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Versin No.01 enero 2014








LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA DE ENFERMEDAD
DIARREICA AGUDA BACTERIANA POR LABORATORIO
























DGE-InDRERNLSP
2014

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Versin No.01 enero 2014
PRIMERA EDICIN, 2014


EDA BACTERIANARNLSP


Este documento fue avalado por los representantes de las instituciones que conforman el Grupo
Tcnico Interinstitucional del Comit Nacional de Vigilancia Epidemiolgica (CoNaVE).


TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY,
INDRE-DGE-SECRETARA DE SALUD



SE PERMITE LA REPRODUCCIN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE:
LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA DE ENFERMEDAD DIARREICA
AGUDA BACTERIANA POR LABORATORIO VERSIN NO. 01. INDRE, 2014.



COLECCIN PUBLICACIONES TCNICAS DEL INDRE:
ISBN: EN PROCESO



INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS.
Francisco P Miranda 177 bis, Col. Lomas de Plateros Del. lvaro Obregn, C. P. 01480,
Mxico, D. F.
www.indre.salud.gob.mx
Tel. (55)53-42-75-50



LA EDICIN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ
EL DISEO ESTUVO A CARGO DE:



IMPRESO EN MXICO. PRINTED IN MEXICO

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SECRETARA DE SALUD

DRA. MERCEDES JUAN LPEZ
SECRETARIA DE SALUD

DR. PABLO KURI MORALES
SUBSECRETARIO DE PREVENCIN Y PROMOCIN DE LA SALUD

DR. CUITLHUAC RUZ MATUS
DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGA

DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO DEL INDRE

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INSTITUTO DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLGICOS

DR. JOS ALBERTO DAZ QUIONEZ
DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

DRA. MA. DEL CARMEN GUZMN BRACHO
DIRECTORA DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCA HERNNDEZ RIVAS
DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TCNICO

LIC. DIANA ALEX FLORES ROMERO
SUBDIRECTORA DE OPERACIN

M EN C IRMA LPEZ MARTNEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGA

QFB. ROBERTO VZQUEZ CAMPUZANO
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIAS

M EN C MAYRA GISELA MELNDEZ HERNNDEZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGA

M EN C JUDITH ESTVEZ RAMREZ
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. ERNESTO RAMREZ GONZLEZ
JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MOLECULAR Y
VALIDACIN DE TCNICAS

BIOL. NORMA ANGLICA MONTES COLIMA
JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGA

QBP. IRMA HERNNDEZ MONROY
ASESORA TCNICA DE LA DIRECCIN

Q.F.B. MARA ASUNCIN MORENO PREZ
JEFA DEL LABORATORIO DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS
COORDINADORA DE LA RED DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS

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AUTORES

Q.F.B. MARA ASUNCIN MORENO PREZ
JEFA DEL LABORATORIO DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS
COORDINADORA DE LA RED DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS

Q.B.P. ALTAGRACIA VILLANUEVA ZAMUDIO
ADSCRITA AL LABORATORIO DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS

Q.B.P. GUADALUPE ADRIANA GALICIA NICOLS
ADSCRITA AL LABORATORIO DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS

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LINEAMIENTOS PARA LA
VIGILANCIA DE ENFERMEDAD
DIARREICA AGUDA
BACTERIANA POR
LABORATORIO




















DGE-InDRERNLSP
2014

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NDICE
INTRODUCCIN ..................................................................................................................... 8
ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
PBLICA (RNLSP) PARA EL DIAGNSTICO DE LA ENFERMEDAD
DIARREICA AGUDA BACTERIANA .................................................................................. 8
RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA
ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA ................................................. 10
MARCO LEGAL DEL LABORATORIO............................................................................ 11
OBJETIVOS .............................................................................................................................. 11
ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE
ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) BACTERIANA .................................... 12
FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE EDA BACTERIANA ....... 13
DEFINICINES OPERATIVAS (Salud, 2012) .................................................................... 15
TOMA, MANEJO Y ENVO DE MUESTRA ..................................................................... 17
ALGORITMO DIAGNSTICO ........................................................................................... 18
ESTNDARES DE CALIDAD ............................................................................................. 19
CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS ......................................................................... 20
PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED) ............... 20
CRITERIOS PARA LA LIBERACIN DEL DIAGNSTICO ....................................... 21
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ................................................................................ 22
BIBLIOGRAFA ...................................................................................................................... 23
ANEXO 1. TCNICAS DIAGNSTICAS .......................................................................... 25
ANEXO 2. INTERPRETACIN Y RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUMICAS ........... 46
ANEXO 3. RESULTADO DE PRUEBAS DE AGLUTINACIN ................................... 53
Grupo somtico ................................................................................................................... 53
Antisuero flagelar ............................................................................................................... 53


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INTRODUCCIN
Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud pblica. Son una de las principales
causas de mortalidad y morbilidad de la niez en el mundo y generalmente son consecuencia de
la exposicin a alimentos y agua contaminados. En pases industrializados, los nios menores de
tres aos presentan en promedio tres episodios de diarrea al ao. Esta alta incidencia hace
necesario que la poblacin, est sujeta a vigilancia epidemiolgica para identificar de forma
oportuna eventos que signifiquen un riesgo de salud para la poblacin y con base en los hallazgos,
tomar decisiones para las acciones de planeacin, control y prevencin de las enfermedades sujetas
a vigilancia. En Mxico, las acciones de vigilancia se apoyan en el Sistema Nacional de Vigilancia
Epidemiolgica (SINAVE), el cual cuenta con el subsistema de laboratorio para llevar a cabo las
actividades de vigilancia de manera oportuna y uniforme para el diagnstico de clera,
salmonelosis, shigelosis y otras enfermedades bacterianas transmitidas por alimentos.
El presente documento establece los lineamientos de operacin para la vigilancia basada en los
hallazgos de laboratorio de la enfermedad diarreica aguda bacteriana incluyendo las funciones por
niveles; la toma, manejo y envo de muestras; la metodologa para el anlisis de muestras (mtodos
tradicionales y mtodos moleculares); la evaluacin del desempeo as como los estndares de
calidad.
ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
PBLICA (RNLSP) PARA EL DIAGNSTICO DE LA ENFERMEDAD DIARREICA
AGUDA BACTERIANA
El Laboratorio de Clera y Enterobacterias, de forma conjunta con la Direccin General Adjunta
de Epidemiologa (DGAE) y el Programa de Clera y Urgencias, son responsables de la
vigilancia epidemiolgica del clera en Mxico. A nivel internacional, la Organizacin Mundial
de la Salud (OMS) ha desarrollado una estrategia creando una red de vigilancia de las
Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA). El objetivo primario de esta red es apoyar la
vigilancia de los patgenos transmitidos por alimentos, con base en el orden de prioridades y de
acuerdo al impacto y severidad de enfermedad que ocasiona cada uno de los patgenos asociados.
Este proyecto es coordinado por la (Organizacin Panamericana de Salud y la Organizacin
Mundial de la Salud) OPS-OMS, la Administracin Nacional de Laboratorios e Institutos de
Salud (ANLIS) Dr. Carlos G. Malbran de Argentina a travs del Instituto Nacional de
Enfermedades Infecciosas y los Centros de Control de Enfermedad y Prevencin [Centers for
Disease Control and Prevention (CDC), por sus siglas en ingles].
En 1939 fue creado en Mxico el Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales (ISET) y
al interior de ste el Centro de Salmonelas. Aos ms tarde, en 1971, se incorporan nuevos
diagnsticos para dar origen al Laboratorio de Bacteriologa Entrica como una necesidad para
tener un sitio destinado al estudio de patgenos entricos con fines de apoyo a la vigilancia
epidemiolgica. Este nuevo laboratorio inici su trabajo analtico con el aislamiento e
identificacin de Shigella dysenteriae tipo 1 y en 1972 tuvo una participacin muy importante en
el estudio de los brotes de tifoidea.
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Debido a la inminente llegada al Continente Americano de la sptima pandemia de clera que
inici en 1961 en Indonesia, en 1990 se fund en el Instituto Nacional de Diagnstico y
Referencia Epidemiolgicos (InDRE) el Laboratorio de Clera para identificar al agente
etiolgico en los casos compatibles con este padecimiento.
A partir de junio de 1991, cuando se report el primer caso de clera en Mxico, se cre
paulatinamente la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica en apoyo a la vigilancia
epidemiolgica y desde entonces, el InDRE coordina a los laboratorios que realizan la bsqueda
de patgenos entricos como Vibrio cholerae, Salmonella spp y Shigella spp. En 1992 se cre el
Laboratorio de Bacteriologa Entrica II y se dio inicio a la realizacin de estudios moleculares
para Escherichia coli y posteriormente para Vibrio cholerae.
En la actualidad, el InDRE es el Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) para Vibrio
cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp. Realiza pruebas serolgicas,
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos y pruebas moleculares para la bsqueda de genes de
toxigenicidad, determinacin de patotipos o el anlisis de clonas. Proporciona los reactivos para
la caracterizacin de Vibrio cholerae y la identificacin de grupo de Salmonella spp y Shigella
spp, imparte cursos de capacitacin y capacitaciones en servicio al personal del sector salud y lleva
a cabo el aseguramiento de la calidad de la red a travs de programas de evaluacin del desempeo.

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RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE LA
ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA BACTERIANA
























Estados de la Repblica Mexicana que realizan el aislamiento y la identificacin de agentes
causantes de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana (Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio
cholerae y Vibrio parahaemolyticus).

Figura. 1. Conformacin de la red para el diagnstico de EDA Bacteriana.





























PRUEBA 2009 2010 2011 2012 META
Aislamiento e
identificacin.
31
LESP
31
LESP
31
LESP
31
LESP
31 y D.F.
Pruebas
moleculares (PCR)
0 0 0 0 31 y D.F.
Autosuficiencia
en el
diagnstico
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MARCO LEGAL DEL LABORATORIO
1. Constitucin Poltica de los Estados Unidos Mexicanos. Artculo 4. DOF 05/02/1917,
ltima Reforma D.O.F. 15/02/2012.
2. Ley General de Salud. Artculo 3, XV; 59; 64, III; 133; 134, I; 136, 138, 139 y 141. DOF
7/02/1984, ltima Reforma DOF 07/06/2012.
3. NORMA Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiolgica.
DOF: 19/02/2013
4. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Proteccin ambiental-salud
ambiental-residuos peligrosos biolgico-infecciosos-clasificacin y especificaciones de
manejo.
5. NORMA Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005, Que establece las
caractersticas, el procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los
residuos peligrosos. DOF: 23/06/2006.
6. PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-016-SSA2-2009. Para la
vigilancia, prevencin, control, manejo y tratamiento de clera. DOF 21/02/2012.
7. Reglamento Interior de la Secretara de Salud, publicado en el Diario Oficial de la
Federacin el 19 de enero de 2004.
8. Secretara de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial de la
Federacin DOF: 12/12/2013.
9. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federacin, DOF:
20/05/2013, www.dof.gob.mx
10. Secretara de Salud. Programa de Accin Especfico 2007-2012. Sistema Nacional de
Vigilancia Epidemiolgica, primera edicin 2008.


OBJETIVOS
Objetivo general
Instaurar los procedimientos para la aplicacin del algoritmo de diagnstico de clera y
enterobacterias y establecer el manejo adecuado de la informacin generada por laboratorio, a
travs de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica (RNLSP), en apoyo a la Vigilancia
Epidemiolgica de la enfermedad diarreica aguda bacteriana.

Objetivos especficos
Detectar la circulacin de los principales agentes bacterianos causantes de enfermedad
diarreica aguda.
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Realizar la caracterizacin de los aislamientos de Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio cholerae
y Vibrio parahaemolyticus.
Mantener la vigilancia de la circulacin de Vibrio cholerae O1 y Vibrio cholerae O139.
En situaciones de brote, realizar estudios de electroforesis de campos pulsados (PFGE) del
agente bacteriano relacionado.
Proporcionar datos relevantes sobre estos patgenos en la Enfermedad Diarreica Aguda, que
sean tiles para estudios epidemiolgicos de vigilancia bacteriolgica.

