3B-2

GUA DE PRCTICAS
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MEDICA
ESPECIALIDAD: LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA
INMUNOLOGIA I
Autor: Lic CARLOS ALBERTO BALTODANO !ONORES


AGRADECIMIENTOS: "i##i$% Cor&'(o M')i&$
Pi#$r A#*$ B't$##'#u+
,-ctor R$.# Arru&/t'0ui Corr'$
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007
8

INTRODUCCIN
Los animales superiores son atacados por microorganismos y partculas extraas. Pero poseen
sistemas defensivos frente a tales patgenos; dichos mecanismos tienden a distinguir lo propio de lo
extrao
La inmunidad es un conjunto de mecanismos de defensa de los animales frente a estos agentes
externos extraos. Se adquiere al nacer y va madurando y consolid!ndose durante los primeros aos
de vida.
La "nmunologa es la ciencia #iolgica que estudia todos los mecanismos fisiolgicos de defensa de la
integridad #iolgica del organismo. $ichos mecanismos consisten esencialmente en la identificacin
de lo extrao y su destruccin. La inmunologa tam#i%n estudia los factores inespecficos que
coadyuvan a los anteriores en sus efectos finales.
La respuesta inmune frente a los agentes extraos es la actuacin integrada de un gran n&mero de
mecanismos heterog%neos de defensa contra sustancias y agentes extraos. 'n general a las
sustancias extraas se las denomina como antgenos y son ellos los que desencadenan en el
organismo una serie de eventos celulares que provocan la produccin(n de los mecanismos de
defensa. )omo veremos los mecanismos de respuesta tienen una componente celular y otra
molecular.
Por lo mencionado un alumno de#e de ser capa* al finali*ar la asignatura de comprender el
significado de las defensas org!nicas del ser humano en especial del sistema inmune su
organi*acin la dualidad de su respuesta y sus mecanismos celulares y moleculares.
+tro o#jetivo fundamental es que los alumnos en el desarrollo de su ejercicio profesional futuro
puedan aplicar estos conceptos generales al diagnstico inmunolgico de las enfermedades
infecciosas y parasitarias de los seres humanos y que cuenten con los conocimientos suficientes para
permitir su solucin.
La parte pr!ctica del curso se desarrolla en dos grupos de pr!ctica ,aproximadamente -. estudiantes/
en el la#oratorio de "nmunologa de la facultad de )iencias de la Salud
0ay un total de -1 pr!cticas a desarrollar a lo largo del semestre y se cuenta esta una gua de
la#oratorio que los estudiantes de#en manejar de forma individual para orientar cada pr!ctica.
Las prcticas de laboratorio buscan establecer una relacin entre los conceptos tericos y las
herramientas diagnsticas en inmunologa, disponibles en el laboratorio con el fin de correlacionar la
teora con la interpretacin clnica del laboratorio.
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I PRCTICA No 1 Co&2trucci3& 4 E#$5or$ci3& )' 0ru6o2 )' 6r/ctic$2 G'&'r$#i)$)'2 t7c&ic$2 '&
i&%u&o#o0-$
1.1 Marco terico
La i&%u&o#o0-$ es una rama ampia !e as ciencias "iom#!icas $ue se ocupa !e estu!io
!e sistema inmunitario en to!os os or%anismos& enten!ien!o como ta a con'unto !e
r%anos& te'i!os ( c#uas $ue en os verte"ra!os tienen como )uncin "io%ica e
reconocer eementos e*tra+os o a'enos !an!o una respuesta ,respuesta inmuno%ica-.
La ciencia trata& entre otras cosas& e )uncionamiento )isio%ico !e sistema
inmunitario tanto en esta!ios !e sau! como !e en)erme!a!. as ateraciones en as
)unciones !e sistema inmunitario en os !esr!enes inmuno%icos ,en)erme!a!es auto
inmuno%icos& /ipersensi"ii!a!es& !e)iciencia inmuno%ica& rec/a0o a transpante-. as
caracter1sticas )1sicas& $u1micas ( )isio%icas !e os componentes !e sistema
inmuno%ico in vitro& in situ& e in vivo. La inmunoo%1a tiene varias apicaciones en
numerosas !iscipinas cient1)icas.
1.2 Competencias
Conocimiento !e 2ormas& or%ani0acin ( mane'o !e aparatos en e a"oratorio !e
3nmunoo%1a. Conocimientos previos in!ispensa"es en 3nmunoo%1a.
1.3 Materiaes ( e$uipos
4i0arra
Materia impreso
1.5 4roce!imiento
Breve e*picacin !e curso a !esarroar& "rin!an!o a os aumnos os !i)erentes
conceptos pr6cticos so"re os !i)erentes m#to!os a usar !urante e !esarroo !e curso.
Breve repaso !e as normas !e se%uri!a!& Mane'o !e micro pipetas& preparacin !e
!iuciones& o"tencin !e un suero a partir !e una muestra !e san%re e*tra1!a !e un
anima
1.7 Resuta!os
3nventario !e os e$uipos !e a"oratorio& )ormacin !e os %rupos !e pr6ctica
1.8 Cuestionario
9ue impresin tuvo !e a"oratorio !e pr6cticas:
;! cree $ue necesita m6s e$uipos: Cu6es:
1.7 Fuentes !e in)ormacin
/ttp<==me!icinausac/.iespana.es=)isiopat=inm%en./tm
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II. PRACTICA N 2 Inoculacin de animales de Laboratorio
2.1 arco Terico
> sistema inmune !e os seres verte"ra!os soo pue!e ser evi!encia!o cuan!o se e
cooca sustancias e*tra+as a >L $ue permitan e reconocimiento ( !esenca!enar una
respuesta inmune contra e ant1%eno $ue o /a !esenca!ena!o.
4or su naturae0a $u1mica os ant1%enos pue!en ser prote1nas& car"o/i!ratos& 6ci!os
nuce1!os ( 1pi!os. La capaci!a! inmun%ena !e os ant1%enos se !e"e a<
- ser reconoci!a por CM? !e case 33 ( ser reconoci!o por receptores !e mem"ranas !e os
in)ocitos
- @e"e ser meta"oi0a"e
- @e"e !e tener ep1topos capa0 !e ser reconoci!os por os anticuerpos !e os L B.
>stas caracter1sticas son as tres propie!a!es $u1micas intr1nsecas $ue se necesitan para
$ue una mo#cua estimue una "uena respuesta !e anticuerpos. Ain em"ar%o e*isten
otros )actores $ue pue!en intervenir ( mo!uar a respuesta inmune<
- La !osis
- > esta!o !e inmun%eno
- > uso !e a!(uvantes
- V1a !e inocuacin
Ae inocuar6n ant1%enos a cone'os a )in !e o"tener anticuerpos circuantes. Los me'ores
resuta!os se o%ran a provocar a anima una respuesta inmune /umora secun!aria&
inocuan!o e ant1%eno en m6s !e una !osis& es !ecir& se !e"e /iperinmuni0ar a cone'o.
Los anticuerpos circuantes tienen un ato tituo !e 3% B espec1)ica& son !e ata a)ini!a! (
!e mu( eeva!a !iversi!a!.
Los ant1%enos a inocuarse pue!en ser sou"es o particua!os. Los sou"es se emusionan
con a!(uvante ( os particua!os se inocuan sin a!(uvante.
2.2 Co%6't'&ci$2
Reconocer as )ormas !e inocuacin en os animaes !e a"oratorio
Reconocer os pro!uctos !e inocuacin
C"tener muestras !e anima !e a"oratorio con canti!a! su)iciente !e anticuerpos
2.3 M$t'ri$#'2 4 '8ui6o2
->ritrocitos< as suspensiones !e eritrocitos son usa!os con )recuencia como a%entes
inmuni0antes en a preparacin !e sueros para tipi)icar san%u1nea. Aoo usar san%re )resca& no
contamina!a.
- Aan%re /umana !e tipo DCE e*tra1!os con FC@ o citrato !e so!io a 10G& en una reacin !e
10 voumenes !e san%re por 1 voumen !e anticoa%uante.
- ;n cone'o en "uen esta!o !e nutricin ,cone'os 2ueva Hean!a !e 2-2.7 I% !e peso
-Auero )isio%ico tampona!o
-Bra!ia ( tu"os !e prue"a !e 13*100
-Jerin%as ( a%u'as !escarta"es !e 3 m * a%u'a 21& 23& ( 28E.
-Fco/o (o!a!o. F%o!n.
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2.5 Proc')i%i'&to
3nocuar cone'os con san%re tota por v1a intracutanea se%ui!a !e %"uos ro'os a 20G en
soucin saina 0.87G con su)ato !e ma%nesio por v1a en!ovenosa. se o"tienen t1tuos m6s
atos !e anticuerpos.
-Retirar a cone'o !e su 'aua ( coocaro en a mesa !e tra"a'o
-Car%ar a suspensin en a 'erin%a se%Jn protocoo
-3nmovii0ar a cone'o. Au'etar a ore'a !e anima ( )rotar a re%in mar%ina con a%o!n
em"e"i!o en aco/o.
-3nsertar a a%u'a en a vena. @espa0ar e em"oo /acia arri"a. Ai aparece san%re en a
'erin%a& inocuar e ant1%eno entamente.
-F terminar a inocuacin& esperar unos se%un!os ( !espu#s retire a a%u'a. Coocar un tro0o
!e a%o!n so"re e sitio !e inocuacin ( esperar /asta $ue se coa%ue a san%re.
Ae usan as !osi)icaciones se%Jn ta"a a!'unta& si e tituo no satis)ace se inocua nuevamente
!osis >.V.
@1a @osis V1a Materia inocua!o
1 0.7 3.@
Aan%re tota Brupo DCE
3 1.0 3.@
D
7 1.7 3.@
D
7 2.0 3.@
D
K 2.7 3.@
D
12 1.0 >.V
B.R.ECE a 20G en so.
17 1.0 >.V
Aaina 0.87G con su)ato
18 1.0 >.V
Ma%nesio a 0.01G
21 1.0 >.V
23 1.0 >.V
27 Aan%r1a !e prue"a
2.7 R'2u#t$)o2
;na "uena inocuacin se evi!encia por a ausencia !e e!ema en a 0ona !e inocuacin.
F )ina !e proceso !e inocuacin se ten!r6 un cone'o /iperinmuni0a!o& con una
concentracin ata !e anticuerpos.
2.8 Cu'2tio&$rio
- Fnimaes )recuentes !e inocuacin:
- V1a !e inocuacin m6s )recuente:
- Cuaes son as Austancias $ue pro!ucen me'or respuesta inmune:

