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volumen adecuado, completamente llenos y cerrados hermticamente,
que se iluminaron de forma continua con lmparas de tungsteno para
obtener condiciones saturantes de luz (240 W m
-2
).
Para el anlisis de los transconjugantes, las placas de
microtitulacin se mantuvieron en contenedores anaerbicos con el
sistema GasPak (BBL, USA) que genera una atmsfera de H
2
y CO
2
.
Para el cultivo de E. coli a pequea escala se utilizaron tubos de
ensayo de 15 mL con 3 mL de medio LB, cerrados con tapones
metlicos. Cuando se necesit un mayor volumen de cultivo se utilizaron
frascos Erlenmeyers de volumen adecuado (100 2000 mL) rellenos
slo con un cuarto de su capacidad con medio de cultivo y cerrados con
algodn hidrfobo estril. Los cultivos se mantuvieron a 37 C en
oscuridad con agitacin de 220 rpm en un incubador orbital HT
(Bottmingen). En el caso de los cultivos utilizados para la hiperexpresin
de la protena recombinante NprB, se aadi IPTG 2 mM para inducir la
ANTIBITICO
CONCENTRACIN
EN EL MEDIO
(g mL
-1
)
DISOLVENTE
Ampicilina (Ap) 150 H
2
O
Estreptomicina (Sm) 200 H
2
O
Kanamicina (Km) 25 H
2
O
Cloramfenicol (Cm) 50 CH
3
CH
2
OH
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expresin de dicha protena cuando la absorbancia de los cultivos a 600
nm fue de 0,4 0,6.
Los inculos para los cultivos se prepararon partiendo de
clulas almacenadas en punciones de medio slido PY o de clulas
congeladas a 80 C en medios con un 20% de glicerol.
4. PUREZA Y MANTENIMIENTO DE LOS CULTIVOS
La pureza de los cultivos se sigui rutinariamente extendiendo
con un asa de platino sobre medio slido en una placa de Petri una
pequea cantidad extrada del cultivo en condiciones axnicas. La
conservacin de cepas a corto plazo se hizo a 4
o
C en cultivos en estra
en placas con medios selectivos. La conservacin a largo plazo se hizo
por congelacin a 20
o
C y a 80
o
C de cultivos lquidos con un 20% de
glicerol.
5. OBTENCIN DE EXTRACTOS ACELULARES
Las clulas de E. coli JM109 se recogieron por centrifugacin a
8.000 rpm durante 15 min, a 4 C, en una centrfuga Beckman Avanti J
25. Se desech el sobrenadante y las clulas se congelaron a 80
o
C,
hasta su uso posterior. A continuacin se resuspendieron en tampn
TrisHCl 50 mM, pH 8. Cuando se midi la actividad nitrorreductasa,
las clulas se resuspendieron en el mismo tampn suplementado con 0,2
mM de 2,4DNP.
Los extractos acelulares se obtuvieron mediante sonicacin de
las suspensiones celulares a 90 W en tres perodos de 5 s utilizando un
sonicador Vibracell. Durante el procedimiento las clulas se
mantuvieron en hielo.
Tras este tratamiento, la suspensin obtenida se centrifug en
viales de 1 mL hasta obtener el color traslcido del extracto: primero
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durante 20 min y luego durante 15 min, a 12.000 rpm y 4
o
C. El extracto
acelular (sobrenadante) se utiliz directamente como fuente de la
protena His
6
NprB.
6. DETERMINACIONES ANALTICAS
6.1. Medida del crecimiento celular
El crecimiento de las estirpes de Rhodobacter se sigui
midiendo la absorbancia a 680 nm de los cultivos, mientras que el
crecimiento de las estirpes de E. coli se sigui a 600 nm. Estas
determinaciones se realizaron en un colormetro Turner (modelo 350) o
un espectrofotmetro UVvis ThermoSpectronic, Helios Epsilon.
6.2. Determinacin de la concentracin de protenas
Para la determinacin de protenas se ha utilizado el mtodo de
Bradford (1976). A 0,8 mL de muestra se le aadieron 0,2 mL de
reactivo BioRad Dye reagent concentrate, ref. 5000006 (BioRad).
Transcurridos 10 min se determin la absorbancia a 595 nm y el valor
obtenido se interpol en una recta patrn obtenida con distintas
concentraciones de seroalbmina bovina (BSA).
6.3. Deteccin de compuestos nitroaromticos por UV/vis y HPLC
El compuesto nitroaromtico 2,4DNP se determin
espectrofotomtricamente a la longitud de onda correspondiente a su
mximo de absorcin a pH neutro (360 nm) y el 2amino4nitrofenol
(ANP) se midi a 436 nm.
El cido pcrico (TNP), el TNT, el 2,4DNP y el ANP tambin
se determinaron mediante HPLC, para lo cual se emple un equipo
System Gold equipado con un detector de diodos en batera (diode
array), modelo 168 (Beckman Instruments Inc). La cromatografa se
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realiz utilizando una columna Extrasil ODS2 5 M 15 x 0,4
(Teknokroma, Barcelona) o Spherisorb ODS2 (TRACER Analtica) de
15 x 0,4 cm y 5 m de tamao de partcula. El procedimiento se llev a
cabo a un flujo de 0,8 1 mL min
-1
a temperatura ambiente. Las fases
mviles empleadas fueron:
Asimismo, los compuestos nitroaromticos se prepararon segn
Race et al. (2005), como se indica en el apartado 2.1.4. de Materiales y
Mtodos.
7. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
NITRORREDUCTASA DE NprB
Se determin cuantificando por HPLC el TNP o el TNT
desaparecido. La mezcla de reaccin contena, en un volumen final de 1
mL, los componentes que se indican en la tabla:
COMPUESTO TR (min) (nm)
FASE MVIL
FASEORGNICA FASEACUOSA
2,4DNP 5,4
360
45% metanol
55% (100 mM cido actico y 0,8 mM
trietilamina en agua MilliQ, Millipore, Bedford,
MA)
TNP 2,9
ANP 3,2 436
TNT 2,6 360 65% acetonitrilo 35% (agua MilliQ, Millipore, Bedford, MA)
ENSAYO NITRORREDUCTASA
Mezcla de tampones, pH 6,9 250 moles
Sustrato 0,2 moles
NADH 0,6 moles
Extracto o enzima cantidad adecuada (5 25L)
H
2
O destilada hasta 1 mL
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Para tamponar la mezcla de reaccin se uso siempre una mezcla
de tampones 250 mM, pH 6,9 que contena (a una concentracin 50 mM
cada uno): MES, MOPS, HEPES, TrisHCl y CHES. Tras aadir el
NADH, la reaccin se dej transcurrir durante 20 min a 34 C. Pasado
este tiempo, para parar el ensayo se calent durante 5 min a 95 C. La
mezcla se centrifug y el TNP o el TNT se determinaron mediante
HPLC para cuantificar la concentracin de sustrato consumida. Como
referencia se utiliz la misma mezcla de reaccin, pero con extracto
acelular o enzima His
6
NprB hervidos.
Tambin se determin la actividad de NprB con otros
compuestos nitroderivados y quinoides midiendo la disminucin de
absorbancia a 340 nm como consecuencia de la oxidacin del NADH, en
un espectrofotmetro Beckman DU 7500. Todos los compuestos se
utilizaron a una concentracin 0,2 mM por ensayo, menos las quinonas
que se utilizaron a una concentracin 0,034 0,06 mM.
Los compuestos nitroderivados utilizados en la determinacin
de la actividad nitrorreductasa de NprB fueron: aroclor 1254, 2amino
4nitrofenol (ANP), 4amino2nitrofenol, CB1954, 2,4
dihidroxibenzoilo, 1,3dinitrobenceno, 2,4dinitrobenzoato (2,4DNB),
2,5dinitrobenzoato (2,5DNB), 3,5dinitrobenzoato (3,5DNB), 2,4
dinitrofenol (2,4DNP), 2,5dinitrofenol (2,5DNP), 3,4dinitrofenol
(3,4DNP), 2,4dinitrotolueno (2,4DNT), 2nitrobenzoato, 4
nitrobenzoato, nitrosobenceno, 2,4,6trinitrofenol (cido pcrico o TNP),
2,4,6trinitrotolueno (TNT), furazolidona, nitrofurantona y
nitrofurazona. Adems se utilizaron las quinonas lawsona (2hidroxi
1,4naftoquinona) y pbenzoquinona (1,4benzoquinona).
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Todos los compuestos nitroderivados se prepararon en DMSO,
menos el aroclor 1254 que se prepar en metanol 100%, a una
concentracin 20 mM, segn Race et al. (2005) (ver apartado 2.1.4. de
Materiales y Mtodos).
8. TCNICAS DE MANIPULACIN DEL DNA
8.1. Aislamiento y purificacin de DNA plasmdico
Para el aislamiento del DNA plasmdico se utiliz el mtodo de
purificacin mediante un preparado comercial, a partir del sistema High
Pure Plasmid Isolation Kit de Roche Mannheim (ref. 1754785) para
obtener el DNA con la calidad y concentracin necesarios para su
secuenciacin. Para ello se utilizaron 3 mL de cultivo y se siguieron las
instrucciones del fabricante.
8.2. Aislamiento de DNA total
Dependiendo de la cantidad y grado de pureza requerida se
emplearon dos mtodos.
8.2.1. Mediante kit comercial
La extraccin de DNA se realiz a partir de clulas de
Rhodobacter capsulatus B10S. Para ello las clulas se cultivaron en el
medio PY suplementado con estreptomicina. El cultivo se recogi
cuando presentaba una absorbancia a 680 nm de aproximadamente 0,5.
El sistema de aislamiento del DNA que se utiliz fue el preparado
comercial Wizard Genomic DNA Purification de Promega (ref.
A1120). El protocolo de extraccin y los tampones utilizados fueron los
recomendados por la casa comercial.
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8.2.2. Mtodo del fenol/cloroformo
Para ello se emple el mtodo descrito por Sambrook et al.
(1989). Se parti de 100 mL de clulas de R. sphaeroides DSM158S
cultivadas en medio RCV con D,Lmalato y glutamato como fuentes de
carbono y de nitrgeno, respectivamente. Las clulas se recogieron por
centrifugacin y posteriormente se lavaron y se resuspendieron en 10 mL
de un tampn TE que contena: TrisHCl 75 mM (pH 8,0), EDTA 20
mM y NaCl 100 mM. Se aadieron 50 mg de lisozima y se incub a
37
o
C durante 30 min con ligera agitacin. A continuacin se aadieron
200 mg de Nlaurilsarcosina y 10 mg de proteinasa K, y se incub en las
mismas condiciones durante otros 30 min. Para eliminar las protenas se
realizaron tres extracciones sucesivas. La primera de ellas con una
solucin 1:1 de fenol:TrisHCl 1 M (pH 8) preparado a partir de una
solucin comercial de Sigma (ref. P4557) neutralizando con el tampn
comercial mediante agitacin durante toda la noche, la segunda con
10 mL de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico 25:24:1 y la tercera con
10 mL de cloroformo saturado en TE.
La fase acuosa se precipit aadiendo el mismo volumen de
isopropanol y 0,1 volmenes de acetato sdico 3 M (pH 5,2). Las
muestras se mantuvieron a 20 C durante aproximadamente 12 h para
facilitar la precipitacin. Posteriormente las muestras se centrifugaron 30
min a 12.000 g. El precipitado se lav finalmente con 1 mL de etanol al
70% (v/v), se sec en una estufa a 65 C. El DNA precipitado se
resuspendi en 0,5 mL de H
2
O estril.
