Universidad Centroccidental

Lisandro Alvarado
Decanato de Ciencias de la Salud














ACTIVIDAD PRACTICA No. 7 BIOLOGIA CELULAR
CENTRIFUGACIN Y ELECTROFORESIS























Octubre 2009


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TCNICAS DE FRAGMENTACIN Y SEPARACIN DE LOS
COMPONENTES DE LAS CLULAS
Fragmentacin celular El fraccionamiento subcelular es un conjunto de
mtodos y tcnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o
enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea ste un orgnulo
(mitocondrias, ncleos, peroxisomas, etc.) una fraccin de membrana
(membrana total, plasmtica, dominio basolateral, dominio apical, etc.),
complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtbulos, poros
nucleares, etc.).
Fases:
Preanaltica: Obtencin preparacin preliminar de la muestra hasta llegar
al laboratorio.
Analtica: o de aplicacin de procedimientos. Toma y tratamiento de
datos, recogida de resultados en un informe.
Post-analtica: Validacin tcnica del informe analtico.
Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas:
Ruptura de las clulas o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular)
en el que la fraccin deseada se encuentre en condiciones adecuadas
para su purificacin.
Separacin de la fraccin deseada del resto de componentes de la
clula o del tejido mediante algn criterio como puede ser una diferencia
de densidad (centrifugacin en gradientes o centrifugacin diferencial),
la presencia de algn antgeno (cromatografa de inmunoafinidad,
inmunoprecipitacin, etc.).
Tcnicas de ruptura de clulas y tejidos: El primer paso en la purificacin de la
mayora de las protenas y estructuras subcelulares es la ruptura de los tejidos
o de las clulas para obtener un lisado celular en el que la protena, el complejo
multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que
permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos
mecnicos suaves conocidos generalmente como homogenizacin. Estos
mtodos producen la ruptura de las membranas celulares, suavemente, con lo
que se libera el contenido celular.
Los procedimientos de homogenizacin ms comunes son: La purificacin de
cada uno de los principales organelos subcelulares, represent un gran logro
en la Biologa celular al hacer posible el estudio detallado de sus estructuras y
funciones metablicas. La purificacin se inicia con la ruptura de la pared
celular, de la membrana plasmtica, o de ambas. Las clulas deben estar
suspendidas en una solucin con pH y concentracin de sales apropiada.
Normalmente se emplea sacarosa isotnica (0,25%) o una combinacin de
sales similar a las de la clula.




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El proceso de fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas:
HOMOGENIZACION Se trata de romper las clulas con la ayuda de un mbolo
rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de
cristal especial, el homogenizador. Clulas anexas: primero se deben romper
conexiones con otras clulas. Clulas no anexas: pueden separarse teniendo
en cuenta forma, densidad o caractersticas que puedan marcarse. Existen
dispositivos de homogenizacin en los que est calibrada la separacin entre el
mbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamao de
partcula determinado. Consiste en el procesamiento del tejido y posteriormente
de las clulas con el fin de obtener una mezcla fluida en la cual estn todos los
componentes celulares, para lo cual podemos recurrir a diversos mtodos
fsicos.







Homogenizador de Esferas Fragmentacin celular por accin del choque de las
esferas de vidrio con las clulas.
Tamao de esferas:
0.1 mm: Bacterias, esporas.
0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, clulas animales no anexas,
clulas tripsinizadas.
1.0, 2.5 mm: Cerebro, msculo, piel, hojas.
La cantidad de esferas debe ser al menos el 50% del volumen total de la
biomasa-lquido.
Homogenizador de mbolo y tubo Potter, Potter- Elvehjem, Dunce, Ten Broeck.
Separacin mbolo-pared del tubo calibrada segn tamao de partcula
deseado. Los tejidos deben ser previamente disociados y se suspenden en un
volumen exceso de medio (4-10 veces). Fraccionamiento de tejidos animales.
Preferido en preparacin de organelos subcelulares de tejidos frgiles como
cerebro e hgado. (Accin suave). Permite un mejor control de la temperatura
generada por la friccin. No es eficiente en la fragmentacin de
microorganismos
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SHOCK OSMOTICO La clulas se hacen estallar al someterlas a un medio
hipotnico, lo cual hace que la membrana no resista la presin osmtica.
Puede ocasionar el dao a las membranas de algunas organelas. No se
recomienda porque en algunas organelas se lesiona la membrana. Es utilizado
para el aislamiento: Mitocondria y Cromosomas Mitticos