ORGANIZACIN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE
ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA (EDA) BACTERIANA
La Red Nacional de Laboratorios de Diagnstico de Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana la
encabeza el Laboratorio de Clera y Enterobacterias, adscrito al Departamento de Bacteriologa
del InDRE, integrada por los Laboratorios Estatales de Salud Pblica (LESP) a travs de los
componentes de clera y enterobacterias y los laboratorios locales, aunado a los laboratorios
pblicos y privados que realicen el diagnstico de EDA bacteriana.

LABORATORIO DE CLERA Y ENTEROBACTERIAS InDRE
[(Laboratorio Nacional de Referencia (LNR)]

Muestras Resultados

Laboratorios de diagnstico de EDA Bacteriana (LESP)
(Redes Estatales de Diagnstico)

Laboratorios locales de diagnstico de EDA bacteriana
(Redes locales de diagnstico)


Redes de apoyo jurisdiccionales


Laboratorios locales de diagnstico pblicos y
privados que realicen el diagnstico de EDA bacteriana

Figura. 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios para el diagnstico de
Enfermedad Diarreica Aguda Bacteriana

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FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE EDA BACTERIANA
FUNCIONES DEL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA

El laboratorio de clera y enterobacterias del InDRE, es el Laboratorio Nacional de Referencia
y la pieza normativa para el diagnstico. Se considera que entre sus funciones que competen al
rea de la Red de Laboratorios, se encuentran:
Realizar el anlisis de muestras y confirmacin inmediata de las cepas que por su naturaleza
se consideren urgentes.
Mantener algoritmos de referencia y criterios de interpretacin de resultados pre-establecidos.
Realizar el control de calidad de la red mediante el programa de evaluacin del desempeo a
los LESP a travs de:
o Monitorear el desempeo de la Red de Laboratorios de Diagnstico de EDA Bacteriana.
o Aplicar el programa de evaluacin externa del desempeo (PEED).
Proveer capacitacin en servicio para la formacin de recursos humanos con base a las
necesidades detectadas.
Supervisar a los laboratorios estatales.
Proporcionar apoyo tcnico a los laboratorios que lo requieran y lo soliciten.
Realizar investigacin operativa en apoyo a la vigilancia epidemiolgica.
Generar informacin de orden nacional en materia de diagnstico, control de calidad,
formacin de recursos humanos e investigacin en la vigilancia epidemiolgica que coadyuve
a la toma de decisiones en el control y prevencin de la enfermedad en el marco del programa
nacional de salud.
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS ESTATALES DE SALUD PBLICA
Para el diagnstico
Realizar los estudios analticos bsicos para el diagnstico de enfermedad diarreica aguda
bacteriana de importancia en salud pblica: aislamiento e identificacin de Vibrio cholerae,
Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp.
Realizar la bsqueda de Escherichia coli slo en situacin de brote o cuando se trate de
menores de cinco aos que presenten evacuaciones con sangre y moco.
Enviar de 3 a 5 aislamientos en cualquier caso, de cada paciente al InDRE.
Asegurar la calidad del diagnstico en el laboratorio de clera y enterobacterias.
o Enviar al InDRE el 100% de los aislamientos de Vibrio cholerae O1, Vibrio
parahaemolyticus, Salmonella spp y Shigella spp.
o Enviar al InDRE del 100% de los aislamientos de Vibrio cholerae no O1 aislados de seres
humanos.
o Enviar al InDRE del 30% de los aislamientos de Vibrio cholerae no O1 aislados de
muestras ambientales y de alimentos.
Emitir en tiempo y forma los resultados de los exmenes de laboratorio.
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Generar evidencia y notificar al rgano normativo estatal correspondiente los casos
confirmados.
Participar como mecanismo de apoyo tcnico, proporcionando la informacin relacionada y
requerida por el Programa de Clera y Urgencias de su entidad federativa.
Determinar la resistencia a los antimicrobianos ajustndose a los lineamientos vigentes del
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
Para el monitoreo del desempeo
Coordinar a los laboratorios locales que realicen el anlisis de muestras para la vigilancia
epidemiolgica de EDA bacteriana.
Asegurar que se lleven a cabo los procedimientos, mtodos y tcnicas estandarizadas.
Seleccionar las muestras para referencia del rea de influencia del LESP.
Compilar las muestras de los laboratorios locales o jurisdiccionales y realizar el control de
calidad indirecto de los mismos.
Reportar inmediatamente las incongruencias encontradas.
Realizar el anlisis de la informacin generada.
Recabar y analizar la informacin sobre la prestacin de servicios de diagnstico de los
laboratorios locales para el aseguramiento de la calidad de la red.

Para el Programa de Evaluacin Externa del Desempeo
Participar en la evaluacin del desempeo del InDRE, a travs de los programas oficiales
correspondientes.
Realizar la evaluacin del desempeo en los componentes de clera y enterobacterias a los
laboratorios locales.
Generar la evidencia de la evaluacin para la red y enviar copia de resultados al laboratorio
evaluado y al InDRE.
Organizar la informacin de estas actividades y proporcionarla cuando sea requerida por las
instancias evaluadoras.

Para capacitacin
Capacitar en el rea de EDA Bacteriana al personal de los laboratorios locales y dems
instituciones del Sector Salud que lo requieran en su entidad de acuerdo con las necesidades
detectadas para la participacin en estrategias especiales de vigilancia como son los Ncleos
Trazadores de Vigilancia Epidemiolgica.

Apoyo tcnico
Participar en las urgencias epidemiolgicas en el rea de su competencia.
Podrn colaborar y/o elaborar trabajos de investigacin operativa que proporcione
informacin prioritaria estatal, una vez que los protocolos sean aceptados por los comits de
investigacin.
Apoyar con la preparacin y/o evaluacin de los reactivos que utilizan los integrantes de la
red.
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Apoyar en la seleccin para la adquisicin y en el suministro de materiales y reactivos
requeridos por los laboratorios de la red estatal de acuerdo a la evaluacin proporcionada por
el InDRE.
Participar en la elaboracin y actualizacin de los manuales tcnicos referentes a diagnstico
y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biolgico-infecciosos,
etc.) para uso en el mbito estatal y local.
FUNCIONES DE LOS LABORATORIOS A NIVEL LOCAL
Recepcin e identificacin de las muestras recibidas.
Realizar los estudios analticos para el diagnstico de enfermedad diarreica aguda bacteriana
de importancia en salud pblica de acuerdo con los lineamientos pre-establecidos:
Aislamiento e identificacin de Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp y
Shigella spp.
Realizar la bsqueda de Escherichia coli slo en situacin de brote o cuando se trate de
menores de cinco aos que presenten evacuaciones con sangre y moco. Enviar de 3 a 5
aislamientos de cada paciente al InDRE.
Participar como mecanismo de apoyo tcnico, proporcionando la informacin relacionada y
requerida por el programa de Clera y urgencias de su jurisdiccin sanitaria.
Reportar los casos encontrados diariamente a la instancia correspondiente.
Aplicar las recomendaciones del nivel estatal.
Cumplir con el programa de control de calidad indirecto que establece el nivel estatal.
Participar en la evaluacin del desempeo que organice el nivel estatal.
Recibir capacitacin y asesora del nivel estatal.
DEFINICINES OPERATIVAS (Salud, 2012)
Caso de EDA: Todo paciente de cualquier edad que demande atencin mdica por presentar
cinco o ms evacuaciones diarreicas en 24 horas durante no ms de cinco das con o sin signos de
deshidratacin.

Definicin de caso EDA sin deshidratacin: Paciente que presenta menos de cuatro evacuaciones
lquidas en 24 horas, con o sin presencia de vmito, sin prdida de peso y sin signos clnicos de
deshidratacin.

Caso de EDA moderada: Paciente de cualquier edad que demande atencin mdica por presentar
cuadro diarreico con cinco o ms evacuaciones en 24 horas, cuya evolucin sea menor a cinco das
y que presente datos de deshidratacin moderada: Inquietud o irritabilidad, ojos hundidos (llanto
sin lgrimas), mucosas secas, sed aumentada, polipnea o taquipnea, taquicardia, llenado capilar
mayor a tres segundos y menor de cinco, oliguria.

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Caso de EDA grave: Paciente de cualquier edad que demande atencin mdica por presentar
cuadro diarreico con cinco o ms evacuaciones en 24 horas, cuya evolucin sea menor a cinco das
y que tenga dos o ms de los siguientes signos o sntomas: Vmito de ms de cinco en 24 horas,
cuadro disentrico, temperatura mayor a 38 C, datos de deshidratacin moderada a grave; letargo
o inconsciencia, incapacidad para beber, pulso dbil o no perceptible, llenado capilar igual o
mayor de cinco segundos.

Caso sospechoso de clera, a todo enfermo de diarrea que presente las siguientes caractersticas:
Que en su lugar de residencia no se haya demostrado o se desconozca la circulacin de Vibrio
cholerae O1 y/o O139 toxignicos, a todo enfermo de diarrea que tenga cinco aos de edad
o ms, que presente cinco evacuaciones o ms en 24 horas y cuyo cuadro diarreico tenga una
evolucin menor a cinco das.
Que en su lugar de residencia donde se ha demostrado la circulacin de Vibrio cholerae O1
y/o O139 toxignicos en los ltimos 90 das o en las comunidades ubicadas dentro del rea
de los cercos epidemiolgicos, se considerar como sospechosa a toda persona con diarrea no
mayor a cinco das de evolucin, independientemente de su edad y en situacin de desastres.

Brote de clera, a la presencia de dos o ms casos confirmados relacionados epidemiolgicamente
entre s o la presencia de un caso en un rea donde no se ha demostrado la existencia previa del
padecimiento.
Caso confirmado de clera, a todo enfermo en el que se asle, mediante cultivo bacteriolgico, en
materia fecal o contenido gastrointestinal, Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxignicos, as como
los que por asociacin epidemiolgica se determinen.
Caso hospitalizado por clera, a toda persona a la que se brinde atencin mdica en un
establecimiento de salud, fijo o mvil y que permanezca en el mismo 24 horas y en quien se asle
o demuestre Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxignicos, mediante cultivo bacteriolgico.
Contacto, a toda persona que en el hogar, lugar de trabajo o sitio de reunin haya compartido,
preparado o manipulado alimentos, agua o hielo o que haya realizado cambio de paal de los
casos sospechosos o confirmados en los cinco das previos al inicio de la enfermedad.
Defuncin por clera, al fallecimiento de un caso confirmado que ocurra hasta dos semanas
posteriores al inicio de las manifestaciones clnicas y en cuyo certificado de defuncin aparezcan
como causa bsica o asociada los siguientes trminos: Gastroenteritis o diarrea ms
deshidratacin; gastroenteritis; diarrea ms desequilibrio hidroelectroltico.
Enfermedad del clera, la infeccin intestinal aguda causada por el Vibrio cholerae O1 y O139
toxignicos que se transmite al hombre por la ingesta de agua y alimentos contaminados por este
microorganismo.
Fuente de infeccin de clera, a todo alimento, agua, bebida, hielo, heces o vmito donde se asle
Vibrio cholerae O1 y/o Vibrio cholerae O139 toxignicos.
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Portador, a la persona que alberga al agente infeccioso en ausencia de enfermedad clnica aparente
y en quien se asle Vibrio cholerae O1 y/o O139 toxignicos en materia fecal o contenido
gastrointestinal.
TOMA, MANEJO Y ENVO DE MUESTRA
Las muestras de materia fecal se deben obtener en los primeros estadios de cualquier enfermedad
entrica, cuando los agentes patgenos estn en mayor nmero y antes de que se haya iniciado el
tratamiento antibitico. Una excepcin a esta regla es el caso de las heces obtenidas de pacientes
con enfermedad febril y se sospeche de fiebre tifoidea ya que el agente etiolgico, Salmonella ser.
typhi, puede estar presente en las heces en mayor cantidad, entre la segunda y la tercera semana
de la enfermedad por lo que s se sospecha de este padecimiento se debe tomar muestra para
hemocultivo durante la primera semana de evolucin.
El nmero de hisopos fecales o rectales que se tomen por paciente debe ser igual al nmero de
anlisis que se realizarn. Para la bsqueda de Vibrio spp y enterobacterias se deben tomar dos
hisopados fecales o rectales y deben ser enviados al laboratorio en medio de transporte de Cary-
Blair.
La toma de materia fecal se realiza con un hisopo estril con punta de algodn, pudiendo ser
hisopo fecal (obtenido a partir de una muestra directa de materia fecal), o bien mediante hisopo
rectal, el cual se obtiene introduciendo el hisopo en el esfnter anal ms de un centmetro y
girando el hisopo, el cual debe salir manchado con materia fecal.
Cuando se trata de un cuadro caracterstico de clera, la muestra se toma de las heces en forma
de agua de arroz. El hisopo se introduce en el tubo de Cary-Blair, tapando bien el tubo e
identificndolo al menos con el nombre del paciente y la fecha de la toma de la muestra.
El transporte de las muestras diagnsticas y de agentes patgenos (cepas) se debe hacer en sistema
de triple bsico de triple embalaje
[1]
para reducir al mnimo el riesgo para los seres humanos, para
el medio ambiente y para proteger la viabilidad de los microorganismos.
Las cepas deben ser enviadas en tubos hermticamente cerrados, preferentemente con medio de
cultivo Base de Agar Sangre (BAB) o algn otro medio apropiado que no contenga azcares.


