DETERMINACION DE NITROGENO TOTAL Y PROTEINA BRUTA POR EL METODO DE KJELDAHL

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1. INTRODUCCIN

El problema que representa proporcionar protenas adecuadas a la poblacin del mundo
es un tanto secundario en el problema general de alimentacin mundial. Adems de su
significado nutritivo las protenas juegan un papel importante en las propiedades
organolpticas de los alimentos. Las protenas ejercen una influencia controladora en la
textura de los alimentos provenientes de fuentes animales. Las protenas existen en los
alimentos en combinacin fsica o qumica con carbohidratos o lpidos. Las
glucoprotenas y las lipoprotenas afectan las propiedades reolgicas de las soluciones
alimenticias o poseen aplicaciones tcnicas como emulsificantes comestibles.
El analista de alimentos comnmente desea saber el contenido protico total de los
alimentos, aunque dicho contenido est conformado por una mezcla compleja de
protenas. El contenido protenico de los alimentos puede determinarse por medio de
diversos mtodos. La forma ms habitual es su cuantificacin de forma indirecta y
aproximada, bien a partir del contenido en nitrgeno de la muestra, o bien deduciendo su
cantidad a partir del contenido de uno o dos aminocidos particulares que conforman la
protena, fciles de identificar y de cuantificar por su reactividad qumica especfica. Este
segundo procedimiento conlleva una mayor inexactitud. Desde hace ms de 100 aos se
est utilizando el mtodo Kjeldahl para la determinacin del nitrgeno en una amplia
gama de muestras (alimentos y bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el clculo del
contenido en protena. Tambin se utiliza el mtodo Kjeldahl para la determinacin de
nitrgeno en aguas residuales y suelos. Es un mtodo oficial descrito en mltiples
normativas: AOAC, USEPA, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias.
Se llevo a cabo la determinacin de protena de coca y sacha inchi a travs de este
mtodo.



2. OBJETIVOS

Comprender los fundamentos del mtodo Kjeldahl para la determinacin del contenido
en protena de un alimento.
Comprender los mecanismos qumicos que se dan en la determinacin de protenas
por el mtodo de Kjeldahl.
Determinar la cantidad de protena en la coca y sacha inchi.


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3. REVISIN BIBLIOGRAFICA

3.1. Fundamento del metodo de Kjeldahl.
En 1883 el investigador dans Johann Kjeldahl desarroll el proceso bsico del conocido
mtodo actual de anlisis de protenas por el mtodo Kjeldahl, ms propiamente, para
analizar nitrgeno orgnico. En esta tcnica se digieren las protenas y otros
componentes orgnicos de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia
de catalizadores. El nitrgeno orgnico total es convertido en sulfato de amonio. La
mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solucin de
cido brico. Los aniones del borato as formado se titulan con HCl estandarizado, lo cual
se convierte en el nitrgeno de la muestra. El resultado del anlisis representa el
contenido de protena cruda del alimento ya que el nitrgeno tambin proviene de
componentes no proticos. Este mtodo ha sufrido varias modificaciones. As, Kjeldahl
us originalmente permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidacin,
sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se
descart. En 1885 Wilforth encontr que se poda acelerar la digestin con cido sulfrico
aadiendo algunos catalizadores. Gunning en 1889 sugiri la adicin de sulfato de
potasio para elevar el punto de ebullicin de la mezcla de la digestin para acortar la
reaccin. Por lo tanto, el procedimiento de esta tcnica es ms correctamente conocido
como Mtodo Kjeldahl-Wilforth-Gunning.
La convencin general, sobreentendida, es que la totalidad del nitrgeno de la muestra
est en forma proteica, an cuando la realidad es que, segn la naturaleza del producto,
una fraccin considerable del nitrgeno procede de otros compuestos nitrogenados
(bases pricas y pirimidnicas, creatina y creatinina, urea, amoniaco, etc.), por ello se
denomina protena bruta o protena total a la obtenida por este mtodo.
3.2. Procedimiento del mtodo de Kjeldahl
El mtodo consta de tres etapas: DIGESTIN DESTILACIN TITULACIN.
En la DIGESTIN se produce la descomposicin del nitrgeno que contienen las
muestras orgnicas utilizando una solucin de cido concentrado. Esto se obtiene
haciendo hervir la muestra en una concentracin de cido sulfrico. El resultado es una
solucin de sulfato de amonio.
En la etapa de DESTILACIN se libera amoniaco, el cual es retenido en una solucin con
una cantidad conocida de cido brico. Inicialmente se realiza una destilacin con vapor
por el mtodo de arrastre de vapor de agua, mediante la cual acelera la obtencin del
destilado.
Al final, se utiliza la TITULACIN para valorar finalmente la cantidad de amonio presente
en la muestra destilada.
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3.3. Fuentes de error del mtodo de Kjeldahl:
Las principales fuentes de error segn la FAO son:
En el proceso de digestin:

1.- La inclusin de nitrgeno no protico (aunque la cantidad de este nitrgeno suele ser
despreciable comparada con la del nitrgeno protico).

