ELECTROFORESIS DISCONTINUA Y FOCALIZACION ISOELECTRICA:

I. OBJETIVOS:
Analizar las tcnicas de anlisis de electroforesis discontinua y focalizacin
isoelctrica
Profundizar conocimientos acerca de la aplicabilidad de estas tcnicas en la
industria alimentaria
II. INTRODUCCION:

La electroforesis es un mtodo estndar de separacin de partculas que involucra el
movimiento de molculas cargadas en un campo elctrico. La direccin y la velocidad de
movimiento de estas molculas depende del signo y el nmero de cargas.
Una molcula cargada se mover a una velocidad (v) determinada por su carga (q), el
campo elctrico aplicado (E) y el coeficiente de friccin (f):
V = E . q / f
El grado de migracin de dicha molcula es adems dependiente de su tamao y forma, y
de la viscosidad del medio a travs del cual se mueve. Existen dos tipos de electroforesis
de acuerdo al medio en el cual se produce la migracin:
Electroforesis libre: se realiza en medio lquido. Consiste en un tubo en U que
contiene la solucin buffer a pH adecuado para que todas las partculas
migren al polo positivo (nodo). Se deposita sobre este buffer la mezcla a
separar y la migracin se sigue por un sistema ptico que mide los cambios de
ndice de refraccin.
Electroforesis de zona: en este caso las partculas se desplazan en un
soporte (agar, agarosa, celulosa, almidn, slica, acetato de celulosa,
poliacrilamida, etc.) que confiere una estructura porosa al medio, otorgndole
estabilidad en la separacin. La electroforesis discontinua y focailzacion
isoelctrica se encuentran en este tipo.
III. FUNDAMENTO TEORICO:
1. DEFINICIONES
Electroforesis discontinua: se emplean dos geles que difieren en la concentracin del soporte y en
el pH de la solucin buffer empleada en su preparacin. Se construyen verticalmente uno encima
del otro. El primero de estos, el superior, se prepara con un buffer de pH ms cido y a menor
concentracin de acrilamida-Bis, produciendo un gel con poros de mayor tamao y ms flexible.
Este gel es denominado concentrador, espaciador o stacking ya que las protenas sembradas
tienden a acumularse en bandas estrechas y definidas al comienzo del segundo gel, denominado
separador. El gel separador, en el que se produce la separacin real de las protenas de la muestra,
esta ubicado por debajo del anterior, posee mayor concentracin de acrilamida-Bis y el pH del
buffer utilizado es ms alcalino.
Electroforesis discontinua con geles de poliacrilamida:
Tcnica que se utiliza para conseguir mximas resoluciones. Consiste en concentrar una fina capa
demuestra. El sistema de geles se prepara en una columna vertical constituida por 3 regiones:
superior ogel muestra y otra intermedia o gel espaciador ( ambos con mayor tamao de poro y
menos concentrado) y la inferior o gel separador. Se preparan en un tampn y a distintos pHs. El
mayor tamao de poro permite una mayor movilidad de molculas que en el gel separador. La
baja fuerza inica crea una resistencia elctrica mayor, donde el campo elctrico es mayor en
regiones superiores con lo que la movilidad es mayor en regiones muestra y espaciador. Los
distintos componentes ademas de acumularse se apilan por orden de movilidades. Al final del
proceso se extrae el gel del tubo de vidrio y se procede a la identificacin de las zonas


Isoelectroenfoque: El isoelectroenfoque es una tcnica empleada para mejorar la separacin,
consiste en someter a las protenas a un campo elctrico en un soporte adecuado en el cual se
estableci un gradiente de pH. Cada protena se ubica en la zona del gradiente de Ph
correspondiente a su pI; una vez que alcanz esta posicin, detiene su movilidad.

2. Condiciones requeridas para lograr buenos resultados en una electroforesis en geles de
poliacrilamida
a) Pureza de los reactivos: Una acrilamida o una Bis-acrilamida de mala calidad puede contener
cantidades significativas de cido acrlico, poliacrilamida lineal o contaminantes inicos. El cido
acrlico puede copolimerizar con la acrilamida, conduciendo a cambios de pH locales. La
poliacrilamida lineal puede estar presente por autopolimerizacin previa durante la etapa de
produccin o almacenaje. Los contaminantes inicos pueden actuar tanto como inhibidores o
aceleradores de la polimerizacin. Los iniciadores de la polimerizacin, persulfato de amonio y
TEMED (N,N,N,N tetrametil etilendiamina), tienen que ser de buena calidad ya que pueden sufrir
oxidacin o descomposicin perdiendo su capacidad cataltica.
b) Tipos de iniciador y concentracin: La velocidad de polimerizacin y principalmente las
propiedades del gel dependen de la concentracin de los iniciadores. El aumento de las
concentraciones disminuye la longitud promedio de la cadena del polmero, incrementa la
turbidez del gel y disminuye la elasticidad del mismo. Un exceso de persulfato de amonio puede
oxidar las protenas y cambiar el pH del buffer, mientras que el exceso de TEMED puede
reaccionar con las protenas y alterar la disposicin de las bandas.
c) Temperatura: El calor acelera la polimerizacin, las altas temperaturas producen geles
inelsticos y de cadenas de polmeros cortas. La polimerizacin a bajas temperaturas resulta en gel
turbio, poroso, de baja elasticidad y mala reproducibilidad, debido a la formacin de puentes
hidrgenos del monmero. La temperatura ptima es entre 23 y 25 C.
d) Oxgeno: Inhibe la polimerizacin ya que puede atrapar radicales libres.
e) Aditivos: Los detergentes no afectan significativamente la polimerizacin, mientras que el
agregado de urea y formamida puede causar la formacin de geles de poro de menor tamao
3. Inicio de la Electroforesis discontinua
Al inicio de la electroforesis, las muestras se colocan en un pozo. El volumen puede ser
variable en cada muestra aunque la cantidad de protena debe ser constante.








