de los microorganismos
En lo que respecta a la gentica de los microorganismos (o la gentica microbiana) hay que
tener en cuenta que una de las caractersticas de sta es el hecho de que los
microorganismos se pueden estudiar de un modo fcil y rpido, esto es debido a que su
distribucin es generalmente muy amplia, su tamao es microscpico, su ciclo vital es
relativamente corto y muy simple en comparacin con el de organismos ms desarrollados y
tienden tanto a vivir formando colonias como a generar una abundante descendencia. En lo
que respecta a la gentica, hay que destacar que un ciclo de vida simple asociado a una gran
descendencia favorece el anlisis gnico del ADN de estos organismos, o lo que es lo mismo,
gracias a esto podemos llevar a cabo un estudio detallado sobre mutaciones, expresin
gnica, variabilidad genotpica y fenotpica...
Los microorganismos comprenden formas de vida procariotas (bacterias principalmente),
formas eucariotas (como algas, hongos y protozoos) y hasta otro tipo de organismos, los virus.
En comn todos estos microorganismos tienen en comn las caractersticas detalladas en el
prrafo anterior, pero adems cada una de ella presenta ciertas caractersticas nicas.

Variabilidad gentica
Uno de los motivos esenciales de discrepancia entre la Teora de Darwin y la Teora
General de la Evolucin Condicionada de la Vida es la fuente u origen de variabilidad
gentica, modificaciones del cdigo gentico o deriva gentica.
Para la primera, el origen de la variabilidad gentica es de carcter aleatorio mientras la
segunda considera imposible, desde el punto de vista lgico, que as sea. Por lo
tanto, para la TGECV, dichas modificaciones han de tener un carcter dirigido y, en
consecuencia, una finalidad.
Por otra parte, sealar que la gentica actual est interactuando en el cdigo gentico
del ADN sin saber las consecuencias que una modificacin del mismo puede tener..
La regulacin gentica actual es algo parecido a la modificacin de un programa de
ordenador sin conocer su estructura, ni sus funciones, ni el lenguaje de
programacin en su globalidad. No es mi intencin exagerar en absoluto los riesgos
que la ingeniera gentica pueda conllevar, indudablemente existen, pero pienso que
son realmente pequeos.
Cuando se modifica un programa, puede dejar de funcionar, pero es difcil crear un
virus informtico por accidente. Con la variabilidad gentica aleatoria o por accidente
debera ocurrir lo mismo, el nuevo ser sera inviable pero nada ms. Un tema
distinto sera el diseo intencionado de problemas genticos tipo guerra
bacteriolgica.
Asimismo, es de suponer que, cuanto ms se conozca sobre el funcionamiento del
ADN, ms fcil ser llegar al convencimiento de la imposibilidad de que sistemas
tan complejos y perfectos hayan surgido como consecuencia de una variabilidad
gentica aleatoria. Tambin tengo la impresin que las variaciones en la informacin
gentica se siguen considerando aleatorias porque no se conocen las causas de las
mismas ni su distribucin estadstica concreta y no porque est demostrado su
carcter aleatorio.
Clasificacin de la variabilidad gentica
La variabilidad gentica se puede clasificar desde varios puntos de vista; no
intentar, ni mucho menos, ser exhaustivo en su clasificacin; lo que se pretende es
dar una idea de las muchas posibilidades existentes a la hora de su clasificacin y
mostrar las ms relevantes que me han surgido en el anlisis de la evolucin.
Variaciones genticas derivadas de los objetivos del sistema evolutivo.
Mejora de la eficacia.
Mejora de las caractersticas de los materiales: protenas nuevas.
Racionalizacin y simplificacin de la estructura del cdigo
gentico.
Mejora la eficacia funcional de cualquier elemento de la
informacin gentica.
Garanta y seguridad.
Provocar variaciones genticas para cubrir diferentes
circunstancias medio ambientales.
Asociar a parte de la informacin gentica la condicin de
estructural para saber las consecuencias que podran traer una
futura modificacin o variacin de la misma.
Mantenimiento de informacin gentica no operativa para
posibles usos posteriores.
Coherencia y compatibilidad.
Asociar la condicin de verificacin con la informacin de la
otra fuente en los casos de diferenciacin sexual.
Desarrollo paralelo o equilibrado de funciones de genes con
caracteres complementarios.