1
El sistema bsico de triple embalaje consiste en la utilizacin de un recipiente primario, en el cual est contenida
la muestra biolgica (exudado farngeo, exudado nasofarngeo, lavado bronquio alveolar, biopsia, suero, etc.), el
recipiente primario (p. ej. criotubos, tubos o frascos con tapa de rosca) debe ser hermtico para evitar que la muestra
se derrame y tiene que estar perfectamente etiquetado con el nombre o nmero de muestra del paciente. El recipiente
primario deber rodearse de material absorbente como gasa o papel absorbente y colocarse en un recipiente
secundario hermtico a prueba de derrames y golpes. Si se colocan varios recipientes primarios dentro de un
recipiente secundario se deber usar una gradilla y material absorbente para evitar algn derrame. Es importante
mencionar que dentro del recipiente secundario (hielera) tiene que haber suficientes refrigerantes para mantener una
temperatura de 4 a 8 C. Los recipientes secundarios debern llevar las etiquetas de riesgo biolgico y seal de
orientacin del recipiente, a su vez el recipiente secundario deber ir contenido en un paquete externo de envo (caja
de cartn o hielera) que proteja el contenido de elementos externos del ambiente y debe estar etiquetado con los
datos del remitente, destinatario y seal de orientacin. La documentacin que se integre al triple embalaje deber
colocarse en la parte interior del paquete.

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ALGORITMO DIAGNSTICO






































Figura. 3. Algoritmo para el diagnstico de EDA Bacteriana
Clave de tabulador: 1B2547012, 1B2542002
*Medio de baja
selectividad
Enriquecimiento
para Salmonella
spp
Enriquecimiento
(APA)
Materia
fecal
Aislamiento en
TCBS
**Identificacin
Bioqumica
Aislamiento en 2
medios de alta
selectividad
Aglutinacin para grupo
Aglutinacin para
serotipo
Prueba de
susceptibilidad
antimicrobiana
Pruebas moleculares
PFGE
(Solo en caso de brote)
**Identificacin
Bioqumica
Aglutinacin para
grupo y serotipo
Prueba de
susceptibilidad
antimicrobiana
Pruebas moleculares
PFGE
(Solo en caso de urgencia)
Identificacin de
genes de
toxigenicidad
** Se pueden emplear
mtodos automatizados o
semi automatizados para
la identificacin.
* En caso de brote y se
sospeche de Escherichia
coli picar cinco colonias
e identificar.
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ESTNDARES DE CALIDAD
Con la finalidad de verificar el cumplimiento de los objetivos de la vigilancia por laboratorio de
las diarreas agudas bacterianas se definen los siguientes estndares.
ESTNDARES DE EVALUACIN DE LA CALIDAD
Indicador Estndar Clculo Accin Evaluacin
Calidad de las
muestras
90% de las
muestras cumplen
con los criterios
de aceptacin
(Muestras
aceptadas/muestras
recibidas) X 100
La define el
laboratorio local o
estatal. Puede ser
capacitacin dirigida
u oficio de
notificacin
Mensual
Oportunidad en el
envo de la muestra
90% de las
muestras
aceptadas se
recibieron hasta 5
das posteriores a
su fecha de toma
(Muestras
aceptadas hasta 5
das posteriores a
su fecha de
toma/total de
muestras
aceptadas) X 100
La define el
laboratorio local o
estatal. Puede ser
capacitacin dirigida
u oficio de
notificacin
Mensual
Concordancia
analtica
90% de
concordancia de
las cepas enviadas
al InDRE
(Cepas
concordantes/Total
de cepas aceptadas
en el InDRE) X
100
La define el
laboratorio con base
en el anlisis de
causas que deber
enviar al InDRE
Trimestral
Evaluacin del
desempeo
Al menos 80% de
cumplimiento en
cada uno de los
componentes
(clera y
enterobacterias)
Se realiza con base
en los criterios que
se especifican en el
informe del anlisis
de resultados
El laboratorio
realizar un anlisis
de causas y enviar
su plan de acciones al
InDRE
Semestral
Cumplimiento del
envo de cepas
Envo de los
aislamientos de
Vibrio cholerae
O1, Vibrio
parahaemolyticus,
Salmonella spp y
Shigella spp.
(Cepas aceptadas
en el InDRE/cepas
informadas en el
Sistema de
Informacin en
Salud) X 100
El laboratorio de
referencia nacional
enviar oficio de
notificacin
Trimestral

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CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS

Las actividades de captura de datos y resultados la realizar cada Laboratorio Estatal de Salud
Pblica con sus recursos disponibles. Para el informe de resultados se deber cumplir con lo
siguiente:
El laboratorio es responsable de la realizacin del formato de informe. Este formato (ya sea
electrnico o en papel) y la manera en que va a ser comunicado por el laboratorio, deben ser
determinados en acuerdo con los usuarios de los servicios del laboratorio.
El laboratorio comparte la responsabilidad con el solicitante para asegurar que los informes
son recibidos por las personas apropiadas dentro del intervalo de tiempo acordado.
Los resultados deben ser legibles, sin errores de trascripcin e informados a las personas
autorizadas para recibir y utilizar la informacin mdica.
El informe tambin debe incluir, sin estar limitado a la siguiente informacin:
Identificacin clara y sin ambigedad del examen.
Identificacin del laboratorio que emite el informe.
Identificacin nica, ubicacin del paciente cuando sea posible y destino del informe.
Nombre u otra identificacin nica del solicitante y la direccin del mismo.
Fecha y hora de la toma de la muestra primaria, cuando est disponible y sea pertinente
para el cuidado del paciente, as como la hora de recepcin en el laboratorio.
Fecha y hora de la liberacin del informe, las cuales si no estn en el informe, deben estar
fcilmente accesibles cuando sea necesario.
Tipo de muestra primaria.
Resultados de los exmenes.
Otros comentarios (calidad de la muestra primaria condiciones que puedan haber
comprometido el resultado).
Identificacin de la persona que autoriza la liberacin del informe.
Si es pertinente, los resultados originales y los corregidos.
Firma o autorizacin de la persona que verifica o libera el informe, cuando sea posible.
PROGRAMA DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO (PEED)
El InDRE enviar a los Laboratorios Estatales de Salud Pblica un panel de cepas o muestras
cada seis meses, el cual deber ser procesado con la metodologa establecida en el laboratorio y
remitir los resultados obtenidos al InDRE.
El InDRE analizar los resultados de la red de laboratorios y elaborar un informe con el
resultado global y particular de los participantes de la red.
Con base en los resultados obtenidos, se evaluar el desempeo de cada participante y se definirn
las acciones a seguir. Estas pueden ser desde reconocer el esfuerzo realizado hasta de ser necesario,
establecer un plan de acciones correctivas y/o preventivas, evaluar si se requiere capacitacin o si
amerita una visita de supervisin.
Los laboratorios locales sern evaluados por el Laboratorio Estatal de Salud Pblica que le
corresponda bajo los lineamientos anteriormente descritos.
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Actividades a realizar durante el ciclo anual del Programa de Evaluacin Externa del
Desempeo
Figura. 4. Ciclo PEED en los componentes de Clera y Enterobacterias

CRITERIOS PARA LA LIBERACIN DEL DIAGNSTICO
La liberacin del diagnstico de enfermedad diarreica aguda bacteriana se realiza nicamente
cuando el LESP obtiene ms del 90% en los indicadores: "Concordancia analtica" y "Evaluacin
del desempeo" sin embargo, deben seguir enviando las cepas al InDRE para realizar la vigilancia
de susceptibilidad a los antimicrobianos, la vigilancia de circulacin de cepas de Vibrio cholerae
O139 y la realizacin de pruebas moleculares de alta complejidad para el estudio de brotes y
atencin de urgencias nacionales e internacionales.


1ra Evaluacin
(marzo)

Envo de plan
de
Acciones
(<80)
(junio)

Capacitacin
-Asesora
(Previa
solicitud o
invitacin)
A
n

l
i
s
i
s

d
e

l
a

i
n
f
o
r
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a

C
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a
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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDAD
E
N
E

F
E
B

M
A
R

A
B
R

M
A
Y

J
U
N

J
U
L

A
G
O

S
E
P

O
C
T

N
O
V

D
I
C

Capacitacin en
servicio
A programar, previa solicitud a travs del Departamento de Control
de Muestras y Servicios del InDRE
Envo del primer panel
a los Laboratorios
Estatales de la Red de
EFES
x
Recepcin de
resultados del Panel en
el InDRE
x
Envo de resultados a
la RNLSP
x
Envo del segundo
panel a los
Laboratorios Estatales
de la Red de EFES
x
Recepcin de
resultados del Panel en
el InDRE
x
Envo de resultados a
la RNLSP
x


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BIBLIOGRAFA
1. Organizacin Panamericana de la Salud. Organizacin Mundial de la Salud. Manual de
procedimientos para la serotipificacin de V. cholerae. Washington, D. C. 2004.
2. Centros para el Control y la Prevencin de Enfermedades: Centro Nacional para las
Enfermedades Infecciosas y Organizacin Mundial de la Salud, Enfermedades
Transmisibles: Vigilancia y Respuesta. Manual de Laboratorio para la Identificacin y Prueba
de Susceptibilidad a los antimicrobianos de Patgenos Bacterianos de Importancia para la
Salud Pblica en el Mundo en Desarrollo. Atlanta, Georgia: CDC; 2004.
3. Organizacin Panamericana de la Salud. Organizacin Mundial de la Salud. Manual de
procedimientos para la serotipificacin de Salmonella y Shigella. Washington, D. C. 2004.
4. Antigenic Formulae Of The Salmonella Serovars, 2007, 9th edition WHO Collaborating
Centre for Reference and Research on Salmonella Patrick A.D. Grimont, Franois-Xavier
Weill, Institute Pasteur, 28 rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
5. Ewing, W.H, Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4th Edition.
Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York 1986:135-172.
6. Aidara A. Koblavi S, Boye CS, Raphenon G, Gassama A, Girmoni E, Grimont PAD.
Phenotypic and genotypic characterization of Vibrio cholerae isolates from a recent outbreak
in Senegel: Comparison with isolates from Guinea-Bissau. Am J Trop Med Hyg 1988; 58:
163-7.
7. Fields PI, Popovic T, Wachsmuth K, Olsvik O, 1992. Use of Polymerase Chain Reaction
for Detection of Toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera
epidemic. J Clin Microbiol 30: 2118-2121.
8. Albert M, Islam D, Nahar S, Qadri F, Falklind S, Weintraub A, 1997. Rapid Detection of
Vibrio cholerae O139 Bengal from Stool Specimens by PCR. J Clin Microbiol 35: 1633-
1635.
9. Raja N, Nor-Shamsudin M, Somarny W, Rosli R, Rahim RA, Radu S, 2001. Detection and
molecular characterization of the zot gene in Vibrio cholerae and V. alginolyticus isolates.
Southeast Asian J Trop Med Public Health 32: 100-104.
10. Sarkar A, Nandy RN, Nair BG, Ghose AC, 2002. Vibrio Pathogenicity Island and Cholera
Toxin Genetic Element-Associated Virulence Genes and Their Expression in Non-O1
Non-O139 Strain of Vibrio cholera. American Society for Microbiology 70: 4735-4742.
11. Cabrera-Garca ME, Vzquez-Salinas C, Quiones-Ramrez EI, Serologic and Molecular
Characterization of Vibrio parahaemolyticus Strains Isolated from Seawater and Fish
Products of the Gulf of Mexico, 2004. American Society for Microbiology 70: 6401-6406.
12. Tadaa J, Ohashia T, Nishimuraa N, Shirasakia Y, Ozakia H, Fukushima S, Takanoa J,
Nishibuchib M, Takedab Y. Detection of the thermostable direct hemolysin gene (tdh) and
the thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene (trh) of Vibrio parahaemolyticus
by polymerase chain reaction. Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Kyoto
University. 1992.
13. Vibrio cholerae and Cholera molecular to global perspectives, Edited by I. Kaye Wachsmuth,
Paula Blake and Orjan Olsvik. ASM PRESS, Washington D.C. American Society for
Microbiology, 1994.
EDA Bacteriana-RNLSP/InDRE Pgina 24 de 54
Versin No.01 enero 2014
14. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic
laboratories. MMWR Surveill Summ. 6; 61:1-102; 2012.
15. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement / Vol. 60; 2011.
16. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious
Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.
17. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories
5th ed. CDC-NIH; 2009.
18. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk
management standard. Brussels: CEN; 2011.
19. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual 3rd ed. Geneva: WHO Press;
2004.

