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B A

S E
Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2003 7 (34), 177182
1. INTRODUCTION
Lolivier constitue dans la plupart des pays du bassin
mditerranen la principale essence fruitire, tant par
le nombre darbres cultivs que par limportance
sociale et conomique de sa culture et son rle
environnemental. Lolivier est multipli commerciale-
ment essentiellement par bouturage semi-ligneux
(Abousalim et al., 1993). La multiplication de lolivier
a peu peu intgr les techniques de culture in vitro
principalement le microbouturage. Cette technologie
fraie de nouveaux chemins pour la production en
masse de matriel slectionn. Elle ne se limite pas au
seul coefficient de rapidit de la multiplication, mais il
sest avr que les plantes autoracines in vitro sont
plus vigoureuses et plus rsistantes aux maladies
(Cimato, 1999). Ainsi, pour maintenir lintgrit
gntique des clones, la mise en culture des
microboutures, puis la stimulation des bourg e o n s
axillaires et leur prolifration constituent la mthode la
plus gnralement applique en micropropagation des
ligneux (Walali Loudiyi, 1993).
La russite du microbouturage via la culture in
vitro, est influence par plusieurs facteurs, dont la
Effet du milieu de culture sur le microbouturage de
lolivier (Olea europeae L.) cv. Picholine Marocaine
Najiba Brhadda
(1)
, Abdelhadi Abousalim
(2)
, Dou ElmacaneWalali Loudiyi
(2)
,
Doha Benali
(1)
(1)
Laboratoire de Physiologie vgtale. Dpartement de Biologie. Facult des Sciences. Universit Ibn Tofail. Kenitra
(Maroc). E-mail : brhadda@hotmail.com
(2)
Dpartement dHorticulture. Institut agronomique et vtrinaire Hassan II. B.P. 6202, Madinat Al Irfane (10101). Rabat
(Maroc).
Reu le 3 juin 2003, accept le 29 septembre 2003
En vue dtudier la prolifration in vitro de pousses du cultivar dolivier Picholine Marocaine, issues de matriel g de
30ans, cinq milieux de culture ont t prouvs: le milieu de base OM (Milieu dOlivier), 1/2 MS (Murashige et Skoog dont
les macrolments ont t rduits de moiti), WPM (Lloyd et McCown), 1/2 Miller (Miller dont les macrolments ont t
rduits de moiti) et K&H (milieu compos des macrolments de Knop et des microlments de Heller), additionns de la
Zatine 5mg/l. Les milieux OM et 1/2MS se sont montrs plus ractifs au dbut de la phase de prolifration avec
respectivement 91,6% et 90,9%. Les pourcentages les plus levs de nouvelles pousses par explant ont t obtenus dans les
milieux 1/2 MS et OM (67 et 65% respectivement). Mais le milieu OM sest distingu par la suite, dune part en favorisant
une meilleure croissance des pousses (12,4mm) suivi par le milieu 1/2MS (8,9mm) et, dautre part, du fait quil na pas
induit de vitrification. Lutilisation des autres milieux tests a t associe un dveloppement important de cals et
lapparition de chlorose, et la rduction de la croissance des pousses a t notable.
Mots-cls. Olivier, Olea europeae L., micropropagation, milieu de culture, culture in vitro.
Effect of culture medium on micropropagation of olive (Olea europeae L.) cv. Moroccan Picholine. The effect of the
basal media OM (Olive Medium), 1/2 MS (Murashige et Skoog with half strength macronutrients), WPM (Lloyd and
McCown), 1/2 Miller (Miller with half strength macronutrients), and K&H (medium with Knop macronutrients and Heller
micronutrients), supplemented with 5mg/l Zeatine, on shoot proliferation of mature Moroccan Picholinecultivar (30years
old) was investigated. OM and 1/2 MS media were the most effective at the early stages of proliferation. A microcutting
percentage of up to 91,6 and 90,9% were achieved in OM and 1/2 MS media respectively but OM was distinguished later
by permitting a better shoot growth with no vitrification symptoms The highest percentages of new shoots per explant were
obtained with 1/2 MS and OM media (67 and 65% respectively). OM was the most effective for shoot height (12,42mm)
followed by 1/2 MS (8,92mm). The other tested media induced an important callus development and leaf chlorosis, and the
reduction of shoot growth was noticeable.