Optimizacin.
Efectuar modificaciones de la informacin gentica arriesgadas
confiando en el mecanismo posterior de la seleccin natural
para el supuesto de no-xito.
Variaciones genticas destinadas a ampliar las posibilidades de
uso de los mismos mecanismos o funciones del nuevo ser.
Por los mtodos de evolucin gentica de que forman parte o en los
que se apoyan.
Prueba y error.
Seleccin natural.
Comprobacin exhaustiva.
Comprobacin parcial.
Diferenciacin sexual primaria endogmica y otras variantes.
Diferenciacin sexual.
Verificacin externa de la informacin gentica.
Copia de seguridad o archivo histrico.
Por la causa u origen de la variabilidad gentica.
Accidental o mutaciones aleatorias / dirigida.
Interna / externa (al individuo) La primera sera el conjunto de
mejoras en el cdigo gentico que se producen como consecuencia del
aprendizaje, trabajo y experiencia durante la vida del individuo y
anterior a la transmisin de la informacin gentica.
Endgena (lgica del sistema gentico) / exgena (factores medio
ambientales)
Por la naturaleza de su expresin.
Cdigo operativo / no operativo. (ADN "basura" Trmino no muy
apropiado.)
Discretas / continuas.
Restrictiva (Condicin de verificacin externa...) / aditiva / especiales.
Variaciones de genes con caracteres complementarios /
independientes / dependientes.
Inmediatas / lejanas (confirmacin en varias generaciones)
Momentos iniciales (del nuevo ser) / posteriores.
Visibles (escala macro) / no visibles (escala micro)
7.2.1
Mutaciones
Las mutaciones son cambios heredables puntuales de la molcula de ADN. Algunas
son sustituciones y, otras, deleciones o adiciones de bases por errores en el proceso de
replicacin semiconservativa del ADN. Aunque estos errores ocurren con muy baja
probabilidad en cualquier proceso de replicacin de ADN, para las bacterias son una
fuente importante de variabilidad, debido a que son poblaciones muy numerosas con
tiempos de generacin muy cortos. Adems, la mutacin de ciertos genes relacionados
con la propia replicacin (genes mutadores), conduce a un aumento drstico de la tasa
de mutacin de cualquier otro gen
7.2.2
Recombinacin homloga
A travs de la recombinacin las bacterias pueden adquirir varias caractersticas a un
tiempo y evolucionar as mas rpido que mediante mutaciones.

Para hacer posible la recombinacin homloga previamente han de transferirse los
fragmentos de una bacteria donadora al citoplasma de la receptora que se convierte
en parcialmente diploide.


Bacterias parcialmente diploides (falsos zigotos) pueden obtenerse por
transformacin, transduccin o conjugacin.

En todo caso estas recombinaciones son la excepcin y no la regla porque cada especie
pose sus sistemas de seguridad para protegerse de la entrada de de fagos y plsmidos
y mantener as su identidad. Se trata de enzimas que introducen modificaciones
qumicas para marcar y proteger el ADN propio y destruyen toda molcula ajena que
no est marcada por ellas. Estos sistemas restringen el rango de transferencias o
intercambios de informacin entre especies y se denominan enzimas de restriccin.
En este curso aprendemos a emplear estos enzimas para identificar fragmentos de ADN
bacteriano relacionados con la virulencia o con la resistencia a los antibiticos.

