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Farmacologia e Toxicologia II

Mestrado Integrado em Medicina Veterinria








Relatrio n 2
Ensaios farmacolgicos in vitro em rgos e tecidos - ensaios em duodeno de rato







Sara Sofia Duarte Peres
N 24942


INTRODUO
Os estudos de resposta dose de um frmaco, so muitas vezes conduzidos em farmacologia, recorrendo a
rgos ou tecidos isolados. Tradiconalmente os banhos de rgos so usados para experincias de resposta dose,
in vitro.
Embora uma grande variedade de ferramentas moleculares tenhma sido desenvolvidas para a avaliao das
respostas celulares aos frmacos, o ensaio de banho de rgos ainda considerado uma ferramenta valiosa para
avaliar o efeito, optimizao e mecanismo de aco de drogas. Os distintos orgos isolados com que se trabalha no
laboratrio utilizam-se de forma especfica de acordo com o tipo de aco a estudar. Os estudos mais comuns
incluem:
1. Investigao cardiovascular, usando arcos articos isolados, tecido cardiaco ou artrias.
2. Estudo de efeitos gastro-intestinais, utilizando preparaes de intestino delgado ou grosso, tecido gastric e
esfncters.
3. Efeitos respiratrios, atravs da utilizaao de anis traqueais, tecido pulmonar, diafragma ou artrias
pulmonares.
4. Outras preparaes de msculo liso incluindo bexiga urinria, msculo peniano, tero ou prostata, etc.
Em contraste com os ensaios moleculares, a utilizao de banhos de rgos permite estudar respostas
complexas resultantes de diversos mecanismos fisiolgicos reguladores. Adicionalmente, os efeitos de compostos
com alvos moleculares desconhecidos podem ser estudados. Nas culturas celulares podem perder-se importantes
expresses e modificaes de alvos moleculares. Os banhos de rgos so tambm ideiais no estudo de respostas
em modelos de doenas animais especficos. A eliminao de factores farmacocinticos permite identificar o efeito
do frmaco directamente no rgo utilizado, dependendo este efeito apenas de parmetros farmacodinmicos
associados ao frmaco e aos receptores presentes no tecido.
Os ensaios com banhos de rgos implicam a manuteno do tecido vivo, mesmo aps do sacrficio do animal.
Para tal, diversas condies devem ser asseguradas, nomeadamente de nutrio, temperatura e oxigenao.
A soluo de Tyrode, no qual o rgo embebido, uma soluo grosseiramente isotnica em relao ao fluido
intesticial e utilizada em muitos estudos em fisiologia e culturas tissulares. Assemelha-se soluo de Lactato de
Ringer, mas contm tambm magnsio, glucose e bicarbonato (em vez do lactato). Com esta soluo obtm-se o
objectivo de nutrio e equilibrio electroltico no tecido. A soluo perfundida com oxignio e mantida a uma
temperatura fisiolgica prxima do 37C. O rgo, preso por ambas as extremidades, sofre uma contraco. A
tenso exercida pela contrao transmitida pelo fio, a um sistema transdutor e deste a um polgrafo, que regista a
amplitude da contrao em termos de distncia. Desta forma possvel avaliar a intensidade do efeito do frmaco.
Em seres unicelulares, a digesto realizada no interior do citoplasma, mas nos animais multicelulares que se
alimentam de grandes partculas a digesto d-se externamente, no lmen do tracto gastrintestinal. Em mamferos,
a actividade mecnica do tracto gastrintestinal propele e mistura os alimentos com as secrees digestivas. A
regulao da motilidade gastrintestinal exercida pelo sistema nervoso autnomo e uma srie de hormonas
endcrinas e parcrinas. A presente metodologia permite avaliar a aco biolgica directa de frmacos sobre a
motilidade gastrintestinal.
A acetilcolina, um ster do cido actico e da colina, uma substncia que actua como neurotransmissora, tanto
ao nvel do Sistema Nervoso Central (SNC) como do Sistema Nervoso Perifrico (SNP). O SNP divide-se em sistema
nervoso somtico (SNS) e o sistema nervoso autnomo (SNA), sendo este ltimo responsvel por grande parte da
regulao das funes viscerais, nomeadamente do tracto gastrointestinal. A diviso simptica do SNA exerce o seu
efeito no tracto gastrintestinal ao reduzir tanto a motilidade como as secrees digestivas, atravs da aco da
norepinefrina ao nvel da terminao nervosa. A diviso parassimptica utiliza a acetilcolina para aumentar a
motilidade gastrintestinal e as secrees do tracto digestivo, ao nvel dos receptores colinrgicos.
A atropina um frmaco anticolinrgico que bloqueia a aco muscarnica da acetilcolina. , portanto, um
antagonista reversvel dos receptores muscarnicos, impedindo a ligao da acetilcolina. Os seus efeitos ao nvel do
intestino incluem a diminuio do tnus e motilidade intestinal, sem que estes efeitos sejam completamente
abolidos, uma vez que o tubo digestivo possui fibras no colinrgicas e nele tambm actuam mecanismos hormonais
locais. O efeito sobre a secreo gstrica de reduo, mas apenas em doses elevadas.

