Prctica de La materia de Bioqumica I, tercer

semestres de La Carrera de ing. Bioqumica,

semestre 2009-2010.
Practica 2. Enzimas: Catalasa y alfa-amilasa
Dra. America Pech y Ak
Enzimas Cata!asa " a!#a-ami!asa
Objetivos General. Que el alumno conozca, comprena y puea observa y
valorar la acci!n e las enzimas en los alimentos y puea comprener caa
uno e los conceptos relacionaos con las enzimas como son la catalasa y alfa
amilasa en las practicas a realizar en iferentes alimentos y le permita alumno
comprener el proceso para poer aplicarlo en la a"uisici!n e conocimientos
b#sicos y en los procesos inustriales e investi$aci!n
particulares
%. Observar la presencia e la enzima catalasa en tejios animales y
ve$etales.
2. Comprobar la acci!n e la temperatura sobre la activia e las
enzimas.
3. Comprobar la acci!n &irol'tica e la amilasa en los alimentos.
(as enzimas son prote'nas "ue sirven como catalizaores. Ellas son las
encar$aas e re$ulas la cat#lisis, incrementano o isminuyeno la velocia
e las reacciones "u'micas, una enzima act)a sobre un sustrato espec'fico,
son sustancias "ue participan sin consumirse urante la reacci!n, son vitales
para el funcionamiento el cuerpo en la i$esti!n, ellas son las "ue &acen
posible los procesos "ue normalmente por'an no ocurrir solo a temperaturas
altas.
(as enzimas son prote'nas "ue trabajan a$rupaas con otro componentes no-
prote'nicos llamaos coenzimas.
(os cofactores pueen ser:
Grupos or$#nicos "ue son permanentemente unios a la enzima *$rupo
prost+tico,, Cationes iones met#licos car$aos positivos *activaores,, los
cuales se unen temporalmente al sitio activo e la enzima ano una intensa
car$a positiva a la prote'na e la enzima, una mol+cula or$#nica, $eneralmente
vitaminas o &ec&o e vitaminas *coenzimas,, los cuales no permanecen unios
a la mol+cula e la enzima, pero se combina con el complejo enzima-sustrato
temporalmente.
En las reacciones "u'micas las sustancias conocias como reactivos act)an
con otros para formar nuevas sustancias, llamaas prouctos. (a ener$'a es un
componente muy importante en la reacci!n "u'mica, por "ue sirven como un
almac+n e ener$'a, y re"uieren e una ener$'a e activaci!n para llevarse a
cabo. -uc&as e los procesos "ue se llevan a cabo en el cuerpo &umano
normalmente re"uieren temperaturas muy altas, temperaturas "ue no son
sostenibles en para la via &umana.
(as prote'nas en enzimas son $eneralmente $lobulares. (os enlaces intra e
intermoleculares "ue mantienen a las estructuras secunarias y terciarias son
moificaas o esnaturalizaas por la temperatura y cambios por el p. . este
efecto cambia la forma y la activia el sitio catal'tico e una enzima, los
cuales son muy sensibles a el p. y la temperatura.
La cata!asa es una enzima com)n encontraa en los or$anismos vivos, one
funcionan como catalizaores en las reacciones e escomposici!n el
pero/io e &ir!$eno*.2O2, en a$ua y o/i$eno.
(a catalasa tiene uno e los recambios mas altos e toas las enzimas. 0na
mol+cula e catalasa por'a convertir millones e mol+culas e pero/io e
&ir!$eno a a$ua y o/i$eno por se$unos.
(a catalasa es un tetramero e cuatro caenas polipeptiicas, caa una lar$a
caena con 122 amino#cios. contiene cuatro $rupos &emo porfirinicos *&ierro,
"ue llevan a la enzima a reaccionar con el pero/io e &ir!$eno. El p.
optimo para la catalasa es apro/imaamente e 3, la temperatura varia por
especie
(a reacci!n e escomposici!n el pero/io e &ir!$eno
2 .