7.2.3
Una secuencia de insercin es una secuencia corta de ADN que acta como un elemento de
transposicin sencilla. Las secuencias de insercin tienen dos caractersticas principales: son
pequeas en relacin con otros elementos de transposicin y slo cdigo para las protenas
implicadas en la actividad de transposicin. Estas protenas son por lo general la transposasa
que cataliza la reaccin enzimtica que permite la es avanzar, y tambin una protena
reguladora que estimula o inhibe la actividad de transposicin. La regin de codificacin en
una secuencia de insercin est generalmente flanqueado por repeticiones invertidas. Por
ejemplo, el IS 911 bien conocido est flanqueado por dos 36bp extremidades repetidas
invertidas y la regin de codificacin tiene dos genes se solapan parcialmente orfA y OrfAB, la
codificacin de la transposasa y una protena reguladora. Una secuencia de insercin en
particular puede ser el nombre de acuerdo a la forma ISN, donde n es un nmero, lo que no es
el nico esquema de nomenclatura utilizada, sin embargo. Aunque las secuencias de insercin
suelen ser discutidos en el contexto de los genomas procariotas, eucariotas ciertas secuencias
de ADN que pertenecen a la familia de elementos transponibles Tc1/mariner pueden ser
considerados, secuencias de insercin.
Transposicin
La transposicin es un mecanismo especial de recombinacin, totalmente diferente de los vistos
hasta ahora. Un segmento del DNA puede saltar de una zona a otra del genoma, dicho segmento
se llama transposn o elemento gentico transponible. Los elementos genticos transponibles
no se encuentran nunca aislados, siempre estn integrados. Generalmente, los elementos
genticos transponibles no presentan ninguna homologa de secuencia con los DNAs donde se
integran. Como consecuencia se producen mutaciones en los sitios donde se insertan los
transposones. Debido a esto la transposicin ha de estar altamente regulada y por tanto ocurre con
una frecuencia muy baja: 10
-3
- 10
-4
. Este fenmeno se conoce desde hace tiempo, lo observ
Brbara McClintok mientras estudiaba genticamente la variegacin del maz. Postul que eran
necesarios unos "genes que saltaban". Ms tarde, en los aos 50, en hospitales japoneses se
observ la aparicin sbita de cepas bacterianas que presentaban mltiples resistencias a
antibiticos, la base de lo que se conoce como enfermedades hospitalarias. Aunque
fisiolgicamente distintos, ambos fenmenos estn molecularmente relacionados.
Los genes que llevaban la resistencia a esos antibiticos se propagaban de unas cepas a otras
rpidamente. El empleo masivo de antibiticos lleva consigo que se seleccionen las cepas ms
resistentes, lo que aumenta la probabilidad de que los genes de resistencia se propaguen va
transposicin. La transposicin puede llevarse a cabo de dos maneras:
Va RNA, un fragmento de RNA previamente copiado a DNA por la transcriptasa reversa, pasa a
otro DNA. Los retrovirus se transponen por un intermediario de RNA.

Va DNA, un fragmento de DNA pasa a otro DNA (es el tipo de transposicin que vamos a tratar).
En la transposicin estn implicados tres sitios: los extremos del transposn y el sitio de
integracin. Existen diferentes mecanismos de transposicin con distintas consecuencias:
(a)
(b)
(c)
7.3 Transformacin
En la transformacin la bacteria receptora acepta molculas desnudas de ADN que
penetran por su pared desde el medio externo. De forma natural podra ocurrir cuando
las bacterias receptoras comparten su ecosistema con una poblacin de bacterias
donadoras que muere y cuyos cromosomas se fragmentan. El ADN desnudo es destruido
rapidamente por DNAsas que son enzimas muy frecuentes en muchos medios,
por lo que la probabilidad de que ocurran transformaciones naturales es pequea.
Adems la pared de la clula receptora debe estar relativamente permeable para dejar
pasar fragmentos de ADN. Suelen ser competentes, es decir, capaces de sufrir
transformacin las especies de Streptococuus, Staphylococcus, Haemophilus, Neisseria
y Bacillus. Sin embargo en el laboratorio puede forzarse la competencia mediante
cambios en la concentracin de calcio del medio. Esta tcnica se emplea para introducir
en la bacteria molculas mixtas de ADN recombinante de las que interesa obtener
copias (clonacin).

