Protocolo Hemato 2013

Manual de Hematologa. Dpto. Microbiologa y parasitologa. UNAN-Len.
I

NDICE
CONTENIDO PGINA
I. TOMA DE MUESTRA .............................................................................................................. 1
1. ANTICOAGULANTES USADOS EN HEMATOLOGA. ................................................ 1
3. PUNCIN VENOSA ............................................................................................................ 4
4. PUNCIN CAPILAR............................................................................................................ 7
II. BIOMETRA HEMTICA COMPLETA ................................................................................. 9
1. MICROHEMATOCRITO ...................................................................................................... 9
2. RECUENTO DE GLBULOS ROJOS ........................................................................... 11
3. RECUENTO DE GLBULOS BLANCOS ..................................................................... 13
4. RECUENTO DE PLAQUETAS ........................................................................................ 15
5. DETERMINACION DE HEMOGLOBINA ....................................................................... 18
6. RECUENTO DIFERENCIAL ............................................................................................ 20
7. NDICES CORPUSCULARES ......................................................................................... 30
III. HEMOSTASIA Y COAGULACIN ................................................................................. 32
1. TIEMPO DE SANGRA ..................................................................................................... 32
2. TIEMPO DE COAGULACIN .......................................................................................... 34
3. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP) ................................................................................. 36
4. TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA (TPT) .................................................... 39
IV. TINCIONES ESPECIALES ............................................................................................... 41
1. AZUL CRESIL BRILLANTE (RECUENTO DE RETICULOCITOS) .......................... 41
2. MTODO DE LA GOTA GRUESA PARA EL DIAGNOSTICO DE MALARIA ....... 44
V. OTROS PRUEBAS ................................................................................................................ 49
1. VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN GLOBULAR (VSG) .......................................... 49
2. CLULAS L.E..................................................................................................................... 52
VI. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES.................................................. 54
1. SOLUCIN DE TURK 2% ................................................................................................ 54
2. SOLUCIN DE HAYEN .................................................................................................... 54
3. SOLUCIN OXALATO DE AMONIO 1% ...................................................................... 54
4. EDTA .................................................................................................................................... 55
5. CITRATO DE SODIO AL 3.8% ........................................................................................ 55
II

6. COLORANTE DE GIEMSA .............................................................................................. 55
7. COLORANTE DE WRIGHT .............................................................................................. 56
8. SOLUCIN SALINA FISIOLGICA AL 0,9% .............................................................. 56
9. SOLUCION AZUL CRESIL BRILLANTE....................................................................... 56
10. SOLUCIN DE AZUL DE METILENO FOSFATADO. ............................................ 57
11. SOLUCIN ALCOHLICA DE GIEMSA ................................................................... 57
VII. BIBLIOGRAFA .................................................................................................................. 58

1

I. TOMA DE MUESTRA

1. ANTICOAGULANTES USADOS EN HEMATOLOGA.

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total
para estudiar las caractersticas morfolgicas y realizar los recuentos celulares.
Deben intentar que las clulas sanguneas a estudiar se encuentren en el estado
ms parecido al fisiolgico, como cuando se encuentran circulando por el torrente
sanguneo. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los
leucocitos, el tamao eritrocitario, no producir hemlisis e impedir la agregacin
plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el mximo perodo de conservacin de
la muestra.
La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible, incluso
mantenida bajo refrigeracin (4 C) si no pasan de las 2 horas. El tiempo mximo
entre la extraccin de la sangre y su procesamiento depende del coagulante de
eleccin y no debe ser ms de 4 horas, a excepcin del anticoagulante EDTA
(etilendiaminotetractico) que puede ser hasta 24 horas (en refrigeracin a 4 C).

EDTA (C
10
H
16
N
2
O
8
) o sal disdica, dipotsica o tripotsica del cido
etilendiaminotetractico.
Acta mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca
++
), impidiendo el proceso de
la coagulacin al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la
realizacin de recuentos celulares, sobre todo en los autoanalizadores y permite
adems la realizacin del hematocrito y del frotis sanguneo hasta dos horas
despus de la extraccin de la muestra al mismo tiempo que impide la aglutinacin
de las plaquetas. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio,
por ser ms fcilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del
producto slido, sin embargo , las tres sales afectan el tamao del eritrocito,
2

especialmente despus del almacenamiento de la sangre anticoagulada por
espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in
Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotsica como anticoagulante para
recolectar muestras sanguneas destinadas al recuento y caracterizacin del
tamao celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren
para la calibracin de los contadores automticos. El K
2
EDTA .2H
2
O posee un
peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio inico y el pH para
una solucin al 1% es de 4.8+/-1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a
la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/ml. de sangre total. Esta cantidad es un
compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulacin y la cantidad a
la cual se producen las alteraciones celulares.

Citrato trisdico, C
6
H
5
O
7
Na
3
.
Acta impidiendo que el calcio se ionice, evitando as la coagulacin. Se utiliza
para realizar las pruebas de Hemostasia en una proporcin anticoagulante-sangre,
1:9; as como para la velocidad de eritrosedimentacin en una proporcin
anticoagulante-sangre, 1:4. El citrato sdico se utiliza a una concentracin de
0.106 mol/l (31,3 g/L de C
6
H
5
O
7
Na
3
.2H
2
O).

Heparina sdica. Heparina de litio.
Es un anticoagulante fisiolgico que acta impidiendo que la protrombina se
transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacrido cido. Los frotis
realizados con muestras sanguneas anticoaguladas con heparina producen en las
tinciones panpticas un color azulado y una pseudovacuolizacin celular por lo
tanto no se lo recomienda para tal fin. La proporcin adecuada es de 15-20 UI
(0.1-0.2 mg) de heparina por ml de sangre.

3

2. CDIGO DE COLOR DE TAPONES.

4

3. PUNCIN VENOSA

El mtodo mas comn y rpido para la obtencin de muestras sanguneas es la
venopuncin. La venopuncin consiste en perforar una vena superficial con una
aguja hipodrmica, la sangre es colectada dentro de una jeringa o tubo con
anticoagulante.
La venopuncin es una tcnica que involucra la aplicacin de las normas de
bioseguridad para reducir el riesgo de pinchazos accidentales, salpicaduras, que
pudieran perjudicar la salud del flebotomista.

Materiales y equipos requeridos
Algodn.
Alcohol al 70%.
Ligadura o torniquete.
Jeringas de 5 mL o 10mL.
Agujas Agujas 21Gx 1 (32x8).
Agujas 22Gx1.
Tubos con anticoagulante EDTA.
Caja para descartar material cortopunzante.

Obtencin de la muestra
1) Verificar que los elementos por utilizar estn listos, y que el paciente se
sienta cmodo.
2) Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la
flexin del codo o a 10 cm del codo, sujetar con un medio nudo.

5

3) Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado, en un rea de 2
pulgadas.

4) El paciente deber abrir y cerrar la mano durante unos segundos y despus
la mantendr cerrada, esto ayudar a visualizar las venas superficiales
(Ceflica. Baslica y Mediana Cubital) o palpar la vena si no es posible
observarla.

5) Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de tal manera
que el bisel se encuentre hacia arriba.

6) Se fija la vena y se coloca la aguja en direccin paralela a esta, se perfora
la piel haciendo avanzar la aguja 0,5-1 cm en el tejido subcutneo, hasta
perforar la vena.

6

7) Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido.
8) Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puo. Se coloca
el algodn seco encima de la puncin y se retira la jeringa.

9) Retirar la aguja de la jeringa. Verter la muestra lentamente por las paredes
del tubo con anticoagulante.
10) Mezclar suavemente el tubo para homogeneizar la muestra con el
anticoagulante.