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8.3. Digestin del DNA total con endonucleasas de restriccin
8.3.1. DNA genmico de Rhodobacter
Las reacciones de digestin del DNA genmico de R.
capsulatus y R. sphaeroides se realizaron en las condiciones ptimas
fijadas por el fabricante para cada enzima de restriccin. Las reacciones
contenan habitualmente 0,5 5 g de DNA; 0,1 volmenes del tampn
de restriccin suministrado diez veces concentrado por la casa
comercial; 0,5 5 unidades de la enzima de restriccin, en un volumen
final de 30 L complementados con agua estril. Adems, se aadi
RNasa 0,1 mg mL
-1
. Las digestiones se incubaron a la temperatura que
indicaba el fabricante durante 12 24 horas.
8.3.2. Digestin del DNA plasmdico
Las digestiones del DNA plasmdico con endonucleasas de
restriccin se realizaron en las condiciones recomendadas por las
diferentes casas comerciales (Promega, Pharmacia o Boehringer). Las
digestiones contenan aproximadamente unos 0,5 3 g de DNA, 0,1
volmenes del tampn de restriccin, suministrado por la casa comercial
diez veces concentrado, 0,5 1 unidades de enzima de restriccin, en
volmenes finales de 15 L completados con H
2
O.
8.4. Ligacin
Se parti de fragmentos lineales obtenidos por digestin con
enzimas de restriccin en sitios compatibles para la ligacin. Estas
molculas se mezclaron en una proporcin vector:inserto de 1:3, segn
la frmula siguiente:
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La reaccin se llev a cabo aadiendo, adems de la proporcin
adecuada de DNA vector y DNA inserto, 0,1 volmenes de tampn de
ligacin y 1 U de DNA ligasa del fago T4 (Roche, ref. 481220) en un
volumen final de 15 L completado con agua estril. Las reacciones se
mantuvieron a 15
o
C, durante 12 24 h.
8.5. Electroforesis de DNA
La electroforesis de fragmentos de DNA se llev a cabo segn
el mtodo de Sambrook et al. (1989). Se utilizaron para ello geles de
agarosa preparados en tampn TAE, cuya composicin se indica al final
de este apartado. El porcentaje de agarosa utilizado fue de 0,8% para las
muestras de DNA total y 1% para las muestras de DNA plasmdico. A
cada 5 L de muestra de DNA se aadi 1 L de tampn de carga. La
mezcla se deposit en un pocillo del gel sumergido en una cubeta con
tampn TAE. La separacin se realiz por electroforesis horizontal a un
voltaje de 5 10 V cm
-1
durante aproximadamente dos horas. Para
visualizar el DNA en el tampn de electroforesis se aadi bromuro de
etidio, 1 g mL
-1
, y el DNA se visualiz mediante exposicin del gel a
radiacin ultravioleta (254 nm) en un transiluminador. El tamao de los
fragmentos se estim por interpolacin en curvas logartmicas del
tamao de cada fragmento frente a su movilidad relativa, utilizando
como patrn los fragmentos de DNA del marcador comercial de Roche
(DNA Molecular Marker X, ref. 1498037), que se muestra en la Figura
21.
=
ng de inserto
X
50 ng vector
X kb inserto
kb vector
3
1
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Figura 21. Marcadores de tamao para electroforesis de DNA (DNA
Molecular Marker X, Roche).
La composicin de los tampones y soluciones empleados en la
electroforesis fue la siguiente:
Tampn TAE: 4,84 g de TrisBase, 1,14 mL de cido actico
glacial, 0,5 M EDTA, pH 8,2 y hasta 1 L de H
2
O. Este tampn se
prepar a partir de una solucin 50 veces concentrada y esterilizada en el
autoclave.
Tampn de carga: glicerol 30% v/v, azul de bromofenol 0,3%
p/v y azul de xilencianol 0,3% p/v.
8.6. Secuenciacin del DNA
Se realiz en un secuenciador automtico ABI PRISM 310
Genetic Analyser (Perkin Elmer, USA), que separa los distintos
polinucletidos mediante electroforesis capilar. Este secuenciador se
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encuentra en el Servicio Central de Apoyo a la Investigacin (SCAI) de
la Universidad de Crdoba.
8.7. Transformacin por tratamiento con cloruro de calcio en fro
La transformacin de las estirpes E. coli DH5 y JM109 se
llev a cabo segn el mtodo descrito por Mandel y Higa (1970), basado
en la capacidad que adquieren estas clulas para captar DNA exgeno
cuando se tratan con una disolucin de cloruro de calcio en fro.
8.7.1. Obtencin de clulas competentes
Las clulas de E. coli se cultivaron en el medio LB durante
aproximadamente 12 h. A continuacin el cultivo se diluy 50 veces en
medio LB, incubndose durante unas 2 h, hasta alcanzar una absorbancia
a 600 nm de aproximadamente 0,5. En este punto, las clulas se
centrifugaron a 5.000 g durante 5 min y el precipitado se resuspendi en
la mitad del volumen de partida con una solucin fra de CaCl
2
50 mM.
Se incubaron en hielo durante 30 min y se volvi a centrifugar. Las
clulas competentes obtenidas se resuspendieron en una dcima parte del
volumen inicial en una solucin fra de CaCl
2
50 mM.