7.3.1 RESTRICCIN DEL ADN IN VITRO
Sistemas de modificacin - restriccin (M - R).
Qu son?
Las endonucleasas de restriccin son enzimas nucleolticas que catalizan la hidrlisis de
enlaces fosfodiester internos en las dos hebras de una molcula de ADN bicatenario,
mayoritariamente por sitios especficos (dianas o sitios de restriccin), y que en la naturaleza
se encuentran formando parte de los sistemas de restriccin - modificacin bacterianos.
Estos sistemas desempean en la clula bacteriana una funcin de proteccin gentica,
dirigida a impedir el establecimiento en su interior de material gentico exgeno que pudiera
codificar productos capaces de alterar la vida celular. Algunos sistemas R-M estn codificados
en genes cromosmicos, otros en plsmidos e incluso en bacterifagos.
Cmo funcionan?
Bsicamente, el sistema incorpora dos actividades enzimticas: una metilasa y una
endonucleasa, ambas con una misma especificidad de secuencia. El sitio o diana de
reconocimiento es una corta secuencia de pares de bases, constituido por lo tanto por las dos
hebras. Ambas actividades van a reconocer la misma secuencia en su ADN sustrato, luego
actuar una u otra en funcin del estado de metilacin de la diana:
Si no est metilada, la endonucleasa, ms potente, cataliza la rotura de las dos hebras del ADN.
Si est metilada en ambas hebras, la nucleasa no acta; la metilacin protege al ADN haciendo que
los sitios especficos sean resistentes a su accin.
Si est metilada nicamente en una de las dos hebras (hemimetilada), es igualmente inmune a la
rotura por parte de la nucleasa; entonces la metilasa catalizar la metilacin de la hebra no metilada.
La metilacin es una forma de sealizar el material gentico de la bacteria y evitar su rotura
por el propio sistema de restriccin. Cuando el ADN cromosmico es replicado, las dianas de
restriccin de las molculas hijas estn metiladas slo en la hebra parental (dianas
hemimetiladas); en ese estado se encuentran protegidas contra la nucleasa. Cuando estos
sitios son reconocidos por el sistema R-M, la nucleasa no acta, pero s la metilasa que
modifica la hebra an no metilada para producir una diana ya metilada en ambas hebras. En
los casos de invasin por ADN exgeno, por ejemplo tras la infeccin por un bacterifago, el
sistema R-M lo investigar y reconocer en l una o varias dianas especficas del sistema, que
normalmente no estarn metiladas en ninguna de las dos hebras, entonces la accin de la
nucleasa se impone a la metilasa y el ADN del fago resultar degradado.
La presencia de un sistema R-M es muy normal entre bacterias; incluso no es raro que una
estirpe posea ms de uno. Sin embargo, algunos bacterifagos han desarrollado mecanismos
para evitar las defensas bacterianas, tales como metilasas con la misma especificidad que el
hospedador, inhibidores de la endonucleasa celular o eliminacin de su genoma de los sitios
reconocidos por el sistema R-M bacteriano. Adems, en raras ocasiones, el ADN invasor
puede escapar a la accin de la restriccin celular por fallo del sistema. En estos casos, el
ADN extrao resulta metilado en las dianas especficas de la clula y, a partir de ese
momento, tanto l como las copias que resulten de su replicacin se encontrarn modificados
segn el patrn de metilacin propio de la clula y sern capaces de sobrevivir en ella. El
sistema R-M es especfico de estirpe y por ello no impide la transferencia de ADN entre
clulas de la misma estirpe, por ejemplo mediante conjugacin; en este caso, el ADN
transferido vendr metilado segn el mismo patrn que existe en la clula receptora.
Tipos:
Hoy en da se conoce un gran nmero de sistemas R-M, que, segn una clasificacin
probablemente provisional, se suele agrupar en tres tipos:
Los sistemas R-M tipo I; son estructuralmente complejos e incorporan tres tipos de subunidades:
La subunidad R, responsable de la restriccin.
La subunidad M, que cataliza la metilacin.
La subunidad S, que marca la especificidad de sustrato y es la encargada de reconocer la secuencia
especfica de la diana.
El agregado multinumrico cataliza tanto la metilacin como la restriccin. Requiere iones Mg2+, ATP,
y S-adenosilmetionina como cofactores. El sitio de reconocimiento de estos sistemas consiste en una
secuencia especfica de 3 pb, separada una cierta distancia de otra secuencia especfica de 4 pb; la
secuencia de la regin central es intranscendente, pero su longitud es importante porque hace que las
regiones especficas aparezcan en el mismo costado de la doble hlice del ADN, lo que nos dice que es
una diana bipartida y asimetrica. El sitio de la rotura catalizada por su actividad de restriccin se localiza
a ms de 1000 pb del sitio de reconocimiento y no implica ninguna secuencia especfica, esta distancia
implica que disminuya mucho el inters por su utilizacin.
Los sistemas R-M tipo II; son los ms comunes en el mundo bacteriano. Su estructura proteica es
sencilla. Quiz lo ms interesante de este tipo de sistema es que las actividades de metilacin y
restriccin se localizan en entidades enzimticas separadas. Las dos actividades enzimticas
constituyentes de la enorme mayora de los sistemas tipo II actan en la misma diana de reconocimiento,
bien metilando ciertas bases, bien cortando ciertos enlaces. En este caso, la rotura se da por sitios
especficos y definidos, lo que permite su utilizacin en trabajos con fines analticos y en el diseo de
una gran variedad de experimentos. En este caso como vemos la nucleasa y la metilasa estn separadas,
por lo tanto las reacciones estn tambin separadas. Su diana es simtrica (palindrmica), y el sitio de
corte es en la misma diana.
Los sistemas R-M tipo III; son bastante raros. Presentan dos tipos de subunidades, la R, responsable de
la restriccin, y la MS, responsable tanto de la metilacin como del reconocimiento del sitio especfico
de accin. Ambas actividades requieren Mg2+, ATP y S-adenosilmetionina. La metilacin se da en
residuos de adenina en el propio sitio de reconocimiento, pero la restriccin se produce fuera de este, a
unos 24 o 26 pb. Esto reduce mucho su aplicacin para el anlisis y manipulacin de ADN.
Desde la creacin de la gentica y hasta antes de 1953, los genes fueron considerados entidades
abstractas de informacin, que determinaban caractersticas de morfologa y funcin en un
organismo. Eran unidades independientes que se trasmitan generacin tras generacin, siguiendo
principios mendelianos y otros patrones de herencia. Esta perspectiva limitaba la gentica al
estudio de caracteres hereditarios, como color de semillas, longitud de tallos, color de ojos,
pigmentacin de la piel, hemofilia, anemia falciforme y otros.