2.7 Fu'&t'2 )' i&9or%$ci3&
- VaituLaitis JL. 4ro!uctin o) antisera Mit/ sma !oses o) immuno%en< mutipe intra!erma
in'ections. Met/o!s >n0(mo 73< 58-72& 1K81.
- 4iot& J. ( 4etier& 9. >*amenes !e La"oratorio. N#cnicas en 3nmunoo%1a. >!itoria Jims&
Barceona& 1K77.
- Corne'o O.& Fva 4. Manua !e 4racticas !e 3nmunoo%1a ( Vacunas. 2Pe!. ;2MAM& 2007.
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III. PR!CTICA No. " Identi#icacin de r$anos lin#oides
2.- 3arco terico
:r0$&o2 Li&9/tico2
:r0$&o2 6ri%$rio2
Como 3r0$&o2 6ri%$rio2 tenemos a timo& !on!e ma!uran os in)ocitos N& ( a m#!ua
Qsea& sitio !e in)opo(esis ( ma!uracin !e os in)ocitos B. >n etapas tempranas !e
@esarroo )eta& e /1%a!o asume estas )unciones& aun$ue pauatinamente se ve
Au"stitui!o por a m#!ua e cua es e otro r%ano primario $ue por su importancia en a
?ematopo(esis ser6 trata!a en cap1tuo correspon!iente a este te'i!o con'untivo
>speciai0a!o.
Ti%o
>s un r%ano ocai0a!o en e tra*& por encima !e cora0n.
>ste r%ano est6 eno !e c#uas in)oi!es !enomina!as timocitos& !istri"ui!as en una
corte0a !e %ran !ensi!a! ceuar ( una m#!ua !e menor !ensi!a! ceuar.
Las c#uas no in)oi!es !e estroma e*presan en sus super)icies mo#cuas M?C !e tipo 3
(=o 33& ( participan en a ma!uracin ( seeccin !e os timocitos /acia c#uas N ma!uras.
Desarrollo % e&olucin del timo.
>n /umanos& a nacer& e timo pesa 10-17 %& acan0a su m6*imo !esarroo en a
a!oescencia& #poca en a $ue e%a a pesar 30-50 %& ( va invoucionan!o con a e!a!& !e
mo!o $ue en a ve'e0 ,R 80 a+os- pesa entre 10 -17 %. 4or o tanto& en a vi!a a!uta& a
pro!uccin !e in)ocitos N en e timo !ecae "astante& aun$ue siempre e*iste una activi!a!
resi!ua.
>n a )ase a!uta& cuan!o e timo /a invouciona!o& si%ue /a"ien!o ma!uracin !e
in)ocitos N en otros u%ares& principamente en e epiteio intestina& !on!e se pro!uce
in)opo(esis !e c#ua N $ue permanecen en e epiteio intestina o mi%ran a a 6mina
propia.
M')u#$ 32'$
@urante muc/o tiempo no )ue teni!o en cuenta& e pape $ue !esempe+a a me!ua sea
en a respuesta secun!aria. @urante esta respuesta& os r%anos secun!arios
Sc6sicosS respon!en r6pi!amente& pero !urante poco tiempo. >n cam"io& a m#!ua sea
con una respuesta enta pero m6s proo%a!a !e pro!uccin !e anticuerpo e%a a ser
responsa"e !e apro*ima!amente e 80 G !e a respuesta secun!aria. >s por esta ra0n $ue
!e"e !e incuirse !entro !e os r%anos secun!arios aun$ue tam"i#n 'ue%ue un pape
)un!amenta como r%ano primario& en e suministro !e as c#uas $ue intervienen en a
!e)ensa !e or%anismo.
:r0$&o2 2'cu&)$rio2
Los r%anos secun!arios est6n representa!os por e "a0o& e cua procesa os ant1%enos $ue
transitan en a san%re& os %an%ios in)6ticos $ue o /acen !e os e*istentes en os te'i!os (
por Jtimo tenemos e te'i!o in)oi!e asocia!o a mucosa& $ue se encar%a !e reai0ar esta
)uncin en as mucosas !e os r%anos como e pumn& as v1as !i%estivas ( e tracto
urinario. Nam"i#n se !e"e !e tener en cuenta $ue en a respuesta secun!aria a m#!ua
sea se comporta como un r%ano secun!ario.
B$+o
> "a0o es e ma(or !e os r%anos in)oi!es u"ica!o !entro !e a cavi!a! a"!omina.
Varia muc/o su voumen !e acuer!o a con a canti!a! !e !e san%re $ue reten%a en su
interior ( se%Jn a activi!a! /ematopo(#tica $ue reaice. Au coor purpJreo se !e"e a a
%ran canti!a! !e san%re $ue contiene. >s una v1scera "an!a ( mu( )ria"e& o cua tiene
importancia para os traumatismos a"!ominaes.
G$&0#io2 #i&9/tico2
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>s a primera estructura in)oi!e or%ani0a!a $ue se encuentra un ant1%eno $ue proce!a !e
os espacios tisuares ( est6n especiamente !ise+a!os para retener ant1%enos& $ue vienen
en a in)a a cua a circuar por su interior pone en contacto a os ant1%enos con os
in)ocitos ( as otras c#uas inmunocompetentes& responsa"es !e iniciar a respuesta
inmune espec1)ica.
>n este r%ano se evar a ca"o una respuesta inmuno%ica espec1)ica& )rente a a entra!a
!e un ant1%eno a or%anismo ( se !e"e tener en cuenta $ue estos eventos acontecen !e
manera !in6mica cam"ian!o a mor)oo%1a !e %an%io en !epen!encia !e a activi!a!
)unciona en $ue se encuentra en e momento $ue se e*trae ( procesa para su o"servacin.
3.2 Co%6't'&ci$2
Conocer os r%anos in)oi!es !e ratones $ue tienen seme'an0a con os r%anos in)oi!es !e
os seres /umanos.
3.3 M$t'ri$#'2 4 '8ui6o2
- Ratones a!utos& no importa e se*o.
- Materia !e !iseccin< Buantes& ti'eras& "istur1& pin0as& 'erin%as ( a%u'as para insuina.
- Vaso !e precipita!o !e 1000 cc
- 4ape auminio
- Nu"o !e 70 m con tapa.
- Nu"os !e ensa(o !e 7 m ( %ra!ia.
- 4ipetas !e 7-70 T ( 200-1000 T ( puntas.
- Contene!or para materia cortante.
- 4acas !e petri
- >tano 70G
- >ter !iet1ico anest#sico
- Nampn 4BA p? 7.2
- Auero )isio%ico
- 4ape toaa
- 4ipeta pasteur
3.5. Proc')i%i'&to
>n inmunoo%1a /umana es )recuente e empeo !e animaes !e a"oratorio. >n esta pr6ctica
se apren!er6n as t#cnicas "6sicas !e manipuacin !e ratones $ue pue!en tener utii!a! en
3nmunoo%1a. Ae evar6n a ca"o e*traccin !e r%anos in)oi!es ( aisamiento !e c#uas a
partir !e estos te'i!os si!os.
Los ratones !e"en ser manipua!os con cui!a!o pero con !ecisin para evitar estresar a
anima& o $ue pue!e resutar en mor!e!uras o ara+a0os a e*perimenta!or ( en !a+os
innecesarios a anima. @e"e tenerse en cuenta $ue os ratones son m6s a%resivos $ue as ratas
( ten!er6n a mor!er instintivamente.
>*traccin !e r%anos in)oi!es ,"a0o& %an%ios ( timo-
1. Aacri)icar a anima por !isocacin cervica< Coocar un man%o !e "istur1 !etr6s !e as
ore'as& cru0an!o a nuca& tirar !e ra"o /acia atr6s con a otra mano mientras se presiona
/acia a"a'o en a nuca.
2. Coocaro !e espa!as so"re un pape secante.
3. >sterii0ar con aco/o a 0ona !e a 1nea me!ia.
5. Cortar por a 1nea me!ia con ti'eras.
7. Retirar a pie con os !e!os.
Ba0o<
8. Birar a anima para e*poner su )anco i0$uier!o.
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7. F"rir e peritoneo con una incisin !e 2-3 cm me!iante unas ti'eras.
8. Locai0ar e "a0o ( e*traero con unas pin0as& cortan!o e te'i!o conectivo.
K. Coocar e "a0o en una paca petri con 1 m !e 4BA.
Ban%ios<
10. @iseccionar a re%in a*iar ( ocai0ar a%Jn %an%io in)6tico.
11. >*traer& !epositar en una paca petri ( impiar !e te'i!o %raso ( conectivo. F+a!ir 1m
!e 4BA.