8.7.2. Transformacin de clulas competentes
Por cada 200 L de clulas competentes obtenidas como se
indica en el apartado anterior se mezclaron de 1 a 10 L de la
preparacin de DNA plasmdico (50 500 ng de DNA) y 100 L de
tampn TCM. La mezcla se incub 30 min en hielo y posteriormente se
realiz un choque trmico durante 90 s a 42 C. A continuacin se
aadieron 700 L de medio LB, y los viales se incubaron a 37 C
durante 30 45 min. Posteriormente, se sembraron partes alcuotas de
100 L en medio LB slido con los antibiticos correspondientes. En
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caso de llevar a cabo seleccin mediante complementacin se aadi
IPTG y XGal, como se ha mencionado en el apartado 2.2. de Materiales
y Mtodos.
8.7.3. Seleccin de los transformantes
Generalmente el vector en el que se inserta el DNA suele
presentar uno o varios marcadores de resistencia a antibiticos, de forma
que slo las clulas que han incorporado dicho vector (con o sin inserto)
sern capaces de crecer en un medio selectivo suplementado con dicho
antibitico. Para diferenciar entre los transformantes con y sin inserto se
utiliz la capacidad de las clulas transformadas para utilizar o no un
sustrato cromognico (complementacin ).
Los vectores empleados en el mtodo cromognico clsico (tipo
pUC) tienen el DNA que codifica los primeros 146 aminocidos de la
galactosidasa. Insertada en esta secuencia lacZ se encuentra otra,
denominada sitio de clonacin mltiple (polycloning site o
polylinker), que no altera la fase de lectura, aunque genera un extremo
amino terminal de la galactosidasa con unos cuantos aminocidos
adicionales. Generalmente, cuando se clona un inserto en el sitio de
clonacin mltiple se produce el cambio de la fase de lectura y/o la
generacin de un extremo amino de la galactosidasa no funcional.
Estos vectores se emplean con clulas hospedadoras que codifican la
porcin carboxiterminal de la galactosidasa. Aunque por separado
ninguno de los productos de la expresin gnica de los extremos amino o
TAMPN TCM
Tris-HCl 10 mM; pH 7,5
CaCl
2
10 mM
MgCl
2
20 mM
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carboxilo de la galactosidasa son activos enzimticamente, pueden
asociarse para generar una galactosidasa completa y funcional. A este
tipo de fenmeno se le denomina complementacin . Las bacterias con
fenotipo Lac
+
que resultan de la complementacin se pueden
reconocer fcilmente porque forman colonias azules en presencia del
sustrato cromognico XGal y de un inductor del gen de la
galactosidasa, como el IPTG. Sin embargo, la introduccin de un inserto
en el sitio de clonacin mltiple del vector, produce un extremo amino
terminal de galactosidasa que no es capaz de conseguir la
complementacin . Estas bacterias recombinantes con DNA inserto
ligado en el vector generan colonias blancas en dicho medio.
8.8 Mutagnesis por insercin al azar del transposn Tn5 en el
genoma de R. sphaeroides DSM158S
La mutagnesis por insercin al azar del transposn Tn5 en el
genoma de R. sphaeroides DSM158S se realiz segn el mtodo de
Simon et al. (1983), basado en la transferencia por conjugacin de
plsmidos movilizables (con genes mob) portadores del transposn Tn5
desde estirpes donadoras de E. coli hasta estirpes receptoras de bacterias
Gram negativas. Las estirpes donadoras poseen integrado en el
cromosoma los genes tra del plsmido RP4 requeridos para la
transferencia de material gentico. Los vectores suicidas portadores de
Tn5 no pueden mantenerse como tales en las bacterias fototrficas y, por
lo tanto, la seleccin en medios con el antibitico kanamicina (Km),
cuya resistencia est codificada por Tn5, indica la integracin al azar del
transposn en el genoma de dichas bacterias (Fig. 22).
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8.8.1. Transferencia por conjugacin de plsmidos movilizables desde
E. coli S171 a R. sphaeroides DSM158S
En estudios previos a este trabajo se ha comprobado que la
estirpe DSM158S de R. sphaeroides muestra una frecuencia de
mutagnesis con el vector PSUP2021 portador de Tn5 de
aproximadamente 10
-5
, similar a la observada en otras bacterias Gram
negativas (Roldn, 1992; MorenoVivin et al., 1994).
Las clulas de la estirpe S171 de E. coli, previamente
transformadas con el plsmido pSUP2021 que contiene el transposn
Tn5, se cultivaron en placas con medio slido LB y el antibitico
kanamicina (Km). De estas placas se tomaron clulas con un asa de
platino estril y se resuspendieron en 1 mL de medio PY sin hierro. Por
Figura 22. Esquema de la mutagnesis con Tn5 y posterior seleccin de
mutantes afectados en la degradacin de DNP.
Sm
R. sphaeroidesDSM158S (Sm
r
)
mob
Km
tra
Tn5
E. coli S17- 1
Km
Sm
Tn5
R. sphaeroides DSM158S
(Sm
r
, Km
r
)
PY + Km + Sm
RCV + Glu + Km + Sm
RCV + Glu + Km + Sm + DNP
RCV + Km +Glu + Sm + ANP
pSUP2021
EcoRI
PstI
SalI
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otro lado, las clulas receptoras de la estirpe DSM158S de R.
sphaeroides se cultivaron en condiciones de luzanaerobiosis en el
medio RCV con estreptomicina (Sm) hasta alcanzar una absorbancia a
680 nm de 0,8 1,0. Se mezclaron 0,5 mL de ambas suspensiones
celulares en un tubo de centrfuga de 1,5 mL, eliminndose los medios
de cultivo por centrifugacin a 5.000 x g durante 10 min. Las clulas se
resuspendieron cuidadosamente en 0,1 mL de medio PY carente de
hierro y, a continuacin, se transfirieron a filtros de acetato de celulosa
(tamao de poro de 0,2 m y 25 nm de dimetro) colocados en placas de
Petri conteniendo medio slido PY. Se incubaron durante toda la noche a
30
o
C en la oscuridad. Los filtros se colocaron en viales que contenan 1
mL de medio RCV sin fuente de nitrgeno y se agitaron para detener el
proceso de conjugacin y poner las clulas en suspensin. Finalmente, se
sembraron las clulas en placas con medio slido PY suplementado con
los antibiticos Sm (200 g mL
-1
) y Km (25 g mL
-1
). Esto permiti la
seleccin de los transconjugantes de R. sphaeroides.