MORTERO Y MANO Es un mtodo convencional de rompimiento por friccin.
Pueden emplearse materiales abrasivos como cuarzo, vidrio molido, arena, o
materiales silceos. La masa celular contenida en un volumen de buffer se
mezcla con un volumen de medio moledor (0.5 1). La friccin sobre las
clulas genera calor que puede afectar la actividad que se desea estudiar.
Actualmente se dispone de homogenizadores ms sofisticados que emplean el
mismo principio, pero que permiten controlar el nivel de friccin y la
temperatura del proceso, son conocidos como potters. Los principales
problemas de esta tcnica son: la eficiencia baja cuando se usan pequeas
cantidades de medio moledor o cuando es baja la concentracin celular; la
friccin genera calor y pueden presentarse alteraciones en las protenas.





SONICACION Consiste en la aplicacin de ultrasonidos a una suspensin
celular. La intensa agitacin producida destruye las membranas celulares.
Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energa aplicada se pueden destruir
asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos.
Se suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que
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podra provocar la desnaturalizacin de las protenas. Se transmite una
corriente elctrica a un sistema mecnico, que la convertir en vibraciones de
alta intensidad generndose ondas de ultrasonido que generan millones de
burbujas microscpicas, las cuales se expanden y colapsan contra las clulas
causando la ruptura de su membrana. Este fenmeno llamado cavitacin
puede incrementarse adicionando al medio finsimas esferas de vidrio.
Ultrasonificacin Generacin de intensas ondas snicas en medio lquido. Se
transmite una corriente elctrica a un sistema mecnico, que la convierte en
vibraciones de alta intensidad generando ondas ultrasnicas que forman
millones de microburbujas que se expanden y colapsan contra las clulas:
CAVITACIN. El choque de ondas rompe membranas y an enlaces
covalentes. Mayor accin por adicin de esferas de vidrio. El Sonicador tiene
dos forma de operar, por Pulsos: Las Vibraciones de ultrasonido pueden
transmitirse en una solucin en un rango de 0,1 a 0,9 pulsos por segundo,
permitiendo una adecuada sonicacin sin generacin importante de calor y
continuo: Puede ser usado de forma continua por hasta 15 minutos.
Con este sistema se puede lograr la ruptura de levaduras entre 3 y 10 minutos
o de E. coli con 40 segundos. Presenta los siguientes inconvenientes: alta
generacin de calor de las muestras que se mantienen en congelamiento, los
tejidos duros (piel o tendn) se deben macerar previamente; se pueden generar
radicales libres, el dao por oxidacin de radicales libres puede minimizarse
adicionando cisteina, ditiotreitol o algn otro componente -SH en el medio. Por
Radicales Libres: Lesin en membrana celular, aberraciones, cromosmicas
menores y cambios de tipo Fisiolgicas. Uso en Transferencia de DNA
plasmdico en Protoplasmos y clulas intactas; con expresin temporal de un
gen testigo. Flexible: Protoplasmos, Clulas en Suspencin y en fragmentos de
tejido con la misma sencillez.
CONGELAMIENTO-DESCONGELAMIENTO: Requiere de periodos
prolongados de tiempo (hasta 36 horas) para el congelamiento y
descongelamiento. El lquido al congelarse a -56 C forma cristales muy finos
que rompen la clula cuando esta se descongela rpidamente a 37C. Tejidos
animales y vegetales y masas microbianas pueden congelarse con nitrgeno
lquido y molerlos en mortero comn. Aparato fracturador: pulverizador de
tejidos Bessman. Fragmenta 10 mg 10 g de tejido. Procedimiento largo (36 h).
SEPARACION DE LOS ORGANELOS: La separacin puede ser llevada a cabo
empleando la centrifugacin. Manejando las variables fuerza centrifuga y
tiempo podemos separar primero los organelos de mayor tamao como el
ncleo. En centrifugaciones sucesivas de mayor fuerza gravitacional y mayor
tiempo obtendremos las diferentes fracciones de nuestro inters. La etapa final
es la obtencin del citosol que es un lquido complejo el cual contiene los
elementos del citoesqueleto y entre el 25 - 50% de las enzimas celulares. De
acuerdo a la ley de Stokes, tambin podemos separar las organelas de
acuerdo a sus densidades relativas con respecto a un gradiente de densidades.