Keywords. Olive, Olea europaea L., micropropagation, culture medium, in vitro culture.
composition minrale (Rugini, 1984; Berenguer,
Gonzalez, 1989; Bartolini et al., 1989; Leva et al.,
1992) et hormonale (Leva et al., 1992, Mencuccini,
1995; Rama, Pontikis, 1990) des milieux de culture,
le gnotype (Rugini, 1984; Leva et al., 1992 ) et lge
de lexplant (Porlingis, Therios, 1976; Rugini, 1986).
Les quelques travaux achevs sur le microboutu-
rage de lolivier ont abouti la rgnration des
plantes seulement chez certains cultivars, notamment
Dolce agogia (Rugini, Fontanazza, 1981) ;
Frantoio, Dolce agogia et Moraiolo (Rugini,
1984) ; Maurino (Leva et al., 1992) et rcemment
Chondrolia chalkidikis (Grigoriadou et al., 2002).
Diverses compositions minrales ont t utilises pour
la micropropagation de ces divers cultivars dolivier et
les formulations retenues semblent varier selon le
gnotype utilis. Les tudes effectues chez le cultivar
Picholine Marocaine, qui reprsente prs de 98%
des plantations olicoles au Maroc, ont surtout
concern le microbouturage du matriel juvnile
(Walali Loudiyi, 1989), avec ltude des effets des
diffrentes cytokinines (Brhadda et al., 2002) et des
diffrentes auxines (Walali Loudiyi et al., 1999). Chez
ce cultivar, les facteurs contrlant la germination in
vitro des embryons zygotiques ont t galement
tudis (Brhadda e t a l ., 2000) ainsi que ceux
permettant dobtenir lembryogense somatique
(Brhadda et al., 2003). Ce dernier travail a dailleurs
mis en vidence leffet du milieu de culture et a
montr la supriorit du milieu MS par rapport
dautres formulations testes. La micropropagation du
matriel adulte reste encore difficile et dautres
travaux simposent pour mettre au point un processus
de microbouturage adquat. Dans ce travail, leffet de
la composition minrale du milieu de culture sur la
prolifration de matriel adulte de la Picholine
Marocaine a t tudi.
2. MATRIELET MTHODES
2.1. Matriel vgtal utilis et mthode de
dsinfection
Les explants utiliss proviennent de la Picholine
Marocaine, varit double fin et reprsentant prs
de 98% des plantations dolivier au Maroc. Les
pousses ont t prleves partir de matriel adulte
provenant darbres gs de 30ans.
Les pieds-mres dolivier ont t traits avec le
cryptanol la concentration de 10g/l, et ce 15jours
avant le prlvement des pousses. Ces dernires ont
ensuite t essuyes avec du coton imbib de Tween
20 et laves, pendant quelques minutes sous leau
courante. Les microboutures ont enfin t trempes
pendant 3minutes dans le chlorure de mercure
(HgCl
2
) 677mg/l contenant 2 3gouttes de Tween
20, avant dtre rinces abondamment leau distille
strile.
Aprs la phase dtablissement, les microboutures
ont t mises en culture dans un milieu de prolifration
additionn de 5mg/l de Zatine (Sigma) et de 30g/l
de saccharose. Les milieux tests sont: le milieu de
base de lolivier OM (Rugini, 1984), 1/2 M S
(Murashige et Skoog, 1962; dont les macrolments
ont t rduits de moiti), WPM (Lloyd et Mc Cown,
1981), 1/2 Miller (Miller, 1967 ; dont les
macrolments ont t rduits de moiti) et enfin le
milieu K&H compos des macrolments de Knop
(1965, cit par George et Sherrington, 1984) et des
microlments de Heller (1953). Les milieux de
culture ont t solidifis par lagar (Bactriologique,
Difco) 0,8%. Lautoclavage a lieu pendant 20
minutes 121C aprs ajustement du pH 5,8 avec le
HCl ou le NaOH (0,1N). Les milieux de culture ont t
rpartis dans des tubes essai (2,5 15cm) raison
de 15ml par tube.