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ANEXO 1. TCNICAS DIAGNSTICAS
1. Aislamiento e identificacin de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus
1.1. Principio del mtodo
El mtodo se fundamenta en la capacidad de Vibrio spp para crecer en medios alcalinos y de sus
diferentes capacidades metablicas para descarboxilar aminocidos como la lisina, ornitina y
arginina; fermentar azcares como sacarosa, lactosa y glucosa; producir indol a partir del
triptfano; de ser mvil y poseer la enzima citocromo oxidasa. La serotipificacin de Vibrio
cholerae se fundamenta en la deteccin de antgenos especficos del lipopolisacrido bacteriano
a travs de una reaccin antgeno-anticuerpo.

1.2. Sistema de muestra primaria
Muestra de materia fecal o cepas de Vibrio spp.
1.3. Tipo de contenedor y aditivos
La muestra de materia fecal deber recolectarse con hisopo de algodn (hisopo rectal o hisopo
fecal) e introducirse en un tubo con medio de transporte de Cary Blair; las cepas de Vibrio spp
debern estar sembradas en un medio de cultivo de soporte (base de agar sangre).
1.4. Equipos
Incubadora a 36 +1 C
Refrigerador de 4 a 8 C
Lmpara de luz blanca
Termmetro de -5 a 15 C
Termmetro de 20 a 50 C

1.5. Materiales
Mechero Bunsen, cuadro bsico nmero 533.604.0042
Manguera de ltex para la conexin del gas al mechero, cuadro bsico nmero 080.909.5383
Asas de nicromel con punta recta, cuadro bsico nmero 537.085.0018
Placa Petri de 100 x 15 mm cuadro bsico nmero 080.148.0120
Tubo de 16 x150 mm con tapn de rosca de baquelita
Tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca de baquelita
Gradillas para 72 tubos, cuadro bsico nmero 533.461.0507
Pipetas graduadas de vidrio de 5 mL, cuadro bsico nmero 080.709.2606
Portaobjetos 12 x 75 x 0.8 mm, cuadro bsico nmero 080.729.0010
Aplicadores de madera sin algodn, cuadro bsico nmero 060.082.0054
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Jeringa desechable para tuberculina de 1 mL, cuadro bsico nmero 060.550.0636
Bulbo de seguridad de tres vas
Gasa simple, cuadro bsico nmero 060.436.0669
Pinzas de diseccin de acero inoxidable, de 12.7 cm. cuadro bsico nmero 535.701.0056
Pizeta con solucin desinfectante de hipoclorito de sodio dilucin 1:100 (1%)
Frasco con solucin salina formalinizada 0.6%

1.6. Reactivos y material biolgico
Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS), cuadro bsico nmero 080.610.2448, 30 mL en
placa Petri.
Base de agar sangre (BAB), cuadro bsico nmero 080.610.1200, 4.0 mL de medio inclinado
en tubo de 13 x 100 mm con tapn de hule.
Base de agar sangre (BAB), cuadro bsico nmero 080.610.1200, 30 mL de medio en placa
Petri.
Medio de movilidad indol ornitina (MIO), cuadro bsico nmero 080.610.1770, 4.0 mL de
medio sin inclinar en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca.
Agar de hierro y triple azcar (TSI), cuadro bsico nmero 080.610.2364, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca.
Agar de hierro y lisina (LIA), cuadro bsico nmero 080.610.0269, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca.
Peptona de casena, cuadro bsico nmero 080.610.1879, cloruro de sodio, cuadro bsico
nmero 080.830.0677, para preparar agua peptonada alcalina pH 9 (APA) 10 mL en tubo
de 16x150 mm con tapn de rosca.
Peptona de casena, cuadro bsico nmero 080.610.1879, cloruro de sodio, cuadro bsico
nmero 080.830.0677, para preparar caldo peptonado (CP), 4 mL.0 en tubo de 13x100 mm
con tapn de rosca.
Base descarboxilasa de Meller, cuadro bsico nmero 080.610.2455, L-arginina, cuadro
bsico nmero 080.832.4107, para preparar caldo arginina 4.0 mL en tubo de 13x100 mm
con tapn de rosca.
Reactivo de Kovac, cuadro bsico nmero 080.783.1557.
Reactivo de oxidasa, cuadro bsico nmero 080.889.0172.
Vaselina lquida.
Cloruro de sodio, cuadro bsico nmero 080.830.0677.
Formaldehido, cuadro bsico nmero 080.830.1311.
Hipoclorito de sodio.
Agua destilada.
Todos los medios de cultivo se deben preparar siguiendo las especificaciones del fabricante.
Suero polivalente Vibrio cholerae O1.
Suero monovalente Vibrio cholerae Inaba.
Suero monovalente Vibrio cholerae Ogawa.

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1.7. Pasos del mtodo
Aislamiento
La muestra de materia fecal debe ser fresca y estar en medio de transporte de Cary-Blair y deber
ser procesada lo antes posible una vez que llega al laboratorio.
Depositar el hisopo del Cary-Blair en tubo de Agua Peptonada Alcalina (APA), incubar a 36 +1
C durante 6-8 h.
Con una asa redonda previamente quemada y enfriada en el agar depositar 3 asadas de la
superficie del APA en una placa de agar TCBS, sembrar por estra cruzada sin quemar el asa
entre cuadrantes. Incubar a 36+1 C durante 18 a 24 h.
Las cepas de origen clnico, alimentos o ambientales para referencia o control de calidad se
siembran directo en agar TCBS por estra cruzada quemando el asa entre el primer o segundo
cuadrante. Incubar a 36+1 C durante 18 a 24 h.

Identificacin
Seleccionar del agar TCBS colonias, sacarosa positivas (colonias amarillas, planas de 2 mm,
generalmente pegajosas) y/o sacarosas negativas (colonias verdes, de 2 mm, generalmente
pegajosas).
Quemar una asa en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar
la colonia sin extender en el agar (con esta nica colonia se siembran todas las pruebas
bioqumicas), inocular en tubo de caldo arginina (CA) y caldo peptonado (CP), depositando el
inculo, MIO picadura hasta el fondo, TSI, LIA y tubo de BAB, picadura hasta el fondo y estra
en la superficie (las bioqumicas que se utilicen para identificar las colonias verdes se deben
adicionar con 1% de cloruro de sodio; adicionalmente se deben sembrar caldos nutritivos con
0%, 1%, 3%, 6%, 8% y 10% de cloruro de sodio.
Sellar con vaselina lquida estril el caldo arginina; sembrar tambin una placa de BAB por estra
cerrada. Incubar a 36+1 C durante 18 a 24 h.
De la placa de BAB hacer la prueba de oxidasa, depositar un inculo con asa desechable o
aplicador de madera en la zona reactiva de la tira o en el papel impregnado con el reactivo, leer
el resultado en un tiempo mximo de 10 segundos.
Antes de leer las pruebas bioqumicas agregar 0.5 mL de reactivo de Ehrlich o Kovac en el caldo
peptonado, interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas utilizando el cuadro 1, e
identificar el patrn bioqumico de V. cholerae o V. parahaemolyticus con el cuadro 2.

Serotipificacin
Si bioqumicamente se identific Vibrio cholerae, realizar la serotipificacin a partir de la placa
de BAB.
En un portaobjetos limpio y desengrasado depositar 5 gotas de solucin salina formalinizada en
el extremo superior del portaobjetos, separadas lo suficiente para evitar que se mezclen. En el
extremo inferior colocar una gota de solucin salina (testigo negativo), una gota de suero
polivalente Vibrio cholerae O1, una gota de suero monovalente Vibrio cholerae O1 Ogawa, una
gota de suero monovalente Vibrio cholerae O1 Inaba y una gota de suero monovalente Vibrio
cholerae O: 139.
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Con un asa estril o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB y depositar en
cada una de las gotas de solucin salina formalinizada, mezclar las gotas de suspensin con cada
antisuero, agitar por 1 minuto e interpretar. Registrar los resultados.

1.8. Interpretacin por laboratorio
Para emitir un resultado positivo a Vibrio cholerae O1 (Ogawa o Inaba), N O1 u O139 de una
muestra procesada, se considera la identificacin bioqumica que debe corresponder al patrn
bioqumico de dicha especie, as como los resultados de serotipificacin del antgeno somtico.
Para emitir un resultado positivo a Vibrio parahaemolyticus de una muestra procesada, se
considera la identificacin bioqumica que debe corresponder al patrn bioqumico de dicha
especie.
Un resultado negativo corresponde a la ausencia de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus en
la muestra fecal o cepa recibida.
Realizar pruebas moleculares a las cepas identificadas como Vibrio parahaemolyticus, Vibrio
cholerae O1 y Vibrio cholerae O139.
1.9. Medidas de bioseguridad
El nivel de bioseguridad requerido es nivel 2 por lo que se recomienda:
Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada, esta vestimenta no debe ser usada fuera
de las reas de trabajo.
Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo antes y despus de procesar muestras.
Mantener cerrada la puerta del laboratorio.
Lavarse las manos antes y despus de trabajar.
No hablar, estornudar ni toser durante el sembrado de la muestra.
No pipetear directamente con la boca.

2. PCR punto final para la deteccin de cepas toxignicas de Vibrio cholerae
2.1. Principio del mtodo
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica mediante la cual se replican de
forma exponencial miles de copias de un gen o segmento de ADN especfico. Esta tcnica
molecular utiliza dos iniciadores (oligonucletidos) especficos y complementarios a la secuencia
buscada en la bacteria y consiste en separar con calor ambas cadenas de ADN, posteriormente
cada iniciador se hibrida complementariamente a una cadena de ADN, interviniendo en ese
momento la ADN polimerasa que utiliza los desoxioligonucleotidos (dNTPs) presentes para
sintetizar a su vez dos cadenas complementarias a las del molde. Este proceso se repite varias
veces, hasta obtener cantidades detectables y visibles del ADN presente originalmente en las
muestras.
2.2. Sistema de muestra primaria
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Cultivo puro de Vibrio cholerae O1 o Vibrio cholerae O139.
2.3. Tipo de contenedor y aditivos
Las cepas deben estar sembradas por aislamiento en medio de Agar Base Sangre sin aditivos.
2.4. Equipo
Termociclador-PCR
Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A
Cabina para PCR
Cmara de electroforesis horizontal
Fotodocumentador
Fuente de poder
Congelador vertical
Refrigerador vertical
Termoagitador
Sistema de purificacin de agua
Balanza analtica
Aire acondicionado
2.5. Materiales
Micropipetas de: 1-10, 2-20, 20-200 y 100-1000 L
Micropipeta
Guantes de nitrilo
Tubos tipo eppendorf de: 0.2, 0.5 y 1.5 mL
Puntas para micropipeta de: 10, 200 y 1000 L
Tubos para centrifuga de: 50 mL
Pipetas desechables de 5.0 y 10 mL
Marcadores indelebles
Gradillas para tubos eppendorf
Bolsas de polipropileno
Contenedores para desecho de puntas
Gasas

