Prtica 2

Cintica Enzimtica
Rio de Janeiro, 28 de maro de 2013
Grupo: Louise Souza, Marina Paes, Ma!a Roc"a, #"ais
Loureno$
%M381
&iscip!ina: 'io(u)mica **
Pro+essores: Lucineia Gomes e %ntonio ,ar!os Mor-ado
Sumrio
1$ *ntrodu.o $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ 3
2$ /01eti2o $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
3
3$ Materiais $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
3
3$ Procedimento $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
3
4$ Resu!tados$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$ 4
5$ &iscuss.o $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
11
6$ ,onc!us.o $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$11
8$ Re+er7ncias 'i0!io-r+icas $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
12
2
1. Introduo
% cin8tica enzimtica tem as rea9es enzimticas, principa!mente a 2e!ocidade
de rea.o enzimtica, como o01etos de estudo e tem como o01eti2os:
: Medir as 2e!ocidades das trans+orma9es (ue se processam;
: <studar a in+!u7ncia das condi9es de tra0a!"o na 2e!ocidade reaciona!$
,ondi9es de temperatura, p=, concentra9es de rea-entes, enzimas, ini0idores
e ati2adores;
:,orre!acionar as 2e!ocidades das rea9es com os +atores (ue as a+etam;
:<sta0e!ecer crit8rios para o contro!e de determinado processo$
Influncia da concentrao de substrato
% concentra.o de su0strato 8 um dos +atores (ue a+eta a 2e!ocidade da rea.o
enzimtica$ > um dos +atores mais di+)ceis de estudar, pois a concentra.o de
su0strato tende a 2ariar durante a rea.o, pois este 8 con2ertido em produto$ Mede?se
a 2e!ocidade inicia! de rea.o @AoB para simp!i+icar este pro0!ema$ <m um eCperimento
cin8tico 8 necessrio (ue a concentra.o de su0strato se1a maior (ue a concentra.o
de enzimas ou se o tempo de rea.o 8 curto o su+iciente, pode?se tomar a
concentra.o de su0strato como uma constante$
Inibio da atividade enzimtica
*ni0idor 8 um modi+icador ne-ati2o (ue promo2e uma redu.o da 2e!ocidade da
cat!ise enzimtica$ Pode ser c!assi+icado em:
1B *ni0idor competiti2o
> uma su0stDncia (ue tem +orma seme!"ante a do su0strato e portanto pode?se
!i-ar ao s)tio ati2o da enzima$ / percentua! de ini0i.o, nesse caso, corresponde a
dois +atores: a concentra.o de su0strato e de ini0idor e a a+inidade da enzima$ Se
aumentarmos a concentra.o de su0strato, conse-ue?se manter a AMEF mesmo na
presena do ini0idor, por8m Gm apresenta uma aparente e!e2a.o$
2B *ni0idor n.o?competiti2o
Pode ser re2ers)2e! ou irre2ers)2e!, por8m do ponto de 2ista cin8tico, as ini0i9es
s.o id7nticas$
<ste tipo de ini0idor apresenta pouca ou nen"uma seme!"ana com o su0strato,
ent.o esse tipo de ini0idor se une a enzima por um centro enzimtico di+erente do
centro ati2o$ &essa +orma, a!8m de <S, +orma?se um comp!eCo enzima?su0strato?
ini0idor @<S*B (ue 8 inati2o, ou se1a, n.o +orma o produto da rea.o$ #em?se tam08m a