Aprs 20 jours de culture, les microboutures ont
t transfres dans des milieux frais dpourvus de
rgulateurs de croissance et ceci dans loptique de
favoriser lallongement des pousses. Lincubation a
lieu 252C, sous une photopriode de 16heures.
2.2. Analyses statistiques
Un dispositif compltement alatoire a t adopt et
36explants ont t utiliss par traitement. Le test de
Newman et Keuls (Dagnelie, 1980) au seuil de 5% a
t utilis pour le classement des moyennes. Les
pourcentages 0 et 100 ont subi, respectivement, la
transformation (1/4n) et (1-1/4n), n tant le nombre
dexplants mis en culture; les pourcentages ont subi la
transformation arc sin avant de procder
lanalyse de variance.
3. RSULTATS
3.1. Effet du milieu de culture sur le
dbourrement
Les rsultats obtenus ont montr des ractions trs
diffrentes du comportement des explants suivant les
milieux de prolifration utiliss. Ceux-ci ont
significativement (P0,001) affect le dbourrement
des bourgeons axillaires. En effet, pour lentre en
activit des bourgeons axillaires, les milieux OM et
1/2 MS se sont montrs globalement les plus ractifs
avec, respectivement, 92 et 91% de dbourrement. La
diffrence avec les autres milieux tests (1/2 Miller,
WPM et Knop-Heller) est trs hautement significative.
En effet, sur ces derniers, les pourcentages de
dbourrement observs des bourgeons axillaires sont
P
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Effet du milieu de culture sur le microbouturage de lolivier 179
seulement de 67 50 et 33% respectivement. Concer-
nant la vitesse de dbourrement, on constate que le
nombre de bourgeons dbourrs a t de 10% pour le
milieu OM aprs une semaine de culture et ce nest
quaprs 15jours de culture que le dbourrement a t
important pour les deux milieux OM et 1/2 MS. Dans
le cas des autres milieux, lactivit des bourgeons na
t apprciable qu partir de la quatrime semaine de
culture. Il est signaler aussi que seuls les explants
mis en culture sur les milieux OM et 1/2 Miller ont
prsent un feuillage verdtre dun aspect
morphologique tout fait conforme celui de la
plante mre. Les milieux Knop-Heller et WPM ont
cependant induit le dveloppement de feuilles
chlorotiques, avec un feuillage de taille rduite dans le
cas dutilisation du milieu WPM. Les symptmes de
vitrification ont galement t observs dans le cas du
milieu 1/2 MS.
Concernant la formation des cals au niveau des
parties basales des microboutures, les dveloppements
les plus importants ont t obtenus dans le milieu
Knop-Heller suivi des milieux 1/2 Miller et WPM.
3.2. Effet de la composition du milieu de culture
sur le pourcentage et lallongement des pousses
Le nombre de pousses formes a significativement
(P 0,001) t affect par le milieu de culture. Le
pourcentage le plus lev a t obtenu dans les milieux
1/2 MS et OM (67 et 65%, respectivement) et sont
suivis par les milieux 1/2 Miller (42%), Knop-Heller
(36%) et par WPM (25%).
Le milieu de culture a aussi affect significati-
vement (P 0,001) la longueur des pousses et ce aprs
deux subcultures successives (Tableau 1). OM, ayant
permis la production de pousses de 12,4mm de long,
sest distingu des autres milieux tests et est suivi par
1/2 MS (8,9mm). Il est noter que lutilisation du
milieu 1/2 MS a t accompagne de lapparition de
symptmes de vitrification ayant atteint un niveau de
30%.
4. DISCUSSION ET CONCLUSION
La composition du milieu de mise en culture joue un
rle trs important dans lorganogense. Leffet dun
milieu de culture rsulte de lensemble des
interactions des diffrents lments qui le composent.