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2.6. Reactivos y material biolgico
Reactivos y materiales biolgicos Fabricante
dNTPs (A, T, C, G) 100M Roche
Taq polimerasa 5U/L Roche
CTX2 5 CGG GCA GAT TCT AGA CCT CCT G 3 (1,2) Applied biosystems
CTX3 5 CGA TGA TCT TGG AGC ATT CCC AC 3 (1,2) Applied biosystems
CTX7 5 GGT TGC TTC TCA TCA TCG AAC CAC 3' (5) Applied biosystems
CTX9 5 GAT ACA CAT AAT AGA ATT AAG GAT 3' (5) Applied biosystems
ACE1
5-TAA GGA TGT GCT TAT GAT GGA CAC CC
3 (1)
Applied biosystems
ACE2 5-CGT GAT GAA TAA AGA TAC TCA TAG-3 (1) Applied biosystems
ZOT1
5 TGG CTT CGT CTG CTG CCG GCG ATT 3'
(1,4)
Applied biosystems
ZOT2 5 CAC TTC TAC CGA CAG CGC TTG CG 3' (1,4) Applied biosystems
1-39Vc 5 GCG TTA TAG GTA TCA TCA AGA GA 3 (3) Applied biosystems
2-39Vc 5 GTC ATT ATT AAA ACT GCT CCA TT 3 (3) Applied biosystems
MgCl2, 25mM Applied biosystems
Regulador 10 X Applied biosystems
Solucin amortiguadora TBE
Agarosa Sigma
Bromuro de etidio
Agua destilada y desionizada MILLIPORE
Marcador de peso molecular
Naranja de acridina
Alcohol etlico al 70%

2.7. Pasos del mtodo
Re-suspender una colonia de una cepa aislada y caracterizada como Vibrio cholerae en 200 L
de agua destilada para obtener el ADN molde.
Hervir la suspensin durante 15 minutos e inmediatamente colocar en bao de hielo.

Consideraciones antes de iniciar la PCR
Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad.
Usar el equipo de seguridad.
Mantener las suspensiones de las muestras en hielo listas para PCR.
Descongelar previamente los reactivos para PCR.
Rotular los tubos de acuerdo al nmero y tipo de muestra a trabajar.

Preparacin de la mezcla de reaccin.
La mezcla de reaccin se prepara en el REA BLANCA del laboratorio.
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El volumen de los reactivos se calcular de acuerdo al nmero de muestras a analizar, siguiendo
el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la mezcla de reaccin, homogenizar
suavemente con pipeta aproximadamente 30 veces (aspirando y expulsando con ayuda de la
pipeta), finalmente adicionar 22 L de esta mezcla en el fondo de cada tubo.
En el rea de templados, adicionar 3.0 L del ADN extrado de cada muestra en el tubo
correspondiente.

Formato de trabajo para PCR
REACTIVOS VOLUMEN (L)
H2O 9.35
Reg 10X 2.5
MgCl2 25mM 4.0
dNTPs 1M 4.0
Iniciador 1 (ctx 2, ctx 7, ace 1, zot 1, 1-39Vc) 1.0
Iniciador 2(ctx 3, ctx 9, ace 2, zot 2, 2-39Vc) 1.0
Taq 5U/L ROCHE 0.15
ADN 3.0

Programa
1 ciclo 94
o
C 1 min
35 ciclos
94
o
C 30 s
55
o
C 30 s
72
o
C 1 min
1 ciclo 72
o
C 2 min
Controles
En el rea de controles adicionar 3.0 L de control positivo y negativo respectivamente.
Control negativo: Colocar una muestra de ADN confirmada como negativa a V. cholerae.
Control positivo: Colocar ADN extrado de una cepa caracterizada como V. cholerae O139
toxignica bajo el resguardo del InDRE.
Control de reactivos: utilizar 3.0 L de agua inyectable o calidad Milli-Q.

NOTA: Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados para evitar que el contenido se
evapore.
Colocar los tubos en el termociclador, seleccionar el programa para Vibrio cholerae y dar inicio a
la corrida. Los productos de ADN obtenidos se someten a 120 V por 30 minutos a electroforesis
en un gel de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-cido actico. Finalizada la electroforesis
evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV.

2.8. Interpretacin por laboratorio
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Presencia de una banda de aproximadamente 564 pb indica la presencia del gen de la subunidad
A de la toxina colrica.
Presencia de una banda de aproximadamente 460 pb indica la presencia del gen de la subunidad
B de la toxina colrica.
Presencia de una banda de aproximadamente 314 pb indica la presencia del gen de la toxina
accesoria ace.
Presencia de una banda de aproximadamente 1083 pb indica la presencia del gen de la toxina
accesoria zot.
2.9. Medidas de bioseguridad
Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos y analizarse
en un laboratorio de bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de bioseguridad
tipo II 2A.
El analista debe usar equipo de proteccin personal, bata (una para cada rea del proceso),
guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de seguridad.
Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos de Residuos
Peligrosos Biolgico-Infecciosos (RPBI) en cada rea.
Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y despus de trabajar con etanol al
70% o benzal-metanol 1:1 v/v.
Todo el material a utilizar deber ser estril.
El personal que realice la electroforesis no podr hacer mezcla para PCR en la misma jornada.
El rea limpia o rea blanca est libre de toda contaminacin por ADN por lo que solo podrn
manejarse reactivos.
El rea de templados ser la nica en donde se podrn abrir los tubos que contienen el ADN
de las muestras.
El rea de controles ser la nica permitida para la colocacin del ADN control.
Solo en el rea sucia o de electroforesis se podrn abrir los tubos con cADN y cargarse en los
geles.
Cada rea deber estar separada fsicamente para evitar contaminaciones.
Es muy importante que cada rea cuente con su propio material (puntas, guantes, agua, etc.),
y ste no deber compartirse entre reas.
Los equipos debern descontaminarse antes de una reparacin, mantenimiento o antes de ser
removidos del laboratorio.
El analista debe lavar sus manos antes y despus de trabajar.
La prueba se realizar en un laboratorio entre 18-25 C. Las diferentes reas debern estar
separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar as la contaminacin.

3. PCR punto final para la deteccin de genes de patogenicidad en cepas de Vibrio
parahaemolyticus
3.1. Principio del mtodo
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Versin No.01 enero 2014
Como ya se mencion, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica mediante la
cual se replican de forma exponencial miles de copias de un gen o segmento de ADN especfico.
Esta tcnica molecular utiliza dos iniciadores (oligonucletidos) especficos y complementarios a
la secuencia buscada en la bacteria y consiste en separar con calor ambas cadenas de ADN,
posteriormente cada iniciador se hibrida complementariamente a una cadena de ADN,
interviniendo en ese momento la ADN polimerasa que utiliza los desoxioligonucleotidos
(dNTPs) presentes para sintetizar a su vez dos cadenas complementarias a las del molde. Este
proceso se repite varias veces, hasta obtener cantidades detectables y visibles del ADN presente
originalmente en las muestras.
3.2. Sistema de muestra primaria
Cultivo puro de Vibrio parahaemolyticus
3.3. Tipo de contenedor y aditivos
Las cepas deben estar sembradas por aislamiento en medio de Agar Base Sangre sin aditivos.
3.4. Equipo
Termociclador
Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A
Cabina para PCR
Cmara de electroforesis horizontal
Fotodocumentador
Fuente de poder
Congelador vertical
Refrigerador vertical
Sistema de purificacin de agua
Balanza analtica
Aire acondicionado
Horno de microondas
3.5. Materiales
Micropipetas de: 1-10, 2-20, 20-200 y 100-1000 L
Guantes desechables
Tubos tipo eppendorf de: 0.2, 0.5 y 1.5 mL
Puntas para micropipeta de: 10, 200 y 1000 L
Tubos para centrifuga de 50 mL
Pipetas desechables de 5 y 10 mL
Marcadores indelebles
Gradillas para tubos eppendorf
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Bolsas de polipropileno
Contenedores para desecho de puntas
Gasas

3.6. Reactivos y material biolgico
Reactivos y Materiales biolgicos Marca
dNTPs (A, T, C, G) 100M Roche
Taq polimerasa 5U/L Roche
Tdh1 5'-GGT ACT AAA TGG CTG ACA TC-3' (1,2) Applied biosystems
Tdh2 5'-CCA CTA CCA CTC TCA TAT GC-3' (1,2) Applied biosystems
Trh1 5'-GGC TCA AAA TGG TTA AGC G-3' (1,2) Applied biosystems
Trh2 5'-CAT TTC CGC TCT CAT ATG C-3' (1,2) Applied biosystems
MgCl2, 25mM Applied biosystems
Regulador 10 X Applied biosystems
Solucin amortiguadora TBE
Agarosa Sigma
Bromuro de etidio
Agua destilada y desionizada MILLIPORE
Marcador de peso molecular
Naranja G
Alcohol etlico al 70%

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3.7. Pasos del mtodo
Resuspender una colonia de la cepa aislada y caracterizada como Vibrio parahaemolyticus en 200
L de agua destilada.
Hervir 15 minutos la suspensin e inmediatamente colocar en bao de hielo.

Consideraciones antes de iniciar la PCR
Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad utilizando el
sanitizante asignado.
Colocarse el equipo de seguridad.
Mantener las suspensiones de las muestras en hielo listas para la PCR.
Descongelar previamente los reactivos para la PCR.
Rotular los tubos de acuerdo al nmero y tipo de muestra a trabajar.

Preparacin de la mezcla de reaccin
Esta se har en el rea blanca del laboratorio.
El volumen de los reactivos se calcular de acuerdo al nmero de muestras a diagnosticar,
siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la mezcla de reaccin
homogenizar suavemente con la pipeta (aspirando y expulsando con ayuda de la pipeta)
aproximadamente 30 veces, finalmente adicionar 22 L de esta mezcla en el fondo de cada
tubo.
En el rea de templados, adicionar 3.0 L del ADN extrado de cada muestra en el tubo
correspondiente.

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Formato de trabajo para PCR de Vibrio parahaemolyticus
Reactivos Volumen (L) Reactivos Volumen (L)
H2O 4.35 H2O 12.35
Reg 10X 2.5 Reg 10X 2.5
MgCl2 25mM 10 MgCl2 25mM 2
dNTPs 1M 3 dNTPs 1M 3
tdh 1 1:80 1 trh 1 1:80 1
tdh 2 1:80 1 trh 2 1:80 1
Taq 5U/L 0.15 Taq 5U/L 0.15 L
ADN 3 ADN 3

Programa
1 ciclo 94
o
C 1 min
25 ciclos
94
o
C 20 s
55
o
C 20 s
72
o
C 30 s
1 ciclo 72
o
C -2 min

Controles
En el rea de controles, adicionar 3.0 L de control positivo y negativo respectivamente en el
tubo que corresponda.
Control negativo para tdh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus
trh positivo.
Control negativo para trh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus
tdh positivo.
Control positivo para tdh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus
tdh positivo.
Control positivo para trh: Colocar una muestra de ADN confirmada como V. parahaemolyticus
trh positivo.

Control de reactivos: utilizar 3.0 L de agua inyectable o agua calidad Milli-Q.

NOTA: Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados, para evitar que el contenido se
evapore.

Colocar los tubos en el termociclador, seleccionar el programa para Vibrio parahaemolyticus y
dar inicio a la corrida.
Los productos de ADN obtenidos se someten a 120 V por 30 minutos a electroforesis en un gel
de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-cido actico.
Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV.
3.8. Interpretacin por laboratorio
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Positivo:
Presencia de una banda de aproximadamente 251 pb indica la presencia del gen tdh que codifica
para la hemolisina termoestable directa.
Presencia de una banda de aproximadamente 250 pb indica la presencia del gen trh que codifica
para la termolisina relacionada a la directa.

Negativo:
Ausencia de los genes que codifican para las termolisinas, ausencia de bandas tdh (251 pb) y trh
(250 pb).