8.8.2. Seleccin de mutantes de R. sphaeroides DSM158S afectados en
la ruta de degradacin de DNP
Para seleccionar los posibles mutantes de R. sphaeroides
DSM158S afectados en la ruta de degradacin de DNP, las colonias
resistentes a los dos antibiticos, kanamicina y estreptomicina, se
transfirieron en condiciones de esterilidad a placas de microtitulacin,
colocando una en cada pocillo. Cada pocillo contena 200 L de medio
PY. A partir de este medio se hacan tres rplicas: una a medio RCV con
D,Lmalato y glutamato y las otras dos a medios que contenan DNP
(0,1 mM) o ANP (50 M), respectivamente. Las placas se incubaron a
30
o
C en condiciones de luzanaerobiosis.
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Se seleccionaron aquellas colonias que no haban crecido en
presencia de DNP o ANP, pero que s haban crecido en la rplica con
RCV y glutamato, lo que permita descartar a los mutantes auxtrofos.
8.9. Hibridacin del DNA genmico del mutante D12 de R.
sphaeroides DSM158S (Southern blotting)
La hibridacin de cidos nucleicos se hizo siguiendo el mtodo
basado en el marcaje de la sonda con digoxigenina (Feinberg y
Vogelstein, 1983).
8.9.1. Transferencia del DNA genmico del mutante D12 de R.
sphaeroides DSM158S a membranas de nailon
El DNA genmico del mutante D12 de R. sphaeroides
DSM158S se digiri mediante las enzimas de restriccin EcoRI, SalI,
BamHI y EcoRI/SalI. A continuacin, se fraccion por medio de una
electroforesis en gel de agarosa 0,8%, en tampn 1 X TAE de 10 cm de
longitud, cargndose en cada pocillo 5 g por aproximadamente 5 horas
para obtener una mayor resolucin de las bandas. Seguidamente, se lav
el gel mantenindolo con agitacin continua durante 30 min en una
solucin despurinizadora de HCl 0,2 M. Transcurrido ese tiempo el gel
se pas a una bandeja que contena una solucin desnaturalizante de
NaCl 1,5 M y NaOH 0,5 N y se mantuvo con agitacin continua durante
45 min. Posteriormente, se pas por una bandeja con agua destilada y de
sta a otra con una solucin neutralizante compuesta de TrisHCl 1 M
(pH 8,0) y NaCl 1,5 M. Con esta solucin se agit durante 15 min.
Pasado este tiempo se renov la solucin de neutralizacin y se agit de
nuevo durante otros 15 min.
Una vez finalizado el proceso de lavado el DNA genmico se
transfiri por capilaridad a una membrana de nailon cargada
positivamente (Boehringer Mannheim, ref. 1417240) siguiendo el
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Purificacin de la nitrorreductasa NprB
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protocolo de transferencia alcalina descrito por Sambrook et al. (1989).
Transcurridas 12 h se lav la membrana en el tampn anterior diluido 10
veces para eliminar los posibles restos de agarosa. A continuacin el
DNA se fij a la membrana mediante radiacin ultravioleta (260 nm)
durante 3 min.
8.9.2. Condiciones de hibridacin del DNA genmico del mutante D12
de R. sphaeroides
La prehibridacin se llev a cabo en la solucin de
prehibridacin a 65
o
C durante 48 h. La hibridacin se llev a cabo en la
solucin de prehibridacin ms la sonda, que contena un fragmento de
DNA perteneciente al transposn Tn5 (fragmento PstI de 1,1 kb)
marcado con digoxigenina, a 65
o
C durante 24 h.
Para el lavado de la membrana se utilizaron:
(a) 2 x SSC + 0,1% SDS, dos lavados durante 15 min a
temperatura ambiente, cada uno y
(b) 0,1 x SSC + 0,1% SDS, dos lavados durante 15 min a
65
o
C.
SOLUCINDE PREHIBRIDACIN
(volumen 30 mL/membrana)
20 X SSC 30 mL
agente de bloqueo 1,2 g
N-lauril-sarcosina 0,12 g
SDS 20% 0,12 mL
H
2
O 89,88 mL
volumen total 120 mL
disolver 1 h en bao mara a 65
o
C antes de usarlo
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Purificacin de la nitrorreductasa NprB
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9. HIPEREXPRESIN DE LA PROTENA RECOMBINANTE
His
6
NprB EN E. coli
Para la expresin de la protena recombinante His
6
NprB, se
amplific el gen nprB utilizando el DNA genmico de R. capsulatus
B10S como molde. Para ello se disearon los oligonucletidos
HISNPRB1 y HISNPRB2, que permiten la clonacin del fragmento
resultante de la PCR en los sitios de corte para las enzimas de restriccin
BamHI y HindIII del vector pQE32, de forma que se produzca la fusin
en la fase de lectura correcta entre la secuencia His
6
codificada por
pQE32 y la secuencia de NprB a partir del segundo codn.
9.1. Amplificacin del gen nprB de R. capsulatus B10S mediante
PCR
La secuencia del gen nprB para el diseo de los cebadores se
obtuvo de la base de datos correspondiente a la secuencia completa del
genoma de Rhodobacter capsulatus SB1003
(www.integratedgenomics.com).
