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Prols immunoanalytiques en biologie clinique

Les troponines
Troponins
O. Gaillard *
Service de biochimie, centre hospitalier, 194, avenue Rubillard, 72037 Le Mans cedex 1, France
Reu le 1 janvier 2002; accept le 2 janvier 2002
Les socits internationales de cardiologie ont modi
rcemment leurs dnitions, en faisant une place plus large
aux paramtres biologiques. Pour les syndromes corona-
riens aigus, les nouvelles recommandations europennes et
amricaines de juillet 2000 incluent dans la dnition de
linfarctus du myocarde, en plus des signes cliniques et
lectriques, la prsence de troponine I ou T dans le sang
circulant [1,2]. Cest dire la place essentielle prise par les
marqueurs biologiques dans la stratgie diagnostique et
thrapeutique des syndromes coronariens aigus, ainsi que
dans le pronostic de ces affections [3].
1. Nom de lanalyte
Les troponines
2. Structure et proprits
La troponine (Tn) est un complexe protique constitutif
des myobrilles, contrairement la myoglobine et la
CK-MB qui sont plus de 90 % cytosoliques. Le lament
n du myocyte, rgulateur de la contraction myocardique,
est compos principalement de lactine, de la tropomyosine
et du complexe des troponines. Le complexe des troponines
se compose de trois protines : les troponines I, C et T
(Fig. 1). Il est exprim de manire ubiquitaire et retrouv en
grande quantit dans latrium et le ventricule cardiaque [4].
Ce complexe rgule la contraction musculaire par linterac-
tion de lactine et de la tropomyosine dans le muscle stri
squelettique et cardiaque. Les trois sous-units ont des rles
diffrents.
La troponine C a une masse molculaire de 18 kDa. Elle
xe le calcium grce quatre sites de xation, ce qui induit
un changement de conformation de la troponine I (TnI) sous
une forme tire (Fig. 2). Elle module ainsi laction de la
TnI avec laquelle elle se complexe [5,6]. Il nexiste quune
seule isoforme de TnC et il ny a pas de diffrence majeure
entre les formes exprimes dans le muscle squelettique et le
myocarde. Son dosage na donc pas dintrt dans le
diagnostic des pathologies cardiaques [7].
La troponine T (TnT) a une masse molculaire de
37 kDa. Elle est constitue de 298 acides amins (aa). Elle
est lie la tropomyosine alors que la TnI, rgulatrice, est
xe au repos lactine et inhibe la xation de lactine et de
la myosine. La xation du calcium entrane un changement
de conformation de la tropomyosine et de la troponine,
permettant la xation de la tte de la myosine sur lactine
(Fig. 2). Il existe des isoformes cardiaques (TnTc) et
squelettiques de la TnT prsentant une homologie de
squence daa. La TnTc est code par le chromosome 1 q 32
[5].
La TnI fait partie du complexe rgulateur qui rgle
linteraction du complexe actine-myosine avec le complexe
ATPasique du muscle stri. Cest une protine myobrillaire
non globulaire mais linaire avec cinq hlices adoptant en
solution une structure allonge [8]. La TnI a une masse
* Auteur correspondant.
Adresse e-mail : ogaillard@ch-lemans.fr (O. Gaillard).
Fig. 1. Le complexe de troponine.
Immuno-analyse & Biologie spcialise 17 (2002) 297301
www.elsevier.com/locate/immbio
2002 ditions scientiques et mdicales Elsevier SAS. Tous droits rservs.
PII: S 0 9 2 3 - 2 5 3 2 ( 0 2 ) 0 1 2 1 3 - 9
molculaire de 24 kDa. Elle est forme de 210 aa. Elle
existe sous trois isoformes : des isoformes du muscle
squelettique lent et rapide et lisoforme cardiaque qui
possde sur son extrmit N-terminale une squence spci-
que de 31 acides amins non retrouve dans les formes
squelettiques. La TnIc est code par le chromosome 19 q
13,3 [5].
Au sein du myocyte, il existe une interaction calcium
dpendante des trois troponines I, T et C. Linteraction
TnI-TnC est diminue si la concentration en calcium est
abaisse par des chlateurs (Ka = 1,7.10
9
M
1
en prsence
de calcium et Ka = 1,0.10
6
M
1
en labsence de calcium)
[6,9]. La partie C-terminale de la TnI interagit avec la TnC
[8] et la partie moyenne de la TnI interagit avec la TnT [10].