Certains dentre eux stimulent les processus du
dveloppement in vitro, dautres par contre ont peu
dinfluence sur le dbourrement (Thorpe, 1980;
Rugini, 1986; Rugini, Caricato, 1995; Grigoriadou
et al., 2002; Brhadda et al., 2003).
Les milieux OM et 1/2 MS ont permis dobtenir les
meilleurs pourcentages de dbourrement chez les
microboutures de matriel adulte du cv. Picholine
Marocaine. Ce rsultat confirme celui obtenu chez le
matriel juvnile (souquets)
1
du mme cultivar (Walali
Loudiyi, 1989). Lutilisation des autres milieux tests
(WPM, 1/2 Miller et K&H) a t associe un
dveloppement important de cals, lapparition de
chlorose et une rduction de la croissance des
pousses. Rugini (1984) a fait des observations
similaires dans le cas de certains milieux, notamment
WH (Wite,1963), LM (Litvay et al., 1981) et Knop
(1965, cit par George et Sherrington, 1984) ayant
manifest une faible prolifration.
Les milieux tests diffrent essentiellement par la
teneur en azote total et en nitrates. Les milieux 1/2 MS
et OM se distinguent des autres milieux tests par
leurs teneurs leves en azote total (30 et 26, 24 mq/l)
et en nitrates (19,7 et 21,1 mq/l, respectivement).
Leffet stimulateur de lazote dans le phnomne
dorganogense a t signal chez lolivier (Rugini,
1988; Brhadda et al., 2003) et chez plusieurs autres
espces telles que le mas (Miao, 1980) et le bl (Feng,
Ouyang, 1988). Caboche (1987) a voqu le rle trs
important du rapport azote/hydrates de carbone dans
le contrle de la biosynthse des rgulateurs de
croissance dans les tissus indiffrencis chez
Nicotiana plumbaginifolia (Viviani) et a signal que
les nitrates assurent dautres fonctions encore
inconnues dans la morphogense.
Il a aussi t rapport quun dficit de croissance in
v i t ro dans un milieu dilu peut tre corrig par
1
Les souquets sont des protubrances ligneuses formes
spontanment au niveau du tronc de larbre, sa base ou dans le sol.
Aprs leur dissection au moyen dune scie, les souquets, dsinfects et
mis en culture dans des bacs garnis de vermiculite maintenue humide,
peuvent donner des petits bourgeons donnant naissance des pousses
dolivier qui peuvent servir de matriel de dpart pour la culture in
vitro.
Tableau 1. Effet du milieu de culture sur le pourcentage des
pousses nouvellement formes et sur la longueur aprs deux
subcultures. Les pourcentages suivis par la mme lettre ne
sont pas significativement diffrents selon la mthode de
Newman et Keuls au seuil de 5%.Effect of the culture
medium on the number of new shoots (%) and on their
length, after 2 subcultures. The percentage marked with the
same letter are not significantly different.
Type de OM 1/2 1/2 WPM Knop-
morphogense MS Miller Heller
Pousses (%) 65 a 67 a 42 b 25 d 36 c
Pousses,
longueur (mm) 12,42 a 8,92 b 5,57 b 3 d 3,31 d
OM =Rugini (1984) ; 1/2 MS=Murashige et Skoog (1962) ;
1/2Miller =Miller (1967) ; WPM =Lloyd et Mc Cown (1981) ;
K n o p - H e l l e r =milieu compos des macrolments de Knop
(1965) et des microlments de Heller (1953).
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laugmentation de la concentration du milieu en
NH
4
NO
3
(McCown, Sellmer, 1987). Par ailleurs, dans
le milieu 1/2 MS, on a constat que certaines plantules
prsentent une vitrification. Zryd (1988) affirme que la
plupart des cas de vitrification des plantules de Pcher
(P ru n u s sp.) sont constats dans le milieu de
Murashige et Skoog (1962) qui est particulirement
riche en nitrate dammonium. De mme, Beauchesne
(1981) a constat que les microboutures de Salix
babylonica (Linn) mises en culture sur le milieu MS
montrent une hypolignification. Selon cet auteur, cet
aspect pathologique pourrait tre d la forte
concentration en ammonium. Gaspar et al. (1987)
indiquent que les plantes vitrifies prsentent une
lignification dficiente, et quune carence en lignine
et en cellulose pourrait rsulter de la diminution du
rapport hydrates de carbone/azote d lexcs
dazote. Ces auteurs ajoutent que les peroxydases
basiques des plantes vitreuses montrent une
augmentation dactivit ce qui indiquerait une baisse
du niveau auxinique endogne. Si lon considre que
lauxine est un lment cl de la diff r e n c i a t i o n
cellulaire, cette diminution du taux en a u x i n e
endogne pourrait expliquer lhypolignification des
plantes vitreuses (Philips, 1980).