Nimo<

12. Num"ar a ratn !e espa!as.
13. F"rir e tra* me!iante una incisin& con ti'eras& !es!e e *i)oi!es /asta e cueo.
15. F"rir as costias con as pin0as.
17. >*traer e timo con as pin0as ( coocar en una paca petri con 1m !e 4BA.
3.7 Resuta!os
3.8 Cu'2tio&$rio
3.7 Fu'&t'2 )' i&9or%$ci3&
' Stevens A, Lowe J. Texto y atlas de histologa. Mosby/oy!a Libros. "ar#elona$%s&a'a.
1((2.
- Corne'o O.& Fva 4. Manua !e 4racticas !e 3nmunoo%1a ( Vacunas. 2Pe!. ;2MAM& 2007.
http://www.med.uva.es/~pingo/Inmunologia/Apuntes/tema2.htm
I,. PR!CTICA No.( )a$ocitosis
;.* arco Terico.
La fagocitosis ,del griego phagein 4comer4 y kytos 4c%lula4/ es un tipo de endocitosis por el cual
algunas c%lulas ,neutrfilos y macrfagos/ rodean con su mem#rana citoplasm!tica a un antgeno
y lo introducen al interior celular. La unin se reali*a mediante la emisin de pseudopodos por
parte del macrfago englo#ando al microorganismo. $ando lugar al fagosoma. 'n la posterior
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destruccin del microorganismo intervienen los lisosomas. 'sta destruccin puede llevarse a
ca#o5 a/ Por mecanismos dependientes de oxgeno. 6l activarse rutas meta#licas que consumen
oxigeno. la activacin de esta ruta produce la li#eracin de radicales que son toxicos para los
microorganismos. #/ 3ecanismos independientes del oxigeno. 3ediante la li#eracin de en*imas
tipo hidroltico que destruir!n los microorganismos.
Para que se pueda producir la fagocitosis es necesario que el macrfago se una al
microorganismo y activarse para poder emitir el pseudpodo y englo#arlo. 'n esta activacin
interviene la ruta alternativa del complemento.
'n "nmunologa las prue#as de funcin fago citica pueden ser in vitro o in vivo. Las prue#as in
vitro miden la capacidad de los leucocitos P37 y de los macrfagos de ingerir partculas o
#acterias. Las prue#as mas com&nmente usadas son el ensayo micro#icida la eritrofagocitosis y
la prue#a de reduccin del a*ul de tetra*olio.
;.2 Com+etencias
' )e#ono#er la *ago#itosis #o!o &arte del siste!a in!une innato
$ +ono#er la i!&ortan#ia de los ,M- #o!o &ri!era lnea de de*ensa del hu.s&ed
;." ateriales % e,ui+os
')atones adultos
$%ritro#itos de #arnero al 2/0
$Solu#i1n 2an3s, #on anti#oagulante
$+olorante &ara #.lulas, 4ie!sa o Leish!an
$Agua ta!&onada
$Metanol
$+loro*or!o
$Al#ohol etli#o al 5/0
$,la#as &etri #on la!inillas
$,i&eta &asteur #on tetina
Jeringa de 1 !l #on agu6a -7 28
$,in9as y ti6eras
$Tabla de dise##i1n y al*ileres
$Algod1n
$,a&el *iltro
$Mi#ros#o&io y a#eite de in!ersi1n
;.( Procedimientos
Me!ia /ora antes !e a pr6ctica& os ratones /a"r6 reci"i!o 0.1 !l de eritro#itos &or va
intra&eritoneal.
$ :no#ular 1 !l de solu#i1n 2an3s al rat1n, &or va intra&eritoneal.
$ es&u.s de 1/ !inutos, sa#ri*i#ar al ani!al #on #loro*or!o en una #;!ara !ortuoria.
+olo#ar al rat1n en &osi#i1n ventral sobre una tabla de dise##i1n, !o6ar la &iel del ani!al #on
al#ohol y #on la ayuda de una &in9a levantar la &iel y ha#er una in#isi1n en la lnea ventral, sin
ro!&er la &ared !us#ular.
$)etirar la &iel tra##ionando #on los dedos ndi#e y &ulgar de a!bos !anos en dire##iones
o&uestas.
$ ,asar un algod1n i!&regnado en al#ohol &or el !us#ulo abdo!inal. :ntrodu#ir la agu6a ha#ia
un #ostado de la #avidad abdo!inal, *or!ando una es&e#ie de bolsa #on el l<uido &eritoneal.
%l bisel de la agu6a debe de estar ha#ia el interior de la #avidad &eritoneal.
$ %xtraer el l<uido &eritoneal y #olo#arlo sobre las la!inillas de la &la#a &etri. Si es
ne#esario, lavar la #avidad &eritoneal #on /.1 !l de solu#i1n 2an3s y retirar !as #.lulas,
de&osit;ndolas en la!inillas no usadas.
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$ :n#ubar las #.lulas a =57+ durante 1$2 horas &ara *avore#er la adheren#ia de los !a#r1*agos
al vidrio de la la!inilla.
$ )etirar las la!inillas d=e la &la#a &etri y lavarlas a #horro dire#to #on la solu#i1n de han3s.
)e&etir 2$= ve#es. Luego, #olo#ar las la!inillas en &osi#i1n #asi verti#al, sobre &a&el *iltro,
&ara se#arlas. %n todo !o!ento se debe saber sobre #ual su&er*i#ie se han adherido los
!a#r1*agos.
$:ntrodu#ir la la!inilla en la &la#a #on #olorante y de6ar #olorear &or 1$8 !inutos.
$,ara la observa#i1n ba6o el !i#ros#o&io de lu9, !ontar la &re&ara#i1n #on una gota de
gli#erina entre l;!ina y la!inilla.
;.- Resultados
Ae consi!era )a%ocitosis positiva cuan!o a menos un eritrocito )ue incorpora!o a citopasma
!e macr)a%o.
;.. Cuestionario
' >u. i!&ortan#ia tiene la *ago#itosis?
$ La *ago#itosis solo se da en hu!anos?
$ La *ago#itosis &ertene#e a la in!unidad innata o ad<uirida?
;./ )uentes de in#ormacin
' Stuart a. %. Te#hni<ues *or the study o* &hago#ytes. 2andboo3 o* ex&eri!ental i!!unology,
@eir M AedB, "la#3well S#ienti*i# ,ubli#ations, +a&. =2, 1(C5.
$ Janses @TM y #ol. +o!&arison o* a #lassi#al &hago#ytosis assay and a *low #ito!etry assay *or
assess!ent o* the &hago#yti# #a&a#ity o* sera *ro! adults va##inated with &neu!o#o##al. +lin
iag Lab :n!unology 2//1D EF2G8$28/.
- Corne'o O.& Fva 4. Manua !e 4racticas !e 3nmunoo%1a ( Vacunas. 2Pe!. ;2MAM& 2007.
V. PRCTICA N5 CUANTIFICACIN DE ANTICUERPOS POR EISA
5.! "a#co Te$#ico
EISA ,'nzyme-Linked ImmunoSorbent ssay 'nsayo por inmunoa#sorcin ligado a en*imas/ es
una t%cnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovili*ado se detecta mediante un anticuerpo
enla*ado a una en*ima capa* de generar un producto detecta#le como cam#io de color o alg&n otro
tipo; en ocasiones con el fin de reducir los costes del ensayo nos encontramos con que existe un
anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su ve* es reconocido por un antgeno
secundario que lleva enla*ado la en*ima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes
permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra.
Se usa en muchos la#oratorios para determinar si un anticuerpo particular est! presente en la
muestra de sangre de un paciente. 6unque el procedimiento es rutinario y sencillo involucra a un gran
n&mero de varia#les tales como seleccin de reactivo temperatura medicin de volumen y tiempo
que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prue#a.
La interaccin antgeno8anticuerpo en el la#oratorio puede ser utili*ada para determinar si un paciente
tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. 9n resultado positivo indica que el anticuerpo est!
en la sangre e implica que la persona ha contrado una determinada enfermedad.
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

'ste principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal5 es vers!til ro#usto simple
en su realice mediante el uso de la fase slida una separacin f!cil entre la fraccin retenida y la
fraccin li#re.
'ste m%todo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se precisa#a la
cuantificacin de productos mediante anticuerpos5 diagnstico clnico deteccin viral clasificacin de
anticuerpos en isotipos #&squeda de anticuerpos monoclonales etc.
7.2 Co%6't'&ci$2
Conocer os principios "6sicos !e cuanti)icacin !e anticuerpos me!iante e uso
!e a t#cnica !e >L3AF.
Conocer a utii!a! !e a prue"a !e >L3AF en a !eteccin !e anticuerpos.
7.3 M$t'ri$#'2 4 '8ui6o2
Lector !e >L3AF
Iit para >L3AF
4acas !e >L3AF
Micropipetas
4untas
7.5 Proc')i%i'&to
1. Cu"rir a paca !e >L3AF con e anti%eno !iui!o e incu"ar !urante a noc/e en 5c.
2. Lave 5 veces os pocios con 4BA-NMeen 20.
3. Bo$uee e atascamiento no espec1)ico usan!o e 1G BAF=4BA e incu"e por
30 minutes en a temperatura am"iente.
5. Lave a paca. F%re%ue os est6n!ares ( 100uL !e muestras !iui!as a os pocios
apropia!os.
7. 3ncu"e por 1 /ora a temperatura am"iente.
8. F%re%ue a !iucin apropia!a 100 u !e anticuerpo secun!ario con'u%a!a con a
)os)atasa acaina ,F4- o a pero*i!asa ,?R4- e incu"e por 30 minutos.
7. F%re%ue 100uL !e su"strato a ca!a pocio e incu"e a temperatura am"iente por 30
minutos.
8. Leer as pacas en un ector !e >L3AF.
7.7 R'2u#t$)o2
,F- ;n >L3AF in!irecto& a pro!uccin !e coor in!ica a canti!a! !e un anticuerpo para
un ant1%eno especi)ico
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

,B- >n >L3AF san!Mic/& a pro!uccin !e coor in!ica a canti!a! !e ant1%eno
7.8 Cu'2tio&$rio
Los anticuerpos !etecta!os por a prue"a !e >L3AF son !e tipo B o M:
La prue"a !e >+isa soo sirve para !etectar anticuerpos:
> m#to!o >L3AF es !i)1ci !e reai0ar en os !i)erentes a"oratorios !e sau! pJ"ica:
7.7 Fu'&t'2 )' i&9or%$ci3&
o F""as FI ( Lic/tman FO ,2005- 3nmunoo%1a ceuar ( moecuar. 7U e!.& McBraM-
?i V 3nteramericana& Ma!ri!.
JaneMa( CF Jr& Nravers 4& Oaport M ( A/omc/iL M ,2003- 3nmuno"ioo%1a. >
sistema inmune en con!iciones !e sau! ( en)erme!a!. 7U e!.& Masson& Barceona.
o R. F. Bo!s"(& N. J. Iin!t& B. F. Cs"orne& Huby :!!unology& 5t/ e!. ,O. ?. Freeman
an! Compan(& 2000-& p. 182.W
o Corne'o O.& Fva 4. Manua !e 4racticas !e 3nmunoo%1a ( Vacunas. 2Pe!. ;2MAM&
2007.
/ttp<==en.MiLipe!ia.or%=MiLi=>L3AF
0I. PR!CTICA No. . 1an$r2a de animales de Laboratorio
8.1 M$rco t'3rico
'l en !rea de la "nmunologa encontramos una gran variedad de procedimientos para lograr
diversos o#jetivos.
Para cada animal de experimentacin se utili*an t%cnicas de sangra diferentes teniendo en
cuenta que en algunas se quiere mantener vivo al animal,sangra parcial o de prue#a/ mientras
que en otras ocasiones se extrae el m!ximo de sangre posi#le,sangra total o en #lanco/.
$espu%s de lograr la sangre del animal mediante t%cnica adecuada de puncin se procede a la
separacin de la muestra y la o#tencin de los antisueros que gracias a ellos es que podernos
contar hoy en da con las vacunas gran avance que en tiempos pasados no se tena lo cual
era causante de muchas muertes por enfermedades que podan ser tratadas o evitadas con
solo una inyeccin de este antisuero claro y especifico para determinada enfermedad.
"ncluso hoy en da estamos en continua lucha por seguir encontrando mas opciones de cura
para otras enfermedades que nos afligen.
'sta o#tencin de antisuero es gracias a un procedimiento que se les reali*a a las #acterias o
agente infeccioso causante de la enfermedad.
'n este proceso tornarnos el antgeno #acteriano ya sea c!psulas flagelos protenas entre
otros y les reali*amos una serie de prue#as en las cuales el producto final es el antisuero.
Para verificar la eficacia de estos necesitarnos un animal de prue#a al cual se le llevara un
seguimiento de la accin del antisuero pero para eso necesitamos sa#er las t%cnicas
adecuadas de inoculacin para estos animales y la diferencia entre cada t%cnica para tener una
accin m!s confia#le del producto final que es el antisuero.
8.2 Co%6't'&ci$2
Adquirir conocimientos sobre las tcnicas a utilizar en el laboratorio de
Inmunologa y saber con que tipos de animales podemos realizar estas
tcnicas.
Aprender las bases sobre cmo se obtiene un antisuero
Obtener un conocimiento previo terico sobre las reas donde se deben
realizar las punciones en los animales.
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