+orma.o de um comp!eCo enzima?ini0idor @<*B (ue n.o a!tera a a+inidade do su0strato
com a enzima$ ,omo resu!tado da +orma.o desses di2ersos comp!eCos, a
concentra.o de enzima !i2re 8 muito reduzida e 8 constante
3
3B *ni0idores %competiti2os
Hesse caso o ini0idor n.o se !i-a diretamente a enzima em sua +orma !i2re, mas
ao comp!eCo <S, dando ori-em ao comp!eCo <S* (ue, como dito anteriormente, 8
inati2o$
2. Objetivo
Confeccionar uma curva padro de PNP, relacionando as concentraes
dos padres com suas respectivas absorvncias, observando os
parmetros cinticos da fosfatase alcalina, e determinar a formao de
produto em reaes da enzima com e sem inibidor, com o auxlio desta
curva padro, alm da confeco das curvas de Micaelis!Menten e
"ine#eaver!$ur%, verificando as velocidades m&ximas e as constantes de
cada tipo de reao enzim&tica'
3. Materiais
So!u.o padr.o de p?nitro+eno! @PHPB
0,1M em tamp.o #ris?=,! 0,2M, p= I,4
So!u.o de p?nitro?+eni!?+os+ato @PHPPB
1mM em tamp.o #ris?=,! 0,2M, p= I,4
So!u.o de Ha/= 2M So!u.o tamp.o #ris?=,! 0,2M, p=I,4
So!u.o de Ha2=P/3 em tamp.o #ris?=,!
0,2M, p= I,4 @so!u.o tamp.o #ris?Pi?
=,!B
So!u.o de enzima +os+atase a!ca!ina
@Si-ma +ine ,"emica!s?<,3$1$3$1B
Pipetadores automticos +iCo e 2ari2e! Pipetas -raduadas
Pro?pipete #u0os de ensaio
AorteC ,u0eta
<specto+otrJmetro
4. rocedimentos
,ur2a de su0strato e *n+!u7ncia do ini0idor
!ubo n"
!am#o
!ris$%&l'
#% (')
*m+,
- 1
mM *m+,
.nzima
*m+,
/oluo
de -aO%
2M *m+,
'ranco 2,I 0,1 0,2 1
1 2,I 0,1 0,2 1
2 2,8 0,2 0,2 1
3 2,6 0,3 0,2 1
3 2,5 0,3 0,2 1
4 2,3 0,5 0,2 1
5 2,2 0,8 0,2 1
6 2,0 1,0 0,2 1
8 1,8 1,2 0,2 1
I 1,4 1,4 0,2 1
3
10 1,2 1,8 0,2 1
11 0,I 2,1 0,2 1
12 0,5 2,3 0,2 1
13 0,3 2,6 0,2 1
!abela 1. Ao!umes de cada uma das so!u9es$
#rans+eriu?se, com o auC)!io de uma pipeta e um prK?pipete, a!)(uotas das
so!u9es indicadas, na ta0e!a 1, com eCce.o da so!u.o de Ha/= e a enzima$
<m se-uida pr8?incu0ou?se os tu0os no 0an"o?maria a 36L, durante 4
minutos$ Passado este tempo, uti!izou?se um pipetador automtico para a
adi.o de 0,2 mL de enzima, adicionou?se a so!u.o de enzima em cada tu0o
em inter2a!os de 30 se-undos$ %ntes de incu0ar os tu0os em 0an"o?maria a
36L, durante 14 minutos, "omo-eneizou?se o conteMdo dos tu0os com a a1uda
de um 2orteC$
&epois para!izou?se a rea.o adicionando 1 mL de so!u.o de Ha/= 2M aos
tu0os em inter2a!os de 30 se-undos, "omo-eneizou?se no2amente e procedeu?
se a !eitura espectro+otom8trica, de cada um dos tu0os, a a0sor0Dncia a
304nm, uti!izando o tu0o 0ranco como re+er7ncia para a ca!i0ra.o do
apare!"o$
). 0esultados
1, ,onstru.o de uma cur2a padr.o de p?H*#R/N<H/L @PHPB
!23O/ abs1 abs2 abs 3
M4dia abs
45) nm
M
1 0,10I 0,113 0,10I 0,111 6,13<?03
2 0,238 0,236 0,23I 0,231 1,33<?02
3 0,36 0,353 0,35 0,353 2,13<?02
3 0,386 0,404 0,403 0,3I8 2,85<?02
4 0,512 0,518 0,513 0,514 3,46<?02
5 0,634 0,633 0,635 0,638 3,2I<?02
!abela 1. Resu!tados o0tidos para a con+ec.o da cur2a padr.o de PHP