Aussi le milieu OM est caractris par la prsence
des teneurs les plus leves en ions K
+
, Ca
++
et Mg
++
( 2 0 , 0 8; 11,06 et 12,17 mq/l respectivement)
comparativement aux autres milieux tests. Leffet
bnfique de K
+
et Ca
++
sur lorganogense a t
signal par certains auteurs (David e t a l ., 1978;
Bornman, 1983). Margara (1978) fait remarquer quun
milieu trs riche en potassium est favorable la
production de bourgeons chez la betterave et la
production des inflorescences chez lendive et le chou-
fleur. De mme, Alskief (1978) rapporte que le milieu
de Miller riche en potassium, calcium et ammonuim
favorise le dveloppement des bourgeons sur les
microboutures de Citrange troyer.
En comparant leffet de quatre milieux diffrents
sur les explants un nud chez Picea abies (L. Karst.)
Bornman (1983) a trouv que la faible concentration
de Ca
++
dans le milieu LM (20 fois infrieure celle
du milieu MS) explique pourquoi le milieu LM
(Litvay et al., 1981) est le moins efficace dans la
morphogense. Cet lment joue un rle important
dans la stimulation de lactivit mristmatique de la
partie apicale de la pousse nouvellement forme
(Bornman, 1983).
Les milieux 1/2 MS et OM sont aussi caractriss
par les concentrations les plus leves en manganse
(99,97M) et le milieu OM est le plus riche en zinc et
bore (49,72 et 200,51M, respectivement). Ces ions
Mn, Zn et Bo pourraient aussi tre impliqus dans
lamlioration du microbouturage de la Picholine
Marocaine. Margara (1978) a signal que lemploi
dune solution enrichie en Mn, Zn et Bo est
gnralement trs favorable lorganogense. Un
niveau relativement plus lev de bore a induit un
accroissement linaire du nombre de nuds chez
lolivier (Briccoli, Lambardo, 1988) .
En analysant les lments minraux dans les
bourgeons apicaux et les embryons dolivier, Rugini
(1984) a trouv dimportantes quantits de Ca, S, Cu
et Zn. Bas sur ces donnes, le milieu OM a t
dvelopp. Ce milieu a permis une prolifration des
bourgeons axillaires issus dun nud aprs seulement
une semaine. Le taux de multiplication a t 9
10fois plus important aprs 40jours chez les cultivars
Dolce agogia, Moraiolo et Frantoio. Lide de
Rugini (1984) a t partage par McCown et Sellmer
(1987) qui ont signal que des corrlations existeraient
entre les exigences, les conditions de culture de la
plante in vivo et les besoins nutritifs de ses tissus en
culture in vitro.
Le milieu OM a t plus bnfique que le milieu
MS pour le microbouturage de lolivier cv Picual
(Berenguer, Gonzalez, 1989). Par ailleurs, Bartolini
et al. (1989) ont trouv que cest le milieu MS qui est
plus bnfique que OM pour la multiplication du
cultivar Maurino. Chez le cultivar Chalkidikis,
Grigoriadou et al. (2002) ont montr que le milieu
WPM a permis une meilleure prolifration des pousses
comparativement au milieu OM. Ces rsultats
indiquent que le facteur gntique est dterminant
dans le choix du milieu de culture utiliser, ce qui
ncessite ladaptation de la composition minrale du
milieu au cultivar multiplier. Cette diffrence serait
lie des exigences nutritionnelles variables selon le
gnotype.
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