Ventajas de una extraccin de sangre venosa
Pueden hacerse repetidos exmenes con la misma muestra.
Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referencia
futura.

Desventajas de una extraccin de sangre venosa
La puncin venosa, por su largo procedimiento, requiere mayor preparacin
que el mtodo capilar.
El mtodo es tcnicamente difcil en nios, individuos obesos y pacientes
en shock.

Recomendaciones
La hemlisis debe ser evitada, pues se puede obtener una disminucin en
el recuento de eritrocitos.
Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete, pues
produce hemlisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado
7

inadecuado para el anlisis de gases, recuentos celulares, determinacin
de pH sanguneo y algunas pruebas de coagulacin.
La sangre anticoagulada si no es de obtencin reciente no debe ser
utilizada en extensiones de sangre, pues algunos anticoagulantes producen
cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones, agregacin
plaquetaria y dificultan la identificacin de leucocitos.
Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables, los
recuentos de leucocitos y plaquetas e ndice de sedimentacin deben
realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra.

4. PUNCIN CAPILAR
La sangre capilar es la obtenida por puncin cutnea. Es una mezcla de sangre
procedente de arteriolas, vnulas y capilares con lquidos intersticiales e
intracelulares; su composicin depende fundamentalmente de la cantidad de flujo
sanguneo en la zona de puncin y de la profundidad de penetracin de la
lancetas.
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequea o cuando por
diferentes motivos no pueda practicarse una puncin venosa, debe recurrirse a la
puncin capilar.

Materiales
Algodn.
Alcohol al 70%.
Lancetas.
Capilares con heparina.
Capilares sin heparina (frotis sanguneo).

Procedimiento
1) La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anular en
los adultos y del dedo gordo del pie o taln en los nios.
8

2) Desinfectar la zona con alcohol al 70%, secar con algodn estril.
3) Punzar la piel con una lanceta estril desechable (2 mm de profundidad).
4) Usar gasa estril para desechar la primera gota y recoger las siguientes en
tubos capilares. Evitar comprimir la extremidad para obtener sangre porque
se altera la composicin sangunea.

Ventajas
Puede obtenerse con facilidad.
Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifrica.

Desventajas
Slo se pueden obtener pequeas cantidades de sangre y los exmenes de
repeticin requieren nuevas muestras.
La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemoliza
interfiriendo con la mayora de pruebas de laboratorio.
Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no pueden ser
comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa.
El dedo no slo es delicado sino difcil de desinfectar adecuadamente en el
tiempo disponible.
En pacientes con resistencia disminuida a la infeccin (aquellos con
leucemia, agranulocitosis, diabetes, uremia y enfermedades con
deficiencias inmunolgicas), una muestra tomada del dedo es mucho ms
probable que conduzca a una infeccin que otra tomada del brazo.
El recuento de eritrocitos y leucocitos, as como el recuento de plaquetas y
reticulocitos, no debe realizarse en sangre capilar debido a la difcil
estandarizacin del flujo sanguneo capilar.

9

II. BIOMETRA HEMTICA COMPLETA

1. MICROHEMATOCRITO

Fundamento
El hematocrito se basa en la separacin de los elementos celulares del plasma
mediante centrifugacin. Despus que la sangre es centrifugada en un tubo
capilar, las celulas rojas se desplazan hacia al fondo del capilar, las celulas
blancas y plaquetas forman una pequea capa por encima de las celulas rojas, y
el plasma conforma la capa superficial.
Se determina midiendo la fraccin que comprende a los glbulos rojos (masa
globular), respecto al volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar,
reportado en porcentaje.

Materiales
Capilares con heparina
Capilares sin heparina.
Microcentrfuga.
Lector de Microhematocrito.
Sera selladora.
Mechero con metanol.

Procedimiento:
1) Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejo
del dedo, o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosa con
anticoagulante EDTA.
10

2) Debe llenarse aproximadamente 3/4 del capilar. El Llenado se efecta por
capilaridad y se realiza poniendo en contacto uno de los extremos del tubo
capilar con la gota de sangre, o introducindolo en el tubo de sangre e
inclinando este, posteriormente, para facilitar el proceso.
3) Ocluir (tapar) un extremo opuesto del capilar con plastilina o calor
(mechero).
4) Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centrfuga de
microhematocrito, con el extremo ocluido adherido al reborde externo de la
plataforma.
5) Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm.

Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio.

Valores de referencia
Hombres 40% - 50%
Mujeres 36% - 48%
Nios (5 aos) 34% - 42%
Lactantes (3 meses) 37% - 42%
Recin nacidos 51% - 60%
11

Nota:
Se debe homogenizar las muestras para asegurar la calidad del ensayo.
Cada muestra debe montarse en duplicado; el segundo resultado debe de
variar entre 2%.
Si el resultado vara fuera de 2%, deber repetirse el ensayo.
Al realizar la lectura del hematocrito solo incluir la capa de glbulos rojos.

2. RECUENTO DE GLBULOS ROJOS
La sangre se diluye en un lquido que nos permite observar claramente los
hemates, luego esta dilucin se coloca en una cmara de Neubauer con la ayuda
de una pipeta automtica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopio a un
objetivo de 40x para calcular el nmero de glbulos rojos por mm
3
.

Procedimiento (dilucin 1/200):
1) Rotular los tubos y agregar 3980l de solucin de Hayem.
2) Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar del dedo,
se procede a aspirar 20l de sangre con la pipeta y limpiar la punta con
papel absorbente.
3) Depositar la sangre en el tubo que contenga solucin de Hayem y mezclar
suavemente por inversin de 8 a 10 veces.
4) Monte el cubreobjetos en la cmara de Neubauer (debe estar limpia y
seca).
5) Mezclar la dilucin manualmente y depositar 10l en una de las ranuras de
la cmara de Neubauer.
6) Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las clulas se sedimenten.
7) Enfocar con el objetivo de 10x y luego con 40x realizar el recuento:
cuadrante central y los cuatro angulares del retculo de Thomas.

12

Clculos:
# de Eritrocitos/mm
3
=
Eritrocitos contados en 5 cuadrantes (R. Thomas)
Superficie contada x Profundidad x Dilucin

Eritrocitos contados en 5 cuadrantes (R. Thomas)
1/5 x 1/10 x 1/200

Simplificando, obtenemos el factor de multiplicacin:

# de Eritrocitos /mm
3
= Eritrocitos contados x 10,000

Dnde:

*Superficie contada= 0.2 mm
2

*Profundidad de la cmara=0.1
mm
*Dilucin= 1/200

13

Valores de referencia.
(Millones de Eritrocitos/mm3).
Hombres 4 .5 - 5 .5
Mujeres 4. 0 - 5 .0
Nios (4 aos) 4 .2 - 5 .2
Lactantes (1 - 6 meses) 3 .8 - 5 .2
Recin nacidos 5 .0 - 6 .0

3. RECUENTO DE GLBULOS BLANCOS

La sangre anticoagulada se deposita en un lquido que permite evidenciar los
leucocitos, mantenindolos visibles, mientras que los eritrocitos son hemolizados.
El recuento del nmero de leucocitos o glbulos blancos se expresa por mm
3
.

1) Rotular los tubos y agregar 380l de solucin de Turk.
papel absorbente.
3) Depositar la sangre en el tubo que contenga solucin de Turk y mezclar en
un rotador automtico por 2 3 minutos.
seca).
5) Mezclar la dilucin en el rotador automtico y depositar 10l en una de las
ranuras de la cmara de Neubauer.
6) Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las clulas se sedimenten.
7) Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angulares.