2
O
2
4 2 .
2
O 5 O
2
.
2
O
2
5 6e*777,-E 4 .
2
O 5 O86e*79,-E*.5,
.
2
O
2
5 O86e*79,-E*.5, 4 .
2
O 5 6e*777,-E 5 O
2
-aterial
: Grailla : ; <ubos e ensayo : -ec&ero
: Pipetas : =$ua o/i$enaa : >oluci!n e lu$ol
: >oluciones e 6e&lin$
=y ?
?istur'
: ?a@o -ar'a
: =$ua o/i$enaa
: =lmi!n
$ateria! %io!&gico !os a!umnos de cada equi'o !os 'ro'orcionan
.'$ao e pollo, cero, res
6rutas y veruras, tomate, manzanas , peras , etc
(a catalasa es una enzima "ue se encuentra en las c+lulas e los tejios
animales y ve$etales.
(a funci!n e esta enzima en los tejios es necesaria por"ue urante el
metabolismo celular, se forma una mol+cula t!/ica "ue es el 'er&(ido de
)idr&geno, *
2
+
2
*a$ua o/i$enaa,.
Esta enzima, la catalasa, lo escompone en a$ua y o/'$eno, por lo "ue se
soluciona problema.
(a reacci!n e la catalasa sobre el *
2
+
2
, es la si$uiente:
Aeacci!n =
(a e/istencia e catalasa en los tejios animales, se aprovec&a para utilizar el
a$ua o/i$enaa como esinfectante cuano se ec&a sobre una &eria. Como
muc&as e las bacterias pat!$enas son anaerobias *no pueen vivir con
o/'$eno,, mueren con el esprenimiento e o/'$eno "ue se prouce cuano
la catalasa e los tejios act)a sobre el a$ua o/i$enaa
CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES
La catalasa (perxi! e hir"e#!$ perxi! e hir"e#! !xi!rre%ctasa& EC
'.''.'.() es %#a e las e#*imas m+s a,%#a#tes e# la #at%rale*a y se e#c%e#tra
ampliame#te istri,%ia e# el !r"a#ism! h%ma#!& a%#-%e s% acti.ia .ar/a e#
epe#e#cia el te0i!1 2sta res%lta m+s ele.aa e# el h/"a! y l!s ri3!#es& m+s ,a0a e#
el te0i! c!#ecti.! y l!s epiteli!s& y pr+cticame#te #%la e# el te0i! #er.i!s!. A #i.el
cel%lar se l!cali*a e# las mit!c!#rias y l!s per!xis!mas& except! e# l!s eritr!cit!s&
!#e se e#c%e#tra e# el cit!s!l.
4
Esta e#*ima es %#a metal!pr!te/#a tetram2rica& c%y!
pes! m!lec%lar se e#c%e#tra e# el ra#"! e 4'56475 kD. C!#sta e 8 s%,%#iaes
i2#ticas -%e se ma#tie#e# %#ias p!r i#teracci!#es #! c!.ale#tes. Caa s%,%#ia
c!#tie#e %# "r%p! pr!st2tic! e pr!t!p!r9iri#a I: y el c!#te#i! pr!t!h2mic! y el e
hierr! represe#ta# %# '&' ; y 5&5< ; respecti.ame#te el pes! m!lec%lar t!tal e la
e#*ima.
3

E# al"%#as especies la CAT c!#tie#e m!l2c%las e #ic!ti#am/# ae#/# i#%cleti!
9!s9ata! e# s% 9!rma re%cia (=ADP>) li"aas estrechame#te a la e#*ima1 as/ se ha
em!stra! -%e la CAT h%ma#a y la e res est+# li"aas a 8 m!l2c%las e =ADP>& '
e# caa s%,%#ia y -%e #! existe i#teracci# irecta e#tre el "r%p! hem! y el
=ADP>.