3.9. Medidas de bioseguridad
Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos y trabajarse en
un Laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de bioseguridad tipo II
2A.
El analista debe usar su equipo de proteccin personal, bata (una para cada rea del proceso),
guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de seguridad.
Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos RPBI en cada rea.
Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y despus de trabajar con etanol al
70% o benzal-metanol 1:1 v/v.
Todo el material a utilizar deber estar estril.
El personal que realice la electroforesis no podr hacer mezcla para PCR en la misma jornada.
El rea limpia o rea blanca est libre de toda contaminacin por ADN por lo que solo podrn
manejarse reactivos.
El rea de templados ser la nica en donde se podrn abrir los tubos que contienen el ADN
de las muestras.
El rea de controles ser la nica permitida para la colocacin del ADN control.
Solo en el rea sucia o de electroforesis se podrn abrir los tubos con cADN y cargarse en los
geles.
Cada rea deber estar separada fsicamente para evitar contaminaciones.
Es muy importante que cada rea cuente con su propio material (puntas, guantes, agua, etc.)
y ste no deber compartirse entre reas.
Los equipos debern descontaminarse antes de una reparacin, mantenimiento o antes de ser
removidos del laboratorio.
El analista debe lavar sus manos antes y despus de trabajar.
La prueba se realizar en un laboratorio entre 18-25 C. Las diferentes reas debern estar
separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar as la contaminacin.

4. Produccin de toxina colrica
En toda cepa aislada de Vibrio cholerae O1 se determina su capacidad para producir toxina
colrica a travs de la tcnica de ELISA descrita en el Manual de Tcnicas de Laboratorio Vol.
I, 1995 del InDRE.
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Se preparan placas sensibilizadas con el receptor GM1 y se agrega el sobrenadante del cultivo
donde podra estar la toxina. La presencia de interaccin receptor-toxina se determina agregando
un anticuerpo de conejo antitoxina. La reaccin se pone en evidencia al adicionar anticuerpos
contra las inmunoglobulinas de conejo conjugados a una enzima. Al agregar el sustrato especfico
el desarrollo de color significa que el cultivo de prueba es productor de toxina colrica.

5. Diferenciacin de Vibrio cholerae O1 en biotipos Clsico o el Tor
Despus de identificar el grupo y el serotipo, se procede a la caracterizacin del biotipo (Clsico
o El Tor). Se siembra la cepa en BAB y se incuba 24 h a 36 + 1 C. Se realizan las pruebas
siguientes que se interpretan de acuerdo con lo que se indica.
Reaccin
Biotipo
Vp
(modificado con 1%
NaCl)
Inhibicin de
crecimiento
polimixina b (50 u)
Hemlisis
Aglutinacin de
eritrocitos de pollo
o carnero
Classical N P N N
El tor P N P P

6. Aislamiento, identificacin y serotipificacin de Salmonella spp y Shigella spp.
6.1. Principio del mtodo
El mtodo se fundamenta en el uso de tcnicas bacteriolgicas de aislamiento e identificacin de
las propiedades fenotpicas de Salmonella y Shigella, as como en la tcnica inmunolgica de
aglutinacin en placa para ambos gneros y aglutinacin en tubo para Salmonella.

6.2. Sistema de muestra primaria
Muestra de materia fecal o cepas de Salmonella spp y Shigella spp.

6.3. Tipo de contenedor y aditivos
La muestra de materia fecal deber recolectarse con hisopo de algodn (hisopo rectal o hisopo
fecal) e introducirse en un tubo con medio de transporte de Cary Blair. Las cepas de Salmonella
spp y Shigella spp deben sembrarse en un medio de cultivo de soporte.

6.4. Equipo
Incubadora a 36 + 1 C
Refrigerador a 4 a 8 C
Agitador vortex
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Versin No.01 enero 2014
Lmpara de luz blanca
Bao Mara a 50 + 1 C
Termmetro de -10 a 100 C
Termmetro de -5 a 15 C
Termmetro de 15 a 50 C

6.5. Materiales
Mechero Bunsen, cuadro bsico nmero 533.604.0042
Manguera de ltex para la conexin del gas al mechero, cuadro bsico nmero 080.909.5383
Asas de nicromel con punta redonda, cuadro bsico nmero 537.085.0018
Asas de nicromel con punta recta, cuadro bsico nmero 537.085.0018
Placa Petri de 100 x 15 mm, cuadro bsico nmero 080.148.0120
Tubo de 16 x150 mm, con tapn de rosca de baquelita
Tubo de 13 x 100 mm, con tapn de rosca de baquelita
Gradillas para 72 tubos cuadro, bsico nmero 533.461.0507
Pipetas graduadas de vidrio de 5.0 mL, cuadro bsico nmero 080.709.2606
Pipetas graduadas desechables de 1.0 o 2.0 mL, cuadro bsico nmero 080.709.0311 o
080.709.0329
Tubo de vidrio de 12x75 mm, cuadro bsico nmero 080.909.0525
Portaobjetos de 25 x75 x0.8 mm, cuadro bsico nmero 080.729.0010
Aplicadores de madera cuadro bsico nmero 060.082.0054
Vaso de precipitados de vidrio de 500 mL, cuadro bsico nmero 080.951.0639
Tubo cnico de polipropileno para centrfuga de 50 mL, cuadro bsico nmero 080.909.1648
Placa Petri de 60x15 mm, cuadro bsico nmero 080.148.0195
Jeringa desechable para tuberculina de 1.0 mL, cuadro bsico nmero 060.550.0636
Unidad de filtracin tipo pirinola para jeringa desechable con membrana de acetato de
celulosa de 0.22 micras, cuadro bsico nmero 080.421.0714
Contenedor para RPBI punzocortantes de 3.70 a 4.75 L, cuadro bsico nmero 060.218.0093
Bulbo de seguridad de tres vas
Gasa simple, cuadro bsico nmero 060.436.0669 para limpieza de mesas
Tripee de acero fundido, cuadro bsico nmero 533.898.0021
Pinzas de diseccin de acero inoxidable de 12.7 cm, cuadro bsico nmero 535.701.0056
Contenedor plstico con solucin desinfectante de hipoclorito de sodio dilucin 1:10 (10%)
Pizeta con solucin desinfectante de hipoclorito de sodio dilucin 1:100 (1%)
Frasco con solucin salina formalinizada 0.6%

6.6. Reactivos y material biolgico
Reactivos
Base de agar sangre (BAB), cuadro bsico nmero 080.610.1200, 4.0 mL de medio inclinado
en tubo de 13 x 100 mm con tapn de hule.
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Base de agar sangre (BAB), cuadro bsico nmero 080.610.1200, 30 mL de medio en placa
Petri.
Agar MacConkey, cuadro bsico nmero 080.610.1531, 30 mL de medio en placa Petri.
Agar verde brillante, cuadro bsico nmero 080.610.2497, 30 mL de medio en placa Petri.
Agar sulfito de bismuto, cuadro bsico nmero 080.610.0574, 30 mL de medio en placa Petri.
Medio de movilidad indol ornitina (MIO), cuadro bsico nmero 080.610.1770, 4.0 mL de
medio sin inclinar en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca.
Agar de hierro y triple azcar (TSI), cuadro bsico nmero 080.610.2364, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca.
Agar de hierro y lisina (LIA), cuadro bsico nmero 080.610.0269, 4.0 mL de medio
inclinado en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca.
cido msico, peptona de casena cuadro bsico nmero 080.610.1879 y azul de bromotimol,
cuadro bsico nmero 080.830.4893, para preparar caldo mucato 4.0 mL de medio en tubo
de 13 x 100 mm con tapn de rosca.
L-sorbitol, peptona de casena, cuadro bsico nmero 080.610.1879, 4.0 mL de medio en
tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca.
Rojo de fenol, cuadro bsico nmero 080.830.3408.
Cloruro de sodio, cuadro bsico nmero 080.830.0677, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100
mm con tapn de rosca.
Caldo malonato, cuadro bsico nmero 080.610.9559, 4.0 mL de medio en tubo de 13 x 100
mm con tapn de rosca.
Base agar urea de Christensen, cuadro bsico nmero 080.610.1432, agar, cuadro bsico
nmero 080.610.8254 para preparar 4.0 mL de medio inclinado en tubo de 13 x 100 mm con
tapn de rosca.
Agar citrato de Simmons, cuadro bsico nmero 080.610.7454, 4.0 mL de medio inclinado
en tubo de 13 x 100 mm con tapn de rosca.
Base caldo tetrationato, cuadro bsico nmero 080.610.2265, 5.0 mL de medio en tubo de
16 x 150 mm con tapn de rosca.
Caldo soya tripticasa (TSB), 10 mL de medio en tubo de 16 x 150 mm con tapn de rosca.
Caldo infusin cerebro corazn, cuadro bsico nmero 080.610.1317, agar, cuadro bsico
nmero 080.610.8254.
Reactivo de Kovac, cuadro bsico nmero 080.783.1557.
Cloruro de sodio, cuadro bsico nmero 080.830.0677.
Formaldehido, cuadro bsico nmero 080.830.1311.
Yodo metlico, cuadro bsico nmero 080.830.5304.
Yoduro de potasio, cuadro bsico nmero 080.830.5312.
Hipoclorito de sodio.
Agua destilada.

Todos los medios de cultivo se deben preparar siguiendo las indicaciones del fabricante.
Material biolgico:
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Antisueros somticos para Salmonella (B, C1, O:6, O:8, O:20, D1, E polivalente [Epol], E1,
E2, E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, W, X, Y, Z, 51 al 67).
Antisueros flagelares para Salmonella (f, g, s, h, r, i, 2, v, m, t, 7, z4, z23, b, 5, d, enx, x, z15,
z10, k, q, z28, 6, w, z6, y, z13, z24, a, c, p, z29, z32, z51, z41).
Antisuero somtico polivalente Shigella dysenteriae (A1-7).
Antisuero somtico polivalente Shigella flexneri (B1-6).
Antisuero somtico polivalente Shigella boydii (A1-7).
Antisuero somtico monovalente Shigella sonnei I.
Antisuero somtico monovalente Shigella sonnei II.
Antisueros somticos monovalentes para Shigella A (1-15), B (1-6), C (1-18).
Todos los antisueros son hidratados y diluidos como se indica en los marbetes de los viales y
se conservan a temperatura de refrigeracin de 4 a 8 C.
6.7. Pasos del mtodo
Aislamiento
La muestra de materia fecal deber ser procesada lo antes posible una vez recibida en el
laboratorio.
Si la muestra de materia fecal viene en envase estril, tomar un poco de heces con un hisopo de
algodn estril y hacer una impronta en un cuadrante de agar MacConkey, si la muestra est en
medio de transporte de Cary-Blair, extraer el hisopo y hacer una impronta en un cuadrante de
agar MacConkey. Sembrar por estra cruzada, quemar y enfriar el asa entre el segundo y el tercer
cuadrante.
El hisopo con el que se inculo la placa de MacConkey se introduce en un tubo con base caldo
tetrationato adicionado con 0.2 mL de solucin de yodo. Incubar la placa y el tubo a 36 + 1 C
de 18 a 24 h.
Las cepas de Salmonella y Shigella para referencia o control de calidad se siembran en agar
MacConkey por estra cruzada. Incubar las placas a 36 + 1 C de 18 a 24 h.
Tomar el hisopo del caldo tetrationato y hacer una descarga en un extremo de una placa de agar
verde brillante y en una placa de sulfito de bismuto.
La placa de verde brillante se siembra con asa redonda por estra cruzada, quemar y enfriar el asa
entre el segundo y el tercer cuadrante. La placa de sulfito de bismuto se siembra con una asa
redonda por estra cruzada sin quemar el asa entre cuadrantes. El agar verde brillante se incuba
de 18 a 24 h y el agar sulfito de bismuto se incuba durante 48 h, ambos a 36 + 1 C.