4
,
1
A
1
O ,
2
A
2
!ubo 1 !ubo 2
0,1 C 0,3 O ,#1 C 3,2 0,1 C 0,5 O ,#2 C 3,2
,#1 O 6,13 C 10
?3
mo!L
?1
,#2 O 1,30 C 10
?2
mo!L
?1

!ubo 3 !ubo 4
0,1 C 0,I O ,#3 C 3,2 0,1 C 1,2 O ,#3 C 3,2
,#3 O 2,13 C 10
?2
mo!L
?1
,#3 O 2,85 C 10
?2
mo!L
?1

!ubo ) !ubo 6
0,1 C 1,4 O ,#4 C 3,2 0,1 C 1,8 O ,#5 C 3,2
,#4 O 3,46 C 10
?2
mo!L
?1
,#5 O 3,2I C 10
?2
mo!L
?1

7uadro 1. ,!cu!o das concentra9es dos padr9es PHP

8rfico 1. ,ur2a Padr.o PHP
3, ,ur2a de Su0strato
#u0o nL %0s
,oncentra.o
PHPP@mMB
Ae!ocidade@microMo!esPminutoB
1 0,018 0,02381 0,11083
2 0,06 0,03652 0,30822
3 0,0I6 0,06133 0,31061
3 0,103 0,0I423 0,3333I
4 0,118 0,13285 0,3I032
5 0,141 0,1I038 0,5145I
6 0,158 0,23810 0,58022
8 0,16I 0,28461 0,621I6
I 0,21 0,34613 0,83I53
10 0,213 0,32846 0,84383
11 0,234 0,40000 0,I3343
12 0,232 0,46133 0,I5111
13 0,261 0,53285 1,0611I
!abela 2. Resu!tados de concentra.o de su0strato e 2e!ocidade o0tidos durante a
prtica$
5

7uadro 2. ,!cu!o das concentra9es de PHPP

JCznnc2n
6
Ao!ume uti!izado PHPP P Ao!ume tota!
!ubo 1 !ubo 2
0,1mL P3,2m! O 2,381 C 10
?2
mM 0,2mLP3,2mLO 3,652 C 10
?2
mM

!ubo 3 !ubo 4
0,3mLP3,2mL O 6,133 C 10
?2
mM 0,3mLP3,2mL O I,423 C 10
?2
mM
!ubo ) !ubo 6
0,5mLP3,2mL O 1,328 C 10
?1
mM 0,8mLP3,2mL O 1,I04 C 10
?1
mM
!ubo 9 !ubo :
1,0mLP3,2mL O 2,381 C 10
?1
mM 1,2mLP3,2mL O 2,846 C 10
?1
mM
!ubo ( !ubo 15
1,4mLP3,2mL O 3,461 C 10
?1
mM 1,8mLP3,2mL O 3,285 C 10
?1
mM
!ubo 11 !ubo 12
2,1mLP3,2mL O 4,000 C 10
?1
mM 2,3mLP3,2mL O 4,613 C 10
?1
mM
!ubo 13
2,6mLP3,2mL O 5,328 C 10
?1
mM
<(ua.o da reta: O 16,453C ? 0,0112
!ubo 1 !ubo 2
0,018 O 16,453C ? 0,0112 0,060 O 16,453C ? 0,0112
C O 1,553 C 10
?3
C O 3,523 C 10
?3
A O @1,553 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O @3,523 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O 1,1083 C 10
?1
mcrm Pmin A O 3,0822 C 10
?1
mcrm Pmin

!ubo 3 !ubo 4
0,0I6 O 16,453C ? 0,0112 0,103 O 16,453C ? 0,0112
C O 5,151 C 10
?3
C O 5,402 C 10
?3
A O @5,151 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O @5,402 C 10
?3
P14minB C 10
3

A O 3,1061 C 10
?1
mcrm Pmin A O 3,333I C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo ) !ubo 6
0,118 O 16,453C ? 0,0112 0,141 O 16,453C ? 0,0112
C O 6,345 C 10
?3
C O I,234 C 10
?3
A O @6,345 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O @I,234 C 10
?3
P14minB C 10
3

A O 3,I032 C 10
?1
mcrm Pmin A O 5,145I C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo 9 !ubo :
0,158 O 16,453C ? 0,0112 0,16I O 16,453C ? 0,0112
C O 1,020 C 10
?2
C O 1,083 C 10
?2
A O @1,020 C 10
?2
P14minB C 10
3
A O @1,083 C 10
?2
P14minB C 10
3