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LISIS CELULAR

Las clulas se lisan y los componentes subcelulares se separan mediante una
serie de centrifugaciones que van aumentando de velocidad. Despus de cada
centrifugacin, los orgnulos que se han sedimentado en el fondo del tubo, se
recogen en forma de precipitado slido. El sobrenadante se centrifuga a una
mayor velocidad para sedimentar la siguiente organela ms grande. Se
sedimentan las estructuras ms grandes y pesadas con mayor rapidez

.
7

VERIFICACION DE LA PUREZA DE LOS ORGANELOS SEPARADOS
MORFOLOGIA Se verifica la pureza mediante microscopa electrnica.
MARCADORES ENZIMATICOS: Cada organela presenta unas enzimas
exclusivas, las cuales pueden ser empleadas como marcadores de su pureza.
METODOS INMUNOQUIMICOS Se pueden obtener grados mximos de
pureza en los organelos y macromolculas mediante tcnicas de separacin
como la cromatografa de afinidad.

ELECTROFORESIS











La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente
elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao
y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez en el ao 1937, pero su importancia vino a
incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L. Durrum y Arne W.K. Tiselius
, impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asign a la separacin
de materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte;
aunque este termino se limit originalmente al anlisis de coloides y partculas
submicroscpicas , se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa
aplicada a sustancias de bajo peso molecular.

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1. Fundamentos de la electroforesis
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un
campo elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y
+), en dependencia de una combinacin de su carga, peso molecular y
estructura tridimensional.
Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son de alta
sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como mtodo de
separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y otras
biomolculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer
tambin mediante estas tcnicas, las caractersticas cido-bsicas de las
protenas presentes en un extracto crudo, lo que da la informacin necesaria si
se pretende realizar una separacin cromatogrfica basada en diferencias de
carga. Es til adems para determinar otros parmetros como peso molecular,
punto isoelctrico y nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas.
La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al
producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma
de la molcula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
V = q E / f
La movilidad electrofortica (Me) es un caso particular de la velocidad de
migracin de un in, cuando se aplica un campo elctrico de 1 V/cm. Su signo
es igual al de la carga de la partcula.
La velocidad de migracin electrofortica depende de la densidad de carga de
la molcula (relacin carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del
gel de electroforesis. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente
porque se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede
ocurrir una pobre separacin, por causa de la difusin por tiempo muy
prolongado de la corrida electrofortica.
La mayora de las biomacromolculas (protenas, cidos nucleicos y
polisacridos) poseen determinada carga elctrica con grupos aninicos y
catinicos capaces de disociarse. La carga neta de la partcula est dada por el
pH del medio y puede ser modificada por la interaccin con pequeas
molculas de iones u otras macromolculas. De lo anterior se deduce que el
pH influye sobre la velocidad de migracin de las molculas.

En el punto
isoelctrico de la biomolcula, pH al cual su carga neta es 0, esta no migra. Por
debajo del punto isoelctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el ctodo, y
por encima del punto isoelctrico tienen carga neta negativa y migra hacia el
nodo.

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2. Mtodos electroforeticos zonales. Son los
ms comunes, dada su alta aplicabilidad en
diferentes campos. Son tiles para lograr la
separacin de mezclas complejas. Se aplican
pequeas cantidades de la disolucin de
protenas a un soporte slido, que se impregna
con una solucin tampn.
Los soportes son en general polmeros y forman
un gel poroso que restringe el movimiento de
las molculas a travs del medio durante la
electroforesis y disminuyen los flujos de
conveccin del solvente. Como soporte han sido utilizados papel (celulosa),
almidn, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este
mtodo tiene gran poder resolutivo porque se aplica una cantidad pequea de
protena a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho
mayor que la zona de aplicacin.
El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u
horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos Los ms utilizados son:
10

2.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se
forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente
entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser
preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes
con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que
permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado.
Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se
puede modificar de manera controlada en el tamao del poro, lamentablemente
cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxicidad.