8.3 M$t'ri$#'2 4 '8ui6o
'n los conejos inmuni*ados en las pr!cticas anteriores se les har!n sangras para detectar la
presencia de anticuerpos circulantes; luego si se decide que el nivel de anticuerpos es el
adecuado se proceder! a la sangra total.
8 )onejos inmuni*ados
8 :u#os de -2x-.. mm
8 ;eringas de vidrio de <.8=. ml
86gujas de ->x- ?
8 6gujas de <.x-
86lgodn y alcohol
8.5 Proc')i%i'&to
S67@A"6 $' PA9'B6
8 $esinfectar el area donde se locali*a la vena central de la oreja dejar evaporar el alcohol y
luego introducir la aguja en la vena; la evidencia que la aguja est! en la vena es el flujo
continuo de sangre.
8 )olectar 2 ml de sangre en un tu#o de prue#a.
8 Para terminar la sangr colocar un tro*o de algodn so#re el area de sangra y extraer la
aguja. Presionar ligeramente so#re la vena hasta que coagule la sangre.
8 $ejar coagular la sangre o#tenida.
S67@AC6 :+:6L
- 6gitar al animal colocarlo en posicin ventral so#re una superficie lisa hori*ontal sujet!ndolo
por las patas anteriores y posteriores.
- Palpar los latidos del cora*n y desinfectar el area.
- "ntroducir la aguja hacia el cora*n en una inclinacin de 1=D y hacia el centro de la cavidad
tor!xica; la evidencia de que la aguja est! en el cora*n es el flujo continuo de sangre.
- 'xtraer la jeringa retirar la aguja y depositar la sangre en los tu#os de prue#a.
- Aepetir el procedimiento una o mas veces a fin de o#tener la mayor cantidad posi#le de
sangre.,La sedacin del animal facilitar! la tarea/
8.7 R'2u#t$)o2
- La sangra total de un conejo rendir! entre E.8-<. ml de sangre. 'n las sangras parciales es
generalmente suficiente 28-. ml de sangre.
8.8 Cu'2tio&$rio
8 Se puede usar suero hemoli*ado para prue#as de la#oratorioF
8 'l mejor animal para inocular es el conejoF PorqueF
8)uanto de suero es lo ideal para una #uena sangraF
E.G "ate#ia% &e #efe#encia
8 0arloH '. Lane $. 6nti#odies5 6 la#oratory manual. )old Spring 0ar#or La#oratory 7eH IorJ;
)ap = -K>>.
- Corne'o O.& Fva 4. Manua !e 4racticas !e 3nmunoo%1a ( Vacunas. 2Pe!. ;2MAM& 2007.
SEPARACI:N DEL SUERO
La deteccin o cuantificacin de anticuerpos s%ricos generalmente requiere de una muestra de
suero transparente y li#re de contaminacin. Por lo tanto el suero de#er! o#tenerse -8< horas
despu%s de extrada la sangre cuidando no hemoli*arlo y evitando su contaminacin.
3ateriales5
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

8:u#os -.xG= mm
8 Pipetas pasteur con chupn
8 )riotu#os
8 )entrfuga
Procedimiento
L $ejar los tu#os con sangre ligeramente inclinados hasta que coagule.
L 8)olocar los tu#os en estufa de 2GM) por 2. minutos; luego trasladarlos a 1M) para que
li#eren el suero.
L 8 )on una pipeta pasteur colectar el suero y colocarlo en un tu#o de -.xG= mm
L 8 )entrifugar el suero a <=.. rpm durante =8-. minutos.
L 8 )olectar el suero li#re de eritrocitos y envasarlo en criotu#os. Aotular convenientemente y
guardar a 8<.M).
L Aesultados
L 8 'l suero no hemoli*ado es incoloro o presenta un color ligeramente amarillo.
L 8 $ependiendo del volumen de suero o#tenido repartir entre ...=8..= ml de suero por cada
criotu#o.
L 'l suero pro#lema se puede guardar en congeladora solo o se le puede agregar
solucin para conservar mejor los anticuerpos y evitar la contaminacin #acteriana.
L Preparar en vol&menes iguales el suero con la glicerina y repartirlos en alcuotas
envas!ndolo y conserv!ndolos en congelador a 8<.M).
L
L So%'ci$n "a&#e(
L )on una de las alcuotas preparada preparar una dilucin -N-.. de la siguiente
manera5
0emolisina al =.O en glicerinaPPP..<ml
Sol. Salina tamponada ..>=O..............K1 ml
Qenol al =O en suero fisiolgicoPPP1 ml
L 'sto se conserva esta#le en refrigerador sin congelar.
L
L
L
L
L
L
L VOU"ENES DE SAN)RE *UE SE PUEDEN O+TENER DE VARIAS ESPECIES
ANI"AES
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

3s+ecie
0olumen total de san$re
+romedio4ml56$7
0olumen dis+onible en la
san$r2a
total4ml56$7
0olumen m89imo de
se$uridad en una
san$r2a
+arcial4ml56$7
Caballo /- (: ;
<o&ino .: ": /
Cabra /: ": /
Carnero .: 2- .
Perro =: (- =
Cone>o /: "- /
Coba%o /- "- /
0II. PR!CTICA No./ Titulacin de 1uero4?emolisina7
G.- "a#co Te$#ico
La forma ha#itual de evaluar la respuesta inmunitaria humoral en personas o en animales de
la#oratorio consiste en la deteccin o medicin de inmunoglo#ulinas anticuerpos y protenas del
complemento por t%cnicas serolgicas. La medicin de anticuerpos se lleva a ca#o titulando
seriadamente el suero pro#lema en diluciones al do#le en presencia una cantidad constante de
antgeno. 'l titulo alcan*ado por el suero es un indicador para esta#lecer si hay una relacin causal
entre los anticuerpos anti8eritrocitos de carnero,hemolisina/ contenidos en el suero de un animal
hiperinmuni*ado.
G.< Co,-etencias
8 conocer como se reali*a una titulacin de anticuerpos en muestras de sueros
8 reali*ar correctamente diferentes diluciones de muestras
G.2 "ate#ia% . e/'i-os
80emolisina diluida -5=,Solucin madre de hemolisina-N=./
8 'ritrocitos -8<O
8 Solucin salina
8:u#os -.x-= mm
8Pipeta de - ml
8Puntas para micropipeta
8 Bocal con leja
8 Bao mara
G.1 P#oce&i,iento
Se hace preparando una serie de tu#os de hemlisis en los cuales se me*clan vol&menes iguales de
diluciones crecientes de hemolisina en suero fisiolgico y una suspensin al -O de hemates humano
R+S lavados y no sensi#ili*ados.
TITUACION DE SUERO ANTI)O+UOS RO0OS 1U"ANOS 2O3
Aeactivo
- < 2 1 = E G
Sol. Salina ..< ..< ..< ..< ..< ..< ..<
Sol. 3adre 0emolisina
-N=.
..< 3e*clar
3e*clar el contenido del tu#o - y pasar ..<. ml al tu#o siguiente hasta el tu#o G. $escartar ..< ml.
9sar controles de @A.
@.A.S+S -O ..< ..< ..< ..< ..< ..< ..<
$ilucin -N<.. -N1.. -N>.. -N-E.. -N2<.. -NE1.. -N-<>..
Se colocan en #ao mara a 2GM) por < horas y en refrigeracin a 1M) por -> horas.
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