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en el sistema
Mastercyclerpersonal 5332 Eppendorf. Se utiliz para ello el preparado
comercial Expand
TM
High Fidelity PCR System de Roche (ref. 1440000)
que suministraba la DNA polimerasa, el tampn de reaccin y el cloruro
de magnesio. Los desoxirribonucletidos (dNTPs) utilizados fueron los
de Amersham Biosciencie (ref. 27203501).
REACCIN DE AMPLIFICACIN (PCR)
Volumen Concentracin
PCR Buffer (10 x) 5 L 1X
Solucin de dNTPs 10 mM 1 L 100 M(cada uno)
Oligonucletidos 1 L (cada uno) 0,2 pmol/L
DNA molde 0,5 5 L 0,05 1 g
DNA polimerasa (3,5 UL
-1
) 1 L 0,07 U L
-1
H
2
O destilada estril Hasta 50 L
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Purificacin de la nitrorreductasa NprB
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Los cebadores utilizados para amplificar el gen nprB de R.
capsulatus fueron los siguientes:
HISNPRB1: 5 secuencia 3 (sitio BamHI subrayado)
HISNPRB2: 5 secuencia 3 (sitio HindIII
subrayado).
El programa de PCR utilizado se representa en la Fig. 23.
Figura 23. Esquema del programa de PCR para la amplificacin del gen
nprB de R. capsulatus B10S.
5- TAGGATCCATGAGAATCTGTATTTCCAAGGCGATATTCCCCCCGGCACCGTCA 3
5- AGAAGCTTAGCAGCAGAAGGATGGCGAGGCC 3
PCR
30 ciclos
98
o
C
3 min
98
o
C
45 s
55
o
C
45 s
69
o
C
1 min
72
o
C
10 min
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9.2. Clonacin del gen nprB en el vector de expresin pQE32
Una vez amplificado, el fragmento de DNA de unos 700 pb
conteniendo el gen nprB se introdujo en el plsmido pGEMT,
denominndose a esta construccin pVE1. Posteriormente, se digiri con
las enzimas BamHI y HindIII y se clon en el plsmido pQE32. A
continuacin se transform la estirpe JM109 de E. coli con dicha
construccin, a la que se ha denominado pVE2 (Fig. 24).
En el plsmido pVE2, la expresin del gen nprB est basada en
el promotor lac, de forma que la produccin de la protena recombinante
His
6
NprB es rpidamente inducida por la adicin de IPTG.
Figura 24. Construccin de un vector para la expresin de la protena
recombinante His
6
NprB.
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10. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA
CON DODECILSULFATO DE SODIO (SDSPAGE)
La electroforesis SDSPAGE se llev a cabo segn el mtodo
de Laemmli (1970) con algunas modificaciones. Se utiliz un sistema
MiniProtean II Electroforesis Cell de BioRad. Las muestras se
sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida formados por el
gel separador (resolving) con una concentracin final de acrilamida del
15% (p/v), siendo su funcin la separacin de las protenas en funcin de
su masa molecular, mientras que el gel concentrador (stacking) con una
concentracin final de acrilamida del 4% (p/v), para enfocar las
protenas. Las muestras antes de ser cargadas en el gel, se mezclaron con
un volumen de tampn de carga, preparado al 4X, y posteriormente se
incubaron a 95 C durante 5 min para desnaturalizar las protenas.
Posteriormente se cargaron en el gel y la electroforesis se desarroll
segn las instrucciones de la casa comercial (BioRad), durante 30 min a
15 mA por gel hasta que las muestras entraron en el gel separador, y a
partir de este momento la corriente se increment a 25 mA por gel hasta
conseguir una separacin adecuada de las protenas. El patrn de
protenas utilizado para el gel teido con Coomassie fue SDSPAGE
Molecular Weight Standards, Broad Range de BioRad (ref. 1610317).
Los marcadores Kaleidoscope Prestained Standards de BioRad (ref.
1610324) se utilizaron para el gel que se transfera a membrana (Fig.
25).
Composicin del gel concentrador (4%): 520 L de
acrilamida/bisacrilamida (37,5:1); 830 L de TrisHCl 0,5 M (pH 6,8);
20 L de SDS 20% (p/v); 20 L de persulfato amnico 10% (p/v); 5 L
de N,N,N,Ntetrametiletilendiamina (TEMED) y 2,65 mL de H
2
O.
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Composicin del gel separador (15%): 5 mL de
acrilamida/bisacrilamida (37,5:1); 2,47 mL de TrisHCl 1,5 M (pH 8);
50 L de SDS 20% (p/v); 50 L de persulfato amnico 10% (p/v); 5 L
de N,N,N,Ntetrametiletilendiamina (TEMED) y 2,43 mL de H
2
O.
Las cantidades mostradas estn ajustadas para la preparacin de
dos geles y corresponden a los componentes utilizados en la preparacin
del gel concentrador al 4% y del gel separador al 15%. La disolucin de
acrilamida/bisacrilamida fue suministrada por BioRad (ref. 1610158).
Composicin del tampn de carga (4X): 1,2 mL de TrisHCl 1
M (pH 6,8); 2 mL de SDS al 20% (p/v); 4 mL de glicerol; 2 mL de
mercaptoetanol; 400 L de azul de bromofenol 0,1 % (p/v) y ajustar
volumen hasta 10 mL de H
2
O.
Composicin del tampn de electroforesis: 3 g de Trisbase;
14,4 g de glicina; 4,8 mL de SDS al 20% (p/v); y 990 mL de H
2
O (pH
8,5).
Figura 25. Marcadores de masa molecular para electroforesis de protenas.
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10.1. Tincin de protenas con azul de Coomassie
Las protenas previamente separadas mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida se tieron con una disolucin acuosa de azul de
Coomassie. Tras 1 h de tincin se lav varias veces el gel con una
disolucin de desteido. De esta forma se mantuvo el gel en agitacin
suave durante unas 12 h hasta que se visualizaron bien las bandas
correspondientes a las protenas.