A O 5,8022 C 10
?1
mcrm Pmin A O 6,21I6 C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo ( !ubo 15
0,210 O 16,453C ? 0,0112 0,213 O 16,453C ? 0,0112
C O 1,24I C 10
?2
C O 1,282 C 10
?2
A O @1,24I C 10
?2
P14minB C 10
3
A O @1,282 C 10
?2
P14minB C 10
3

A O 8,3I53 C 10
?1
mcrm Pmin A O 8,4383 C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo 11
0,234 O 16,453C ? 0,0112
C O 1,303 C 10
?2
A O @1,303 C 10
?2
P14minB C 10
3
A O I,3343 C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo 12
0,232O 16,453C ? 0,0112
C O 1,332 C 10
?2
A O @1,332 C 10
?2
P14minB C 10
3
A O I,5111 C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo 13
0,261 O 16,453C ? 0,0112
C O 1,506 C 10
?2
A O @1,506 C 10
?2
P14minB C 10
3
A O 1,0611I mcrm Pmin



7uadro 3. ,!cu!os de 2e!ocidade
8rfico 2. Gr+ico de Mic"ae!is?Menten sem ini0idor
&, *n+!u7ncia do *ni0idor
#u0o nL
,oncentra.o
PHPP@mMB
Ae!ocidade@microMo!esPminB
1 0,02381 0,04011
2 0,03652 0,04660
3 0,06133 0,08036
3 0,0I423 0,0I185
4 0,13285 0,11833
5 0,1I038 0,13880
6 0,23810 0,1I813
8 0,28461 0,2363I
I 0,34613 0,30822
10 0,32846 0,31061
11 0,40000 0,4234I
12 0,46133 0,5I151
13 0,53285 0,63615
!abela 3. Resu!tados de concentra.o de su0strato e 2e!ocidade o0tidos durante a
prtica de in+!u7ncia do ini0idor$
/s mesmos c!cu!os rea!izados para ac"ar as concentra9es de PHPP no
item ' +oram rea!izados neste item$
8
7uadro 4. ,!cu!os de 2e!ocidade com ini0idor
I
<(ua.o da reta: O 16,453C ? 0,0112
!ubo 1 !ubo 2
0,002 O 16,453C ? 0,0112 0,003 O 16,453C ? 0,0112
C O 6,415 C 10
?3
C O 8,543 C 10
?3
A O @6,415 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O @8,543 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O 4,011 C 10
?2
mcrm Pmin A O 4,660 C 10
?2
mcrm Pmin

!ubo 3 !ubo 4
0,010 O 16,453C ? 0,0112 0,013 O 16,453C ? 0,0112
C O 1,206 C 10
?3
C O 1,368 C 10
?3
A O @1,206 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O @1,368 C 10
?3
P14minB C 10
3

A O 8,036 C 10
?2
mcrm Pmin A O I,185 C 10
?2
mcrm Pmin
!ubo ) !ubo 6
0,020 O 16,453C ? 0,0112 0,028 O 16,453C ? 0,0112
C O 1,665 C 10
?3
C O 2,232 C 10
?3
A O @1,665 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O @2,232 C 10
?3
P14minB C 10
3

A O 1,183 C 10
?1
mcrm Pmin A O 1,388 C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo 9 !ubo :
0,031 O 16,453C ? 0,0112 0,043 O 16,453C ? 0,0112
C O 2,I62 C 10
?3
C O 3,612 C 10
?3
A O @2,I62 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O @3,612 C 10
?3
P14minB C 10
3

A O 1,I81 C 10
?1
mcrm Pmin A O2,364 C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo ( !ubo 15
0,060 O 16,453C ? 0,0112 0,0I6 O 16,453C ? 0,0112
C O 3,523 C 10
?3
C O 5,151 C 10
?3
A O @3,523 C 10
?3
P14minB C 10
3
A O @5,151 C 10
?3
P14minB C 10
3

A O 3,082 C 10
?1
mcrm Pmin A O 3,106 C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo 11
0,126 O 16,453C ? 0,0112
C O 6,85I C 10
?3
A O @6,85I C 10
?3
P14minB C 10
3
A O 4,235 C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo 12
0,161O 16,453C ? 0,0112
C O 1,036 C 10
?2
A O @1,036 C 10
?2
P14minB C 10
3
A O 5,I15 C 10
?1
mcrm Pmin
!ubo 13
0,183 O 16,453C ? 0,0112
C O 1,105 C 10
?2
A O @1,105 C 10
?2
P14minB C 10
3
A O 6,362 mcrm Pmin