14

Lectura.
Se realiza en los 4 cuadrantes. Adems de los leucocitos contados dentro de cada
uno de los cuadrantes, se deben contar todos los leucocitos que se encuentren
adheridos en la lnea horizontal superior y vertical exterior (en forma de L) o de lo
contrario, todos los leucocitos, adheridos a la lnea horizontal inferior y vertical
interior.

Clculos:
# de leucocitos/mm
3
=
leucocitos contados en 4 cuadrantes

= leucocitos contados en 4 cuadrantes
4 x 1/10 x 1/20

# de leucocitos/mm
3
= leucocitos contados x 50
Dnde:
Superficie contada=
4 mm
2

Profundidad de la
cmara= 0.1 mm
Dilucin= 1/20

15

Correccin de valores para restar eritrocitos nucleados:
Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el lquido de dilucin, por lo tanto
pueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con los
leucocitos. Cuando se encuentran 10 ms normoblastos por 100 leucocitos
contados en el diferencial el recuento leucocitario debe ser corregido usando la
siguiente frmula:

La concentracin del nmero de Normoblastos (por mm
3
) es:

Normoblastos/mm
3
= # de normoblastos contados x Leucocitos/mm
3

100 + # normoblastos contados

Leucocitos/mm
3
Corregidos = Leucocitos/mm3 Normoblastos/mm
3

Valores Normales.
Adultos: 5,000 10,000 Leucocitos/mm
3

Recin nacidos: 10,000 25,000 Leucocitos/mm
3

Nios: 8,000 15,000 Leucocitos/mm
3

4. RECUENTO DE PLAQUETAS

Las plaquetas son fragmentos del citoplasma del megacariocito, su vida media es
de 9.5 das, sus funciones principales son: coagulacin y mantener la integridad
de las paredes de los vasos. El recuento de plaquetas se efecta en sangre
obtenida de puncin venosa anticoagulada con EDTA, y sometida a hemlisis por
accin de una solucin hipotnica de oxalato de amonio en agua destilada.

1) Rotular los tubos y agregar 1980l de solucin de Oxalato de amonio al 1%.
16

papel absorbente.
3) Depositar la sangre en el tubo que contenga solucin de Oxalato de amonio
al 1% y mezclar en un rotador automtico por 2 3 minutos.
4) Dejar reposar por 15 minutos.
seca).
6) Mezclar la dilucin en el rotador automtico y depositar 10l en una de las
ranuras de la cmara de Neubauer.
7) Deje reposar por espacio de 15 minutos en cmara hmeda y oscuridad.
8) Enfocar con el objetivo de 10x y luego con 40x realizar el recuento:
cuadrante central y los cuatro angulares del retculo de Thomas.

Clculos:
# de Plaquetas /mm
3
=
Plaquetas contadas en 5 cuadrantes (R. Thomas)
Plaquetas contadas en 5 cuadrantes (R. Thomas)
1/5 x 1/10 x 1/100
Dnde:

*Superficie contada= 0.2 mm
2

*Profundidad de la cmara=0.1
mm
*Dilucin= 1/100

17


# de Plaquetas /mm
3
= Plaquetas contadas x 5,000

Primera semana de vida: 150 - 340,000 plaquetas/mm
3

1 semana a 2 meses: 200 - 400,000 plaquetas/mm
3

2 meses a adultos: 150 - 450 000 plaquetas /mm
3

Causas de aumento (trombocitosis):
La trombocitosis puede ser secundaria a un estmulo medular inespecfico
(posthemorrgica o tras una crisis hemoltica), paraneoplsica o posquirrgica.
Es especialmente importante la que se produce tras la esplenectoma.
La trombocitopenia esencial aislada es muy rara, pero puede aparecer
asociada a trastornos mieloproliferativos. En estos casos, las plaquetas pueden
ser funcionalmente inoperantes y cursar, paradjicamente, con hemorragias.

Causas de disminucin (Trombopenia):
Es fundamental descartar que no se haya producido un error de lectura como
consecuencia de una agregacin parcial de las plaquetas en la muestra
estudiada. Especialmente llamativos son los casos en los que existe una
agregacin precisamente en presencia de EDTA, que es el anticoagulante
utilizado para mantener incoagulable la muestra de sangre en la que se ha de
realizar la lectura.
Las verdaderas trombopenias pueden obedecer a una causa central
(generalmente asociada a leucopenia y anemia), perifrica (inmunolgica,
secuestro, consumo) o mixta (vrica). La prpura trombocitopnica idioptica es
relativamente frecuente.

18

5. DETERMINACION DE HEMOGLOBINA

Fundamento.
La hemoglobina es oxidada por la accin del ferricianuro a metahemoglobina y
mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina. La intensidad del color
formado es proporcional a la concentracin de hemoglobina presente en la
muestra ensayada.

Materiales.
Micropipetas.
Agua destilada
Rotador automtico
Tubos de ensayo 12x75mm.
Reactivo de hemoglobina
Espectrofotmetro.

Procedimiento.
1) Rotular los tubos de ensayo de la siguiente manera BLANCO (BL), y
Muestra (Mx).
2) Dispensar:

2.5 ml de H
2
O destilada 2.5 ml de H
2
O destilada
+ +
1 gota de Reactivo de Hb 1 gota de Reactivo de Hb
+
10 l de sangre/EDTA
Hb
Mx
Hb
BL
19

3) Mezclar e incubar 3 minutos a Temperatura ambiente.
4) Seleccionar la prueba # 5 hemoglobina/540 nm en el espectrofotmetro.
5) Colocar el tubo de ensayo para la lectura del blanco y luego la muestra.
6) Anotar la concentracin que est dada en g/dL.

Valores normales.
Edad g/dL
Recin nacido 13.5 19.5
Tres meses 9.5 12.5
1 ao 11.0 13.0
3 a 6 aos 12.0 14.0
10 a 12 aos 11.5 14.5
Adulto (hombre) 14.0 18.0
Adulto (Mujer) 12.0 16.0

Interpretacin de los resultados.
La hemoglobina es una protena que contiene hierro, otorga el color rojo a la
sangre. Se encuentra en los glbulos rojos y es la encargada del transporte de
oxigeno por la sangre desde los pulmones a los tejidos. Cuando el nivel de
hemoglobina aparece por debajo de los niveles normales indica anemia que puede
obedecer a diferentes causas: anemia primaria, cncer, embarazo, enfermedades
renales o hemorragias.
Si el nivel de hemoglobina es alto puede deberse a cardiopatas, deshidratacin o
estancia en lugares de gran altitud.

Notas:
Linealidad hasta 20 g/dL.
Usar anticoagulantes como EDTA, heparina u oxalato.
Estabilidad de la muestra: 1 semana a 2-8C.

20

6. RECUENTO DIFERENCIAL

FROTIS SANGUINEO
La evaluacin de un frotis sanguneo es una parte rutinaria de la Biometra
Hemtica Completa (BHC). Tinciones son aplicadas a los frotis sanguneos para
que los elementos formes de la sangre (glbulos rojos, glbulos blancos y
plaquetas) puedan ser observados, identificados y evaluados usando en
microscopio como en el conteo diferencial.
Un frotis sanguneo correctamente preparado permite al bionalista clnico
observar los elementos formes de la sangre lo ms cercano a su estado natural.
La morfologa o estructuras de los elementos formes puede ser estudiada.

Partes del Frotis sanguneo

Materiales
Lminas portaobjetos 25.4x76.2mm.
Lminas portaobjetos 25.4x76.2mm con bordes esmerilados.
Tubos capilares sin anticoagulante.
Micropipeta.

Procedimiento
1) Una vez extrada la sangre con cualquiera de las metodologas, se coloca
una pequea gota de sangre (5L) sobre un portaobjeto a 2 cm
aproximadamente de uno de los extremos.