Identificacin bioqumica
De la placa de agar MacConkey, seleccionar colonias lactosa negativas (colonias incoloras,
probables Salmonella o Shigella), quemar una asa en punta y enfriar en un extremo de la placa
donde no haya crecimiento, tomar una colonia sin extender en el agar y sembrar los siguientes
medios: Caldo sorbitol y caldo mucato, depositar inculo; medio MIO, introducir el asa hasta
el fondo en posicin vertical; TSI y LIA, picadura hasta el fondo y estriar la superficie; citrato
y urea, estriar en la superficie; BAB, picadura hasta el fondo y estriar la superficie del agar.
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Incubar los tubos a 36 + 1 C de 18 a 24 h.
Antes de leer las pruebas bioqumicas adicionar al medio MIO 0.5 mL de reactivo de Ehrlich
o Kovac, interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas utilizando el cuadro 1 e
identificar los patrones bioqumicos de Salmonella y Shigella con los cuadros 3-5, registrar
los resultados.
Del agar verde brillante seleccionar colonias lactosa negativas (colonias rojas). Quemar un asa
en punta y enfriar en un extremo de la placa donde no haya crecimiento, tomar una colonia
sin extender en el agar y sembrar las pruebas bioqumicas como se indic previamente.
De la placa de agar de sulfito de bismuto hacer una seleccin de colonias caractersticas a
Salmonella, las cuales se observan negras con halo y brillo metlico, tomar una colonia sin
extender en el agar y sembrar las pruebas bioqumicas como se indic previamente.

Serotipificacin del antgeno somtico O de Shigella
Si la cepa se identifica bioqumicamente como Shigella, conservar los tubos de TSI y BAB; a
partir del crecimiento bacteriano del tubo de TSI sembrar en condiciones de esterilidad una
placa de BAB por estra cerrada e incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C.
En un portaobjetos limpio y desengrasado colocar 6 gotas de solucin salina formalinizada
(SSF) en el extremo superior separndolas lo suficiente para evitar que las gotas se mezclen;
en el extremo inferior del portaobjetos colocar en forma correspondiente una gota de SSF y
una gota de cada uno de los siguientes antisueros somticos polivalentes y monovalentes de
Shigella A (1-7), B (1-6), C (1-7), DI y DII.
Con un asa desechable o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB e ir
depositando en cada una de las gotas superiores de SSF para tener una suspensin bacteriana,
mezclar cada gota de suspensin con la gota inferior correspondiente utilizando asa
desechable o aplicador de madera y evitando contaminacin cruzada.
Rotar suavemente el portaobjeto y observar a contra luz una reaccin de aglutinacin
utilizando una lmpara de luz blanca, la observacin se hace durante un minuto; despus de
ese tiempo la prueba se invalida. Interpretar el resultado usando el cuadro 6.
Si la cepa aglutina con cualquiera de los antisueros polivalentes A, B o C; se realiza la prueba
de aglutinacin en portaobjetos con los antisueros monovalentes correspondientes al grupo
somtico con el cual se observ la aglutinacin.
Si la cepa aglutina con los antisueros monovalentes DI o DII, se reportar como Shigella
sonnei I Shigella sonnei II.
En el caso de que la cepa no aglutine con ninguno de los antisueros polivalentes ni
monovalentes sonnei, ser necesario aglutinar con los antisueros monovalentes A (8-15) y C
(8-18).
Si la cepa no aglutina con ninguno de los antisueros polivalentes o monovalentes en existencia,
se reportar como Shigella spp.
Cualquiera que sea el resultado de las pruebas serolgicas, ste deber ser registrado.

Serotipificacin del antgeno somtico O de Salmonella
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Versin No.01 enero 2014
Si se identifica bioqumicamente una cepa como Salmonella, separar los tubos de TSI y BAB;
tomar crecimiento del tubo de TSI con un asa de punta estril y sembrar en placa de BAB por
estra cerrada para obtener un crecimiento masivo, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C.
En un portaobjetos limpio y desengrasado colocar 6 gotas de solucin salina formalinizada en el
extremo superior separndolas lo suficiente para evitar que se mezclen, en el extremo inferior
colocar en forma correspondiente a las gotas superiores una gota de SSF y una gota de cada uno
de los antisueros somticos de Salmonella B, C1, O: 8, D y E pol.
Con un asa desechable o aplicador de madera tomar crecimiento de la placa de BAB e ir
depositando en cada una de las gotas superiores de SSF para tener una suspensin bacteriana,
mezclar cada gota de suspensin con la gota inferior correspondiente utilizando un asa desechable
o aplicador de madera evitando contaminacin cruzada. Rotar suavemente el portaobjeto y
observar a contra luz una reaccin de aglutinacin utilizando una lmpara de luz blanca, la
observacin se hace durante un minuto. Interpretar el resultado utilizando el cuadro 6 y
reportarlo.
Si la cepa aglutina con el antisuero O: 8, aglutinar con los antisueros O: 6 y O: 20; si como
resultado de la aglutinacin la cepa aglutina con el antisuero E pol aglutinar con los antisueros
E1, E2, E3 y E4.
Si el resultado de la aglutinacin es negativo repetir la prueba utilizando los antisueros somticos
del grupo F al 67 hasta identificar el grupo somtico al que corresponde la cepa y registrar.
Si despus de aglutinar con todos los antisueros somticos en existencia no se logra identificar el
grupo somtico, debe hacerse la bsqueda de la especie arizona. Inocular un tubo de caldo
malonato con la cepa problema e incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C.
Interpretar el resultado y consultar el cuadro 5. Si la prueba es positiva, reportar como Salmonella
arizona. Si la prueba es negativa reportar como Salmonella spp.

Serotipificacin del antgeno flagelar H de Salmonella
Inocular la cepa problema identificada bioqumicamente como Salmonella en un tubo con
caldo soya tripticasa (TSB), incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C.
Adicionar v/v solucin salina formalinizada (SSF) al tubo de TSB. Dejar reposar a
temperatura ambiente de 2 a 24 horas.
De acuerdo al grupo somtico de la cepa a probar, consultar el cuadro 9 para identificar los
antisueros flagelares de prueba correspondiente a ese grupo. Colocar en una gradilla tubos de
12x75 mm sin labio, marcarlos y depositar 0.1 mL de cada antisuero flagelar, adicionar 0.9
mL de antgeno formalinizado.
Incubar los tubos en bao Mara a 50 C por una hora y revisarlos (al sacar las gradillas del
bao es importante no sacudirlas ni agitarlas, de lo contrario se podra perder la aglutinacin).
Interpretar los resultados utilizando el cuadro 7.
Considerando el antgeno somtico y las fases flagelares identificadas, buscar en el esquema
de Kauffman-White el serotipo correspondiente y registrar.
Si como resultado de la aglutinacin flagelar, se detecta solo una fase flagelar, realizar la
tcnica de induccin de fase. Si no se detecta ninguna fase flagelar, realizar un pase en medio
GARD para inducir movilidad como se menciona a continuacin.
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Poner en bao Mara un tubo de medio GARD, cuando el medio se haya licuado y alcance
una temperatura aproximada de 40 C, verterlo en una placa Petri estril y dejar solidificar en
condiciones de esterilidad. Con un asa en punta, tomar crecimiento de un cultivo fresco en
BAB de la cepa problema e inocular el agar al centro de la placa. Incubar de 18 a 24 horas a
36 + 1 C.
Revisar la placa de GARD. Si la bacteria muestra una zona de crecimiento circundante al
inoculo, tomar con una asa en punta crecimiento del rea ms lejana al centro de la placa e
inocular un tubo de caldo TSB, incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C.
Formalinizar el cultivo de TSB, con solucin salina formalinizada, y realizar la tcnica de
aglutinacin flagelar, considerando para ello el grupo somtico de la cepa.
Leer aglutinacin, si se detectan las dos fases flagelares, reportar como lo indica el punto
9.5.5.
Si solo se detecta una fase flagelar, realizar la tcnica de induccin de fase (ver ms adelante).
Si en la placa de GARD no se observa ninguna zona de crecimiento circundante al inculo,
reportar el gnero bacteriano y el grupo somtico correspondiente.

Induccin de fase para Salmonella
Sembrar la cepa problema por estra cerrada en medio de BAB. Incubar de 18 a 24 horas a
36 + 1 C.
Licuar utilizando bao Mara, un tubo con medio de GARD y dejar enfriar a 40 C
aproximadamente.
Adicionar en condiciones de esterilidad con jeringa para insulina, 0.1 mL del antisuero
concentrado correspondiente a la fase flagelar identificada, agitar en vortex, verter el medio
en placa Petri estril y dejar solidificar en condiciones de esterilidad.
Con un asa estril en punta, tomar crecimiento de la placa de BAB e inocular la placa de
GARD justo al centro. Incubar de 18 a 24 horas a 36 + 1 C.
Revisar la placa al trmino de este tiempo o en el intervalo de este tiempo. Si la bacteria
muestra una zona de crecimiento circundante al inoculo, tomar con una asa en punta
crecimiento del rea ms lejana al centro de la placa e inocular un tubo de caldo TSB, incubar
de 18 a 24 horas a 36 + 1 C.
Formalinizar el crecimiento del tubo de TSB, empleando solucin salina formalinizada, dejar
reposar de 2 a 24 horas. Revisar el esquema de Kauffman-White
(4)
para seleccionar los
antisueros correspondientes a las posibles combinaciones flagelares con la fase ya detectada.
Realizar la prueba de aglutinacin flagelar como se indic con anterioridad.
Si el resultado de la aglutinacin es la deteccin de la segunda fase flagelar, registrar. Si como
resultado de la aglutinacin no se detecta la segunda fase flagelar, reportar la cepa como
monofsica.
Si se observa nuevamente aglutinacin de la fase inicialmente encontrada es necesario repetir
el procedimiento de induccin de fase hasta tres veces, para lo cual se tomar crecimiento de
la placa de GARD anterior para inocular la segunda y de la segunda para inocular la tercera.
Si como resultado de la ltima aglutinacin, se identifica la segunda fase, registrar; si por el
contrario persiste la aglutinacin de la primera fase, reportar la cepa con gnero y grupo
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somtico, otra posibilidad es que se logre inhibir la primera fase pero no se expresa la segunda,
reportar entonces gnero, grupo somtico y la leyenda monofsica.

6.8. Interpretacin por laboratorio
Para emitir un resultado positivo a Salmonella o Shigella de una muestra procesada, se considera
la identificacin bioqumica que debe corresponder a los patrones bioqumicos de dichos gneros,
as como a los resultados de serotipificacin de los antgenos somticos para ambos gneros
bacterianos y antgenos flagelares de Salmonella.
Un resultado negativo corresponde a la ausencia de Salmonella spp y Shigella spp en la muestra
fecal o cepa recibida.

6.9. Medidas de bioseguridad
El nivel de bioseguridad es 2 por lo que se recomienda:
Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada en las reas de trabajo y nunca fuera de
ellas.
Dejar fuera del laboratorio artculos personales.
Mantener cerrada la puerta del laboratorio.
Limpiar y desinfectar la mesa de trabajo antes y despus de procesar muestras.
Lavarse las manos antes y despus de trabajar.
No hablar, toser o estornudar durante la inoculacin y el sembrado de las muestras.
Evitar pipetear directamente con la boca (usar bulbo de seguridad).
Mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara.