2.2. Formacin del gel de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin vinlica del
monmero acrilamida CH
2
=CH-CO-NH
2
y del monmero entrecruzador N, N'-
metilen-bis-acrilamida CH
2
= CH- CO - NH - CH
2
- NH - CO - CH = CH
2
. La
polimerizacin se inicia con la formacin de radicales libres del monmero, que
se producen por radicales libres de oxgeno, por causa de la accin de iones
persulfato. Las aminas terciarias como el N, N, N, N-tetrametilen-diamina
(TEMED) se emplean como catalizadores de esta reaccin, porque causan la
formacin de radicales libres del persulfato.

Esta reaccin es fuertemente
inhibida por altos niveles de oxgeno, por lo que la solucin debe ser
desgasificada para lograr una formacin de gel reproducible. Hay muchos
factores que desempean una funcin importante en la separacin
electrofortica, como son pH, fuerza inica, gradiente de potencial, tiempo de
corrida, concentraciones de acrilamida y bis-acrilamida, etc. Las condiciones
ptimas de una buena separacin, en la prctica se determinan
experimentalmente, con el anlisis de cmo influyen los diferentes factores en
11

la electroforesis en cuestin. La naturaleza de la muestra sirve de gua para
alcanzar las condiciones en la que se deben obtener los mejores resultados.
2.3. Significacin de % T y % C
La concentracin de acrilamida (% T) representa el porcentaje en peso del
monmero total empleado (acrilamida + entrecruzador en gramos por 100 ml) y
determina la longitud promedio de la cadena del polmero. La concentracin de
bis-acrilamida (% C) representa el porcentaje de este monmero en el gel y
determina el grado de entrecruzamiento.
La estructura del gel comienza a ser evidente a 4 % T; 0,2-5 % C.

Los factores
que gobiernan la talla del poro del gel son complicados, pero en general el
tamao del poro disminuye con el incremento del % T. Las proporciones en que
ambas se encuentran determinan las propiedades fsicas del gel como su
densidad, elasticidad, resistencia mecnica y el tamao del poro. En general se
recomiendan valores de T de 5 a 15 % y de C de 2 a 4 %.

para separar
molculas por tamao, es necesario tomar en cuenta la relacin entre el poro
efectivo del medio y el tamao de la molcula que se pretende separar. Si el
poro del medio es significativamente mayor que la molcula, la separacin
electrofortica ser sobre la base de diferencias de carga y el tamizaje
molecular ser mnimo. Al aplicar muestras biolgicas en un gel con gradiente
de acrilamida, todas las macromolculas comienzan su migracin a bajo
porcentaje y en la medida en que avanzan se encuentran con poros ms
pequeos que retardan su movimiento. Las molculas menores comienzan a
tener alta friccin cuando los poros son ms pequeos, mientras que las
grandes comienzan la friccin en los poros de mayor tamao.
2.4. Catalizadores empleados en la formacin del gel de poliacrilamida
La polimerizacin se lleva a cabo con la utilizacin de sistemas catalticos
redox como por ejemplo:
Persulfato de amonio (agente oxidante) y TEMED como agente reductor.
Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN).
Perxido de hidrgeno, sulfato de hierro y cido ascrbico.
La polimerizacin no ocurre a bajo pH, ya que requiere radicales de
monmeros libres formados por catlisis bsica de radicales oxgeno del
persulfato.
La fotopolimerizacin con riboflavina no es inhibida por el oxgeno, sin
embargo, en ambos casos el TEMED acta como agente reductor suave y
acelera la polimerizacin.