21

2) Colocar un extremo del portaobjeto esmerilado (portaobjeto extensor)
delante de la gota de sangre y desplazarlo suavemente hacia atrs hasta
alcanzar la gota para que se extienda por capilaridad.

3) Formando un ngulo de 45, deslizar suave y uniformemente el portaobjeto
en sentido longitudinal, a velocidad moderada, hasta que la gota de sangre
quede bien extendida hasta 1 cm del extremo final del portaobjeto.

4) Secar el frotis a temperatura ambiente y en posicin horizontal.

22

Frotis sanguneo preparados inadecuadamente

El grosor del frotis sanguneo puede variar segn sea el ngulo que formen entre
s ambos portaobjetos.

Factores que afectan la calidad del frotis sanguneo
La cantidad de sangre depositada en l portaobjeto.
El ngulo formado por la lmina extensora y el portaobjeto.
La velocidad de extensin de la sangre

Si es superior a 45, la extensin obtenida ser gruesa y corta, si es inferior a 45
ser larga y fina.

Notas:
La sangre con anticoagulante debe mezclarse antes de realizar el frotis
sanguneo. nicamente debe utilizarse anticoagulante EDTA porque otros
pueden alterar la morfologa y las caractersticas de las celulas en la tincin.
23

El frotis sanguneo debe realizarse dentro de 2 horas despus de colectada
la muestra.
Las lminas portaobjetos deben estar libre de grasa y polvo. Estas pueden
comprarse previamente limpias o lavar con agua y jabn, enjuagar con
agua caliente y posteriormente con agua destilada, por ultimo sumergir en
etanol al 95% y secar con una toalla libre de pelusas. Una vez limpias
pueden almacenarse en etanol al 95%.

TINCIN CON COLORANTE DE WRIGHT

Fundamento

Con el fin de estudiar satisfactoriamente los frotis sanguneos, es necesario
colorearlos. En la mayora de los laboratorios los colorantes ms empleados para
la tincin hematolgica se basan en el de Romanowsky constituido
fundamentalmente con la mezcla de eosina (cido) y azul de metileno (bsico).
Adems se han incorporado el empleo de derivados por oxidacin del azul de
metileno que se conoce con el nombre de azures (A, B, C). Son los azures los
responsables de la coloracin prpura o roja de ciertas estructuras.
Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de
pH de las diferentes estructuras celulares, de forma que las que tienen carcter
bsico fijan la eosina mientras que las que poseen propiedades cidas fijan
principalmente el azul de metileno.
Esto explica que las estructuras basfilas se tian de color azul mientras que los
competente acidfilas adquieren un color rosado. La diferente afinidad de ciertas
granulaciones citoplasmticas por dichos colorantes permite clasificar a los
leucocitos polimorfonucleares en 3 grupos:
Granulocitos eosinfilos, en los que la granulacin especfica contiene sustancias
de carcter bsicos que fijan los colorantes cidos y se tien de color rojo-naranja.
24

Granulocitos basfilos, en los que la granulacin especfica posee sustancias de
carcter cido que fijan los colorantes bsicos y se tien de color azul oscuro.
Granulocitos neutrfilos, en los que la granulacin especfica posee compuestos
de carcter neutro por lo que fijan ambos colorantes simultneamente, de ah que
se tien de color pardo.
Dentro del grupo de colorante tipo Romanowsky los ms utilizados son el de
Wright, Giemsa y May- Grnwald-Giemsa, entre otras.

Materiales
Colorante de Wright
Puente de tincin
Solucin amortiguada tamponada (H
2
0 destilada)
Pizeta
Papel filtro
Embudo
Beaker.
Algodn con alcohol.

Procedimiento
1) Una vez obtenido el frotis sanguneo, se le dejar secar entre 15 y 20
minutos.
2) Luego se coloca la preparacin en un soporte y se cubre con el colorante
de Wright, dejndolo por espacio de 4 minutos.
3) Posteriormente se aade solucin amortiguada tamponada (H
2
0 destilada)
en partes iguales hasta obtener un brillo metlico, dejando 4 minutos
adicionales.
4) Finalmente se lava con agua corriente, se deja secar y limpiar con un
algodn con alcohol el reverso de la lmina.
25

5) Se coloca en el microscopio y, con pequeo aumento, se revisa la calidad
de la coloracin, la cantidad aproximada de glbulos blancos y se escoge el
sitio para iniciar el recuento. Se coloca una gota de aceite de inmersin y se
enfoca a un aumento de 100x.

Una extensin de sangre bien teida debe caracterizarse por una buena
diferenciacin de las estructuras subcelulares en los leucocitos, una coloracin
rosada de los hemates y la ausencia de precipitados.

Los defectos ms frecuentes observados en la tincin del frotis sanguneo son:
Coloracin excesivamente azul, debido a:
Frotis excesivamente grueso.
Lavado insuficiente.
Tincin muy prolongada.
Empleo de colorante excesivamente alcalino.
Coloracin con una tonalidad rosada: el colorante, el tampn o el agua de
lavado tienen un pH demasiado cido.
Presencia de precipitados: obedecen a una accin excesiva del colorante.
Esto se puede evitar con la filtracin.

RECUENTO DIFERENCIAL DE GLBULOS BLANCOS

Fundamento
El propsito del conteo diferencial es determinar el porcentaje de cada tipo de
celulas blancas en sangre perifrica.
En la sangre se encuentran los leucocitos o glbulos blancos que son las clulas
mviles del sistema inmunitario. Todos ellos difieren en cuanto a su funcin y
morfologa. Los leucocitos no desempean sus funciones cuando se encuentran
en sangre, sino cuando abandonan sta y entran a los tejidos linfoides o a las
zonas donde hay inflamacin intensa. En este sentido, la sangre es un medio de
26

transporte, que le permite a las clulas sanguneas recircular entre los diferentes
tejidos del cuerpo.
Normalmente en sangre se encuentran cinco tipos de leucocitos: monocitos,
linfocitos, neutrfilos, eosinfilos y basfilos. Adems de estas clulas, se
encuentran presentes las plaquetas, que son fragmentos citoplasmticos de los
megacariocitos que se asientan en la mdula sea.
Los leucocitos se estudian en preparaciones coloreadas por dos razones: a fin de
determinar la apariencia normal o anormal de las clulas y sus porcentajes
relativos en el diagnstico de ciertas enfermedades.
Materiales
Microscopio ptico.
Contador manual para diferencial de celulas.
Aceite de inmersin.

Uso del objetivo de inmersion
Enfocar primeramente la lamina con el objetivo de menor aumento, rotar
ligeramente el objetivo hacia un lado. Colocar una gota de aceite de inmersion en
el portaobjeto justamente encima del condesador. El objetivo de inmersion ahora
es rotado cuidadosamente sobre la gota de aceite y la imgenes enfocada con el
tornillo micrometrico. El condensador se eleva al maximo, el diafragma se abre
completamente y se usa la luz maxima.

Lectura del diferencial
Se realiza en la zona donde los glbulos rojos apenas se tocan entre si. Las
celulas se identifican ms fcilmente en esta rea debido a que tienen una forma
algo aplanada, lo que permite una mejor observacin de los componentes
celulares.
27

El conteo diferencial se realiza al contar e identificar 100 glbulos blancos y
reportando el porcentaje de cada tipo celular.

CARACTERSTICAS Y DIFERENCIACIN DE LOS LEUCOCITOS

28

CARACTERSTICAS Y DIFERENCIACIN DE LOS LEUCOCITOS

29

Clculos:
Valores absolutos de glbulos blancos cells/mm
3
=

Recuento total de glbulos blancos cells/mm
3
x % del tipo de glbulo blanco
100

9,000 cells/mm
3
x 60% neutrfilos segmentado
100

= 5,400 Neutrfilos segmentados/mm
3

Estimacin del Recuento Total de Leucocitos
Con el objetivo de 40x localizar la zona ideal de conteo, examinar 10 campos en
esta rea y determinar el nmero promedio de leucocitos por campo y multiplicar
por 2,000.