METODOLOGIA
A. Banho de rgos
Banho de rgos:
A- Banho: Consta de um copo central de volume fixo no qual se submerge o tecido mediante uma vareta oca
atravs da qual se procede areao. O copo tem uma entrada na parte superior e na parte interior um orifcio de
sada que permite mudar a soluo nutritiva.
B-Arejamento: efectua-se por meio de injeco de ar atravs de uma bomba.
C-Temperatura: O controlo da temperatura deve ser rigoroso, dado que as variaes de temperatura
modificam de maneira importante a sensibilidade do tecido. O copo do banho de rgos deve permanecer num
banho termostatizado bem como a serpentina por onde circula a soluo nutritiva antes de alcanar o tecido
preparado.
D-Sistema de registo: transductor cujos impulsos elctricos se registam num polgrafo.
E-Tecidos animais: extraem-se os rgos de forma rpida e cuidadosa, a fim de conservar no mximo a sua
sensibilidade.
F - Dissoluo dos frmacos: Como a maioria das dissolues dos frmacos utilizados para estes estudos so
muito diludas, preparam-se dissolues padro e a partir destas obtm-se as restantes com a concentrao
desejada.

B. Ensaios in vitro em duodeno de rato
Material
1. Ratos de 250-300g
2. Instrumentos cirrgicos
3. Placas de Petri
4. Banho de rgos
5. Quimgrafo
6. Soluo de Tyrode (NaCl: 8,0; NaCO3H: 1,0; KCl: 0,2; CaCl2: 0,2; MgCl2: 0,1; Na2PO4H: 0,05 e Glucose 1,0g/L)
7. Solues dos frmacos a utilizar

Protocolo experimental
1 Parte
1. Manter os animais em jejum com gua ad libitum durante as 24 horas anteriores ao ensaio.
2. Sacrificar os animais por decapitao
3. Proceder a uma laparotomia e fazer a exerse da primeira poro do duodeno (2-3cm)
4. Transferir a poro de rgo recolhida para uma placa de Petri com soluo de Tyrode. Nota: uma vez que o
animal foi sujeito a jejum pode no ser necessrio limpar o lumen intestinal, no entanto se apresentar restos de alimentos deve
lavar-se com lquido nutritivo por meio de uma seringa.
5. Remover as aderncias mesentricas que possa conter a fim de facilitar uma boa contraco.
6. Fixar um fio em cada extremidade por meio de uma agulha suturante.
7. Fixar um dos fios vareta que serve de arejamento, situada no copo e unir a outra extremidade ao sistema
de registo.

Os frmacos a ensaiar so os seguintes:
1- Cloreto de acetilcolina
2- Sulfato de atropina
2 Parte
1. Iniciar o ensaio registando a actividade contrctil basal do rgo em estudo.
2. Realizar uma curva dose-resposta no cumulativa de acetilcolina empregando a seguinte sequncia de doses
(varivel segundo a preparao)
Tabela 1 Concentrao e volume das solues de acetilcolina a admnistrar, sequencialmente, ao rgo colocado no banho de rgos.
Concentrao inicial (M) Vol. de frmaco em L
10-6 100
10-6 500
10-5 100
10-5 500
10-4 100
10-4 500
10-3 100
10-3 500
10-2 100
10-2 500

3. Para obter solues com as concentraes indicadas diluir sequencialmente, a partir de uma soluo de
concentrao de acetilcolina de 10
-2
M. (Concentrao 10
-x
= 1ml soluo de concentrao 10
x-1
+9ml de H
2
O).
4. Comear com uma dose de agonista mais diluida, seguindo a sequncia da Tabela 1, at se alcanar a resposta
mxima. No presente procedimento utilizam-se concentraes cumulativas uma vez que no se procede
lavagem entre cada administrao. Contudo, os clculos sero feitos como se as concentraes fossem no
cumulativas.
5. Escolher para o ensaio a dose mais diluida que produz resposta.
6. Lavar a preparao.
7. Administrar a soluo de agonista a partir da dose estabelecida no ponto 3., aumentando-a em progresso
geomtrica.
8. Entre cada administrao deixar repousar.