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2.5 Sistemas de tampn que se emplean en la electroforesis en geles de
poliacrilamida
La fuerza inica (m) determina el potencial electrocintico ya que reduce la
carga neta de los grupos con cargas efectivas. Se ha determinado que la
movilidad de las partculas cargadas es inversamente proporcional a la raz
cuadrada de la fuerza inica, a baja m se eleva la velocidad de migracin y es
menor la difusin, de manera que la zona de separacin es ms ancha y mayor
la resolucin. Con el aumento de la m, se incrementa el desprendimiento de
calor y la evaporacin. En la electroforesis, los efectos de absorcin de agua,
no-homogeneidad del material, intercambio inico con grupos cargados del
soporte y electroendsmosis, pueden influir sobre la movilidad y la calidad de la
separacin. La electroendsmosis generalmente ocurre porque grupos
cargados del soporte se ionizan en soluciones tampn, neutras o cidas y los
contraiones libres hidratados
(H
3
O
+
) migran hacia el ctodo, esto provoca un movimiento relativo del
solvente respecto al soporte slido y que las molculas no cargadas sean
transportadas hacia el ctodo a pesar de no tener grupos ionizados.
La electroforesis en geles de poliacrilamida puede realizarse en el rango de pH
de 2 a 11, sin embargo la desaminacin de las protenas o las reacciones
hidrolticas pueden ser severas a valores de pH inferiores a 3 y superiores de
10. La mayora de las protenas con puntos isoelctricos comprendidos entre
pH 4 y 7,5, son separadas en geles con pH entre 8 y 9.
La fuerza inica del sistema tampn debe mantenerse a un nivel adecuado
para garantizar la solubilidad de la muestra y suficiente capacidad
amortiguadora. Es usual utilizar concentraciones de tampn en un rango entre
0,025 y 0,1 mol/L, pero pueden emplearse concentraciones sobre 0,5 mol/L en
sistemas fuertementes cidos, pues a bajos valores de pH muchos cidos
dbiles (que son los ms empleados) estn dbilmente ionizados y es
necesaria una alta concentracin para obtener la adecuada capacidad
amortiguadora.
2.6. Sistemas de electroforesis. Electroforesis de mltiples zonas (MZE)
El sistema de electroforesis a emplear depende de los objetivos a alcanzar, los
ms empleados son gel uniforme y tampn homogneo, y gel y tampn
heterogneo. La principal desventaja del primero, es que la resolucin es
menor que con los sistemas heterogneos, porque no hay efecto concentrador
en la primera parte de la corrida. En el sistema discontinuo o heterogneo se
varan el poro del gel y los iones del tampn, por lo que se puede concentrar la
muestra. Cuando no es necesaria una gran resolucin, los sistemas
homogneos tienen la ventaja de ser rpidos, sencillos. Las bandas,
especialmente de protenas pequeas, son ms anchas en el sistema
homogneo que en el heterogneo, efecto que se compensa con la mayor
pendiente de este ltimo.
13

En la actualidad es comn que la electroforesis discontinua se realice con 2
tipos de geles, un gel concentrador (de poros grandes) y un gel separador (de
poros pequeos). Esto se fundamenta en que los constituyentes inicos de las
soluciones tampones utilizadas en ambos geles son iguales, pero el pH de
estas y el tampn de corrida empleado en los electrodos es diferente. La
separacin ocurre en el gel separador, donde la migracin est determinada
por la carga y el tamao molecular de las partculas. Encima de este gel se
sita el gel concentrador, generalmente de una menor altura (1/3 del gel
separador), en el que la muestra se concentra en una zona muy estrecha; lo
que determina la separacin en bandas finas en el gel separador y alto poder
de resolucin. El proceso general en PAGE-SDS discontinuo consta de 3
etapas: concentracin, desconcentracin y resolucin.
La teora de MZE fue formulada por Jovin. Al aplicar esta teora a un sistema
con tris-HCl en ambos geles y tris-glicina como tampn de corrida, se observa
que las 2 especies inicas existentes Cl
-
(iones conductores) y glicinato (iones
rezagados) migran en la misma direccin que las molculas de la muestra. Al
comenzar la electroforesis, los iones Cl
-
tienden a moverse rpidamente,
separndose del resto de las especies inicas y dejando tras de s una zona de
baja conductividad. La conductividad especfica es inversamente proporcional a
la fuerza del campo elctrico, se forma un gradiente de voltaje en esta regin
que acelera el movimiento de los iones rezagados, lo que hace que estos
migren en seguida detrs de los iones conductores y a la misma velocidad; de
esta manera se forma el denominado lmite de Kohlraush, entre los iones
conductores y los rezagados (entre las regiones de alto y bajo gradiente de
voltaje). Las movilidades de los componentes de la muestra son intermedias
entre las de los iones conductores y rezagados, por lo que se encontrarn en la
regin lmite, en capas de solo algunos micrones de grosor.