Solucin de tincin Coomassie: 0,1% (p/v) de azul de
Coomassie; 50% (v/v) de metanol y 10% (v/v) de cido actico glacial.
Solucin de desteido: 10% (v/v) de metanol y 10% (v/v) de
cido actico glacial.
10.2. Anlisis inmunolgico
10.2.1. Transferencia de protenas a membranas de PVDF
Una vez finalizada la electroforesis en gel de poliacrilamida, las
protenas contenidas en el gel se transfirieron a una membrana de
difluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando para ello un sistema
Novoblot semiseco (BioRad). La transferencia se llev a cabo a una
intensidad de 60 mA por gel durante 30 min. Para ello se usaron dos
filtros de papel Whatman Extra Thick Blot Paper de BioRad, ref.
1703967. Uno de los filtros se colocaba en contacto con el sistema de
transferencia, previamente equilibrado en tampn de transferencia. A
continuacin se colocaba la membrana de PVDF previamente hidratada
durante 1 min en metanol al 100%, y posteriormente equilibrada en el
mismo tampn de transferencia. A continuacin se coloc el gel, con la
precaucin de que no se formasen burbujas de aire entre la membrana y
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Purificacin de la nitrorreductasa NprB
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el gel, y por ltimo se coloc otro papel Whatman tambin equilibrado
en la misma solucin.
Composicin del tampn de transferencia: TrisHCl 25 mM;
glicina 192 mM; metanol 20% y ajustar volumen hasta 2 L de H
2
O.
10.2.2. Inmunodeteccin de la protena His
6
NprB
La membrana de PVDF con las protenas transferidas se
bloque durante 1 h con agente de bloqueo (BioRad, ref. 1706404)
disuelto al 5% en tampn PBS. Despus del bloqueo, la membrana se
incub durante 1 h con anticuerpo primario monoclonal anti
polihistidina (Sigma) clon his1 de ratn (ref. H1029), con una dilucin
1:10.000 en solucin de bloqueo. Despus de la incubacin con el
anticuerpo primario, la membrana se lav dos veces con 10 mL de
disolucin de bloqueo y una vez con 10 mL de PBS y se incub durante
1 h con anticuerpo secundario antiIgG de ratn obtenido en cabra
(Sigma, ref. A3566), con una dilucin 1:1.000 en solucin de bloqueo,
conjugado con fosfatasa alcalina. La deteccin se llev a cabo por
incubacin de la membrana en oscuridad con los reactivos de deteccin
para la fosfatasa alcalina en la solucin de revelado. Una vez que se
desarroll el color, la reaccin se par mediante lavados con agua y la
membrana se sec mediante su almacenamiento entre filtros de papel.
Composicin del tampn PBS: 137 mM de NaCl; 2,7 mM de
KCl; 1,4 mM de KH
2
PO
4
y 4,3 mM de Na
2
HPO
4
.
Composicin de la solucin de revelado: 1,5 mL de TrisHCl 1
M pH 9,5; 300 L de NaCl (5 M); 75 L de Mg
2
Cl (1 M); 150 L de
NBT/BCIP y 13,125 mL de H
2
O.
El reactivo NBT/BCIP utilizado se obtuvo de una mezcla
comercial de Roche (ref. 1681451) y se utiliz a una concentracin final
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en la solucin de revelado de 0,3 mgmL
-1
de NBT y 0,15 mgmL
-1
BCIP.
11. PURIFICACIN DE LA PROTENA RECOMBINANTE His
6
m
g
-
1
)
TNP (M)
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De igual forma se determin la Vmx y la constante Michaelis
Menten (K
M
) para la protena recombinante His
6
NprB utilizando TNP
como sustrato (Figs. 44 y 45), obtenindose un valor de Vmx de 150
mU mg
-1
y un valor de K
M
aparente de 800 M. En comparacin con la
protena NprA, la K
M
es similar pero la Vmx es unas cinco veces
superior.
Figura 44. Velocidad de reaccin frente a la concentracin de TNP como
sustrato para la protena recombinante His
6
NprB. La concentracin de
enzima fue de 1,3 g.mL
-1
.
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Como la protena NprB, a diferencia de NprA, puede utilizar
TNT como sustrato (Fig. 37), tambin se procedi a determinar los
parmetros cinticos Vmx y K
M
de NprB utilizando concentraciones
entre 0 y 5000 M de TNT (Figs. 46 y 47), obtenindose un valor de
Vmx de 100 mU mg
-1
y un valor de K
M
aparente para el TNT de
aproximadamente 0,7 mM.
Figura 45. Representacin de dobles recprocos de LineweaverBurk para la
actividad nitrorreductasa de la protena recombinante His
6
NprB con TNP
como sustrato.
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La Vmx para esta enzima NprB con TNT como sustrato es
menor que la observada con el sustrato TNP. Estos resultados sugieren
que la nitrorreductasa NprB tiene cierta preferencia por el TNP como
sustrato, respecto al TNT, ya que la reduccin del grupo nitro se ve ms
favorecida por la presencia del grupo OH (TNP) que del grupo CH
3
(TNT) (Roldan et al., 2008). Sin embargo, la K
M
aparente para el TNT
es similar a la del TNP, que tambin tiene los grupos nitro situados en
las mismas posiciones del anillo aromtico.
Figura 46. Velocidad de reaccin frente a la concentracin de TNT como
sustrato para la protena recombinante His
6
NprB. (a) 0 200 M y (b) 0
5000 M. La concentracin de enzima fue 1,3 gmL
-1
para ambos casos.