En 1953, la publicacin de la estructura del ADN por Watson y Crick fue el evento trascendental
que transform a la gentica desde su fundamento. El conocimiento de la estructura del ADN
marc el rumbo de la investigacin hacia la codificacin y la expresin de informacin gentica,
que subyacen a los mecanismos de la herencia. El descubrimiento de que los genes son ADN
signific la sorprendente posibilidad de manipular el material gentico, exactamente igual que como
se hace con cualquier otra molcula, y fue el inicio de la tecnologa del ADN recombinante.

ADN recombinante es una molcula de ADN, cuya estructura resulta de haber modificado ADN de
dos o ms fuentes.

Los avances en la tecnologa del ADN recombinante han conseguido aislar genes especficos,
cortar ADN en regiones predeterminadas, unir diversos fragmentos de ADN sin importar secuencia
ni origen, hacer mutaciones en sitios especficos, insertar en el genoma de un organismo
fragmentos de ADN de otra especie, clonar organismos transgnicos, secuenciar genomas
completos y muchos otros tipos de manipulaciones ms.

Con la gentica como plataforma, el desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante dio origen a
dos campos cientficos: la ingeniera gentica y la genmica.

Ingeniera gentica

La ingeniera gentica es la coleccin de metodologas aplicadas a la manipulacin de genes.
El procedimiento consiste normalmente en:

1. Aislamiento de un gen
2. Manipulacin del gen para hacer alguna modificacin
3. Introduccin del gen modificado en algn organismo.

El objetivo es por lo general introducir en un organismo un rasgo novedoso. Por ejemplo, la
insercin del gen humano de la insulina en la bacteria Escherichia coli.

7.3.2 Transformacin
La transformacin consiste en la obtencin por parte de una clula receptora de un
fragmento de DNA y la incorporacin de esta molcula al cromosoma de esta clula en una
forma heredable. En la transformacin natural, el DNA procede de una bacteria donante. Es
un proceso al azar, y puede ocurrir entre bacterias de la misma o diferentes especies.
Cualquier porcin del genoma de la clula donante puede incorporarse, siempre y cuando
sea igual o similar a la de la clula husped. El DNA de la clula donante debe tener las
siguientes caractersticas: ser de doble hlice, similar al DNA de la clula receptora, de bajo
peso molecular y de tamao pequeo.


7.3.3Transducin
En la transduccin son los virus bacteriofagos los que llevan una fragmento de ADN de
la bacteria donadora hasta el citoplasma de la receptora. Los bacterifagos son virus que
se reproducen en el interior de las bacterias. Para infectarlas inyectan su ADN en el
citoplasma dejando fuera la cpside del fago. Despus paralizan la replicacin de la
bacteria, cuyo ADN comienza a degradarse, replican el ADN del virus y traducen la
informacin precisa para sintetizar nuevas cpsides que se ensamblan rodeando a las
copias de ADN fgico. Para liberar los nuevos bacterifagos lisan la bacteria infectada.
A veces, durante estos ciclos lticos se introduce por error en una cpside de
bacteriofago ADN de la bacteria infectada. Estas partculas pueden iniciar la infeccin
de otra bacteria y le inyectan de forma automtica el ADN que portan. Como en estos
casos no es inyectado el genoma completo del virus, la bacteria no muere y puede
recombinar el fragmento adquirido. Cualquier gen de la bacteria donadora tiene igual
probabilidad de ser transducido y porteriormente recombinado a travs del proceso
descrito que se denomina transduccin generalizada (figura 2.3.)..