Leucocitos/ mm
3
= promedio de leucocitos en 10 campos x 2,000

Estimacin de Recuento Total de Plaquetas
Con el objetivo de 100x localizar la zona ideal de conteo, examinar 10 campos en
esta rea y determinar el nmero promedio de plaquetas por campo y multiplicar
por 20,000.

Plaquetas/ mm
3
= promedio de plaquetas en 10 campos x 20,000

30


VALORES DE REFERENCIA DE
RECUENTO DIFERENCIAL (%)
VALORES
ABSOLUTOS
CELULAS/UL
Tipo de Clula 1 mes 6 aos 12 aos Adultos Adultos
Neutrfilos (seg) 15 -35 45-50 45-50 50-65 2,250 - 7,150
Neutrfilos (band) 7-13 0-7 6-8 0-7 0 770
Eosinfilos 1-3 1-3 1-3 1-3 45 - 330
Basfilos 0-1 0-1 0-1 0-1 0 - 110
Monocitos 5-8 4-8 3-8 3-9 135 - 990
Linfocitos 40-70 40-45 35-40 25-40 11,125 - 4,400

7. NDICES CORPUSCULARES

Volumen corpuscular medio
Representa el volumen que, por trmino medio, tiene un hemate. Mediante la
tcnica clsica, el clculo se realizara dividiendo el volumen globular comprendido
en 1 mm
3
de sangre entre el nmero de hemates contenidos en ese mismo
volumen.

VCM (fL)= Hematocrito (%) x 10
# Eritrocitos en millones/mm
3
.

VN: 82 94 fl
31

Hemoglobina corpuscular media
Es la proporcin real de hemoglobina que corresponde, en promedio, a cada
glbulo rojo en cifras absolutas. Relaciona la cantidad de hemoglobina con el
recuento de glbulos rojos.

HCM (pg) = Hemoglobina (g/dl) x 10
# Eritrocitos en millones/mm
3

VN: 27 32 pg

Concentracin de hemoglobina corpuscular media
Es la concentracin de hemoglobina por glbulo rojo en porcentaje. Relaciona la
hemoglobina con el hematocrito. Expresa el tenor hemoglobnico en forma
porcentual respecto al paquete eritrocitario.

CHCM(g/dL) = Hemoglobina (g/dl) x 100
Hematocrito (%)
VN: 32 36 g/dL
Clasificacin morfolgica de las anemias.

32

III. HEMOSTASIA Y COAGULACIN

1. TIEMPO DE SANGRA

Fundamento
El tiempo de sangra prueba la funcin de las plaquetas y de los capilares
sanguneos al medir el tiempo requerido para que una pequea incisin en la piel
deje de sangrar.

Materiales
Algodn
Alcohol al 70%
Lancetas
Papel filtro
Cronmetro

Procedimiento

.

1. Limpie con suavidad el lbulo de la
oreja utilizando algodn embebido en
alcohol al 70%.

2. Haga la incisin en el lbulo de la
oreja, al mismo tiempo cronometrar.
Deje fluir la sangre sin exprimir el lbulo
de la oreja.
33

Clculo
Anote el tiempo transcurrido segn el reloj, o contar el nmero de gotas recogidas
en el papel filtro y multiplicarlo por 30 segundos.

Redondee al medio minuto ms cercano.

Valor de referencia
1 a 4 minutos.

3. Despus de 30 segundos. Recoja la
primera gota de sangre en una esquina
del papel secante. No toque la piel con
el papel.

4. Espere otros 30 segundos y recoja la
segunda gota de sangre.

5. Cuando las gotas de sangre dejen de fluir, detener el
cronmetro.
34

Propsito de la prueba
Diagnosticar ciertos padecimientos hemorrgicos.
Antes de realizar operaciones quirrgicas.
Antes de efectuar una puncin en el hgado o el bazo.

Nota: No realizar la prueba en pacientes que han tomado aspirina en los ltimos
8-10 das.

2. TIEMPO DE COAGULACIN

Fundamento
El tiempo de coagulacin evala la funcin de los factores plasmticos que
intervienen en la coagulacin como la globulina antihemoflica, protrombina y
fibringeno, o que la dificultan como la antitrombina al medir el tiempo que tarda
en coagular una muestra de sangre venosa en un tubo de ensayo a 37 C.

Materiales
Algodn
Alcohol al 70%
Torniquete
Jeringa de 3 ml
Tubos de ensayo 12x75mm
Bao maria
Cronmetro

35

Procedimiento

Clculos
Se notifica como tiempo de coagulacin la media de los dos tubos.
Valor de referencia
5 a 10 minutos a 37 C.
1. Mediante una jeringa extraiga poco
ms de 3 mL de sangre venosa,
Cronometrar el tiempo desde el
momento que la sangre entre a la
jeringa.

2. Llenar 2 tubos de ensayo con 1 mL
de sangre. Taponar con algodn.
Colocar en bao mara a 37 C.

3. Despus de 3 a 5 minutos sacar el
primer tubo del bao mara. Inclinar en
posicin horizontal en rotacin a
intervalos de 30 segundos hasta que la
sangre coagule.

4. Examine el segundo tubo
inmediatamente despus que haya
coagulado la sangre del primero, lo que
por lo general es inmediato.
Cronometrar.
36

Interpretacin
El tiempo de coagulacin est prolongado cuando hay severa deficiencia de todos
los factores de coagulacin, excepto en la trombocitopenia y deficiencia de factor
VII o XIII. Tambin est prolongado en presencia de heparina o anticoagulantes
circulantes endgenos. Un tiempo de coagulacin normal no excluye un desorden
de la hemostasia.

3. TIEMPO DE PROTROMBINA (TP)
Fundamento.
Desde su descripcin por Quick en 1935, el Tiempo de Protrombina (PT) o Tiempo
de Quick ha servido para determinar trastornos de la coagulacin, la PT es la
determinacin ms frecuente junto con la APTT.
Mide el tiempo que tarda en coagular una muestra de plasma, desprovisto de
plaquetas y anticoagulado con citrato sdico, al ponerlo en contacto con una
suspensin de tromboplastina clcica (sustituto de la tromboplastina tisular
fisiolgica). Explora la va extrnseca y comn de la coagulacin en las que
intervienen los factores I (fibringeno), II (protrombina), V, VII y X.
Es una prueba de gran inters y muy utilizada con fines de screening, diagnstico
y control del tratamiento con anticoagulantes orales.

Materiales.
Suspensin de tromboplastina clcica.
Plasma.
Micropipeta.
Cubeta con baln.
Incubadora.
Coagulometro.

37

Obtencin del plasma:
Centrifugar la muestra a 1500 x g 15 min. y transferir el plasma a tubos de
ensayos.
Los plasmas turbios, ictricos, lipmicos o hemolizados pueden dar
resultados errneos.
La muestra es estable 2 horas a temperatura ambiente (15-25C) o 4 horas
a 2-8C.

Procedimiento.
1) El tubo conteniendo la tromboplastina clcica debe ser incubado a 37 C
(dependiendo del volumen 5 a 10 minutos).
2) Encender y esperar que el coagulometro alcance su temperatura optima.
3) Aparecer en la pantalla 0.0 lo que indica que el equipo est listo.
4) Agregar un baln y 100 uL de plasma del paciente en una cubeta.
5) Colocar la cubeta en la ranura central del coagulometro y poner a incubar
incubation 180 a 300 segundos.
6) Tomar con una pipeta 200 uL de tromboplastina clcica y presionar Start,
el equipo realizara una cuenta regresiva de tres segundos. Cuando llegue al
ltimo segundo agregar la tromboplastina clcica en la cubeta.
7) Anotar la lectura y reportar en segundos.
8) Presionar Start para obtener el valor de INR.

