TINCIONES DIFERENCIALES USADAS EN MICROBIOLOGA CLNICA.

Juan Antonio Araya Pastn, Rodrigo Nicols Errzuriz Guines, Katherina

Constanza Jara Olivares



Resumen

Para el estudio de las distintas clases de bacterias se utiliza la tincin
diferencial que como su nombre indica permite la diferenciacin de los distintos
tipos de bacterias para su posterior clasificacin, esto se realiza por medio de la
utilizacin de colorantes especficos que actan segn las propiedades tintoriales
de las bacterias modificando los contrastes entre las estructuras de la clula y el
medio que la rodea. Las tinciones ms comunes son la tincin simple, tincin
diferencial Gram y tincin diferencial de esporas, para estas tinciones se utilizan
colorantes que pueden ser de tipo cidos o bsicos y se aplican segn el tipo de
bacteria a estudiar.


Abstract
For the study of several types of bacteria is used the differential
staining as the name suggests allows differentiation of different types of
bacteria for subsequent classification, this is accomplished through the use
of specific dyes that act as the staining properties of changing the contrast
between structures of the cell and the medium surrounding the bacteria. The
most common stains are simple staining, differential Gram staining and
differential spore staining for these dyes can be acidic or basic type and are
applied according to the type of bacteria used to study.


Introduccin

Las tinciones diferenciales se utilizan
para obtener informacin acerca de la
composicin de las capas de la pared
celular de las clulas bacterianas. En
este proceso. Las clulas
generalmente son tratadas para
coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fijacin.
Para bacterias, la fijacin por el calor
es lo ms corriente, aunque tambin
puede fijarse con sustancias qumicas
como formaldehido, cidos y
alcoholes. Despus de la fijacin, si
se aade el colorante, no se
producen ulteriores cambios
estructurales en el protoplasma. La
fijacin se realiza habitualmente en
clulas que han sido fijadas sobre un
portaobjetos, tratando despus ste
con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin.

Tinciones en microbiologa
Las caractersticas
morfolgicas de los microorganismos
se pueden observar utilizando
especmenes vivos o muertos
(fijados). Sin embargo, el estudio
microscpico de clulas vivas es
limitado ya que en general slo se
detectan configuraciones de contorno
y estructurales de las clulas por
medio del microscopio ptico de
campo claro.
Las preparaciones teidas de clulas
fijas permiten:
- realizar un examen ms
detallado de las clulas.
- observar los componentes
internos celulares.
- lograr una diferenciacin de
especies microbianas.

Tipos de colorantes
Las sustancias qumicas que
se usan comnmente para teir
microorganismos, se conocen con el
nombre de colorantes y stos pueden
ser de tipo cido o bsico.

cidos:
Tien los componentes
citoplsmaticos celulares que poseen
una naturaleza ms alcalina.
Por ejemplo: fucsina cida y
eosina.
Bsicos:
Se combinan con los
elementos celulares que tienen una
naturaleza cida.
Por ejemplo: violeta cristal,
azul de metileno y la safranina.

La observacin de
microorganismos se realiza
preparando un frotis (muestra), se
extiende una porcin de crecimiento
en una monocapa, que ser secada y
a veces fijada, que se llevar al
microscopio.

Preparacin de un frotis:

1.- Limpiar un portaobjetos aplicando
la llama de un mechero a una de las
superficies, colocarlo sobre la mesa
con el lado tratado hacia arriba.
2.- Tomar el asa de inoculacin con el
dedo pulgar y el ndice, al igual como
si fuese un lpiz.
3.- Insertar el asa de inocular en un
ngulo de 45 a 60 dentro del cono de
la llama del mechero y calentar al rojo
la parte de alambre del asa.
4.- Tomar un tubo de cultivo con la
mano libre, quitar el tapn de algodn
o tapa con los dedos de la mano que
sujeta el asa de inocular (con el dedo
meique).
5.- Calentar el borde del tubo
hacindolo pasar por el cono superior
de la llama (esterilizar la boca del
tubo evita contaminacin de la
muestra).
6.- Insertar el asa esterilizada dentro
del cultivo y extraer una porcin del
caldo (es probable que escuche un
chisporroteo al efectuar esta
operacin; pero esto no es
importante).
7.- Colocar esta porcin del cultivo
sobre la superficie del portaobjetos
limpio, flamear el borde del tubo y
volver a taparlo.
8.- Extender el cultivo bacteriano con
el asa para formar una capa delgada
cubriendo una zona de
aproximadamente el tamao de una
moneda pequea, y dejar que el frotis
se seque al aire.
9.- Flamear el asa de inocular.
10- Pasar varias veces el frotis por la
parte caliente del mechero Bunsen.
No calentar en exceso el
portaobjetos (se debe poder tocar el
lado inferior del portaobjetos sin
quemarse, ya sea con el dedo o la
mueca).
11.- Aplicar aproximadamente 5 gotas
de una solucin colorante al frotis y
dejar en reposo la tincin durante 30
a 60 segundos.
12.- Quitar el exceso del colorante
vacindolo y enjuagando con una
corriente suave de agua
13.- Secar el portaobjetos
colocndolo entre trozos de papel
gofrado (absorbente)
14.- Examinar la preparacin bajo el
microscopio.
15.- Repetir el procedimiento anterior
para cada uno de los cultivos y las
soluciones colorantes provistas.