La primera dilucin que no presenta aglutinacin visi#le es considerada la dilucin a usar para la
sensi#ili*acin.
G.= Res'%ta&os
La aglutinacin se lee en el fondo del tu#o seg&n la manera que se han depositado los eritrocitos.
"ncline ligeramente el tu#o de prue#a si los eritrocitos caen a manera de l!grima es porque est!n
sueltos,aglutinacin negatica/; si por el contrario los eritrocitos forman una malla la aglutinacin es
positiva.
'l titulo de la hemolisina va a estar dado por la m!xima dilucin donde acurre la hemaglutinacin.
'l titulo es la inversa de la dilucin donde ocurre la m!xima hemaglutinacin.
G.E c'estiona#io
4 'l titulo es lo mismo que la dilucinF
8 Se puede usar cualquier @A para la titulacinF
8 7o se de#en usar tu#os controles en la titulacinF PorqueF
G.G "ate#ia% &e #efe#encia
8 6lton @ @ ;onesL.3. Las t%cnicas de la#oratorio en #rucelosis. <D ed. +3S -KGE.
8 6lmeida ; + Qife ' 0. 3%todos de fijacin del complemento estandari*ado cuantitativamente para la
evaluacin crtica de antgenos preparados con :rypanosoma cru*i. +PS +f Sanit Panam Pu#.
)ientif. 2-K -KGE.
8 Corne'o O.& Fva 4. Manua !e 4racticas !e 3nmunoo%1a ( Vacunas. 2Pe!. ;2MAM& 2007.
"T. PAU):")6 7DK $eterminacin de Linfocitos en sangre5 Aosetas :
K.- "a#co te$#ico
Las c%lulas indiferenciadas que migran al timo encuentran el microam#iente para su diferenciacin en
linfocitos :. 'stas c%lulas pueden participar en ciertos mecanismos inmunolgicos como el recha*o de
injertos reacciones de hipersensi#ilidad retardada reacciones de injerto contra hu%sped defensa
contra virus y c%lulas tumorales o en proceso de regulacin de la respuesta inmune. La maduracin
de los linfocitos : en el timo su primer marcador que aparece en la superficie es el )$< ,receptor
para gl#ulos rojos de carnero/ posteriormente aparece el receptor )$2. 6l madurar los linfocitos
todava en el timo le aparecen los marcadores )$1 y )$> entre otros receptores y es en el timo
donde se lleva a ca#o una seleccin de los linfocitos :.
$esde el punto de vista morfolgico se encuentra poca diferencia entre los linfocitos pequeos B y :
examinados al microscopio ptico o al electrnico pero se han utili*ado marcadores de superficie
para diferenciar las po#laciones.
Las inmunoglo#ulinas son f!cilmente demostra#les en la superficie de los linfocitos B pero no de los
: usando t%cnicas de inmunoflorecencia y reactivos tales como sueros anticadenas ligeras de
inmunoglo#ulinas marcados con fluorescena. 9na gran proporcin de c%lulas B llevan "g$ e "g3 en
la superficie pero una parte se tien con antisueros dirigidos contra la parte Qc de otras clases de
inmunoglo#ulina parte de las c%lulas : se tien para inmunoglo#ulinas. La inmunoglo#ulina no es un
producto procedente de las c%lulas : si no que es a#sor#ida del exterior y pro#a#lemente representa
complejos inmunes que se unen a los receptores para la regin Qc de la inmunoglo#ulina que poseen
algunas c%lulas :.
'stos receptores se demuestran por la formacin de rosetas con eritrocitos recu#iertas con anticuerpo
"g@; un racimo de eritrocitos rodea al linfocito al cual se unen mediante el fragmento Qc de la "g@
que les recu#re. 'n las c%lulas : humanas pueden ser inducidas a formar las llamadas rosetas
espontaneas con simples eritrocitos de carnero.
Las c%lulas : sanguneas normalmente tpicas carecen de antgenos "a receptores de complemento
y receptores Qc de "g' f!cilmente detecta#les y se los reconoce por formar rosetas con eritrocitos de
carnero ,rosetas '/ una propiedad que no comparten con los linfocitos B. :ales c%lulas : representan
aproximadamente del G< al K< O de los linfocitos en sangre perif%rica. La divisin amplia de los
linfocitos en c%lulas B y : tpicas da cuenta de este modo del total menos qui*!s el 2 al -. O de
linfocitos en sangre perif%rica.
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

'xisten varios m%todos para cuantificar los linfocitos se puede usar por citometra de flujo utili*ando
anticuerpos monoclonales marcados con una sustancia fluorescente. :am#i%n se puede hacer la
determinacin mediante inmunofluorescencia o t%cnica de rosetas.
)$,)luster of differentiation/
K.< Co,-etencias
8 Aeconocer la presencia de los L : mediante la roseta :.
8 $iferenciar los L B de los L:
K.2 "ate#ia%es . e/'i-os
4 Qicoll80ypaque de -.GG de densidad
8 Buffer salino fosfato,PBS/
8 Suero de ternera fetal al <O
8 :u#o de -2x-.. mm con -.= de Qicoll80ypaque
8 @.A. lavados al ..=O en SS
8 6*ul de :oluidina al ..=O en BPS
8 Laminas laminillas y parafina solida calentada.
8 :u#o de -Ex-=. mm
8 :u#o de -.xG= mm
8 Pipeta de - ml
8 Puntas para pipeta
8;eringa de <82 ml con aguja 7D<-
86lgodn y alcohol yodado
8 3anguera para hacer torniquete
8 Qrasco de penicilina con perlas de vidrio y tapa de je#e
8 Bocal con leja
K.1 P#oce&i,iento
8 )olocar un torniquete por encima del codo de la persona cuya sangre se va a extraer y pedirle que
cierre y a#ra la mano para aumentar la circulacin.
8 Seleccionar la vena por inspeccin y palpacin.
8 $esinfectar el area con alcohol yodado y dejar evaporar el alcohol
8Preparar y pro#ar la jeringa y aguja
8 Pedir al voluntario que cierre la mano e introducir la aguja en la vena
8 La sangre fluir! dentro de la jeringa espont!neamente. 'xtraer de =8E ml de sangre
8 Aetirar el torniquete pedir a la persona que a#ra la mano extraer la aguja
8 )olocar un algodn y presionar de 28= min.
8 Aapidamente retirar la aguja de la jeringa y depositar la sangre en el frasco de penicilina con perlas
de vidrio colocar la tapa de je#e y rotar el frasco suavemente durante =8G min. La fi#rina queda
atrapada en las perlas de vidrio evitando as la coagulacin de la sangre.
Se-a#aci$n &e infocitos
Los linfocitos se o#tienen de sangre defi#rinada y se separan de los eritrocitos pas!ndolos a trav%s de
Qicoll80ypaque de -.GG de densidad. 'l Qicoll80ypaque es una me*cla de -< partes de Qicoll al KO y
= partes de 0ypaque al 21O
8 :omar - ml de sangre defi#rinada y depositarla en u tu#o de -Ex-=. mm
8 6gregar 2 ml d PBS para diluir la sangre -51. 3e*clar #ien y depositar en *ona 2 ml de sangre en el
tu#o que contiene -.= ml de Qicoll80ypaque
8 )entrifugar a 2... rpm durante -= minutos
8 Separar suavemente el anillo de linfocitos con la pipeta pasteur y transferirlos al tu#o de -.xG= mm.
6gregar ..=8-.. ml de PBS.
8 )entrifugar a >.. rpm durante 2 minutos. $escartar el so#renadante y agregar ..=8-.. ml de PBS.
Aesuspender las c%lulas agitando suavemente. 'sto se hace para lavar los linfocitos y retirar restos
de Qicoll80ypaque.
8 )entrifugar nuevamente a >.. rpm durante 2 minutos y descartar el so#renadante.
8 Aesuspender las celulas en aproximadamente ..= ml de PBS agregando una gota de suero de
ternera fetal
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

Fo#,aci$n &e Rosetas T 5
La suspensin de linfocitos de#e tener de -8-.x-. c%lulas x ml y de#e contener >.8K.O de c%lulas
vivas. Las rosetas : solamente se forman alrededor de c%lulas vivas.
- $epositar dos gotas de la suspensin de linfocitos en un tu#o de prue#a Gx-.. mm
- )olocar < gotas de eritrocitos al ..=O
- )entrifugar a >.. rpm x -minuto
- )on la pipeta pasteur con tetina separar y descartar una gota del so#renadante sin resuspender
las c%lulas del fondo del tu#o
- )uidadosamente tomar las c%lulas del fondo y colocarlas en una l!mina con una gota de a*ul de
toluidina. )u#rir con la laminilla y sellar con parafina licuada
- +#servar al microscopio
-
K.= Res'%ta&os
+#servar que alrededor de algunas c%lulas ,linfocitos :/ hay adheridos eritrocitos de carnero
formando rosetas. Para que sea considerada una roseta el numero de eritrocitos tendr! que ser
mayor de tres.
K.E C'estiona#io
4 Las rosetas : se o#servan en los LBF
8 Se pueden usar @.A.humanos para o#servar las rosetas :F
8 'l ficoll80ypaque se necesita para separar solo los anticuerposF
K.G "ate#ia% &e #efe#encia
8 Bach ;.Q. 'valuation of :8cells and thymic serum factors in man using the rosette technique.
:ransplant Aev -E5 -KE5<-G -KG2.
8 Pharmacia Qine )hemicals. Qolleto RQicoll80ypaque for in vitro isolation of lymphocytes. -KG=.
8 QuJusaJi ". 3arcadores de linfocitos : y B humanos en sangre perif%rica. :esis de #achiller en
)iencias Biolgicas 973S3 -KGG.
8 Cornejo W., Alva P. Manual de Pratias de Inmunolog!a " #aunas. 2$ed. %&M'M, 2(().
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

T. PAU):")6 7D-. 6ctividad ltica del complemento
!6.! "a#co te$#ico 'l sistema del complemento es una cascada #ioqumica que ataca las superficies
de las c%lulas extraas. )ontiene m!s de <. protenas diferentes y reci#e ese nom#re por su
capacidad para complementar la destruccin de patgenos iniciada por los anticuerpos. 'l sistema del
complemento es el mayor componente humoral de la respuesta inmune innata. 3uchas especies
tienen sistemas de complemento el mismo no slo se presenta en los mamferos sino que las
plantas peces y algunos inverte#rados tam#i%n lo poseen.
'n los seres humanos esta respuesta es activada por la unin de protenas del complemento a
car#ohidratos de las superficies de los microorganismos o por la unin del complemento a anticuerpos
que a su ve* se han unido a los microorganismos. 'sta seal de reconocimiento produce una r!pida
respuesta de destruccin. La velocidad de la respuesta es el resultado de la amplificacin de la seal
que ocurre tras la activacin proteoltica secuencial de las mol%culas del complemento que tam#i%n
son proteasas. :ras la unin inicial de protenas del complemento al micro#io aqu%llas activan su
capacidad prote!sica que a su ve* activa a otras proteasas del complemento y as sucesivamente.
'sto produce una cascada cataltica que amplifica la seal inicial por medio de una retroalimentacin
positiva controlada.
=.
La cascada origina la produccin de p%ptidos que atraen c%lulas inmunitarias
aumentan la permea#ilidad vascular y opsoni*an ,recu#ren/ la superficie del patgeno marc!ndolo
para su destruccin. 'sta deposicin del complemento puede tam#i%n matar c%lulas directamente al
#loquear su mem#rana plasm!tica.
-..< Co,-etencias
- conocer como act!a el complemento en la reaccin antgeno-anticuerpo
8 conocer la presencia del complemento en las muestras de los pacientes
-..2 "ate#ia% . e/'i-os
8 Suero humano grupo R+S
8 'ritrocitos humanos grupo 6 o B al <O
8 )omplemento
8 Suero fisiolgico
8 :u#os de -2x-..mm en gradilla
8 Pipetas de - ml
8 @radilla para tu#os
8 Bao mara a =ED)
8 Bao mara a 2GD)
8 )entrifuga
-..1 P#oce&i,iento
- Inacti"ar el suero humano, incubndolo a #$%& en ba'o mara por () minutos
8Aotular 2 tu#os y repartir los reactivos como se indica5
reactivos
*u+o , 2 -
Suero humano inactivado ml ..<= ..<=
'ritrocitos ml ..<= ..<= ..<=
)omplemento ml ..<=
Suero humano no inactivado ml ..<=
Solucin salina ml ..<= ..<=
8 "ncu#ar los tu#os a 2GD) durante 2. minutos
-&entrifugar los tubos a *#)) rpm durante ( minutos
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