2.- La prdida de nitrgeno durante la digestin. El exceso de sulfato de sodio o potasio
que se aade al cido para elevar el punto de ebullicin, puede producir una
descomposicin por calor y por lo tanto prdida de nitrgeno. Por otro lado, el exceso de
catalizador (de cobre generalmente) tambin puede producir prdidas de nitrgeno.

3.- La digestin incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo de
reaccin o falta de cido sulfrico.


Durante la destilacin:

1.- Neutralizacin incompleta de la mezcla digerida. Es necesario aadir suficiente NaOH
para neutralizar el exceso de cido sulfrico resultante de la digestin as como
transformar todo el amonio formado en la digestin en amonaco.

2.- Perdida de amonaco por fugas en el circuito de destilacin.

3.- Perdida de amoniaco por refrigeracin insuficiente en el condensador.

Otros errores:
Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se aaden al cido (para
elevar el punto de ebullicin) pueden resultar en una descomposicin por calor y la
consecuente prdida de amonaco. Generalmente se recomiendan temperaturas de
digestin de 370-410C.

3.4. Ventajas y desventajas del mtodo de Kjeldhal (fuente: FAO)
Ventajas:
-Apropiado para varios tipos de productos.
-Alta fiabilidad.
-Usado como mtodo de referencia.
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Desventajas del mtodo de Kjeldhal
-Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
-Uso de catalizadores txicos o caros.
-Eleccin del factor de conversin.
Desventajas del uso del factor de conversin:
-Para efectos de clculo se considera el contenido de nitrgeno de la protena
principal y no de toda la mezcla.
-La fraccin analizada no necesariamente es protena pura.
-No se realizan correcciones de nitrgeno no proteico.
-Se ha sugerido determinar el factor de conversin de nitrgeno a protena utilizando
la composicin de aminocidos del alimento a analizar, lo que se complica al
combinar los alimentos, por lo cual se prefiere continuar con el uso de los factores
tradicionales informando a su vez el factor utilizado.
3.5. Contenido de protena en hoja de coca:
El consumo de la hoja de coca data de por lo menos hace 5.000 aos (algunas fuentes
dicen 7.000). Hoy se estima que alrededor de 8 millones de personas en la regin andina
la consumen diariamente. Para muchos de ellos, la hoja de coca es una fuente muy
importante de protenas, minerales y vitaminas. En un estudio realizado por la
Universidad de Harvard en 1975 (The Nutritional Values of the Coca Leaf) la hoja de
coca se caracteriza como una de las plantas ms nutritivas del mundo.
Valor nutritivo de 100 gramos de hojas de coca (Univ. de Harvard, EEUU)
Protenas 19,9 gr.
Minerales
Fsforo 405 mg
Potasio 1110 mg.
Calcio 2191 mg.
Magnesio 911 mg.
Hierro 36 mg.
Zinc 4 mg.
Boro 24 mg.


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Vitaminas
Alfa y beta caroteen 16,6 mg.
B1. 0,8 mg.
B3 1,7 mg.
B6 8,6 mg.
C 2 mg.
E 53 mg.
H 0,5 mg.
3.6. Contenido de protena en hoja de sacha inchi:
Segn la estudios realizados en la Universidad de Cornell (USA) indica que la almendra
de las semillas de sacha inchi contiene 48,6 % de aceite y 29,0 % de protena.

Tabla N1. Contenido de protenas y cidos grasos en sacha inchi y otras oleaginosas








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4. EQUIPOS Y MATERIALES

4.1. Muestras:

- Sacha inchi
- Coca






Figura1: Muestras analizadas
4.2. Equipos o aparatos:

Aparato digestor Kjeldahl modelo K-424 BUCHI

Figura 2: Equipo digestor de protenas

Bomba al vacio












Figura 3: Bomba al vacio
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Aparato destilador.




Figura 4: Aparato de destilacin

Bureta automtica
Erlenmeyers de 500 ml.
Balanza analtica de sensibilidad 0.1 mg.
Molino de martillo de laboratorio.


