Biologa General 241.

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Tcnicas en Biologa Celular.
Microscopa.
Separacin de diferentes tipos celulares.
Cultivo Celular
Fraccionamiento Celular
Aislamiento y Caracterizacin de Biomolculas.
Microscopa: historia
1590: Janssen y Janssen
1670: Cock y Hooke
A mediados del siglo XVII un holands, Anton van Leeuwenhoek, utilizando microscopios
simples de fabricacin propia, describi por primera
vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glbulos rojos.
1 -Microscopio ptico compuesto. Poder de Resolucin. 0.2um.
Amplificacin max. 1000 x
2 Microscopa electrnica Poder de Resolucin. 0.1 nm, Amplificacin 150.000x
1. Microscopa
1 2 2
Que podemos ver con cada microscopio?
Clulas
Comparacin de los microscopios
Microscopio
ptico
compuesto
(MOC)
Sistema estructural,
mecnico o estativo
Sistema
ptico
Sistema de
iluminacin
Sistema de lentes
propiamente tal
Sistema estructural:
1.-Base o pie (lmpara)
2.-Columna o asa
3.-Platina (tornillos
localizadores)
4.-Tubo o can
5.-Revolver o tambor
6.-Tornillos focalizadores
1
2
3
5
6
4
Sistema ptico
(iluminacin):
a) Aparataje de iluminacin:
1.-Lmpara
2.- Diafragma iris
3.-Condensador
4.- Lente de campo
5.- Anillo portafiltros
1
2/3
5
Diafragma
Sistema ptico (de lentes):
b) Sistema ptico propiamente tal:
1.- Objetivos (imagen invertida)
2.- Ocular (forma una imagen virtual)
1
2
Aumento total=A objetivo x A ocular
Objetivos:
- Aumento (4x, 10X, 40X)
- NA: apertura numrica
Poder de resolucin de
un lente
A mayor NA mayor detalles
Partes del Microscopio Optico
Propiedades del MOC
- Poder de aumento:
Aumento del instrumento: aumento del ocular x aumento del objetivo x factor de tubo (si lo hay)
- Poder de resolucin:
A mayor poder de resolucin, menor es el lmite de resolucin
-Poder de definicin:
capacidad de dar imgenes claras de contornos precisos
-Poder de penetracin:
Capacidad de evaluar detalles a distinta altura con un mismo enfoque
Aplicaciones del MOC
- Examen inmediato: preparaciones en fresco
- Examen mediato: procesamiento histolgico
fijacin, corte y tincin
- Cortes: 7-10 m
MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO
Aumenta 500-1000 veces el ojo
humano.
Lmite de resolucin 0,24 m
Mediante el uso del microscopio
ptico se pueden distinguir objetos
separados a una distancia de
0,24 mm
Poder de resolucin
Lo definimos como la capacidad que tiene un microscopio
de percibir por separado dos puntos pequeos,
adyacentes y cercanos.
Vale decir, es la capacidad para percibir detalles.
El lmite de resolucin es la distancia mnima que debe separar
a dos puntos para que sean distinguidos por separado.
Hay una relacin inversa entre poder resolucin
y lmite de resolucin.
Imagen:
Aumentada
Virtual
Invertida
Microscopio de fluorescencia
Los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La
imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las
molculas que han absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con mayor
longitud de onda. Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben
colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo.
Microscopio de fluorescencia
Permite localizar molculas especficas dentro de la clula
Utiliza compuestos fluorescentes FITC,
rodamina, etc.
Se utiliza para detectar protenas dentro de
la clula, acoplando un
anticuerpo al fluorforo
Microscopio de Transmisin
El microscopio electrnico de transmisin
utiliza un haz de electrones para visualizar un
objeto que ha sido previamente cortado.
Debido a que los electrones tienen una
longitud de onda mucho menor ( 0,005 nm) que
la luz (550 nm), pueden mostrar estructuras
mucho ms pequeas.
Los microscopios electrnicos de transmisin
pueden aumentar un objeto hasta un milln de
veces (ojo humano). 1000 veces superior a la
resolucin del MOC
El lmite de resolucin es de 0.3nm
Cortes de 50-100 nm
Replicacin del ADN mitocondrial
Micrografa electrnica de una
mitocondria en divisin en un
hepatocito
Microscopio electrnico de barrido
Permite observar la superficie de muestras no cortadas
La imagen que entrega es tridimensional
El lmite de resolucin es de 10nm, limitado por el espesor de
la muestra.
Microscopio confocal
Aplicaciones: clulas enteras (sin cortar), se captan imgenes
localizados en distintos planos focales y con
un sistema computacional adecuado se realiza la reconstruccin
tridimencional de la imagen.