L
-..= Res'%ta&os
La actividad ltica del complemento se evidencia por el enrojecimiento del medio,hemolisis/ en los
tu#os de ensayo que contienen complemento,tu#os a y #/. 'l tu#o c no de#e mostrar hemolisis.
-..E C'estiona#io
8 'l complemento es una protena que lisa @AF
- +l complemento es !til en las defensas del hu,sped-
8 La reaccin antgeno8anticuerpo es necesaria para destruir al germenF
-..G "ate#ia% &e #efe#encia
8 Va#at '.6. Structural concepts in inmunology and inmunochemistry. <D ed. 0olt Ainehart and
Winston 7eH IorJ -KGE.
8 Cornejo W., Alva P. Manual de Pratias de Inmunolog!a " #aunas. 2$ed. %&M'M, 2(().
T". Pr!ctica T". $eterminacin de la actividad hemoltica del complemento
--.- "a#co Te$#ico.
'ste m%todo se #asa en la actividad de la va cl!sica del complemento para producir hemlisis de
eritrocitos sensi#ili*ados con cantidades ptimas de anticuerpos antieritrocitarios,0emolisina/
's un ensayo de las P#otenas &e% Siste,a Co,-%e,ento circulantes. Las muestras de S'e#o
diluido se aaden a E#it#ocitos recu#iertos con Antic'e#-os midiendo el porcentaje de lisis celular.
Los valores se expresan por el llamado )0=. unidades de P#otenas &e% Siste,a Co,-%e,ento
por mililitro que es la Di%'ci$n de S'e#o necesaria para lisar el =. por ciento de los E#it#ocitos en la
prue#a.
--.< Co,-etencias
8 )onocer la importancia del complemento en la hemolisis de los hemates
8 )onocer la funcin del complemento dentro del sistema antgeno8anticuerpo
--.2 "ate#ia%es . e/'i-os
8 Suero pro#lema
8 'ritrocitos de carnero sensi#ili*ados al -O
8 Buffer #ar#ital sdico ...<=3 P0 G.=
8 6gua destilada
8 :u#os de -2x-.. mm
8 Pipetas de - ml
8 Pipetas de -.. uL
8 Puntas
8 Bao mara a 2GD)
8 )entrifuga
8 'spectrofotmetro
8 Bocal con leja
--.1 P#oce&i,iento
4 Preparar en #uffer sdico < ml de las diluciones -N<= -N=. y -NG= del suero a titular
8 )olocar en una gradilla so#re hielo una serie de -1 tu#os. 6adir5
- < 2 1 Positivo 7egativo
Suero pro#lema ml ..=. ..2= ..<= ..-= 8 8
Buffer Bar#ital ml ..1. ..== ..E= ..G= 8 ..K.
@.A. sensi#il. ml ..E. ..E. ..E. ..E. ..E. ..E.
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

8 Preparar series id%nticas para las diluciones -N=. y -NG= incluyendo los tu#os controles
8 6gitar #ien los tu#os y colocarlos en #ao mara a 2GD) por 2. minutos
8 6adir ..= ml de #uffer 1D) a todos los tu#os excepto al control positivo al cual se aade -.1 ml de
agua destilada. 6gitar suavemente.
8 )entrifugar todos los tu#os a -=.. rpm durante = minutos
8 Leer la $.+.,$ensidad +ptica/ de los so#renadantes a ==. nm utili*ando como #lanco el control
negativo.
--.= Res'%ta&os
8 'n papel semilogaritmico graficar los porcentajes de hemlisis ,ordenada/ contra el volumen de
suero diluido,a#scisa/ que se aadi a cada tu#o.
8 :ra*ar la mejor recta e interpolar para cada dilucin del suero pro#lema el volumen que produce el
=.O de hemlisis. 'ste volumen corresponde a una unidad hemoltica ,90/ =.O. )alcular las 90 en
- ml y multiplicar por la dilucin correspondiente.
8 Xalores esperados en suero de adultos5 >.8-.. 90.
--.E C'estiona#io
8 )ual es la importancia de esta prue#aF
8 Se necesita medir esta prue#a a los pacientes para medir su inmunidadF
8 Los controles permiten verificar el correcto actuar del sistemaF
--.G "ate#ia% &e #efe#encia
8 BroHn $. )omplement and complement fixation. :echniques in clinical immunology :hompson A 6
ed BlacJHell Scientific Pu#lications +xford )ap. 1 -KGG.
8 Cornejo W., Alva P. Manual de Pratias de Inmunolog!a " #aunas. 2$ed. %&M'M, 2(()..
T"". PA6):")6 -<. Prue#a de Waaler Aose modificado
-<.- "a#co Te$#ico.
Los autoanticuerpos son anticuerpos dirigidos contra antgenos del propio organismo;
mucas veces son allazgos serolgicos en pacientes con en!ermedades reumticas
sistmicas.
"e los anticuerpos identi!icados asta aora# solo algunos tienen importancia en el
diagnstico de las en!ermedades reumticas y pueden considerarse como marcadores
serolgicos. Otros son caractersticos de una en!ermedad determinada pero no son
espec!icos.
La prue#a de Waaler Aose es una prue#a inmunolgica que se utili*a para poner de manifiesto el factor
reumatoideo. Se #asa en el hecho de que los pacientes que poseen dicho factor aglutinan los eritrocitos
previamente sensi#ili*ados. La reaccin sale positiva en pacientes con artritis reumatoide o ciertas colagenosis.
6glutinacin de hemates de cordero ,previamente sensi#ili*ados en contacto con un suero de conejo
anticordero/ por suero humano privado de sus heteroaglutininas naturales. La aglutinacin para una
dilucin superior a -N2< es casi caracterstica de enfermedad del col!geno.
La o#tencin de una hemolisina anticarnero de alto poder es una necesidad para mejorar el sistema
hemoltico; y la posi#ilidad de los la#oratorios pequeos para contar con un #ioterio adecuado de
donde o#tener f!cilmente los gl#ulos rojos de carnero.
'n el presente tra#ajo se expone una t%cnica sencilla y f!cil de reali*ar por personal capacitado con
la cual nos permite o#tner altos ttulos de suero hemoltico al inyectar a un conejo primero sangre
humana total del grupo Y+Y por va intracut!nea en dosis crecientes para luego continuar inyectando
por va endovenosa gl#ulos rojos Y+Y al <.O.
Posteriormente se reali* una t%cnica distinta utili*ando gl#ulos rojos Y+Y humanos sensi#ili*ados
con el suero hemoltico o#tenido o#teni%ndose resultados id%nticos.
-<.< Co,-etencias
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

8 )onocer las prue#as de hemaglutinacin para el diagnstico de enfermedades reumatolgicas.
8 'fectuar modificaciones en las diferentes prue#as de un la#oratorio de inmunologa
-<.2 "ate#ia%es . e/'i-os
8 Suero pro#lema
8 @.A. sensi#ili*ados -O
8 Suero fisiolgico
8 Pipeta de - ml
8 Pipeta de -.. uL
8 Puntas para pipetas
8 :u#os -2x-.. mm
8 @radillas
-<.1 P#oce&i,iento
La sensi#ili*acin de los @.A. se reali*a por la me*cla de vol&menes iguales de la suspensin al <O
de hemates R+S lavados y del inmunosuero de conejo diluido en suero fisiolgico a la dilucin
determinada con anterioridad. La me*cla se incu#a a 2GD) por - hora agitando cada -. minutos.
'l suero pro#lema de#e inactivarse a =ED) por 2. minutos.
Para cada suero pro#lema se prepara una serie de -. tu#os de hemlisis en los cuales se vierten ..<
ml de suero fisiolgico. Se aade seguidamente ..< de suero pro#lema diluido Z al primer tu#o se
retira ..< ml y se aade al segundo tu#o y as sucesivamente hasta llegar al tu#o > del que se
extraen ..< y se descarta. 6l tu#o -. se aade ..< de suero diluido al Z y despu%s de me*clar se
descarta ..< ml. 6 los K primeros tu#os se le aade ..< ml de hemates sensi#ili*ados al -O.
:enemos de este modo una serie de diluciones del suero desde -N> hasta -N-.<1 as como un testigo
de hemates sensi#ili*ado sin suero y otro de suero m!s hemates no sensi#ili*ados. Los tu#os son
agitados vigorosamente e incu#ados < horas a 2GD) luego a 1D) toda la noche.
:u#os - < 2 1 = E G > K -.
$ilucin -N> -N-E -N2< -NE1 -N-<> -N<=E -N=-< -N-.<1 ..< ..<
SQ ..>=O ..< ..< ..< ..< ..< ..< ..< ..<
SP -N1 ..< ..<
@.A.sens.-O ..< ..< ..< ..< ..< ..< ..< ..< ..<
@.A.no sens. ..<
-<.= Res'%ta&os
Los dos testigos de#en ser negativos
La reaccin se considera positiva cuando hay aglutinacin al -N2< o m!s
-<.E C'estiona#io
8 La prue#a de Waaler Aose es la &nica para enfermedades reumatolgicasF
8 La prue#a slo usa gl#ulos rojos de carneroF
8 's recomenda#le hacer esta prue#a en los la#oratorios de salud p&#licaF
-<.G "ate#ia% &e #efe#encia
8 )ara*as "gnacio; Aamos 6rturo; Benites ;uan; Aodrgue* Qernando. 9tili*acin de hemates
humanos Y+Y en la prue#a de Waaler8Aose. Aev. Sanidad QQPP Lima -K>=.
@III. PR!CTICA No.*" 3TODO1 D3 DIAANO1TICO 3N 3L LA<ORATORIO D3 INUNOLOAIA
13.1 M$rco t'3rico
E% %a7o#ato#io en %a in,'no%oga &iagn$stica