4.3. Reactivos

Acido sulfrico concentrado.
Acido borico 4%
Acido clorhdrico 0.0845N
Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO45H2O).
Sulfato de potasio
Hidrxido de sodio al 50% (450 g de NaOH en 1 litro de agua).
Papel a prueba de grasa, hojas de aproximadamente 9 x 6 cm.

3.4. Indicadores:
Indicador de fenolftalena
Indicador de Tashiro






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5. PROCEDIMIENTO
5.1. Digestin:
-Se peso por duplicado 2 g de muestra molida (sobre una hoja de papel a prueba de
grasa) y se transfirio a cada uno de los tubos Kjeldahl (papel y muestra problema), se
agrego aproximadamente 0.05 g de sulfato de cobre, 5 g de sulfato de potasio. Por ltimo
se agrego 20 ml de cido sulfrico bajo una campana de extraccin. Esto se repiti para
las dos muestras y el blanco.













Figura 5: Tubos de Kjeldahl con muestras y reactivos

- Se coloco los tubos de Kjeldahl en el digestor, previamente se precalent por 15
minutos el equipo. Luego se calentara suavemente hasta que cese la formacin de
espuma y el contenido se haya licuado completamente, para esto se tuvo que colocar el
equipo en la potencia 10 (temperatura de aproximadamente 370C). Se dejo hervir el
contenido del cada uno de los tubos hasta que la solucin se torno de color verde
esmeralda, se sigue calentando por 45 minutos. El tiempo de digestin total fue
aproximadamente de 2 horas.

Figura 6: Tubos de Kjeldahl con muestras luego de la digestin
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- Se dejo enfriar a unos 40 C y agregar con cuidado aproximadamente 400 ml de agua,
mezclar y se vuelve a enfriar hasta 25 C.

5.2. Destilacin de vapor:
- Se coloco 1 frasco Erlenmeyer con 50 ml de cido brico y 2 gotas de indicador Tashiro
bajo la salida de destilacin.

Figura 7: Erlenmeyer con solucin de acido brico e indicador

- Se transfiri el tubo con la muestra digerida al
destilador, previamente se le agrego cuatro gotas de
fenolftalena. Se encendi el mechero de Bunsen para
calentar el tubo.

-Se aadi aproximadamente 40 ml. aproximadamente
de la solucin de NaOH a la cmara que se encuentra
en la parte superior del equipo. Se dejo caer gota a gota
la solucin, hasta que la mezcla digerida se torno oscura
(azl-gris o caf oscuro). Es decir en cantidad suficiente
para volver todo el contenido a fuertemente alcalino.



Figura 8: Cambio de color de la muestra ya digerida por la adicin de NaOH

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- El destilado estar listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz receptor, es
decir cuando todo el amonaco haya destilado (ms o menos 300 ml).

5.3. Titulacin:
-Se titulo la solucin remanente en el Erlenmeyer, con una solucin valorada de cido
clorhdrico, usando el anaranjado de metilo como indicador, hasta que cambie de color.


Figura 9: Cambio de color de luego de la titulacin con HCl

Este procedimiento se repiti para cada uno de los tubos de Kjeldahl, incluyendo el
blanco.













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6. RESULTADOS

Tabla N2: Resultados de % de protenas experimental y terico
muestra Sacha inchi
N 2
Hoja de coca
N1
Hoja de coca
N2
%Protena
experimental
14.4 27.6 28.7
%Protena
torico
29 19.9 19.9


Tabla 3: % de error experimental en leche en polvo.
Sacha inchi N
2
Hoja de coca
N1
Hoja de coca
N2
% de error
absoluto
50 38 44


7. DISCUSIN DE RESULTADOS

Observando los valores tericos de protenas del sacha inchi segn los
reportes de anlisis realizados en la Universidad de Cornell (USA) se obtiene
un porcentaje de error muy elevado igualmente ocurri con los datos obtenidos
con la hoja de coca ya que se compar con el estudio realizado por la
Universidad de Harvard en 1975 (TheNutritionalValues of the Coca Leaf).
Esta comparacin se puede observar en el cuadro N2.