Clculos
Los valores se pueden expresar en segundos, pero se recomienda expresarlos en
Actividad porcentual (%), en Tasa de PT (PR), o en tasa internacional normalizada
(INR).
Tasa de PT (PR) = PT del paciente en segundos
PT de plasma normal (pool %) en segundos.
38

ndice Internacional de Sensibilidad (ISI).
La Tasa de PT (PR) se puede convertir a su correspondiente valor internacional
usando el ndice internacional de sensibilidad (ISI). De esta manera se obtiene la
tasa normalizada internacional (INR): INR = PR
ISI

PT (segundos) 13-17 seg
PT (porcentaje) 70-120%
PT (tasa) 0,9 1,2

El tiempo de protrombina es expresado en segundos con el valor del control (cada
cual es la media de pruebas duplicadas). El valor del control (y paciente) depende
de la tromboplastina y de la concentracin del citrato y hematocrito. Un tiempo de
protrombina prolongado indica deficiencia de los factores II, V, VII o X tambin
est prolongado en la hipofibrinogenemia y heparinemia.
El tiempo de protrombina es utilizado como una prueba de despistaje y tambin
como control para pacientes anticoagulados con drogas antagonistas de la
vitamina K.

Notas:
No usar como anticoagulante oxalato sdico, EDTA o heparina.
Anticonceptivos orales, corticoides o terapias con anticoagulantes pueden
influir en los resultados.

39

4. TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA (TPT)

Fundamento.
Esta prueba determina anormalidades en los factores VIII, IX, XI y XII,
precalicrena y quiningeno (va intrnseca de la coagulacin) y factores II, V, X y
fibringeno (va comn de la coagulacin).
La cefalina es un extracto de lpidos del cerebro, que funciona como un sustituto
de plaquetas. El slice micronizado es usado como un activador de los factores XI
y XII. Cuando estos reactivos y el cloruro de calcio son agregados al plasma
citratado, los factores de la va intrnseca son activados, el tiempo para la
coagulacin del plasma se mide.

Materiales.
Plasma.
Micropipeta.
Cubeta con baln.
Incubadora.
Coagulometro.
Tromboplastina parcial (cefalina).
Cloruro de calcio 0,025 M.

Obtencin del plasma:
Centrifugar la muestra a 1500 x g 15 min. y transferir el plasma a tubos de
ensayos.
Los plasmas turbios, ictricos, lipmicos o hemolizados pueden dar
resultados errneos.
La muestra es estable 2 horas a temperatura ambiente (15-25C) o 4 horas
a 2-8C.

40

Procedimiento.
1) La tromboplastina parcial y cloruro de calcio debe ser incubado a 37 C
(dependiendo del volumen 5 a 10 minutos).
2) Encender y esperar que el coagulometro alcance su temperatura optima.
3) Aparecer en la pantalla 0.0 lo que indica que el equipo est listo.
4) Agregar un baln, 100uL de Tromboplastina parcial y 100 uL de plasma del
paciente en una cubeta.
5) Colocar la cubeta en la ranura central del coagulometro y poner a incubar
incubation 180 a 300 segundos.
6) Tomar con una pipeta 100uL de Cloruro de calcio y presionar Start, el
equipo realizara una cuenta regresiva de tres segundos. Cuando llegue al
ltimo segundo agregar el Cloruro de calcio en la cubeta.
7) Anotar la lectura y reportar en segundos.

25 a 43 segundos.

El TPT es una prueba importante de despistaje, detectando las deficiencias ms
insignificantes (debajo de 25% de los niveles normales) de los factores XII, XI, IX,
VIII, X, V. Esta prueba es mucho ms sensible que el tiempo de coagulacin para
la deteccin de estas deficiencias. Su utilidad ms importante es en la deteccin
de las deficiencias congnitas de los factores VIII y IX. No detecta deficiencias del
factor plaquetario tres y factores VII y XIII. Esta prueba es til en el monitoreo de
terapias con heparina.

41

IV. TINCIONES ESPECIALES

1. AZUL CRESIL BRILLANTE (RECUENTO DE RETICULOCITOS)
Los reticulocitos son glbulos rojos inmaduros formados por ARN y protoporfirina
en el citoplasma.
Fundamento
Los reticulocitos contienen una fina red de ARN y protoporfirina que se puede teir
con el azul de cresil brillante. Este colorante en combinacin con una misma
cantidad de sangre anticoagulada se mezcla y con la ayuda de la temperatura
(bao mara) se produce la coloracin de estos eritrocitos jvenes visualizndose
en los frotis sanguneos por microscopa.

Materiales y reactivos
Pipetas Pasteur 230mm
Bao maria
Lminas porta objetos 25.4x76.2mm (1x3).
Microscopio ptico
Azul cresil brillante
Aceite de inmersin

Procedimiento
1) En el tubo de ensayo colocar 3 gotas de sangre total con anticoagulante.
2) Inmediatamente adicionar con la ayuda de una pipeta Pasteur la misma
cantidad de Azul Cresil Brillante.
3) Mezclar la solucin suavemente.
4) Se coloca luego en bao mara (37
o
C) por 15 minutos.
5) Se realizan frotis sanguneos.
6) Se lee con objetivo de 100x.
42

Clculos
Examine por lo menos 100 eritrocitos con el objetivo de inmersin. Cuente
cuidadosamente:
Cantidad total de glbulos rojos.
Nmero total de reticulocitos que haya entre ellos.
El recuento se ha venido haciendo clsicamente de forma manual mediante la
observacin en el microscopio ptico. El resultado se da en porcentaje sobre cada
100 hemates. Es ms til calcular el nmero de reticulocitos por mm
3
, mediante la
frmula:
Reticulocitos/mm
3
= % reticulocitos x millones eritrocitos
100
Reticulocitos % = # de reticulocitos
10
Nota: Cuando disminuye el nmero de eritrocitos como suele suceder en la
anemia, el valor porcentual debe corregirse segn el hematocrito empleando la
siguiente frmula:

Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x Hto paciente
Hto normal
Existe una relacin inversa, aproximadamente lineal, entre el hematocrito y el
perodo de maduracin perifrica de los reticulocitos. De esta forma puede
calcularse otra magnitud de inters clnico denominada ndice de produccin
reticulocitaria (IPR) aplicando la frmula siguiente:
43

IPR = Reticulocitos del paciente x Hto del paciente
Perodo de maduracin en das x Hto normal
Un IPR >3 indica aumento de actividad eritropoytica medular (anemia
regenerativa), mientras que un IPR <2 indica escasa actividad eritropoytica
(anemia arregenerativa)

Relacin entre la respuesta reticulocitaria y el grado de anemia:

Primeras 24 h de vida: 2,0 - 6,0%
1 da a 2 semanas: 0,3 1,5%
2 semanas a adultos: 0,5 - 2,2%

Hematocrito 45 40 35 30 25 20 15
Niveles de Hemoglobina (g/L) 15 13.3 11.7 11.0 8.3 6.6 5.0
Recuento de reticulocitos (%) 1 2 5 10 15 20 30
Recuento de reticulocitos
corregido (%)
1 1,8 4 7 8,3 9 10
Tiempo de maduracin
estimado
1 da 2 das 3 das
ndice de reticulocitos 1 2 5 5 7,5 10 10
44

Variaciones patolgicas
Disminucin de la cifra de reticulocitos (reticulocitopenia)
Aplasia medular, anemias carenciales intensas (megaloblstica y ferropnica),
anemias inflamatorias.
Aumento de la cifra de reticulocitos (reticulocitosis)
Perodo neonatal, anemias hemolticas, anemias posthemorrgicas, anemias
carenciales en fase de tratamiento, mieloptisis (infiltracin neoplsica en la mdula
sea), mielofibrosis idioptica.