8
E# la 9i"%ra aparece la represe#taci# e %#a s%,%#ia e la e#*ima.
El =ADP> %#i! a la e#*ima #! est+ i#.!l%cra! e# s% acti.ia catal/tica !
per!xiati.a. Esta m!l2c%la p%ee i#ter.e#ir e# la pre.e#ci# y re.ersi# parcial e la
i#acti.aci# e la CAT p!r s% pr!pi! s%strat! txic! y esta,ili*a a la e#*ima p!r te#er
%# e9ect! al!st2ric! s!,re s% c!#9!rmaci#. Aem+s& la CAT c!#stit%ye %# reser.!ri!
e =ADP>& l! c%al 0%e"a %# imp!rta#te papel %ra#te el estr2s !xiati.!.
?U=CI@= E=AIBATICA
La CAT c!m! parte el sistema a#ti!xia#te est+ i#.!l%craa e# la estr%cci# el
>
4
@
4
"e#era! %ra#te el meta,!lism! cel%lar. Esta e#*ima se caracteri*a p!r s% alta
capacia e reacci# per! relati.ame#te p!ca a9i#ia p!r el s%strat!. Prese#ta 4
9%#ci!#es$ la catal/tica y la per!xiati.a. Am,as se p%ee# represe#tar p!r la ec%aci#$
>
4
@
4
C >
4
R 4 4>
4
@ C R
s%strat! !#a!r CAT
La reacci# "e#eral e#tra3a la re%cci# el s%strat! t!ma#! l!s +t!m!s e hir"e#!
ap!rta!s p!r el !#a!r& y l!s pr!%ct!s 9i#ales ser/a# el s%strat! re%ci! y el
!#a!r !xia!.
E# la 9%#ci# catal/tica& el !#a!r es !tra m!l2c%la e >
4
@
4
. Esta 9%#ci# sl! p%ee
ser reali*aa p!r la e#*ima e# s% 9!rma tetram2rica.
(

>
4
@
4
C >
4
@
4
4 4>
4
@ C C@
4

E# la reacci# per!xiati.a la e#*ima p%ee %tili*ar c!m! !#a!res e hir"e#! al
meta#!l& eta#!l& +ci! 9rmic!& 9e#!l y 9!rmaleh/!.
D
Esta 9%#ci# se p%ee reali*ar
c!# m!#mer!s& /mer!s y tetr+mer!s.
(

La acti.ia e la CAT p%ee ser i#hi,ia p!r el cia#%r!& la a*ia& el s%l9%r!& la
hir!xilami#a& el paracetam!l& la ,le!mici#a& la ariamici#a& la ,e#*ii#a y el para-%at.
-ateriales y -+toos
En esta practica vamos a emostrar la e/istencia e la catalasa en caa una e
las muestras.
%. Colocar en un tubo e ensayo
unos trocitos e &'$ao.
2. =@air 1 mililitros e a$ua
o/i$enaa.
3. >e observar# un intenso
burbujeo ebio al
esprenimiento e o/'$eno.
6i$ura %
*Observa la reacci&n ,,
?i"%ra '
Besnaturalizaci!n e la catalasa
-eiante esta e/periencia, vamos a ver una propiea funamental e
prote'nas, "ue es la desnaturalizacin.
Ca "ue la catalasa "u'micamente es una prote'na, poemos esnaturalizarla al
someterla a altas temperaturas. Puees recorarlo en la pr#ctica e prote'nas.
=l perer la estructura terciaria, perer# tambi+n la funcin y como
consecuencia su funci!n catal'tica, por lo "ue no por# escomponer el a$ua
o/i$enaa y no se observar# nin$)n tipo e reacci!n cuano &a$amos la
e/periencia anterior con muestras e tejios &ervios.
%. Colocar en un
tubo e ensayo
varios trocitos e
&'$ao.
2. =@air a$ua para
&ervir la muestra.