La fuente de error se debi notablemente en el proceso de destilacin ya
que se trat de construir el destilador pero lamentablemente hubo fugas de
amoniaco, este proceso se realiza preferentemente con un destilador
automtico que puede operar evitando este tipo de errores y en un menor
tiempo (5 min).
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Otra fuente de error segn la FAO, se pudo deber a la prdida de nitrgeno
durante la digestin o al exceso de sulfato de potasio que se aade al cido
para elevar el punto de ebullicin, lo que pudo producir una descomposicin por
calor y por lo tanto prdida de nitrgeno. Por otro lado, el exceso de catalizador
(de cobre generalmente) tambin puede producir prdidas de nitrgeno

Tambin durante la digestin hubo formacin de espumas lo que puede
haber conllevado en una prdida de muestra por lo cual se recomienda
aumentar la intensidad de calor gradualmente y no someter bruscamente a la
temperatura requerida (Glenn H. Brown, Eugene M. Sallee). Es decir no
colocar la muestras directo en grado 10 sino aumentar paulatinamente de grado
de temperatura.

Segn la FAO, el contenido porcentual promedio de N en protenas de
diversos alimentos es de 16 %., por eso el factor para convertir N en protenas
sera entonces 100/16 = 6,25. Este factor general de conversin no es sin
embargo exacto, ya que las protenas de origen animal contienen generalmente
menos nitrgeno y las de origen vegetal ms.

En la digestin un tratamiento con cido sulfrico concentrado, en presencia
de un catalizador y ebullicin convierte el nitrgeno orgnico en in amonio,
segn la FAO la mezcla alcalina de salicilato de sodio, nitroprusiato de sodio e
hipoclorito de sodio da la coloracin verde esmeralda brillante con amonio
caracterstico.
Segn la FAO, el mtodo de Kjeldahl es aapropiado para varios tipos de
productos, por su alta fiabilidad; sin embargo la interferencia de compuestos
nitrogenados no proteicos y el uso de catalizadores txicos hace que se usen
otros mtodos para la determinacin de protena, tales como el mtodo de
Dumas.

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Segn Eva Garcia Martinez citada en la bibliografia, en el proceso de
destilacin se adiciona una cantidad suficiente de hidrxido de sodio en la
muestra digerida, para alcalinizar fuertemente el medio y as desplazar el
amoniaco de las sales amnicas. De esta manera el amoniaco es liberado y
arrastrado por el vapor de agua inyectado en el contenido del tubo durante la
destilacin, y se recoge sobre una disolucin de cido brico.

Segn Eva Garcia Martinez utilizando una solucin receptora a base de
cido brico no se necesita dosificar con precisin, ya que la titulacin mide
exactamente la cantidad de amoniaco neutralizando a 1:1 el complejo formado
por el amoniaco y el cido brico. Tambin indica que es necesario calentar la
solucin receptora como mnimo a 45C para evitar la prdida de amoniaco.


8. CONCLUSIONES

El mtodo de Kjeldahl se digieren las protenas y otros compuestos
orgnicos de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia de
catalizadores. El nitrgeno orgnico total se convierte en sulfato de amonio
mediante la digestin. La mezcla resultante se neutraliza con una base y se
destila. El destilado se recoge en una solucin de cido brico. Los aniones de
borato as formado se titulan con HCL estandarizado para determinar el
nitrgeno contenido en la muestra.

En general, el mtodo Kjeldahl tiene la ventaja de poderse ejecutar
mediante equipos no muy sofisticados y puede ser realizado por tcnicos poco
experimentados, sin embargo en esta prctica no se dieron resultados
experimentales aproximados a los resultados tericos. Adems segn la FAO
se puede utilizar otros mtodos tales como el de Dumas para obtener
resultados mas satisfactorios comparado con el mtodo de Kjeldahl.

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9. BIBLIOGRAFIA
Libros

1- Mtodos de anlisis para la determinacin de nitrgeno y constituyentes
nitrogenados en alimentos. Capitulo 15. Manual of food quality control. FAO

2- Qumica cuantitativa. Glenn H.Brown. Editorial Reverte. pagina 221

Paginas web
3- Garca Martnez, Eva. Determinacin de protenas de un alimento por el
mtodo Kjeldahl. Valoracin con un cido fuerte. Universidad Politcnica de
Valncia. Disponible en: http://riunet.upv.es/

4- Francisco Santiago. Engineering Department J.P Selecta.. Determinacin
de protenas de un alimento por el mtodo Kjeldah. Disponible en:
http://www.grupo-selecta.com/

5- Los efectos teraputicos del consumo de la hoja de coca. Joep Oomen.
2012.Disponible en /www.amigoshojadecoca.org

6- Cultivo de sacha inchi. Instituto nacional de investigacin y extensin
agraria.Autor:Ing. Emma Manco Cspedes. 2006. Disponible en:
http://www.incainchi.es/pdf/1358.pdf










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