8rfico 3. Gr+ico de Mic"ae!is?Menten com ini0idor
(r&fico de "ine#eaver!$ur%
#u0o nL 1PQSR 1PA
0
1PQSR 1PA
i

?3,05103432 0 ?3,05103432 0
1 32,00000 I,0220I 32,00000 1I,I46I4
2 21,00000 3,23330 21,00000 16,331I1
3 13,00000 2,33380 13,00000 12,32554
3 10,40000 2,30586 10,40000 10,88515
4 6,00000 2,03I04 6,00000 8,33364
5 4,24000 1,52320 4,24000 5,62043
6 3,20000 1,36012 3,20000 4,03583
8 3,40000 1,3840I 3,40000 3,03046
I 2,80000 1,1I0I8 2,80000 3,23330
10 2,33333 1,15I83 2,33333 2,33380
11 2,00000 1,06003 2,00000 1,I0525
12 1,64000 1,03035 1,64000 1,334I1
13 1,44445 0,I3343 1,44445 1,34546

0 0,4516 0 2,8255
!abela 4. Resu!tados de concentra.o de su0strato e 2e!ocidade o0tidos durante a
prtica para con+ec.o do -r+ico de LineSea2er?'urT$

8rfico 4. Gr+ico de LineSea2er?'urT com as retas com ini0idor
10
7uadro ). ,!cu!o de AmC$ e Gm das cur2as com e sem ini0idor$
6, ;iscusso
Ho -r+ico de Mic"ae!is?Menten sem ini0idor o0ser2a?se a +orma.o de uma
cur2a "iper0K!ica, como 1 era esperado$ <m pe(uenas concentra9es de
su0strato a maior parte da enzima est na +orma !i2re <$ Hessas condi9es, a
2e!ocidade da rea.o ser proporciona! U QSR por(ue o e(ui!)0rio ser
des!ocado para a +orma.o de mais <S, a medida (ue a QSR aumenta$ J em
e!e2adas concentra9es de su0strato o aumento da 2e!ocidade 8 cada 2ez
menor, pois 2ai se aproCimando de sua 2e!ocidade mCima, a (ua! ser
atin-ida (uando todas as mo!8cu!as da enzima esti2erem na +orma do
comp!eCo <S$
Se comparado ao -r+ico de Mic"ae!is?Menten com ini0idor, perce0e?se (ue a
2e!ocidade mCima 8 (uase a metade da 2e!ocidade mCima da rea.o sem
ini0idor, o (ue condiz com a teoria da cin8tica enzimtica$
,om re!a.o ao -r+ico de LineSea2er?'urT, a partir das cur2as e!a0oradas,
perce0e?se (ue o tipo de ini0i.o 8 acompetiti2a, pois o Gm da rea.o com
ini0idor 8 maior (ue o da rea.o enzimtica sem ini0idor, indicando (ue a
+os+atase a!ca!ina te2e menos a+inidade com o su0strato de2ido U presena do
ini0idor Ha
2
=P/
3
, a!8m da 2e!ocidade mCima ter so+rido uma redu.o,
caracter)sticas de uma cur2a de ini0i.o acompetiti2a$
9, &oncluso
11
,om ini0idor
O 0,4031C V 2,5688
AmC O 1P2,5688
AmC O 0,3438 mcrmPmin
Gm O coe+$ %n-u!ar C AmC
Gm O 1,644 C 10
?3
mM
Sem ini0idor
O 0,1834C V 0,4516
AmC O 1P0,4516
AmC O 1,680 mcrmPmin
Gm O coe+$ %n-u!ar C AmC
Gm O 3,256 C 10
?3
mM
:, 0eferncias 3iblio<rficas
M%R*/##/, Ju!iana Ri0eiro$ W<st-io de doc7ncia: cin8tica enzimticaX$
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enzimaticaZ1u$pd+[
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%utor descon"ecido$ W,in8tica <nzimticaX$ &ispon)2e! em:
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