Paulatinamente la inmunologa se ha convertido en una ciencia individual y como todas las
ciencias modernas tom conceptos de otras ciencias Biolgicas y qumicas a las cuales
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

tam#i%n ha enriquecido; incluyendo a la micro#iologa la #ioqumica la gen%tica la
medicina la patologa y la #iologa molecular entre otras.
$e una manera un poco simplista podemos ha#lar de su#divisiones de la inmunologa
como inmunidad serologa inmunoqumica e inmuno#iologa. $urante los primeros aos de
esta ciencia inmunologa e inmunidad eran pr!cticamente sinnimos y se enfoca#a en
forma casi exclusiva a la prevencin de las enfermedades infecciosas mediante vacunacin
y aunque actualmente se destina gran parte de los esfuer*os de investigacin a la mejora de
vacunas y de las t%cnicas de inmuni*acin las diferencias entre am#as son tangi#les. La
serologa como tal se convirti en un elemento con fines meramente diagnsticos
actualmente no slo se #usca descu#rir nuevas prue#as en serologa especificas para cada
enfermedad sino tam#i%n mejorar y so#re todo automati*ar las t%cnicas existentes. Por otro
lado la inmunoqumica y la inmuno#iologa se han dedicado al estudio del conocimiento de
la estructura de los antgenos inmunoglo#ulinas la qumica del complemento y otros
componentes del sistema inmune as como al estudio de las #ases #iolgicas gen%ticas y
moleculares de la respuesta inmune.
$ado que las lneas divisorias entre estas !reas de la inmunologa son poco claras un
la#oratorio de inmunologa diagnstica moderno de#er! involucrar t%cnicas que permitan
evaluar la respuesta inmune. 6ctualmente podemos clasificar las t%cnicas diagnsticas en5
a/ cuantificacin y deteccin de anticuerpos o antgenos especficos mediante interacciones
antgeno8anticuerpo #/ deteccin enumeracin y fraccionamiento de celulas
inmunocompetentes c/ ensayos de inmunidad celular d/ evaluacin de los componentes del
complemento y su funcin y e/ inmunologa de transplantes.
La cuantificacin y deteccin de anticuerpos o antgenos especficos mediante interacciones
antgeno8anticuerpo es definitivamente el !rea m!s importante dentro de un la#oratorio de
inmunologa ya que la mayora de los an!lisis son "g@ e "g3 especficos contra agentes
infecciosos determinacin de inmunoglo#ulinas totales ,"g6 "g@ e "g3/ y las su#clases de
"g@ determinacin de autoanticuerpos e "g' alergenos especficos determinacin de
marcadores de infeccin como la Protena ) Aeactiva marcadores tumorales y la
cuantificacin de linfoquinas.
La deteccin enumeracin y fraccionamiento de celulas inmunocompetentes pr!cticamente
se reali*an en forma exclusiva mediente citometra de flujo lo que hace imprescindi#le una
relacin estrecha entre el la#oratorio de inmunologa y el la#oratorio de citometra de flujo.
La evaluacin de la respuesta celular en un paciente involucra desde prue#as muy sencillas
y pr!cticamente rutinarias como son las intradermoreacciones hasta prue#as sumamente
especificas como la evaluacin de la funcin fagoctica y de la capacidad micro#icida de los
fagocitos ,7B:/ as como prue#as de estimulacin linfoctica a mitgenos y a antgenos
especficos. 'valuar los componentes del complemento y su funcin pretende determinar la
concentracin de los componentes individuales del complemento ,)2 )1 )-q inhi#idor de
)l/ y determinar su capacidad funcional. ,)0=. o )0l../.
La inmunologa de transplantes ha tomado mucha importancia en los &ltimos aos dentro de
los la#oratorios de inmunologa la determinacin de los antgenos de 0L6 tanto clase "
como clase "" as como las prue#as cru*adas son casi imprescindi#les tanto en los
transplantes de rganos slidos como en los de medula sea Lo ideal seria poder identificar
los antgenos de 0L6 por t%cnicas moleculares aplicando "a tecnologa de la reaccin en
cadena de "a polimerasa ,P)A/ pero si no es posi#le se de#er! aplicarse al menos en los
transplantes de m%dula sea "a determinacin de 0L6 clase " por t%cnicas serolgicas de
micro8citotoxicidad y "a determinacin de 0L6 clase 0 por P)A. 'n aquellos transplantes de
rganos slidos en los cuales "a compati#ilidad de 0L6 entre receptor y donador no sea tan
relevante se recomienda reali*ar las prue#as cru*adas y el conocimiento del 0L6 ,clase " y
""/ le ayudara al m%dico a estimar el grado de recha*o y la so#revida del rgano
transplantado.
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

Las t%cnicas utili*adas en el la#oratorio de inmunologa diagnstica varan a gran velocidad
cada da son m!s las t%cnicas moleculares y gen%ticas que est!n a disposicin y es por ello
que el personal profesional y t%cnico de#e estar actuali*ado constantemente; sin em#argo
la incorporacin de algunas de estas novedosas t%cnicas resulta costoso no slo desde el
punto de vista de adquisicin de los reactivos sino tam#i%n en cuanto a infraestructura
necesaria; pero hay que reconocer que nuestro pas cuenta con el equipo humano capa* de
tra#ajar cualquiera de estas t%cnicas modernas. Las autoridades en Salud de#en impulsar el
uso rutinario de estas t%cnicas no solamente con fines diagnsticos sino tam#i%n
promoviendo la investigacin para el desarrollo de las diferentes !reas de la inmunologa
diagnstica.
13.2 Co%6't'&ci$2
Conocer as t#cnicas utii0a!as para a %eneracin !e conocimiento
13.3 M$t'ri$#'2 4 '8ui6o2
Mutime!ia
4i0arra acr1ica

13.5 Proc')i%i'&to
Fn6isis !etaa!o !e os proce!imientos !ia%nsticos m6s utii0a!os en a practica
13.7 R'2u#t$)o2
13.8 Cu'2tio&$rio
13.7 Fu'&t'2 )' i&9or%$ci3&
R'* co2t$rric ci'&c %7) *21 &1-2 S$& <o27 (u& 2===
>I, PRCTICA No 1; PCR . Cito%'tr-$ )' 9#u(o Fu&)$%'&to2 )' #$ t7c&ic$ A6#ic$cio&'2
E('%6#o2 r'6r'2'&t$ti*o2 Mo2tr$ti*o
-1.- "a#co te$#ico
La Citometr1a !e Fu'o ,CMF- es una t#cnica !e an8lisis celular multi+aramBtrico cu(o
)un!amento se "asa en /acer pasar una suspensin !e part1cuas ,%eneramente c#uas-
ainea!as ( !e una en una por !eante !e un /a0 !e 6ser )ocai0a!o. > impacto !e ca!a
c#ua con e ra(o !e u0 pro!uce se+aes $ue correspon!en a !i)erentes par6metros !e a
c#ua ( $ue son reco%i!os por !istintos !etectores. >stos convierten !ic/as se+aes en
se+aes eectrnicas $ue posteriormente ser6n !i%itai0a!as para permitir a me!i!a
simut6nea !e varios par6metros en una misma c#ua. >stos par6metros son<
- 4ar6metros reaciona!os con caracter1sticas intr1nsecas !e a c#ua& como su tama+o (
a compe'i!a! !e su nJceo ( citopasma.
- 4ar6metros reaciona!os con caracter1sticas anti%#nicas !e ca!a c#ua
,inmuno#enoti+o-.
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

4or o tanto a CMF es capa0 !e i!enti)icar una c#ua por me!io !e sus caracter1sticas
anti%#nicas (=o por sus caracter1sticas mor)o%icas !e tama+o ( compe'i!a!.
15.2 Co%6't'&ci$2
>nten!er as "ases !e a citometria !e )u'o& a t#cnica !e !ia%nostico !e prote1nas
15.3 M$t'ri$#'2 4 '8ui6o2
Mutime!ia
4ro(ector
15.5 Proc')i%i'&to
Lectura ( comprensin !e un art1cuo cient1)ico
A6#ic$ci3& )' #$ cito%'tr-$ )' 9#u(o '& '# )i$0&32tico i&%u&o#30ico )' #o2 #i&9o%$2
cut/&'o2 T
Lic. Bert/a B. Aocarr6s Ferrer
3
. Lic. L60aro C. !e Vae 4#re0
3
. @ra. Viane! Mars6n
AJare0
3
. @ra. Miriam A6nc/e0 Ae%ura
3
. Lic. Ru"( Fonso Ram1re0
33
. @raC. Consueo Mac1as
F"ra/am
33

3
3nstituto !e ?ematoo%1a e 3nmunoo%1a. Cu"a.
33
Centro !e 3nmunoo%1a Moecuar. Cu"a.
RESUMEN
Ae comunican as caracter1sticas inmuno)enot1picas !e 7 pacientes ,7 !e se*o mascuino
( 2 !e )emenino- con e !ia%nstico c1nico-mor)o%ico !e in)omas cut6neos !e c#uas
N& aten!i!os en a consuta !e ?ematoo%1a !e 3nstituto !e ?ematoo%1a e 3nmunoo%1a.
La e!a! !e os pacientes osci entre 17 ( 88 a+os. > inmuno!ia%nstico se reai0 por
inmuno)uorescencia !irecta con un pane !e anticuerpos monoconaes $ue incu(
marca!ores in)oi!es B ( N< C@2& C@3& C@5& C@7& C@7& C@8& C@1K& C@22 ( C@27. La
ectura se reai0 en un citmetro !e )u'o FaCAcan ,Becton-@icLinson -. Ca!a marca!or
se consi!er positivo si un porcenta'e ma(or a 20 G !e os in)ocitos e*presa"a e
ant1%eno. 2uestros resuta!os mostraron $ue en a ma(or1a !e os pacientes pre!omin e
patrn %enera !e os in)ocitos N con )uncin au*iia!ora ,C@3X& C@5X& C@8--. Ae
corro"ora $ue a citometr1a !e )u'o es un proce!imiento m6s r6pi!o ( menos a"orioso
$ue otros m#to!os !e inmuno)enotipa'e ceuar& $ue nos permite un !ia%nstico !e
certe0a ( a apicacin !e una terapia e)ectiva.
P$#$5r$2 c#$*': in)omas cut6neos N& citometr1a !e )u'o.
INTRODUCCI:N
Los in)omas cut6neos ,LC- son procesos in)oproi)erativos mai%nos cu(o r%ano !iana es
a pie& ( se%Jn su ori%en se casi)ican en N o B.
1-3

La inci!encia %o"a !e os in)omas cut6neos !e c#uas N ,LCCN- es !e are!e!or !e 0&38
casos por 100 000 /a"itantes a a+o& o $ue constitu(e una proporcin pe$ue+a !entro !e
os in)omas no /o!%Linianos.
5&7
>stas neopasias aparecen )un!amentamente entre os 57
( os 87 a+os ( son 2&2 veces m6s )recuentes en e se*o mascuino $ue en e )emenino.
Las presentaciones c1nicas m6s reporta!as son a micosis )un%oi!es ,MF- ( e s1n!rome !e
A#0ar( ,AA-.
7-K