3 Parte
1- Escolher uma dose de acetilcolina que produza uma resposta de 80% da resposta mxima
2- Ensaiar esta dose.
3- Para observar o efeito da acetilcolina na presena de atropina, juntar ao banho em primeiro lugar 5x10-8 M de
atropina (0,1 mL de 10-5 M) e sem a retirar do banho ao fim de 1 minuto adicionar a dose de acetilcolina
previamente seleccionada.
4- Repetir com esta dose de acetilcolina at recuperao da resposta inicial

RESULTADOS
A concentrao final de frmaco para cada dose administrada foi calculada, tendo em conta que a
capacidade do copo do banho de rgos era de 35ml. Exemplifica-se em seguida o procedimento de clculo para a
soluo uitlizada no ensaio 1. Os restantes foram efectuados da mesma forma.
Assim, uma vez que a soluo inicial tinha 10
-6
M, sabemos que um litro de soluo contm 10
-6
mol de
frmaco. Atravs de uma regra de trs simples temos que 0,1ml de soluo contm 10
-10
mol de frmaco. O volume
final de soluo so 35ml, ou seja, 0,035L, logo:



Tabela 2 Concentrao final de acetilcolina frmaco aps adio ao banho de rgos.
Soluo Concentrao inicial
(M)
Vol. de frmaco em
mL
Volume de
Soluo de Tyrode
(ml)
Concentrao final (M)
1 10
-6
0,1 35 2,86 x 10
-9

2 10
-6
0,5 35 1,43 x 10
-8

3 10
-5
0,1 35 2,86 x 10
-8

4 10
-5
0,5 35 1,43 x 10
-7

5 10
-4
0,1 35 2,86 x 10
-7

6 10
-4
0,5 35 1,43 x 10
-6

7 10
-3
0,1 35 2,86 x 10
-6

8 10
-3
0,5 35 1,43 x 10
-5

9 10
-2
0,1 35 2,86 x 10
-5

10 10
-2
0,5 35 1,43 x 10
-4


Aps a administrao de todas as solues constantes na Tabela 2 terem sido administradas, observou-se
que apenas a partir da soluo 5 se obteve resposta. Desta forma, elaborou-se um segundo ensaio utilizando apenas
a soluo 5 e as solues mais concentradas que esta, tal como apresentado na tabela 3.
Tabela 3 Resultados dos registos do polgrafo em funo do volume e concentrao final de soluo de acetilcolina.
Soluo Volume de soluo
adicionada (ml)
Concentrao final (M) Distncia percorrida pela
agulha do polgrafo a partir
da linha basal (cm)
5 0,1 2,86 x 10
-7
0,0
6 0,5 1,43 x 10
-6
0,2
7 0,1 2,86 x 10
-6
1,0
8 0,5 1,43 x 10
-5
2,4
9 0,1 2,86 x 10
-5
3,5
10 0,5 1,43 x 10
-4
4,5

Logo, 4,5cm corresponde resposta mxima. Assim temos, em termos de percentagem de respostas:
Tabela 4 Resposta obtida pelo rgo em estudo, em termos de percentagem, em funo da distncia percorrida pela agulha do polgrafo e
da resposta mxima obtida no ensaio.
Soluo Concentrao final (M) Distncia percorrida pela
agulha do polgrafo a partir
da linha basal (cm)
Resposta (%)
5 2,86 x 10
-7
0,0 0
6 1,43 x 10
-6
0,2 4,4
7 2,86 x 10
-6
1,0 22,2
8 1,43 x 10
-5
2,4 53,3
9 2,86 x 10
-5
3,5 77,8
10 1,43 x 10
-4
4,5 100


Figura 1 Curva de dose/resposta para as solues de acetilcolina.
Logo, a concentrao que corresponde a cerca de 80% da resposta a da soluo 9, cuja concentrao final
de acetilcolina, aps adio ao banho de rgos, de 2,86 x 10
-5
M.
A adio da soluo de atropina numa concentrao de 10
-2
M, provocou uma total ausncia de resposta
mesmo aps adio da soluo 9, para a qual houve cerca de 80% de resposta no ensaio anterior.

DISCUSSO/CONCLUSO:
A acetilcolina, como neurotransmissor da diviso parassimptica do SNA, exerce um efeito estimulador da
contraco da musculatura lisa intestinal, tal como observado neste trabalho experimental. A curva dose/resposta
(Figura 1) mostra que a resposta do rgo acetilcolina aumenta com o aumento da concentrao de frmaco.
O protocolo indicava que antes da adio da atropina, dever-se-ia ter administrado novamente a soluo de
acetilcolina correspondente a 80% de resposta, por forma a haver confirmao do efeito desta sobre o rgo em
estudo. Contudo, houve um engano no procedimento, e administrou-se a atropina antes da acetilcolina e numa
concentrao superior estipulada pelo protocolo. Todavia, este engano no alterou a interpretao do resultados,
e revelou que a administrao de um antagonista da acetilcolina leva a uma reduo ou abolio do seu efeito. Este
efeito deve-se ocupao, por parte da atropina, dos receptores muscarnicos colinrgicos, inibindo o efeito da
acetilcolina ao nvel gastrintestinal.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
2,86 x 10-7 1,43 x 10-6 2,86 x 10-6 1,43 x 10-5 2,86 x 10-5 1,43 x 10-4
R
e
s
p
o
s
t
a

(
%
)

Concentrao final de acetilcolina (M)