2.1. Rpartition des troponines
La TnT, comme la TnI, est prsente en faible concentra-
tion dans le cytosol (8 % du contenu total en troponine), au
contraire de la myoglobine et de la CK-MB qui sont 90 %
dorigine cytosolique.
2.2. Concentrations physiologiques normales
La concentration en TnI et T chez le sujet sain est proche
de la limite de dtection des tests. Une concentration de
17,5 ng/l a t obtenue par une technique trs sensible [5].
Les tests actuels permettent dtablir que le 99
e
percentile
des valeurs sanguines de la TnI et de la TnT sont dans la
plupart des cas proches ou infrieures aux limites de
dtection des systmes. Pour les tests actuels, des valeurs de
0,04 0,06 g/l pour les TnTc et TnIc peuvent tre
acceptes [5].
2.3. Demi-vie
La demi-vie de la TnT est de 120 min [11]. Les prols
dlimination observs pour les troponines lors dune n-
crose cardiaque dpendent de la taille de la ncrose.
La demi-vie de la TnI nest pas inuence par linsuffi-
sance rnale et est de 1,48 jours 0,77 [12]. Des concen-
trations sanguines signicatives en Troponine peuvent tre
retrouves de 5 21 jours aprs une ncrose cardiaque [5].
3. Formes circulantes de la troponine
Normalement prsente une trs faible concentration
dans le sang du sujet sain, la structure molculaire des
troponines circulantes est mal connue. Au moins trois
formes peuvent tre retrouves dans la circulation sanguine
aprs ncrose cardiaque : une forme libre et des formes
complexes binaires [C-I] ou [I-T] (masse molculaires
thoriques : 42 kDa ou 61 kDa) ou ternaires [C-I-T] (masse
molculaire thorique : 79 kDa) [7]. Il avait t primitive-
ment suggr que la TnIc existait dans la circulation sous
forme libre prsentant une demi-vie de lordre de 1 h [9,13].
Trs tt aprs une ncrose cardiaque, la troponine libre
est retrouve dans le sang, puis sa concentration diminue
[9]. Au pic, il y a dans le sang circulant 5 12 fois plus de
formes complexes de la TnI que de la TnI libre. Les formes
retrouves dans la circulation ne sont pas les mmes selon le
moment de la ncrose ou bien elles se transforment soit au
niveau du myocyte, soit dans la circulation. Wu et al.
retrouvent les complexes binaires et ternaires ainsi que de la
TnT libre, mais pas de TnI libre lors de ltude de srums
recueillis au pic de linfarctus [2].
Une petite proportion de troponine existe sous forme
libre dans le cytosol (Tableau 1). Ce pool, plus accessible,
est le premier tre libr dans la circulation trois quatre
heures aprs un infarctus du myocarde alors que la partie
lie aux myobrilles est relargue pendant cinq neuf jours
pour la TnIc, jusqu 14 jours pour la TnTc. Cela permet un
diagnostic prcoce ou rtrospectif dun IDM.
Les prols des formes de troponines varient selon les
patients et montrent la prsence de fragments dgrads de
TnI de faible masse molculaire [14].
Lactivation des protases lysosomiales prsentes soit
dans le tissu cardiaque ncros, soit dans la circulation peut
modier les complexes de troponine. Les protases mises en
jeu dans la dgradation de la TnIc ne sont pas prcisment
connues. De nombreux sites thoriques de protolyse exis-
tent sur les protines de troponine. Les formes dgrades
sont composes principalement de deux fragments majori
taires (18 et 14 kDa) accompagns de nombreux produits de
dgradation [15]. En ce qui concerne la TnI, ses deux
extrmits N et C seraient sensibles la protolyse. La
partie N-terminale (squence dite cardio-spcique ) se-
rait partiellement mais rapidement dgrade, avec un site de
Fig. 2. Schma des interactions calcium-dpendantes du complexe tropo-
nine.
Tableau 1
Localisation de la troponine (daprs [3])
TnT TnI
Pool cytosolique 6 8 % 5 6 %
Pool myobrillaire 90 % 95 %
.
298 O. Gaillard / Immuno-analyse & Biologie spcialise 17 (2002) 297301
coupure probable en position 27. La liaison de la TnI aux
autres troponines masque laction des protases la partie
intermdiaire de la TnIc (aa 30-110). Dautres transforma-
tions post-traductionnelles, comme la phosphorylation et
loxydation au niveau des groupements-SH de la TnIc ont
t dcrites [15]. Les transformations post-traductionnelles
modient linteraction de la TnIc avec dautres composants
myocardiques comme la TnC ou les interactions avec les
anticorps monoclonaux ou polyclonaux utiliss dans son
dosage [2].