Algunos bacterifagos son capaces de circularizar e integrar su ADN en el cromosoma
de la bacteria infectada iniciando as un ciclo lisognico, en el que no hay lisis ni se
producen nuevas partculas vricas, pero el genoma del virus se reproduce junto al de la
bacteria a la que puede proporcionan nuevos factores de virulencia. Por ejemplo la
capacidad de sintetizar las exotoxinas de Corynebacterium diphteriae y de
Streptococcus pyogenes depende de que las cepas estn infectadas por fagos
lisognicos. El proceso en todo caso es reversible y de tiempo en tiempo el virus se
libera del cromosoma e inicia un ciclo ltico. En este proceso tambin hay errores y a
veces el genoma del fago lisognico arrastra consigo alguno de los genes bacterianos
adyacentes a su punto de integracin que siempre es el mismo. Por eso los fagos as
generados transducen con alta probabilidad estos genes y no otros a travs de lo que se
denomina transduccin especializada.

7.4La conjugacin bacteriana es el proceso de transferencia de material gentico
entre una clula bacteriana donadora y una receptora mediante el contacto directo o
una conexin que las una.

Descubierta por Joshua Lederberg y Edward Tatum en
1946, la conjugacin es un mecanismo de transferencia horizontal de genes como la
transformacin y la transduccin, con la diferencia de que estos ltimos no involucran
contacto intercelular. La conjugacin bacteriana a menudo es considerada el
equivalente bacteriano a la reproduccin sexual o al apareamiento debido a que
implica el intercambio de material gnico. Durante la conjugacin la clula donadora
provee un elemento gnico mvil o conjuntivo que generalmente es un plsmido o
transposn.

La mayora de los plsmidos conjuntivos tienen sistemas que aseguran
que la clula receptora no tenga ya un elemento similar
Este proceso es promovido por determinados tipos de plsmidos, que portan un
conjunto de genes cuyos productos participan en el proceso, y que requiere contactos
directos entre ambas clulas, con intervencin de estructuras superficiales
especializadas y de funciones especficas (pili sexuales en los Gram negativos, y
contacto ntimo en los Gram positivos).
Algunos de estos plsmidos se comportan como episomas, es decir, que pueden
integrarse en el cromosoma; en este caso, si se produce la conjugacin, se puede
transferir el propio plsmido ms un segmento adyacente del cromosoma, que a su
vez podr recombinarse con secuencias homlogas del cromosoma del receptor,
dando lugar a un cromosoma hbrido.
La informacin gnetica transferida a menudo beneficia al receptor. Las ventajas
pueden incluir resistencia antibitica, tolerancia xenobitica o la capacidad de usar
nuevos metabolitos.
[
Algunos plsmidos benficos pueden ser considerados
endosimbiosis bacteriana. Otros elementos gnicos, sin embargo, pueden se vistos
como parasitismo bacterial, y la conjugacin bacteriana como un mecanismo
desarrollado para su propagacin.
Plasmido
Molculas de DNA de doble cadena circular covalentemente cerradas
Llevan una pequea parte de la informacin gentica que no es esencial para la vida e la bacteria
Tienen sus propios orgenes de replicacin, se replican en forma autnoma
Le confieren a las bacterias propiedades especiales que pueden representar una ventaja con
respecto a las bacterias que no lo poseen. Ej. Resistencia a antibiticos.
No son capaces de integrarse al cromosoma
Plsmidos conjugativos: Se transfieren de una bacteria a otra en forma autnoma.
Plsmidos movilizables: Son movilizados por otro plsmido conjugativo con el cual se cointegran.
Plsmidos relajados: Existen en mltiples copias por clula.
Plsmidos restringidos: Una nica copia o pocas copias por clula
Plsmidos incompatibles: Dos plsmidos son incompatibles cuando no pueden coexistir
establemente en una misma clula