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DOSAGE DES PHOSPHATASES

Rappel
La conservation des chantillons de sol devant servir aux analyses enzymatiques doit toujours
se faire (+4C)
Peses
La rise d!essai est de "##m$ de sol our la hoshatase % ceendant cela n!est as une r&$le
a'solue( ce oids eut varier selon la nature du sol)
*n fait quatre (4) eses ar chantillon de sol + le remier sera le tmoin enzyme(,-) et les
trois autres constituent les essais (-))
Tampons et pH
*n utilise d!une art le tamon .c /lvain ou le tamon 0niversel .odifi 1 comris entre
2)3 et 4 our la phosphatase acide et d!autre art le tamon 0niversel .odifi 1 "" our
la phosphatase alkaline)
1) Tampon Mc Ilvain o !"it#ate Phosphate $%%e#)&
5olution 6 #(". + 7issoudre "8(9"$ d!acide citrique dans "###ml d!eau dminralise)
5olution : #(9. + 7issoudre 2;(42$ de <a
9
1=*
4
(21
9
* (7i'asic 5odium =hoshate) ou
dissoudre >"(>$ de <a
9
1=*
4
( "91
9
* dans "###ml d!eau dminralise)
=our rarer le tamon rorement dit au 1 voulu( on fait le mlan$e des deux solutions 6
et : selon le ta'leau ci?ar&s
-xemle + x ml d!6 + y ml de : dilu un volume total de "## ml)
@oir ta'leau de corresondance ci?dessous)
6(A) :(B) 1
44(4 2(4 9(4
49(9 >(3 9(3
;8(3 "#(9 ;
;>(> "9(; ;(9
;2(8 "4(" ;(4
;;(8 "4(" ;(4
;9(; ">(> ;(3
;#(> "8(; 4
98(4 9#(4 4(9
9>(3 99(9 4(4
94(> 9;(; 4(4
92(9 94(3 4(3
94(; 92(> 2
9;(; 94(> 2(9
99(9 9>(3 2(4
9" 98 2(4
"8(> ;#(; 2(3
">(8 ;9(" 4
"4(8 ;;(" 4(9
"2(4 ;4(4 4(4
";(4 ;4(4 4(4
8(" 4#(8 4(3
4(2 4;(4 >
') Tampon (nive#sel Modi%i
5olution stocC + 7issoudre dans 2##ml de <a*1 ". successivement le roduit suivant +
?"9("$ de ,ris (hydroxymthy) aminomthane
?""(4$ d!acide malique
?"4$ d!acide citrique monohydrate
?4(;$ d!acide 'orique
?comlter "###ml avec de l!eau dminralise et $arder (+4C)
Tampon ) pH* + rlever 9##ml de la solution stocC + 2##ml 7!eau dminralise( ajust le
1 4 avec de 1Cl et comlter "L)
Tampon ) pH 11 + rlever 9##ml de la solution stocC+ 2##ml 7!eau dminralise( ajust
le 1 "" avec de <a*1 et comlter "L)
Rema#+e + les solutions stocC comme le tamon se conservent (+4C))
,) -e s.st#at
5olution de =<== "##m$ dans "#ml 2m. d!eau dminralise $arder D9#C et en
flacon fum ou ar dfaut rot$er avec du aier aluminium) =<== si$nifie (? <itrohenyl
=hoshate))
Le su'strat ne doit as Etre $ard endant lus de deux jours s!il n!est as con$el)
/) -es #acti%s
5olution de CaCl
9
#(2. + 7issoudre >;(2$ de CaCl
9
( 91
9
* dans "L d!eau dminralise)
5olution de <a*1 #(2. + 7issoudre 9#$ de soude dans "L d!eau dminralise) Ces deux
solutions se conservent la temrature am'iante)
0) -e Dosa1e et inc.ation
,moin 5u'strat(,5) + 4##Fl de tamon + "##Fl de <==
,moin -nzyme(,-) + 4##FL de ,amon + "##m$ de sol + "##Fl 1
9
*
-ssai (-) + 4##Fl ,amon + "##m$ de sol +"##Fl <==
@ortexer doucement et incu'er endant "h dans une tuve r$le ,23C et sous a$itation )0n
seul tu'e our ,moins su'strats suffit our toute la mani)
*) A##4t de la #action
6u 'out d!une heure de tems( on sort les tu'es de l!tuve et on ajoute "##Fl de la solution de
CaCl
9
dans tous les our comlexer la raction)
6$iter et ajouter 4##Fl de <a*1 our enfin arrEter la raction)