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Figura 47. Representacin de dobles recprocos de LineweaverBurk para la
actividad nitrorreductasa de la protena recombinante His
6
NprB con TNT
como sustrato. (a) 0 200 M y (b) 0 5000 M.
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4.5.2. Inhibicin de la actividad nitrorreductasa de las protenas His
6
NprA y His
6
NprB en presencia de capsaicina. Determinacin de la K
i
Las quinonas son componentes centrales de las cadenas
fotosintticas y respiratorias de transferencia de electrones. La
capsaicina es un anlogo natural de las quinonas que bloquea el
transporte fotosinttico de electrones de algunas bacterias prpuras no
azufradas, como Rhodobacter sphaeroides (Spyridaki et al., 2000). El
transporte de electrones desde el NADH a las quinonas tambin se
inhibe especficamente con capsaicina en R. capsulatus (Dupuis et al.,
1998; Yagi et al., 1998).
En este trabajo se probaron dos concentraciones distintas (10 y
100 M) del inhibidor capsaicina en los ensayos de la actividad
nitrorreductasa de las protenas recombinantes His
6
NprA y His
6
NprB,
utilizando como sustratos TNP o TNT.
En el caso de la protena recombinante His
6
NprA, la
capsaicina caus una disminucin poco moderada de la velocidad de
reduccin del TNP (Figs. 48 y 49). A partir de los datos obtenidos se
calcul un valor aproximado de K
i
para la capsaicina de 0,4 mM. La
representacin de dobles recprocos de LineweaverBurk sugiere que la
capsaicina no compite con el TNP por el sitio activo de la protena
recombinante His
6
NprA, sino que posiblemente se una a otra parte de
su estructura ya que presenta una inhibicin de tipo no competitiva.
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Figura 48. Velocidad de reaccin frente a la concentracin de TNP de la
protena recombinante His
6
NprA en presencia de capsaicina 10 y 100 M. La
concentracin de enzima fue de 6 gmL
-1
.
Figura 49. Representacin de dobles recprocos de LineweaverBurk para la
actividad de la protena recombinante His
6
NprA con TNP como sustrato en
presencia de capsaicina 10 y 100 M.
I
+I
100 M
+I
10 M
0
2,5
5
7,5
10
12,5
15
17,5
20
22,5
25
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
v
o
(
m
U
m
g
-
1
)
TNP (M)
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Por otra parte, la capsaicina mostr un fuerte efecto inhibidor
sobre la actividad de la protena His
6
NprB con TNP como sustrato, y
esta inhibicin fue de tipo competitiva (Figs. 50 y 51). Mientras que la
K
M
para el TNP fue 0,8 mM, la K
M
en presencia de capsaicina fue 35
mM, y el valor de K
i
obtenido fue 2,5 x 10
-3
mM, lo que indica una gran
afinidad de la enzima por este anlogo de las quinonas, incluso mayor
que la que presenta por el sustrato TNP.
Figura 50. Representacin directa de la velocidad de la reaccin catalizada
con la protena recombinante His
6
NprB frente a la concentracin de TNP en
presencia de capsaicina 10 y 100 M. La concentracin de enzima fue de 1,3
g.mL
-1
.
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Tambin se obtuvo el mismo efecto de la capsaicina como
inhibidor cuando se utiliz el TNT como sustrato, a concentraciones de
capsaicina 0 y 100 M, para la protena recombinante His
6
NprB. En
presencia de capsaicina se observ una inhibicin de tipo competitiva
con un valor de K
i
de aproximadamente 0,01 mM (Figs. 52 y 53). Esto
confirma que la capsaicina podra actuar como un efectivo inhibidor
competitivo de la actividad de la protena His
6
NprB. Como este
compuesto es un anlogo de las quinonas, estos resultados podran
sugerir que la protena NprB podra tener actividad quinona reductasa, a
diferencia de NprA, que no presenta esta actividad (PrezReinado,
2005) y se inhibe slo ligeramente por capsaicina (Figs. 41 y 48).
Figura 51. Representacin de dobles recprocos de LineweaverBurk para la
actividad de la protena recombinante His
6
NprB con TNP como sustrato en
presencia de capsaicina 10 y 100 M.
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Figura 52. Representacin de la velocidad de la reaccin catalizada por la
protena recombinante His
6
NprB con TNT como sustrato en presencia de
capsaicina 10 y 100 M. La concentracin de enzima fue 3 gmL
-1
.
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Los estudios cinticos de la inhibicin de las enzimas NprA y
NprB, empleando TNP o TNT como sustratos y capsaicina (trans8
metilNvanillil6nonenamida) como inhibidor, confirman que NprA y
NprB difieren en cuanto a especificidad de sustrato y por lo tanto
podran tener una funcin fisiolgica distinta en las clulas. Utilizando
TNP como sustrato, la K
M
de NprA es similar a la de NprB (0,9 mM y
0,8 mM, respectivamente); no obstante, los valores de K
i
son bastante
diferentes. Con respecto a la protena NprA se obtuvo una inhibicin de
tipo no competitiva usando TNP como sustrato (Fig. 49) y NprB
present una inhibicin de tipo competitiva, utilizando TNP o TNT
como sustratos (Figs. 51 y 53).
Figura 53. Representacin de dobles recprocos de LineweaverBurk para la
actividad de la protena recombinante His
6
NprB con TNT como sustrato en
presencia de capsaicina 10 y 100 M.
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4.6. Actividad enzimtica de la protena His
6
NprB con
dihidrobiopterina o con quinonas como posibles sustratos
fisiolgicos
En el metabolismo de la fenilalanina, un paso metablico
principal consiste en su transformacin en tirosina mediante la
fenilalanina hidroxilasa. Esta enzima requiere un cofactor, la
tetrahidrobiopterina (6R5,6,7,8,tetrahidroLbiopterina, BH
4
o H
4