2. MTODO DE LA GOTA GRUESA PARA EL DIAGNOSTICO DE
MALARIA

La malaria es una infeccin parasitaria causada por una de las 4 especies del
genero Plasmodium, siendo la ms mortal P. falciparum. En el laboratorio puede
ser diagnosticada mediante la identificacin de las formas parasitarias en un frotis
sanguneo.

Toma de muestra
1) Limpiar con un alcohol el dedo medio de la mano o dedo gordo del pie en
lactantes. Nunca debe hacerse en el dedo pulgar ni en los adultos ni en los
nios.
2) Puncionar con lanceta desechable el borde lateral del dedo. Limpiar la
primera gota de sangre con algodn seco.
3) Presionar para obtener una nueva gota de sangre y tomarla en el centro de
un portaobjeto. Presionar nuevamente para obtener ms sangre y tomar
dos o tres gotas ms grandes sobre el portaobjeto a un cm de distancia de
la gota tomada anteriormente.
45

La sangre debe ser colectada antes de empezar cualquier tratamiento.
La sangre capilar es el espcimen de preferencia, porque los
anticoagulantes pueden alterar la morfologa del parasito y las
caractersticas de la tincin.
4) Extensin en capa fina: utilizar otro portaobjeto limpio para hacer la
extensin. Tocar la gota pequea con el segundo portaobjeto y realizar un
extendido perifrico normal con ngulo de 45.
5) Preparacin de gota gruesa: con la esquina del segundo portaobjeto. Unir
en movimientos rpidos las gotas de sangre ms grandes y extender en
una capa gruesa y uniforme. La sangre no debe removerse en exceso pero
puede extenderse en crculo o rectngulo con 3-6 movimientos.
6) Dejar secar la preparacin de gota gruesa en posicin horizontal,
protegiendo el portaobjeto de las moscas, el l polvo y el calor excesivo.

1
2
3
4
46

Para permitir la deshemoglobinizacin, no debe fijarse la preparacin de
gota gruesa; as evite que esta quede expuesta al metanol o a sus vapores.

Tincin de extensin de sangre con colorante de Giemsa.
Mtodo rpido de tincin de extensiones en capa gruesa y en capa fina sobre el
mismo portaobjetos.
1) Fijar la extensin fina aadindole tres gotas de metanol o sumergindola
en un recipiente con metanol durante algunos segundos.
2) Preparar una solucin de Giemsa al 10% en agua amortiguada, destilada o
desionizada, de pH 7,2; si se necesita poca cantidad, 3 gotas de colorante
por ml de agua bastara para conseguir la concentracin correcta de
solucin de Giemsa. Cada portaobjeto necesita unos 3 ml de colorante
preparado.
3) Vertir suavemente el colorante sobre el portaobjeto; para ellos puede
usarse una pipeta. Otra posibilidad es colocar los portaobjetos hacia abajo
en un disco de tincin cncavo e introducir el colorante por debajo del porta
objeto.
4) Dejar actuar el colorante de 5-10 minutos.
5) Eliminar suavemente el colorante del portaobjeto aadiendo agua limpia
gota a gota; no debe inclinarse el portaobjeto para que caiga el colorante y
lavar a continuacin, ya que as quedar un depsito de espuma sobre la
extensin.
6) Colocar el portaobjeto en la gradilla, con la cara de la extensin hacia
abajo, para que escurra y se seque, asegurndose de que la extensin no
toca el soporte.

5
6
47

Identificacin de Plasmodium spp.

48

Recomendaciones
Si es necesario guardar las preparaciones de gota gruesa realice la precoloracin
antes de teir:
Sumergir durante 1 segundo en azul de metileno fosfatado. Dejar escurrir sobre
una toalla de papel. Despus de esto se puede colorear inmediatamente o dejar
secar en posicin vertical. Las placas as tratadas se pueden guardar varios das.

Dilucin y tiempo de tincin usando tincin de Giemsa comercial
Dilucin Tiempo de tincin Como realizarla
1:20 20 minutos
2 ml Giemsa +
38 ml de bH
2
O
1:50 50 minutos
1 ml Giemsa +
49 ml de bH
2
O
1:100 2 horas
1 ml Giemsa +
99 ml de bH
2
O

49

V. OTROS PRUEBAS

1. VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN GLOBULAR (VSG)

Fundamento
Cuando se deja una muestra de sangre anticoagulada en reposo, los hemates
como tienen mayor densidad que el plasma, tienden a sedimentar, la velocidad de
cada depende de la tendencia que tienen los eritrocitos a formar pilas o rouleaux
y esta a su vez depende de la interaccin de dos fuerzas opuestas: Una fuerza de
atraccin: Las fuerzas de Van der Waals y una fuerza de repulsin: El potencial Z.
El equilibrio entre estas dos fuerzas puede ser alterado por la presencia de ciertas
molculas asimtricas plasmticas, especialmente el fibringeno (Protena de fase
aguda) y las gamma globulinas cuando estn muy aumentadas, estas protenas
funcionan como dielctricos disminuyendo el potencial Z, por lo tanto priman las
fuerzas de atraccin y se acelera la velocidad de sedimentacin.
Para la prueba, la sangre no debe coagularse, motivo por el cual, la sangre
extrada se le adiciona una sustancia anticoagulante (la ms comn es citrato
sdico al 3,8 % en proporcin exacta de 1 parte de citrato por 3 de sangre, es
decir, al 1/4).
La sedimentacin globular se realiza en tres etapas:
Hemaglutinacin: Es la tendencia de los hemates a formar agregados en
forma de "pilas de moneda". Estos sedimentan de forma muy lenta por lo
que van a determinar la velocidad de todo el proceso.
Sedimentacin: Desplazamiento de los hemates hacia el fondo de la pipeta
a velocidad constante.
Acumulo o depsito en el fondo.
El principio fsico de esta prueba se basa en la Ley de Stokes considerando los
hemates como esferas suspendidas en un medio infinito.
50

Materiales:
Tubos Wintrobe.
Pipetas Pasteur.
Soporte de Wintrobe.
Tabla de Wintrobe.
Cronometro.
Procedimiento:
1) Con la ayuda de la pipeta pasteur llenar el tubo Wintrobe hasta la marca de
10 o 1 con sangre previamente homogenizada.
2) Colocar el tubo de Wintrobe en la gradilla de sedimentacin cuidando que
est perfectamente nivelada (vertical, 90).
3) Dejar reposar durante 1 hora evitando cualquier movimiento.
4) Hacer la lectura de los milmetros (mm) sedimentados en 1 hora.
Este es el resultado sin corregir y se reporta VSG sin corregir en mm/hr.