Tipos de tincin

Tincin simple

Las soluciones de tincin
simples se preparan disolviendo un
colorante dado en agua destilada o
alcohol y la solucin se aplica al frotis
y se deja en reposo durante 30 a 60
segundos, generalmente se utilizan
colorantes (principalmente sales)
compuestos por iones cargados, cuya
finalidad es incrementar el contraste
de la muestra en la observacin.
Por lo general, este mtodo
permite al investigador observar las
formas y la distribucin general de las
clulas ya que estructuras tales como
paredes celulares, esporas y
cpsulas pocas veces se tien.
In vitro:
Se utiliza en muestras fijadas,
es decir que mediante determinados
procedimientos se mata a la clula y
sus protenas se desnaturalizan
causando que sta se fije al
portaobjeto.
In vivo:
En muestras de tejidos vivos,
al provocar que determinadas clulas
o estructuras adquieran los colores
de contraste, se puede estudiar su
ubicacin y morfologa mientras estn
desempeando su funcin. El
propsito ms comn es revelar
detalles de la citoestructura que de
otra manera no resultaran evidentes,
sin embargo, la tincin puede revelar
adems donde aparece un
determinado producto qumico o
donde se lleva a cabo una
determinada reaccin qumica dentro
de las clulas o tejidos.
conseguir el efecto deseado, el
colorante usualmente se utiliza en
soluciones muy diluidas que van
entre 1:5.000 a 1:50.000. A pesar de
esto las tinciones son eventualmente
txicas para las clulas y puede
destruirlas.


Tincin diferencial de Gram

La tincin de
Gram o coloracin de Gram es un
tipo de tincin
diferencial empleado para la
visualizacin de bacterias. Debe su
nombre al bacterilogo Christian
Gram, que desarroll la tcnica
en 1884. Se utiliza tanto para poder
referirse a la morfologa celular
bacteriana como para poder realizar
una primera aproximacin a la
diferenciacin bacteriana.
Se utiliza una serie de
elementos para llevarla a cabo, dos
colorantes, una sustancia mordiente
(lugol) y un decolorante
Primero debemos agregar a la
muestra un colorante bsico,
generalmente se utiliza el violeta
cristal, se deja actuar por un minuto,
se lava suavemente y se sigue con
una solucin yodo yodurada de
potasio (lugol) por un minuto,se
vuelve a lavar y se agrega el
decolorante, conocido como alcohol
gram que consiste en una solucin de
alcohol y acetona por 20 segundos,
este paso es de suma importancia
para la dierenciacin, finalmente se
utiliza el segundo colorante como
tincin de contraste, casi siempre se
utiliza un segundo colorante bsico,
la safranina, dejndolo actuar por un
minuto, finalmente se lava, se seca y
se lleva al microscopio.
Ciertos organismo pierden
rpidamente la tincin violeta luego
de agregar el alcohol de gran y son
nuevamente teidos con el segundo
colorante, estos organimos que no
son resistente a la decoloracin se
conocen como Gram negativos y se
obeservan de color rojo o rosado.
Aquellos organismos que son
resistente a la decoloracin
conservan una tonalidad azul o
morada y se conocen como Gram
positivos.
La diferencia en la cantidad de
lpidos en las cubiertas celulares es la
clave respecto al resultado diferencial
del procedimiento. Cuando se agrega
el mordiente (lugol) durante el
procedimiento de tincin de Gram, el
violeta cristal y el Yodo forman
complejos que se encuentran sobre
todo en el interior de la clula. Como
la cubierta celular de las bacterias
Gram positivas tiene una cantidad
hasta cierto punto baja de lpidos,
pero de una pared celular gruesa, el
agente decolorante acetona alcohol
deshidrata la pared celular y atrapa
los complejos en el interior de la
clula. En contraste, la membrana
externa de una bacteria Gram
negativa est formada por lpidos y
lipoprotenas, siendo su pared celular
ms delgada. El decolorante extrae
los lpidos de la membrana exterior
sin ocasionar que la pared forme una
barrera impenetrable. Por lo anterior,
el colorante violeta cristal sale del
interior de la bacteria y sta se tie
posteriormente con el colorante de
contraste safranina para visualizarla.
Es importante llevar a cabo el
proceso con extremo cuidado, ya que
el ndice de decoloracin depende de
varios factores como la concentracin
del alcohol, el espesor del frotis y el
hecho de si ste est hmedo o seco,
por lo tanto un mal procedimiento
puede arrojar falsos resultado.