F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

La MF es a )orma m6s comJn !e LCCN ( a a ve0& es a $ue presenta ma(ores !i)icuta!es
!ia%nsticas& particuarmente en a )ase inicia !e su !esarroo. Au inci!encia es !e 0&2K
casos por 100 000 /a"itantes a a+o ( su etiopato%enia se !esconoce.
10&11

4or otro a!o& e s1n!rome !e A#0ar( es consi!era!o como a e*presin eucemi0a!a !e a
MF. se caracteri0a por eritro!ermia& poia!enopat1as ( eeva!o nJmero !e in)ocitos
at1picos en san%re peri)#rica ,c#uas !e A#0ar(-. Ctras mani)estaciones c1nicas $ue se
pue!en presentar son< /iperpi%mentacin pro%resiva& /iper$ueratosis pamopantar (
p#r!i!a !e peos ( u+as.
3&12

Nra!icionamente& e !ia%nstico !e cua$uier esin cut6nea est6 "asa!o en criterios
c1nicos e /istopato%icos. 2in%uno !e estos criterios es a"souto& !e a/1 $ue se !esta$ue
a trascen!encia !e os estu!ios cito%en#ticos& inmuno%icos ( moecuares para un
!ia%nstico !e certe0a ( pronstico !e a en)erme!a!& por o $ue nos propusimos apicar
a citometr1a !e )u'o para e inmuno!ia%nstico !e 7 pacientes con LCCN aten!i!os en a
consuta !e ?ematoo%1a !e 3nstituto !e ?ematoo%1a e 3nmunoo%1a.
M?TODOS
Ae estu!iaron 7 pacientes ,7 !e se*o mascuino ( 2 !e )emenino- con un ran%o !e e!a!
$ue osci entre 17 ( 88 a+os& con !ia%nstico c1nico-mor)o%ico LCCN. Las muestras se
o"tuvieron !e san%re peri)#rica ( se !epositaron en tu"os con >@NF a 10 G.
M$rc$)or'2 i&%u&o#30ico2< > estu!io inmuno)enot1pico se reai0 por un m#to!o !e
inmuno)uorescencia !irecta con un pane !e anticuerpos monoconaes ,FcMo- $ue
!etectan ant1%enos en in)ocitos B ( N. > an6isis se reai0 por citometr1a !e )u'o en un
FaC Acan ,Becton-@icLinson& >>.;;.- me!iante e e*amen !e a reaccin con os FcMo en
a ventana !e a po"acin in)oi!e.
13
> pane utii0a!o incu(< C@2& C@3& C@5& C@7&
C@7& C@8& C@1K& C@22 ( C@27. F%unos FcMo esta"an con'u%a!os con )icoeritrina ,R4>- (
otros con isotiocianato !e )uoresce1na ,F3NC- ,ta"a 1-. No!as as muestras )ueron
)i'a!as con una soucin !e para)orma!e/1!o a 1 G. La ectura se reai0 me!iante a
a!$uisicin !e 10 000 c#uas en ca!a tu"o. Ca!a marca!or se consi!er positivo si un
porcenta'e superior a 20 G !e os in)ocitos e*presa"an e ant1%eno.
RESULTADOS.
La !istri"ucin !e os casos !ia%nostica!os con LCCN se !escri"e en a ta"a 2. >n a
ma(or1a !e os pacientes pre!omina e patrn %enera !e os in)ocitos N con )uncin
au*iia!ora C@3X& C@5X& C@8- ,71&50 G-. >n a minor1a ,1 paciente- se e*presan os
marca!ores con )uncin citot*ica C@3X& C@5-& C@8X ,15&3G-. ;n caso !ia%nostica!o con AA
mostr pre!ominio !e in)ocitos N C@5X ,15&3G-. ?a( otros marca!ores con )ines
!ia%nsticos !e c#uas N como C@7 ( C@7& $ue )ueron varia"emente positivos. Los
marca!ores B ,C@1K& C@22- ( e !e activacin C@27 resutaron ne%ativos en a po"acin
ceuar N.
DISCUSI:N.
Los LCCN constitu(en un %rupo !e en)erme!a!es neop6sicas caracteri0a!o por in)itra!os
!e c#uas N mai%nas. !entro !e estos se encuentran a MF ( e AA& $ue son enti!a!es $ue
aun$ue !i)ieren en sus mani)estaciones c1nicas se cree $ue son variantes !e un mismo
trastorno in)oproi)erativo !e in)ocito N C@5.
> estu!io inmuno)enot1pico en san%re peri)#rica mostr a presencia !e in)ocitos N con
pre!ominio !e N coopera!ores C@3X& C@5X& C@8& ( en e caso !e paciente con AA& se
apreciaron ci)ras !e C@5 superiores a K0 G ( !isminucin !e as c#uas C@3. >stos
resuta!os corro"oraron o pantea!o por otros investi%a!ores.
5&7&15

F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

;n a!ecua!o tratamiento !epen!e !e un !ia%nstico !e certe0a mor)o%ico&
cito%en#tico& inmuno%ico ( moecuar. >n a actuai!a! se utii0a a apicacin
intravenosa !e anticuerpos monoconaes contra ant1%enos !e !i)erenciacin !e c#uas N
( se tra"a'a en proposiciones e*perimentaes para e tratamiento !e os in)omas
cut6neos $ue incu(en vacunacin& terapia %#nica ( traspante anto%o !e c#uas
ma!re&
17&18
o $ue permitir1a una r6pi!a curacin& una ma(or so"revi!a ( a incorporacin
!e estos in!ivi!uos a a vi!a Jti !e a socie!a!.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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4CR9;>:
15.7 Fu'&t'2 )' i&9or%$ci3&
@@@cito%'tri$)'9#u(oco%
I&%u&o#o0i$ Mo#'cu#$r I 4 II
15.1 M$rco t'3rico
4arte !e a "ioo%1a $ue trata !e os )enmenos "io%icos a nive moecuar. >n senti!o
restrin%i!o compren!e a interpretacin !e !ic/os )enmenos so"re a "ase !e a
participacin !e as prote1nas ( 6ci!os nuceicos.
15.2 Co%6't'&ci$2
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

Conocer as t#cnicas utii0a!as para a %eneracin !e conocimiento. ?acer e'ercicios !e
comprensin ( retencin !e conocimientos.
15.3 M$t'ri$#'2 4 '8ui6o2
Mutime!ia
4ro(ector
15.5 Proc')i%i'&to
Aeminario !iri%i!o so"re un tema !e investi%acin
15.7 R'2u#t$)o2
15.8 Cu'2tio&$rio
15.7 Fu'&t'2 )' i&9or%$ci3&
Biologia Molecular
15.1 Marco terico
4CR en tiempo rea es un tipo !e 4CR cuantitativo $ue mi!a a canti!a! !e @2F o !e
mR2F en una muestra& !e una po"acin !e c#uas ,cutura !e te'i!o )ino o !e c#ua-& o
i%uaa recientemente !e una c#ua. > tiempo rea se utii0a comJnmente para
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

!eterminar a e*presin !e mR2F !e un %ene& ( su e*presin nivea ,nJmero !e a copia
!e mR2F- !urante ciertas con!iciones ,taes como tratar as c#uas con una !ro%a-. 4CR
en tiempo rea se pue!e utii0ar para comparar muestras normaes ,!e contro- a as
muestras !e a en)erme!a!& !an!o una i!ea en cuanto a os cam"ios !e a e*presin $ue
ocurren con pato%enesia. 4CR en tiempo rea !e"i!o a su sensi"ii!a! tam"i#n se utii0a
en a !eteccin !e pat%eno en a san%re ta como virus.
> !esarroo !e 4CR cuantitativo en tiempo rea /a eimina!o a varia"ii!a! asocia!a
tra!icionamente a 4CR cuantitativo& as1 e permitir cuanti)icacin rutinaria ( con)ia"e
!e os pro!uctos !e 4CR.
15.2 Competencias
Fsimiar como a tecnoo%ia se actuai0a ca!a !ia
15.3 Materiaes ( e$uipos
Mutime!ia
4ro(ector
15.5 4roce!imiento
> !ocente presenta un seminario so"re o $ue si%ni)ica 4CR en tiempo rea como un arma
si%ni)icativa !e a 3nmunoo%ia moecuar.
15.7 Resuta!os
15.8 Cuestionario
15.7 Fuentes !e in)ormacin
Att6:BB@@@%o#'cu#$r2t$tio&co%B'2Br'$#-ti%'-6crB
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

@0. PR!CTICA No. *- 1eminarioC 3n#ermedades autoinmunes
17.1 M$rco t'3rico
>stas en)erme!a!es son consecuencia !e una respuesta inmune e*a%era!a en contra !e
a%Jn componente propio. 4otenciamente& cua$uier estructura !e cuerpo pue!e
!esenca!enar respuestas autoinmunes& pero /a( unas $ue o /acen con ma(or )recuencia
$ue otras. > !a+o a or%anismo& ( por o tanto as mani)estaciones c1nicas& !epen!e !e
auto-ant1%eno en cuestin& $ue pue!e /aarse so en un tipo particuar !e te'i!o o "ien
ser una mo#cua $ue se ocai0a en !i)erentes r%anos. >n e primer caso& a en)erme!a!
autoinmune es ama!a r%ano espec1)ica ( en e se%un!o& %enerai0a!a.
17.2 Co%6't'&ci$2
4ropie!a!es %eneraes ( !escripcin !e os !i)erentes mecanismos $ue con!ucen a una
respuesta inmunitaria )rente a un ant1%eno propio.- Fun!amentos !e tratamiento
utii0a!o.
17.3 M$t'ri$#'2 4 '8ui6o2
Mutime!ia
4ro(ector
17.5 Proc')i%i'&to
Los aumnos presentan en %rupos preesta"eci!os& un tema reaciona!o a una en)erme!a!
autoinmune< @ia"etes& Lupus eritematoso& artritis reumatoi!e& etc.
17.7 R'2u#t$)o2
17.8 Cu'2tio&$rio
17.7 Fu'&t'2 )' i&9or%$ci3&
/ttp<==MMM./eat/s(stem.vir%inia.e!u=uva/eat/=pe!s^/rpre%nant^sp=auto/u".c)m
F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007