.ervir urante
unos minutos.
D. Bespu+s e este
tiempo, retirar el
a$ua sobrante.
E. =@air el a$ua
o/i$enaa.
E. Observar el
resultao.
6i$ura 2
?i"%ra 4
Cuestionario
%.FEn "ue alimentos se encuentra la enzima catalasaG
2.FEn "ue forma se encuentra la catalasa en caa unos e los alimentos en los
"ue se encuentra en mayor cantia G
D FEn "ue uniaes se reportanG
E. FCual es la temperatura optima e la catalasaG
;. FCual es el p. optimo e la catalasaG
3. F a "ue temperatura se esnaturaliza la catalasaG
H. Fen "ue alimentos se encuentran en mayor cantia y como se encuentran G
,mi!asa
(a ami!asa, enominaa tambi+n 'tia!ina o tia!ina, es un enzima &irolasa
"ue tiene la funci!n e i$erir el $luc!$eno y el almi!n para formar az)cares
simples, se prouce principalmente en las $l#nulas salivares *sobre too en
las $l#nulas par!tias, y en el p#ncreas. <iene un p. e 3. Cuano uno e
estas $l#nulas se inflama aumenta la proucci!n e amilasa y aparece
elevao su nivel en san$re. 6ue la primera enzima en ser ientificaa y aislaa
por =nselme Payen en %HDD, "uien la bautiz! en un principio con el nombre e
diastasa.
--,mi!asa *Iombre alternativos: %,E-J-B-$lucano-$lucano&irolasaK
$luco$enasa,
(as J-amilasas son enzimas epenientes e cloruro, completamente
afuncionales en ausencia e iones e cloruro. =ct)an a lo lar$o e cual"uier
punto e la caena e los carbo&iratos, escomponi+nolos en maltotriosa y
maltosa ese la amilosa o maltosa, $lucosa y e/trina ese la amilopectina.
Bao "ue puee actuar en cual"uier punto e la caena es m#s r#pia "ue la
L-amylasa. En los animales es una enzima i$estiva mayor y su p. !ptimo est#
entre ;.3 y 3.2.
En fisiolo$'a &umana tanto la proceente e la saliva como la pancre#tica son
J-=milasas. Puee encontrarse en al$unas plantas, &on$os y bacterias.
.ir!lisis el almi!n
9er la activia e la enzima, la amilasa o ptialina, presente en la saliva.
Esta enzima act)a sobre el polisac#rio almi!n, &irolizano el enlace O-
$licos'ico, por lo "ue el almi!n se terminar# por transformar en uniaes e
$lucosa.
Es importante "ue recueres las reacciones caracter'sticas e $l)cios para
comprenerla pr#ctica.
(as reacciones "ue nos sirven para ientificar polisac#rios *almi!n, y las "ue
nos permiten ientificar monosac#rios *$lucosa,.
-+too
'. P!#er e# %#a "railla c%atr!
t%,!s e e#say!& #%mera!s el '
al 8.
4. A3air e# caa t%,! E mililitr!s
e %#a s!l%ci# il%ia e
almi#.
3. A l!s t%,!s 3 y 8 a3air %#a
pe-%e3a ca#tia e sali.a.
?i"%ra 3
Para ay%arte y 9!rmar m+s
sali.a& pie#sa e# %# lim# ! e#
al"! -%e te apete*ca m%ch!
c!mer... As/ 9a.!reces -%e
9!rmes m+s sali.a.
?i"%ra 3
E# el t%,! '& ha*
la Reacci# e
?ehli#". ?i"%ra 8
E# el t%,! 4&
reali*a la
Reacci# e
L%"!l. ?i"%ra E
L!s res%lta!s
s!# l!s espera!s
para %#
p!lisac+ri!
c!m! el almi#.