4. Immunodosages
La plus grande partie de la squence en acides amins de
la TnIc est antignique, les extrmits N et C-terminales
possdant les rgions les plus antigniques [8].
Des tudes comparatives des performances des dosages
ont montr des diffrences importantes en particulier pour le
dosage de la TnIc [2]. Les facteurs qui affectent les
performances de ces dosages peuvent tre rattachs
lexpression des motifs pitopiques, la calibration des dosa-
ges, la nature des chantillons et les effets matrice, la
reconnaissance des pitopes, enn les faux positifs et
ngatifs.
4.1. Expression pitopique (Fig. 4)
Les anticorps slectionns dans les dosages de la TnT
(M7, reconnaissant les rsidus 125-131 et M11,7, reconnais-
sant les rsidus 136147) correspondent aux squences
cardiospciques. Ainsi, une lvation de TnTc chez un
patient atteint dinsuffisance rnale chronique correspond
rellement une atteinte myocardique [16].
La TnIc tant retrouve uniquement dans le myocarde, ce
marqueur devrait en thorie poser le moins de problme
pour sa mesure. Au cours du dveloppement, lexpression
plus prcoce de la TnI squelettique par rapport la TnI
cardiaque, rend inutilisable le dosage de la TnIc dans les
pathologies cardiaques no et prinatales.
La slection danticorps utiliss dans la technique sand-
wich permet la reconnaissance de la partie cardiospci-
que de la molcule absente des isoformes squelettiques de
TnIc [4].
Les dosages de TnIc commercialiss utilisent des anti-
corps monoclonaux diffrents reconnaissant les diverses
formes circulantes de faon htrogne [17].
Le dosage de la TnIc nest pas encore standardis [2].
4.2. Calibration des dosages
Le calibrant utilis par les diffrentes trousses de ractifs
nest pas encore standardis, de sorte que les rsultats des
techniques varient dun fabricant lautre.
Des srums de patients tests laide de ractifs utilisant
des standards ou calibrateurs de TnIc libre native ou
recombinante peuvent prsenter des concentrations en TnIc
variant dun facteur de 1 10 [5]. Les comits de standar-
disation de lAACC (American Association for Clinical
Chemistry) et de lIFCC (International Federation of Cli-
nical Chemistry) valuent lutilisation dun matriau de
rfrence international compos de complexes binaires
[18,19]. Cela amliorerait en partie la standardisation, mais
ne rsoudrait pas les carts lis limmunoractivit des
diffrentes formes circulantes [20,21].
En effet, les anticorps prsents sur le march reconnais-
sent les diffrentes formes (libres, complexes binaires,
ternaires) mais pas les mmes pitopes et avec des affinits
diffrentes. La partie la plus stable de la TnI, protine
myobrillaire charge positivement en solution, prsente
des zones de phosphorylation (aa 22 et aa 23), des zones de
rupture (aa 27) et des zones o se xe lhparine (charge
ngativement) qui ont permis de pressentir la partie la plus
stable de la molcule comme tant la fraction mdiane aa
3010 (Fig. 3). Cette zone de la TnI, protge par la TnC,
Fig. 3. Structure du complexe troponine I-troponine C en solution (daprs
[24]).
Fig. 4. Carte pitopique de la TnI.
O. Gaillard / Immuno-analyse & Biologie spcialise 17 (2002) 297301 299
est donc la cible prfrentielle vers laquelle devraient tre
dirigs les anticorps utiliss dans les trousses de ractifs.
4.3. Modalits de prlvement et effet matrice
Des diffrences de rsultats ont t mises en vidence
selon lanticoagulant utilis pour le prlvement [17].
Wu a montr que lEDTA chlate le Ca
2+
et provoque la
rupture des complexes, entranant ainsi une forte proportion
de TnIc libre. La plupart des dosages sont raliss sur srum
ou sur plasma recueilli sur hparine.
Lutilisation du plasma hparin est prfre pour une
plus grande rapidit dexcution et parce que la prsence de
particules de brine peut entraner des faux positifs [21].