Tincin diferencial de esporas

Las especies de los gneros
Bacillus y Clostridium tienen la
propiedad de formar endosporas que
son formas de resistencia capaces de
sobrevivir a altas temperaturas y
medios adversos. Se producen
cuando las condiciones ambientales
son desfavorables (agotamiento de
los nutrientes, temperaturas
extremas, radiaciones, compuestos
txicos, etc.), formndose una espora
por cada forma vegetativa. Al finalizar
el proceso de esporognesis, la
clula vegetativa se lisa y libera la
espora al exterior. Cuando el
ambiente es favorable, la espora
germina generando una nueva forma
vegetativa. La capacidad de germinar
perdura durante aos. La formacin
de endosporas es un carcter de gran
importancia en la biologa de un
microorganismo. La pared celular de
la endospora presenta distinto
comportamiento que la membrana
bacteriana frente a la tincin, por lo
que se utilizan tcnicas especiales de
coloracin con verde malaquita o
fucsina bsica (con aplicacin de
calor) como colorantes.

1.- Preparar frotis delgados, secarlos
al aire y fijarlos con calor.
2.- Cubrir los frotis con reactivo de
Verde malaquita durante 1 minuto
calentando en el mechero
3.- Lavar los portaobjetos en una
corriente suave de agua durante
cinco segundos.
4.- Cubrir el frotis con reactivo de
safranina durante 1 minuto.
5.- Lavar como se indic antes y
secar golpeando suavemente el
portaobjetos sobre el papel gofrado,
luego presionar levemente el papel
sobre la muestra sin tallar.
6.- Observar cada frotis bajo la lente
de inmersin.

La posicin y la morfologa de la
endospora en el interior de la bacteria
constituyen un carcter taxonmico
til para diferenciar especies dentro
de un mismo gnero. Por ejemplo,
Bacillus sphaericus posee una
endospora esfrica con localizacin
terminal y deformante de la clula
vegetativa, por lo que suele ser
denominada en palillo de tambor,
Bacillus thuringiensis tiene localizada
la endospora elipsoidal en el centro
de la clula vegetativa, lo que
provoca un abombamiento
caracterstico denominado en huso.

Conclusiones

Aunque las bacterias no aparecen
muy diferentes del medio que las
rodea, difieren mucho qumicamente
esta diferencia qumica es lo que
permite distinguir las bacterias por
tincin, pues generalmente, el
colorante reacciona con la clula
bacteriana, pero no reacciona con su
medio exterior.




















Debido a eso la tincin es importante
para la microbiologa debido a que:
- Proporciona contraste entre el
microorganismo y el medio que lo
rodea, permitiendo diferenciar varios
tipos morfolgicos.
- Permite el estudio de las estructuras
internas de la clula bacteriana, tales
como paredes celulares, vacuola o
cuerpos celulares.
- Permite el empleo de mayores
amplificaciones.

Referencias

- Aguilera L, Barraza C, Cea A.
Manual laboratorio de
microbiologa e inmunologa.
Departamento de Biologa, rea
de microbiologa, Facultad de
ciencias, Universidad de La
Serena.