?i"%ra 8
?i"%ra E
?i"%ra (
?i"%ra D
?i"%ra 7
(os tubos D y E "ue contienen el almi!n, al "ue le &emos ec&ao la
saliva, ponerlos en un vaso e precipitaos al ba@o -ar'a, controlano la
temperatura el a$ua para "ue no &ierva, ya "ue lo "ue intentamos, es
"ue la enzima e la saliva trabaje a unos D3: C. Bejarlo unos %1
minutos 6i$ura ; .
= continuaci!n realizar las si$uientes reacciones:
En el tubo n)mero D, realizar la Aeacci!n e 6e&lin$. 6i$ura 3.
En el tubo n)mero E, realizar la Prueba el (u$ol. 6i$ura H
El resultao positivo obtenio en el tubo e ensayo D, nos ice "ue no
&ay ya almi!n, por"ue la amilasa e la saliva &a &irolizao el almi!n
transform#nolo en $lucosa, por eso la reacci!n e 6e&lin$ es a&ora
positiva.
Be una manera similar, poemos interpretar el resultao el tubo e
ensayo E, a&ora nos a la reacci!n e polisac#rios ne$ativa, ya "ue el
almi!n* polisac#rio, se &a &irolizao.
Cuestionario
FBe "ue manera act)a la catalasaG y Fpor "ue libera o/i$enoG
(a catalasa e las muestras est#n en las mismas concentracionesG
Cual es la iferencia entre las catalasas animales y ve$etales e las muestras
"ue trabajaronG
FCuales es la reacci!n e la alfa amilasa sobre los componentes e los
materiales empleaosG
FEs una enzima espec'fica para almionesG
FQue tipo e polimeros contienen las muestras "ue trabajaronG
FQue tipo e azucares tienen estas muestrasG
=r$umente sus conclusiones e las pr#cticas
.
?iblio$raf'a
Estructura y mecanismos de las enzimas
?ersht& A. Str%ct%re a# Becha#ism i# Pr!tei# Scie#ce$ A F%ie t! E#*yme
Catalysis a# Pr!tei# ?!li#". G. >. ?reema#& '<<7 ISH= 56D'(D634(767
Galsh& C.& E#*ymatic Reacti!# Becha#isms. G. >. ?reema# a# C!mpa#y.
'<D<. ISH= 56D'(D655D565
Pa"e& B. I.& a# Gilliams& A. (Es.)& '<7D. E#*yme Becha#isms. R!yal S!ciety
!9 Chemistry. ISH= 567E'7(6<8D6E
B.I. I!lke#shtei#& R.R. D!"!#a*e& A.J. Ba%mar!.& A.D. Ur%sha*e& K%.I.
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S!l%ti!#s L!h# Giley M S!#s I#c. '<<'. ISH= 568D'6'788563
Cintica e inhibicin
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P!rtla# Press (4558)& ISH= '67EED76'E76'.
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and !teady"!tate Enzyme !ystems. Giley6I#terscie#ce1 =eN E eiti!# ('<<3)&
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ISH= 56D4386338'65& p. ED.
Funcin y control de las enzimas en las clulas
Price& =. a# Ste.e#s& L.& ?%#ame#tals !9 E#*ym!l!"y$ Cell a# B!lec%lar
Hi!l!"y !9 Catalytic Pr!tei#s @x9!r U#i.ersity Press& ('<<<)& ISH= 56'<6
7E544<6:
=%triti!#al a# Beta,!lic Diseases
Convenciones para asignar nombres a enzimas
E#*yme =!me#clat%re & Rec!mme#ati!#s 9!r e#*yme #ames 9r!m the
=!me#clat%re C!mmittee !9 the I#ter#ati!#al U#i!# !9 Hi!chemistry a#
B!lec%lar Hi!l!"y.
Aplicaciones industriales
>ist!ry !9 i#%strial e#*ymes & art/c%l! e# i#"l2s s!,re la hist!ria e las e#*imas
i#%striales& e#tre 9i#ales el si"l! :: y el prese#te.