Cuando la muestra
concentrada llega a la interfase entre el gel concentrador y separador, ocurren
cambios en la movilidad de los constituyentes por causa del pH, la fuerza inica
y el efecto de tamizaje del gel.
Dependiendo de los componentes individuales de la muestra estos migran en
bandas discretas.
La principal ventaja de la teora de MZE es la flexibilidad con que puede ser
aplicada en el fraccionamiento analtico o preparativo.
2.7. Formatos de la PAGE
Existen 3 formas diferentes de realizar electroforesis en geles de poliacrilamida:
lmina vertical, varilla cilndrica y lmina horizontal.
Los geles ms finos son ms econmicos porque emplean menos reactivos y
pueden ser eficientemente refrigerados durante la corrida, por lo tanto pueden
ser corridos a mayor voltaje, logrndose as una alta resolucin en corto
tiempo. Los tiempos de tincin y decoloracin son menores tambin porque la
difusin es muy rpida; sin embargo como el gel es tan fino es ms propenso a
perturbaciones y problemas en la polimerizacin.
14

Se ha planteado que la resolucin de las molculas generalmente aumenta con
la disminucin del grosor del gel.
2.8. Comportamiento de las protenas en la electroforesis en geles de
poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (PAGE-SDS)
La electroforesis con SDS es un excelente mtodo para identificar y monitorear
las protenas durante un proceso de purificacin; tambin se emplea para la
determinacin del peso molecular de las subunidades de protenas.
La estructura del detergente SDS empleado en esta variacin de la
electroforesis en gel de poliacrilamida es CH
3
(CH
2
)
10
CH
2
=

SO
3
-N
a
+
. El anin
se une a las protenas por absorcin no especfica (aproximadamente una
molcula de SDS por cada dos residuos de aminocidos, con una relacin
SDS/protena mximo de 1,4 g/g). El SDS desnaturaliza por completo las
protenas y rompe las interacciones no covalentes que determinan la estructura
terciaria y cuaternaria. Los grupos alifticos dodecil se colocan en el interior,
mientras que los grupos sulfato en la superficie y todos los complejos SDS-
protena toman carga neta negativa (que excede la carga intrnseca de las
cadenas de aminocidos). Las protenas reaccionan con SDS a relativamente
alta concentracin, pero se ha demostrado que 0,4 % de SDS es el nivel
mnimo necesario para saturar los sitios de unin de la protena, sin embargo,
se emplea 1 % para lograr un margen de seguridad.
El Rf es una medida convencional de la movilidad de la protena relativa al
frente de migracin y se define como la distancia desde el inicio del gel
separador hasta el centro de cada banda dividida entre la distancia a la que ha
migrado el in lder.

La concentracin apropiada de SDS en el tampn superior, se determina
incrementando la cantidad de SDS hasta que no exista variacin en el Rf. Se
ha demostrado que concentraciones en el rango de 0,02 a 0,025% de SDS en
el tampn superior es suficiente, sin embargo se utiliza 0,03 % para obtener un
margen de seguridad.
El complejo SDS-protena tiene forma de varilla con un dimetro aproximado de
18 y una longitud proporcional al peso molecular de la cadena polipeptdica.
El tratamiento concomitante con un agente reductor de puentes disulfuro, como
el beta mercaptoetanol ( ME) o el DTT desnaturaliza las protenas y las rompe
en las subunidades que la componen. Por lo que el complejo SDS-protena
tiene generalmente mayor densidad de carga y menor tamao que las
protenas nativas. Se ha determinado que con 5 min a
95-100
o
C es suficiente para la formacin de enlaces estables SDS-protena a
una concentracin de 1 % de SDS, en presencia de EDTA y condiciones
reductoras. El complejo SDS-protena, es estable durante 3 meses a 4
o
C. El
15