Cependant, lhparine semble modier linteraction de la
troponine avec les anticorps utiliss pour son dosage et les
rsultats entre le plasma et le srum ne sont pas identiques :
ils semblent plus bas pour le plasma hparin [22]. La
molcule de TnIc est charge positivement (pI = 9,87) et
peut se lier lhparine, polyanion charg ngativement. Ce
phnomne pourrait rduire limmunoractivit en provo-
quant des changements de conformation des molcules de
troponine ou en recouvrant directement les pitopes [23].
Le travail de Morin et al. a clairement montr la
contre-indication formelle mlanger diverses natures de
tubes pour le suivi dun mme patient en TnIc [24,25]. Les
valeurs de TnIc sur un type de tube avec ou sans gel ne
montrent pas de diffrence signicative, la fois pour les
tubes secs ou les tubes hparins.
Une centrifugation insuffisante peut conduire des rsul-
tats faussement positifs cause de dbris de membranes des
hmaties en cas dhmolyse [26].
4.4. Stabilit
La molcule de TnIc est trs stable temprature
ambiante, + 4 C et congele. Le redosage dchantillons
conservs pendant une longue priode (5 ans 70 C) ne
montre pas de dgradation signicative ; aucune variation
nest observe aprs cinq cycles de conglation-
dconglation [5].
4.5. Reconnaissance des pitopes et encombrement
strique
4.5.1. Inuence de la TnC
Pour certains tests, la prsence de TnC modie limmu-
nognicit apparente de la TnIc. Cet effet est calcium
dpendant et est rvers par addition dEDTA au tampon de
raction. Cela expliquerait pourquoi les prlvements sur
EDTA sont proscrire.
4.5.2. Effets Redox et de phosphorylation
Certains sites antigniques sont lobjet doxydation au
niveau des groupements SH des cystines, se traduisant par
des changements conformationnels in vitro [27]. Ce phno-
mne affecte les performances de certains immunodosages
[2].
4.5.3. Faux positifs et faux ngatifs analytiques
Fitzmaurice et al. ont rapport un cas de faux positif pour
une trousse de dosage de TnIc attribu la prsence dAc
htrophiles [28].
Un cas de faux ngatif a t rapport chez un patient
opr pour un pontage coronarien, chez lequel au contraire
dautres marqueurs cardiaques, comme la TnT et la CK-
MB, la TnIc naugmentait pas. Une IgG anti-TnIc a t mise
en vidence chez ce patient [29].
4.5.4. Contrle de qualit
En France, une tude ralise par lASQUALAB sur 75
laboratoires dhospitalisation publique et prive a montr
pour 3 niveaux de contrle que 91 % des laboratoires
obtenaient des rsultats satisfaisants (limite dacceptabilit
20 % de la valeur moyenne de la mme technique) [30].
Cependant, il importe de noter la fois une grande
htrognit des valeurs absolues des contrles et avec une
dispersion des valeurs variant entre 3 et 13 % selon les
niveaux et les appareils. Cette dispersion des rsultats
souligne la reconnaissance variable des troponines utilises
dans les diffrents dosages et indirectement lintrt de la
standardisation future.
5. Conclusion
Le dosage des troponines sest impos au cours de la
dcennie coule comme limmuno dosage de rfrence en
pathologie cardiaque aigu. Il a remplac avantageusement
les activits enzymatiques traditionnelles type CK, cause
de sa trs grande spcicit dorgane et de la possibilit de
mise en vidence de la troponine concentration faible.
De plus, les tudes rtrospectives ont montr que contrai-
rement aux activits enzymatiques, le dosage de la tropo-
nine prsentait un intrt prvisionnel court et moyen
terme dans les pathologies coronaires obstructives type
angor instable [31].
Cependant ces tests ncessitent encore dtre amliors
notamment au point de vue analytique de faon pouvoir,
dune part, standardiser les tests et diminuer ainsi les
variabilits observes actuellement entre les diffrents tests
et dautre part abaisser leur limite de dtection an de
faciliter leur usage dans les pathologies o une micron-
crose est susceptible dtre mise en cause.
Remerciements
Nous remercions vivement pour leur aide et leurs rensei-
gnements prcieux Mme le Dr M.J. Bugugnani, CHI
Poissy/St-Germain-en-Laye, 78105 St-Germain-en-Laye,
300 O. Gaillard / Immuno-analyse & Biologie spcialise 17 (2002) 297301
Mme le Dr Ch. Morin et le groupe de travail Marqueurs
cardiaques du Collge National de Biochimie des Hpi-
taux, C.H. Calais, 62107 Calais et Mr le Dr G. Lefevre,
CHU Tenon, 75970 Paris, France.
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