Compactacin (stacking)
El primer gel o gel de compactacin (stacking) es de mayor poro (menor porcentaje de
acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH ms cido que el segundo gel.

Separacin en el gel resolutivo
El segundo gel, o gel de resolucin, es el que realmente separa a las protenas. Presenta un
poro menor y un pH de 8.8

UTILIZACIN EN ANLISIS DE ALIMENTOS
Los mtodos electroforticos se utilizan preferentemente en la qumica de los alimentos como
comprobacin y con menos frecuencia para determinaciones cuantitativas, de sustancias cargadas
elctricamente o de aquellas que se dejan llevar con facilidad en las cargadas elctricamente
(complejos borato y molidato en azcares, complejos de azcares en almidn).
Son especialmente apropiados para la analtica de protenas (comprobacin de adiciones de
protenas extraas, diferenciacin entre diversas protenas, reconocimiento de variaciones como
desnaturalizacin) y tambin de aminocidos (separacin previa), aminas, cidos e iones
inorgnicos. La electroforesis se utiliza sobre todo en investigacin para determinacin de
sustancias (especialmente de protenas: punto isoelctrico) o de alimentos (Mapping de protenas)
de forma que por ej. se pueden diferenciar varios tipos (mapa de patatas de Stcgeinaiin} y tambin
para preparacin de sustancias puras (enzimas, inhibidores enzimticos).
Se pueden separar complejos proteicos (por ej. casena: Kirchmeicr 1975). Es posible la
determinacin del peso molecular de la pro tena sencilla en detergentes (dodecilsulfato sdico) o
urea as como en un tampn que contenga cloruro de guanidio (por ej. Bietz 1972).
Finalmente se puede comprobar la pureza de por ej. Protenas (Peterson 1971). Es posible la
determinacin de la formacin de complejos entre dos componentes uno de los cuales por lo
menos se mueve en un campo elctrico, por ej. Mediante la electroforesis en cruz de Nakamitra.
Revisiones generales vienen ofrecidas por IMitz (1965), A't-r (1974) y (respecto a la electroforesis
en actalo de celulosa) Scliciicriiiaiin (1971). La tabla 9 ofrece ejemplos para la utilizacin de tipos
de electroforesis especiales.
Las ventajas generales de los mtodos clectroforticos son la rapidez (en el caso de sustancias de
bajo peso molecular se compara con la cromatografa en capa fina o en papel, en el de las
maciomoleculares con la cromatografa en gel). y comparando con los mtodos cromato-grficos,
una marcada y mayor sensibilidad en parte de ellos (electroforesis discontinua, focalizacin
isoelctrica), por lo que el limite de reconocimiento de cada una de las sustancias a analizar y el
mtodo de anlisis son muy diferenciables.
Adems son apropiados porque en general la separacin del alimento transcurre muy bien de
forma que no es necesario poco o nada de tratamiento. Sin embargo esto est unido a una
desventaja fundamental del mtodo: slo se puede utilizar para sustancias cargadas
elctricamente. Por lo tanto, slo cuando estas sustancias se utilicen con mucha frecuencia
merece la pena la adquisicin de los aparatos que son caros (FIE, discontinua)

Tabla. Ejemplos para la utilizacin de tipos especiales de electroforesis en el anlisis de
alimentos

Sustancia a analizar Alimento Bibliografa
Electroforesis en capa fina
aminocidos aminas bigenas
enzimas
Pescado y sus productos
judas verdes
Menzel(\9T2)
Fcker(\914)
De lince e (1973)

Electroforesis en gel de
poliacrilamida
Protenas:
Yema de huevo modificaciones
durante la conservacin
diferentes tipos
Clara de huevo
clara de huevo
cacahuete
vino
carne
Feilllet (1973)
Koehler (1974)
Srikanta (1974)
Ebermann (1972) .
Spell(1974)

Electroforesis discontinua
Pectinas
Protenas:
Leche diferentes tipos
productos crnicos
cerveza
uvas
trigo
Stein (1975)
Lotz (1973)
Ten Hoopen (1973)
Drawert 1974)
Mfdit (1976)
Chang(l970)
modificaciones por el calor
Focalizacin isoelctrica
Enzimas
judas verdes
patatas
Delinees (1975)
Kaiser (1974)
inhibidores de proteinasas
protenas:
determinacin de tipos
trigo blando

frutas, legumbres
uvas
trigo duro
Drawert (I 972)
Rodla (1972)
Windemann (1973)


Isotacoforesis
Protenas


cidos
Zumos de cerveza
(varios mtodos de
tratamiento)
Mezcla modelo
Everaerts (\ 974)

Kyser(l976)

Electroforesis de gel de almidn
Protenas del suero lcteo
leche en polvo Koning (1971)