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ANEXO 2. INTERPRETACIN Y RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUMICAS
Cuadro 1. INTERPRETACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS
MIO PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Movilidad
Medio turbio,
crecimiento en todo
el medio
Crecimiento slo a lo
largo de la picadura
Prpura de bromocresol

pH neutro = morado
pH alcalino = K = prpura =
descarboxilacin positiva
pH cido = amarillo =
descarboxilacin negativa
Produccin de indol
El reactivo de Ehrlich
o Kovac toma una
coloracin roja
No cambia la
coloracin del
reactivo
Descarboxilacin de
ornitina
Color prpura en el
fondo del medio
Color amarillo en el
fondo del medio
TSI PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Fermentacin de
glucosa
Fondo del medio
amarillo (A)
Fondo del medio sin
cambio
Rojo de fenol
pH neutro = naranja
pH alcalino = K = rojo
pH cido = A = amarillo
Fermentacin de
lactosa y sacarosa
Inclinacin del
medio amarillo (A)
Inclinacin del
medio roja (K)
Produccin de gas
Burbujas o
rompimiento del
medio
Sin formacin de
burbujas ni ruptura
del medio
Gas = producto de la
fermentacin de la glucosa
Produccin de H2S
Precipitado negro en
el fondo o en todo el
medio
Sin precipitado
negro
H2S = reaccin enzimtica con el
tiosulfito de sodio y citrato frrico
para formar un precipitado negro
LIA PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Descarboxilacin de
lisina
Fondo del medio
color prpura
Fondo del medio
color amarillo
Prpura de bromocresol
pH neutro = morado
pH alcalino = K = prpura =
descarboxilacin positiva
pH = cido = A = amarillo =
descarboxilacin negativa
Desaminacin de
lisina
Inclinacin del
medio color rojo o
vino
Inclinacin del
medio color morado
Prpura de bromocresol
pH neutro = morado
pH alcalino= R = rojo =
desaminacin positiva
pH cido = A = amarillo =
desaminacin negativa
Produccin de gas
Burbujas o
rompimiento del
medio
Ausencia de
burbujas o
rompimiento del
medio
Gas = producto de la
fermentacin de la glucosa

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Cuadro 1. INTERPRETACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS (CONTINUACIN)
Produccin de H2S
Precipitado negro
en el fondo o en
todo el medio
Ausencia de
precipitado en el
fondo o en todo el
medio

Caldo Arginina PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Descarboxilacin de
la arginina
Color del medio
prpura
Color del medio
amarillo
Prpura de bromocresol
pH = neutro = mbar
pH = alcalino = prpura =
descarboxilacin (+)
pH = cido = amarillo
Caldo peptonado PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Produccin de indol
El reactivo toma una
coloracin roja
No cambia la
coloracin del
reactivo

Oxidasa
Color azul en la tira
reactiva
Ausencia de
coloracin
Presencia de la enzima citocromo
oxidasa
UREA DE
CHRISTENSEN
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Hidrlisis de la urea
Inclinacin del
medio
color rosa
Inclinacin del
medio
sin cambio de color
o
amarillo
Rojo de fenol
pH neutro = amarillo o
ligeramente rosa
pH alcalino = rosa = hidrlisis de
la urea positiva
pH cido = amarillo o sin cambio
= hidrlisis de la urea negativa
CITRATO DE
SIMMONS
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Utilizacin del citrato
como nica fuente
de carbono
Inclinacin del
medio
color azul
Inclinacin del
medio
color verde
Azul de bromotimol
pH neutro = verde
pH alcalino = azul = utilizacin
del citrato como nica fuente de
carbono
CALDO SORBITOL PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Fermentacin del
sorbitol
Color amarillo
Color rojo o sin
cambio
Rojo de fenol
pH neutro = anaranjado
pH cido = amarillo
pH alcalino = anaranjado

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Cuadro 1. INTERPRETACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS (CONTINUACIN)
CALDO MUCATO PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Utilizacin del
mucato
Color amarillo Sin cambio o verdoso
Azul de bromotimol
pH neutro = azul menta
pH cido = amarillo
pH alcalino = azul menta verdoso
CALDO
MALONATO
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA INDICADOR DE pH
Utilizacin del
malonato
Azul Verde Azul de bromocresol

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Cuadro 2. IDENTIFICACIN DE DIFERENTES ESPECIES DEL GNERO VIBRIO
MICROORGANISMO COLONIA TSI LIA M I O
CALDO
PEPTONADO
ARGININA
ROJO
DE
METILO
V.P OXIDASA
CALDO NUTRITIVO CON NaCl (%)
GAS
0 1 3 6 8 10 12
Vibrio cholerae Amarilla A (K)/A K/K + + + + - +/- + + + + + V - - - -
Vibrio alginolyticus Amarilla A/A K/K + +/- V + - + +/- + - + + + + +/- -/+ -
Vibrio charchariae A (K)/A K/K - + - + - V + + - + + + - - - -
Vibrio cincinnatiensis Amarilla A (K)/A K/K (A) + - - + - + + + - + + + +/- - - -
Vibrio damsella ** Amarilla K/A K/K (A) -/+ - - + + + + + - + + + - - - -
Vibrio fluvialis Amarilla A/A K/A + -/+ - + + - + + - + + + +/- - - -
Vibrio furnissi Amarilla A (K)/A K/A + -/+ - -/+ + - + + - + + + +/- - - +
Vibrio hollisae Verde K/A K/A
+ (7
das)
+ - + - - - + - + + + - - - -
Vibrio metschnikovii Amarilla A/A K/A + -/+ - + +/- + + - - + + + V - - -
Vibrio mimicus Verde A (K)/A K/K + + + + - - + + + + + V - - - -
Vibrio parahaemolyticus * Azul-verde K/A K/K + + + + - - + + - + + + + - - -
Vibrio vulnificus Azul-verde A (K)/A K/K + + V + - - + + - + + +/- - - - -
* : Ureasa positivo
- : 0 a 10 % de positividad
-/+ : 11 a 39 % de positividad
V : 40 a 60 % de positividad
+/- : 61 a 90 % de positividad
+ : 91 a 100 % de positividad
Fuente: Giono Cerezo S, Escobar Gutirrez A, Valdespino Gmez JS, Diagnstico de Laboratorio de Infecciones Gastrointestinales,
1994. InDRE, SSA, pp 310-315, Zinsser, Microbiologa, 1998, 20 edicin, Edit. Panamericana, pp 771 A

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Cuadro 3. RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUMICAS DE ENTEROBACTERIAS QUE DAN PRUEBA
DE INDOL NEGATIVA
MICROORGANISMO CITRATO UREA LIA H2S TSI M I O MUCATO SORBITOL
Salmonella spp +(95) -(99) K/K(98) +(95) K/A(99) +(95) -(99) +(97) +(90) +(95)
Shigella spp
A,B,C,D
-(100)
-(100)
-(100)
-(100)
K/A(100)
K/A(100)
-(100)
-(100)
K/A(100)
K/A(98)
-(100)
-(100)
-(50)
-(100)
-(99)
+(98)
-(100)
-(90)
-(70)
-(98)
Citrobacter freundii +(78) -(56) K/A(100) +(78) K/A(78) +(89) -(77) -(100) +(100) +(100)
Proteus mirabilis +(65) +(98) R/A(100) +(98) K/A(98) +(95) -(98) +(99) -(100) -(100)
Proteus vulgaris -(85) +(95) R/A(100) +(95) K/A(98) +(95) +(98) -(100) -(100) -(100)
Klebsiella pneumoniae +(98) +(95) K/K(98) -(100) A/A(98) -(100) -(100) -(100) +(90) +(99)
Klebsiella
rhinoscleromatis
-(100) -(100) K/A(100) -(100) K/A(100) -(100) -(100) -(100) -(100) +(100)
Enterobacter aerogenes +(95) -(98) K/K(98) -(100) A/A(95) +(97) -(100) +(98) +(90) +(100)
Enterobacter cloacae +(100) +(65) K/A(100) -(100) A/A(93) +(95) -(100) +(96) +(75) +(95)
Enterobacter sakasakii +(99) -(99) K/A(100) -(100) A/A(99) +(96) -(88) +(91) -(99) -(100)
Pantoea agglomerans +(50) -(80) K/A(100) -(100) K/A(60) +(85) -(80) -(100) -(60) -(70)
Serratia marcescens +(98) -(85) K/K(99) -(100) K/A(98) +(97) -(99) +(99) -(100) +(99)
Providencia heimbachae -(100) -(100) R/A -(100) K/A(100) -(54) -(100) -(100) -(100) -(100)
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Cuadro 4 RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUMICAS DE ENTEROBACTERIAS QUE DAN PRUEBA DE
INDOL POSITIVA
MICROORGANISMO CITRATO UREA LIA H2S TSI M I O MUCATO SORBITOL
E. coli -(99) -(99) K/K (90) -(99) A/A (95) +(95) +(98) +(65) +(95) +(94)
E. coli (inactiva) -(99) -(99) K/A (60) -(99) K/A(75) -(95) +(80) -(80) -(70) -(75)
Klebsiella oxytoca +(95) +(90) K/K(99) -(100) A/A(100) -(100) +(99) -(100) +(93) +(99)
Citrobacter diversus +(99) +(75) K/A(100) -(100) K/A o A/A
(50)
+(95) +(99) +(99) +(95) +(99)
Citrobacter
amalonaticus
+(95) +(85) K/A(100) -(95) K/A(65) +(95) +(100) +(95) +(96) +(99)
Morganella
morganii
Morganella
morganii biogrupo 1
-(100)

-(100)
+(95)

+(100)
R/A(99)

K/K(100)
-(80)

-(85)
K/A(99)

K/A(100)
+(95)

-(100)
+(95)

+(100)
+(95)

+(80)
-(100)

-(100)
-(100)

-(100)
Edwarsiella tarda

Edwarsiella tarda
-(99)

-(100)
-(100)

-(100)
K/K(100)

K/K(100)
+(100)

-(100)
K/A(100)

K/A(100)
+(98)

+(100)
+(99)

+(99)
+(100)

+(100)
-(100)

-(100)
-(100)

-(100)
Hafnia alvei -(100) -(96) K/K(100) -(100) K/A(95) +(85) -(100) +(98) -(100) -(100)
Providencia rettgeri +(95) +(98) R/A -(100) K/A(95) +(94) +(99) -(100) -(100) -(99)
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Cuadro 5. Diferenciacin de Salmonella atpica
CARACTERSTICA Salmonella
typhi
Salmonella
paratyphi A
Salmonella
sp
Salmonella
arizona
Salmonella
choleraesuis
Movilidad + + + + +
Produccin de indol - - - - -
Descarboxilacin de la
ornitina
- + + + +
Fermentacin de la
glucosa
+ + + + +
Fermentacin de
sacarosa
- - - - -
Fermentacin de
lactosa
- - - - -
Produccin de gas - + + + ( - ) +
Produccin de H2S +* - + + ( - ) +/-
Descarboxilacin de la
lisina
+ - + + +
Uso del malonato - - - + -
Utilizacin de citrato - - + + -
Hidrlisis de la urea - - - - -
Caldo mucato - - + ( - ) + ( - ) -
Caldo sorbitol + + + + +
+ :Reaccin positiva
- :Reaccin negativa
( - ):Reaccin ocasionalmente negativa
+/- reaccin al 50 %
* se produce en poca cantidad

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ANEXO 3. RESULTADO DE PRUEBAS DE AGLUTINACIN
Cuadro 6. Prueba de aglutinacin en portaobjetos
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA CONTROL NEGATIVO
Formacin de grumos Suspensin homognea Suspensin homognea


Cuadro 7. Lista de antisueros para la prueba de aglutinacin flagelar de Salmonella en tubo
Grupo somtico Antisuero flagelar
O:2 (A) a, g, m, p, v, 5
O:4 (B) f, g, s, h, r, i, 2, v, m, t, 7, z4, z23, b, 5, d, enx, x, z15
O:7 (C1 ) b, g, m, s, t, r, w, 5, z10, d, h, k, z29, enx, x, z15
O:8 (C2 ) d, h, r, 2, z4, z24, k, 5, enx, z10, i, z6,
O:9 (D1 ) g, d, m, v, q, s, t, 5, 2, p, z28
O:3,10 (E1-E3 ) h, v, 5, 6, 7, w, z10, z6, r, y
O:3,19 (E4 ) g, s, t, i, 2
O:11 (F) a, r, 5, enx, z28, z13, x, z15, z29
O:13,22 (G1 ) z, 6
O:13,23 (G2 ) f, g, z, w, b, 5, 6, s
O:6,14 (H) 7, d, y
O:16 (I) c, 5, y
O:17 (J) d, 5
O:18 (K) z23, z4
O:21 (L) b, enx, y
O:28 (M) 7, y
O:30 (N) b, enx
O: 35 (O) f, g, z4, z23
O:40 b, enx, x, z15
O:44 7, c, z10, enx, x, z15
O:47 i, enx, x, z15


Cuadro 8. Prueba de aglutinacin en tubo
PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA CONTROL NEGATIVO
Formacin de grumos Suspensin homognea Suspensin homognea

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Cuadro 9. DETERMINACIN DE ANTGENOS SOMTICOS DE VIBRIO CHOLERAE
POR AGLUTINACIN EN PORTAOBJETOS
Control
negativo
Poliv O1
O1
Inaba
O1 Ogawa O:139
Interpretacin del resultado
- + + - - V. cholerae O1 Inaba
- + - + - V. cholerae O1 Ogawa
- - - - - V. cholerae No O1 Neg a
O:139
- - - - + V. cholerae No O1 Pos a O:139
+ + + + + V. cholerae No O1 Neg a
O:139
- + - - - V. cholerae No O1 Neg a
O:139
- - + - - V. cholerae No O1 Neg a
O:139
- + +
dbil
+ - V. cholerae O1 Ogawa