Correccin de los valores de VSG:
Se debe realizar la correccin de los valores de VSG a pacientes con anemia,
utilizando la tabla de Wintrobe, que relaciona el Macrohematocrito con el valor en
mm de la VSG.
1) Centrifugue por 30 minutos el tubo de Wintrobe y obtenga el valor de
Macrohematocrito.
2) En la tabla de correccin de VSG, ubique en el eje de la Y la VSG mm/hr y
en el eje de la X el valor del macrohematocrito.
3) Luego intercepte los puntos y descienda hasta la lnea de la mujer y hasta
la lnea del hombre, cuando alcance la lnea que corresponda detngase y
siga recto hasta encontrar el valor de la VSG corregida.
4) La escala de la VSG esta graduada de 2 en 2 y la escala del
macrohematocrito esta graduada de 1 en 1.
51

Factores que afectan a la VSG:
Factores Plasmticos. Los ms importantes son las protenas
plasmticas, especialmente el fibringeno y las globulinas (sobre todo alfa-
1-antitripsina, haptoglobina, etc...). La Albmina posee un escaso efecto
sobre la VSG. Se cree que estas protenas disminuyen la carga
electrosttica de la membrana de los hemates, disminuyendo la repulsin
entre ellos y favoreciendo su agregacin.
Factores Fsicos. Sobre todo la morfologa eritrocitaria y el VCM,
observndose que a mayor tamao de los hemates, mayor velocidad de
sedimentacin.
Factores Ajenos a la Sangre. Tales como temperatura, hemlisis, tiempo
transcurrido desde la extraccin o limpieza de material

Los valores elevados pueden deberse a:
Causas Fisiolgicas: Embarazo, Envejecimiento, Crecimiento normal
Causas Patolgicas: Anemias intensas (especialmente microcticas y
ferropnicas), Procesos Inflamatorios Crnicos, IAM (Infarto Agudo de Miocardio),
Insuficiencia Renal, Neoplasias, tumores y hemopatas, Gammapatas
Monoclonales, Aumento de la fraccin de las globulinas.
Las causas ms frecuentes de valores disminuidos:
Policitemias, Alteraciones eritrocitarias, e Hipofibrinogenenemia (disminucin
concentracin de fibringeno plasmtico.
Valores Normales
Edad Hombre Mujer
Menor a 50 aos < 15mm/hr < 20mm/hr
52

Mayor a 50 aos <20 mm/hr <30 mm/hr

2. CLULAS L.E.

Fundamento
Se denomina clula LE a una clula fagoctica del sistema inmune que
ha fagocitado el material nuclear desnaturalizado de algn otro tipo de clula. Por
lo general esta clula fagoctica es un macrfago o un neutrfilo. El ncleo
desnaturalizado puede ser observado ocupando la porcin central de la clula
fagoctica (esto es conocido como cuerpo LE), mientras que el propio ncleo de la
clula fagoctica por lo general queda extendido en forma de herradura en la
periferia. Las clulas LE fueron descubiertas en 1984 por Hargraves y
colaboradores.

Materiales
Mortero con piln.
Pipeta Pasteur.
Colador.
Tubos Wintrobe.
Centrifuga.
Laminas portaobjetos 25.4x76.2mm (1x3).
Colorante de Wright.
Aceite de inmersin.
Microscopio ptico.
Incubadora.
53

Procedimiento
1) Extraer 10 ml de sangre y dejar coagular durante 2 horas a 37 C.
2) Centrifugar a 3,500 rpm por 10 minutos.
3) Eliminar el suero y depositar el coagulo en el colador, que est sobre el
mortero.
4) Aplastar el coagulo con el piln y recoger el producto en el mortero.
5) Pasar el lquido obtenido a un tubo Wintrobe con la pipeta Pasteur, y
centrifugar 15 minutos a 2000 rpm.
6) Usando la misma pipeta Pasteur, eliminar primero el suero hemolizado, y
luego tomar la capa de leucocitos y depositar en dos lminas portaobjeto
para realizar el frotis.
7) Aplicar la Tincin Wright a los frotis.
8) Observar e identificar las clulas LE en las preparaciones usando el
microscopio a un objetivo de 100x.

Resultados
Se reporta No se Observan Clulas LE Se Observan Clulas LE

54

VI. PREPARACIN DE REACTIVOS Y COLORANTES

1. SOLUCIN DE TURK 2%
cido actico glacial 2,0 mL
*Solucin acuosa de violeta de genciana al 1%........ 1,0 mL
Agua destilada.. 100 mL
*puede ser sustituido por 1 gota de cristal violeta.

Procedimiento
Se mezclan todos los reactivos y se guarda en frasco de vidrio en lugar fresco a
temperatura ambiente.

2. SOLUCIN DE HAYEN
Bicloruro de mercurio 0,5 g
Sulfato de sodio 5,0 g
Cloruro de sodio 1,0 g
Agua destilada 200 mL

Procedimiento

3. SOLUCIN OXALATO DE AMONIO 1%
Oxalato de amonio 1,0 g
55

Agua destilada c.s.p. 100 mL
Procedimiento
4. EDTA
EDTA en polvo.. 8 g.
Agua destilada.. 100ml

Procedimiento
Se mezcla el EDTA en el agua destilada.

5. CITRATO DE SODIO AL 3.8%
Citrato de sodio 3,8 g
Agua destilada. 100 mL

Procedimiento
Se mezcla el citrato de sodio en el agua destilada.

6. COLORANTE DE GIEMSA
Colorante Giemsa en polvo .. 1,0 g
Metanol (CH3 OH) .. 66,0 mL
Glycerol . 66,0 mL

Procedimiento
1) Disolver el colorante con el glicerol.
2) Adicionar el metanol, mezclar bien y dejar a temperatura ambiente de 7 a
14 das (maduracin).
56

3) Filtrar antes de su empleo. Guardar en frasco color oscuro.

7. COLORANTE DE WRIGHT
Colorante de Wright 0,3 g
Metanol (CH3 OH) .. 97,0 mL
Glycerol . 3,0 mL

Procedimiento
Disolver en un mortero el colorante con el glicerol. Una vez disuelto se adiciona el
metanol trasvasndolo a un frasco oscuro (color caramelo), luego agite. Filtrar
antes de usar.

8. SOLUCIN SALINA FISIOLGICA AL 0,9%
Cloruro de sodio 0,9 g
Agua destilada c.s.p. 100 mL

Procedimiento

9. SOLUCION AZUL CRESIL BRILLANTE

Azul cresil brillante.. 1 g.
Citrato trisodico 0.4 g.
Solucin de NaCl al 0.85%....................................................... 100ml

57

Procedimiento

10. SOLUCIN DE AZUL DE METILENO FOSFATADO.
Azul de metileno en polvo 1g
Fosfato disdico (N
a
HPO
4
).. 3g
Fosfato monopotsico (KH
2
PO
4
) 1g
Agua destilada.. 300 ml

Procedimiento
Mezclar en mortero seco y disolver 1 g de la mezcla en 300 ml de agua destilada,
filtrar si es necesario.

11. SOLUCIN ALCOHLICA DE GIEMSA
Giemsa en polvo.. 0.75g
Alcohol metlico. 65.0 ml
Glicerina pura 35.0 ml

Procedimiento
Preparar en botella con perlas de vidrio, la cual se mantiene bien tapada y agitar 6
a 10 veces diarias. Despus de 3 das se puede usar, si los ensayos demuestran
que el colorante es satisfactorio; filtrar si es necesario.

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VII. BIBLIOGRAFA

Rodak F. Bernadette. Hematologa: Fundamentos y Aplicaciones Clnicas.
2a ed. Buenos Aires: Media Panamericana; 2004.
Ruiz Arguelles, G. Fundamentos de Hematologa. 4a ed. Mxico: Editorial
Panamericana; 2009.
Vives Corrons, J. Aguilar Bascompte, J. Manual de Tcnicas de Laboratorio
en Hematologa. 3a ed. Espaa: ELSEVIER; 2006.
Barbara H. Estridge Anna P. Reynolds. Basic Clinical Laboratory
Techniques. 6th ed. USA: DELMAR CENGAGE Learning; 2012
Carr, Jacqueline H. Atlas de Hematologa Clnica. 3a ed. Buenos Aires:
Mdica Panamericana; 2010.

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