Le contenu est vers dans les tu'es eendorfs et centrifu$ endant 2mn "# ### tours) *n
rcu&re le surna$eant et on le asse au sectrohotom&tre)
2) -ect#e
La lecture de la densit otique se fait la lon$ueur d!onde de /55nm et renant comme
rfrence un tmoin 'lanc 1
9
*)
Lire ensuite le tmoin su'strat)
Chan$er de cuve et lire successivement tmoin enzyme et les essais)
"#F$ de <== corresond une 7* de #(49#)
PROTO"O-E DE -A 6-(ORES"EI7E DIA"ETATE
Rappel8
La conservation des chantillons de sol devant servir aux analyses enzymatiques doit toujours
se faire (+4C)
Peses
=rise d!essai otimis 11 de sol our la fluorescine diactate + ceendant cela n!est as une
r&$le a'solue( ce oids eut varier selon la nature du sol)
*n fait 4 eses ar chantillon de sol + le "
er
sert de tmoin enzyme (,-) et les trois autres
constituent les essais (-)) =rvoir un tu'e sans sol our tmoin su'strat (,5)) 6 cause de
l!actone( il est rfra'le d!utiliser des tu'es en verre)
1) Tampons et pH +
*n utilise le tamon otassium hoshate au 1 >(4
Tampon potassim phosphate &
5olution stocC de C
9
1=*
4
et de G1
9
=*
4
4# m. +
7issoudre 3(>$ de G
9
1=*
4
et "(;$ de G1
9
=*
4
dans 3##ml d!eau dminralise)
6juster le 1 >(4 avec de <a*1)
Comlter "L et $arder 4C)
') S.st#at +
C!est la fluorescine diacetate ou H76 + rf + H>;>3 (si$ma)
=rarer une solution "m$ Iml dans de l!actone et conserver 9'53"8
,) Racti%s &
*n utilise soit le mlan$e chloroformeImthanol (' & 1) ou de l!actone "##J)
=our la remi&re otion + rlever 444ml de chloroforme et comlter "L avec du mthanol)
/) Dosa1e &
,5 (tmoin su'strat) + "2ml de tamon + 9##Fl de H76
,- (tmoin enzyme) + "2ml de tamon+ 9##Fl 1
9
* + "$ de sol
- (essai) + "2ml de tamon + 9##Fl de H76 + "$ de sol
:oucher les tu'es et vortexer l$&rement)
/ncu'er endant "h sous a$itation ;#C)
0) A##4t de la #action &
/l se fait ar le mlan$e chloroformeImthanol ou ar l!actone "##J)
6u 'out d!une heure d!incu'ation( rlever dans des tu'es eendorfs "ml de cette solution et
ajouter "ml d!actone)
@ortexer et centrifu$er endant 2mn "### toursImn)
*) -ect#e a spect#ophotom:t#e &
=rlever "ml du surna$eant et lire la 7* au sectro /;5 nm8
Rema#+e &
=our la lecture( faire l!auto zro du sectro avec #F$ Iml de la fluorescine standard)
Lire dans l!ordre + ,moin su'stratK) -ssais)
Haire un tmoin su'strat our chaque chantillon)
0tiliser des cuves sectro en verre cause de l!actone
Gamme talon de la %lo#escine)
") 5olution m&re de fluorescine "m$ Iml
7issoudre "##m$ de fluorescine (H >2#2 5/L.6) dans "##ml d!actone)
9) 5olution fille de fluorescine "## F$Iml
7iluer "ml de la solution D m&re dans 8ml d!actone
Cali'ration des standards + Haire 4 oints de $amme de la mani&re suivante +
#F$ + "###Fl de tamon + "###Fl d!actone + #Fl de la solution standard
"F$ + 88#Fl de tamon + 88#Fl d!actone +"#Fl de la solution standard
9F$ + 83#Fl de tamon + 83#Fl d!actone +9#Fl de la solution standard
;F$ + 8>#Fl de tamon + 8>#Fl d!actone + ;#Fl de la solution standard
4F$ + 84#Fl de tamon + 84#Fl d!actone + 4#Fl de la solution standard
2F$ + 82#Fl de tamon + 82#Fl d!actone + 2#Fl de la solution standard
@ortexer et lire la 7* 48# nm

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