SDS migra ms rpido que el complejo protena-SDS en un gel restrictivo, por
lo que el SDS no es necesario adicionarlo en los geles si este est presente en
la muestra y en el tampn superior, lo que da la ventaja de asegurar las
condiciones y la eficiencia de polimerizacin de los geles sin SDS.
La migracin de los derivados protena-SDS hacia al nodo es inversamente
proporcional al logaritmo de su peso molecular (log PM). La relacin
carga/masa es aproximadamente igual para todas las protenas de la muestra
por lo que la talla de esta deviene en el factor determinante de la separacin. El
SDS-PAGE se emplea para estimar el peso molecular de las protenas y se
compara con un patrn. No obstante ha sido reportado que diferentes protenas
de igual talla pueden migrar como una banda nica.
Bajo iguales condiciones de pH y temperatura, el SDS y las protenas se
concentran en la misma zona, pero como la cantidad de SDS es muy grande
comparada con la de protenas y su concentracin en el gel concentrador se
puede regular, se forma una zona de concentracin amplia caracterizada
fundamentalmente por ser estable con el frente de corrida y que continuamente
aumenta durante la electroforesis dependiendo de la cantidad de SDS
introducido en el tampn. Se aprecia una progresiva difusin del borde de
migracin en la medida en que aumenta la concentracin de T.
Las condiciones pueden ajustarse dependiendo de como se necesite separar
las protenas (en estado completamente desnaturalizada, parcialmente
desnaturalizada o nativa). Las asociaciones covalentes entre las unidades de
protenas pueden mantenerse omitiendo el ME del tampn de muestras. En
ausencia de este agente reductor los puentes disulfuro intracatenarios e
intercatenarios de la muestra de protenas permanecen intactos; la movilidad
electrofortica del complejo SDS protena se altera bajo estas condiciones de
disociacin y durante la electroforesis la movilidad de los oligmeros SDS
protenas es menor que con los componentes SDS polipptidos completamente
desnaturalizados. Las protenas pueden mostrar una respuesta individual
caracterstica a la reduccin, lo que se determina al comparar los geles corridos
con ME o sin este. Adicionalmente las protenas no reducidas, pueden no
estar del todo saturadas con SDS por lo que puede variar su relacin
peso/peso en su interaccin con el detergente. Esto hace que las
determinaciones de peso molecular con estas caractersticas no tengan la
misma confiabilidad que el anlisis hecho con polipptidos del todo
desnaturalizados. Es necesaria la existencia de patrones y protenas conocidas
de igual configuracin para una comparacin vlida (marcadores de peso
molecular, PM). EL SDS-PAGE bajo condiciones reducidas y no reducidas es
un mtodo muy til para el anlisis de los puentes disulfuro que contienen las
protenas.
Fuentes de error en la electroforesis. La electroforesis es una tcnica muy
sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la
temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel, velocidad de la
polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y
preparacin de las muestras.
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Anexo 1: (a) Material de electroforesis vertical: (b) Montaje del sistema; (c, d)
preparacin del gel separador; (e-g) concentrador; (h-) electroforesis; (o-s)
tincin del gel





17

ACTIVIDADES
1.- Mucho de lo que sabemos acerca del funcionamiento celular, depende de
experimentos que utilizan clulas especficas (p.ej., orgnulos) de las clulas.
Qu tcnicas utilizan para aislar comnmente los cientficos las clulas y los
orgnulos de mezclas complejas y cmo trabajan estas tcnicas?







2.- El aislamiento de las protenas de membrana requiere el uso de detergentes; el
aislamiento de otras puede lograrse con el uso de soluciones salinas
concentradas. Qu tipos de protenas de membrana pueden ser aislados con
soluciones salinas concentradas? Describa cmo las propiedades qumicas de los
detergentes y la concentracin elevada de sales facilitan los procesos de
aislamiento de cada tipo de protena de membrana.






3. Numerosas tcnicas pueden separar protenas segn sus diferencias de masa.
Describa el uso de dos de estas tcnicas, la centrifugacin y la electroforesis en
gel. Las protenas de la sangre transferan (PM: 66 KDa) y las lisosimas (PM: 15
KDa) se pueden separar mediante centrifugacin por zonas de velocidad o por
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Cal de las dos protenas
sedimentar ms rpidamente durante la electroforesis? Cul migrar ms
rpidamente durante la electroforesis?





4. Interprete los geles del Anexo 2. Mida y anote la distancia recorrida por el frente
del gel (Df), y por cada una de las protenas estndar (Dp). Calcule el
correspondiente valor de Rf para cada una de ellas y antelo en una tabla.










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Anexo 2.