OBJETIVOS

Elaborar queso tipo panela con leche tratada por altas presiones hidrostticas
en combinacin con bioconservacin por adicin de un cultivo protector
Lactococcus lactis UQ2 rif L+ microencapsulado para garantizar su calidad
sensorial e inocuidad.

Objetivos especficos
1. Microencapsular el cultivo protector L. lactis UQ2 rif L+ mediante secado por
aspersin evaluando el efecto de las condiciones de secado y el tipo de los
materiales de pared sobre la viabilidad final de las clulas.
2. Evaluar el efecto combinado del tratamiento de leche con el cultivo protector
y su posterior tratamiento con altas presiones hidrostticas sobre la inactivacin
de L. innocua como patgeno subrogado de L. monocytogenes.
3. Determinar las condiciones de tratamiento por altas presiones hidrostticas
en leche entera de vaca para la inactivacin de L. innocua como patgeno
subrogado de L. monocytogenes.
4. Evaluar el efecto combinado de altas presiones hidrostticas y
bioconservacin para la inactivacin del patgeno subrogado en leche
cruda entera de vaca.
5. Utilizar el efecto combinado de los factores de conservacin en estudio para
la elaboracin de queso tipo panela, con las condiciones empleadas de
manera individual.
6. Evaluar la viabilidad y produccin de nisina por el cultivo protector L. lactis
en queso panela almacenado en refrigeracin por 30 das.


METODOS Y MATERIASLE

La leche cruda entera se mantuvo a temperatura de refrigeracin (4C) hasta
su tratamiento. Se empacaron 500 ml de leche cruda en bolsas estriles de
polietileno, y posteriormente fueron selladas al vaco (Empacadora al vaco
TOR REY) para despus ser tratadas por el equipo de Altas Presiones
Hidrostticas (High Pressure Food Processor marca Avure Technologies
modelo 2 L provisto con el software RSView32). De acuerdo a cada tratamiento
diseado en algunos casos, la leche cruda fue inoculada con L. innocua y L.
lactis UQ2 rif L+ segn el caso, previo al tratamiento de APH.

La leche presurizada se acondicion a una temperatura de 30 C, y se adicion
el inculo del cultivo protector lquido L. Lactis UQ2 rif L+ al 1% (v/v), se dej
reposar por 15 min, transcurrido este tiempo se agreg el cloruro de calcio (0.4
ml/L, Baker). Posteriormente, se adicion el cuajo microbiano, 0.05 g/L
(QuaLact, Mxico), se agit constantemente para lograr su completa
incorporacin. Se dej reposar por 30 min para favorecer la formacin de la
cuajada, para posteriormente realizar el corte y dejar reposar 10 min
manteniendo una temperatura de 32 C enseguida la cuajada fue agitada
lentamente para favorecer el desuerado.




Tratamiento de la presin hidrosttica de alta aplicada para
modelar los quesos elaborados con leche de vaca
inoculado con Staphylococcus aureus

OBJETIVOS

Estudiar la eficacia de los tratamientos HHP en dos cepas diferentes de S.
aureus dentro de una matriz de queso suave cuajada, y evaluar la evolucin de
sus recuentos durante 30 das.

MATERIALES

2.1. Microorganismos
Las dos cepas utilizadas fueron suministrados gentilmente por la Coleccin
Espaola de Cultivos Tipo (CECT, Universidad Politcnica de Valencia,
Valencia, Espaa). S. aureus CECT 4013 no es una cepa productora de SE
pero fue elegido sobre la base de su presencia en las glndulas mamarias de
vacas; cepa ATCC 13565 estuvo involucrado en los incidentes de
envenenamiento de alimentos, produce enterotoxine A (SEA) y ha demostrado
su baroresistance (Belay y Rasooly, 2002;. Patterson et al, 1995; Smelt, 1998).

2.2. Preparacin de los inculos de S. aureus
Ambas cepas se mantuvieron a? 20? C en cryobeads (Nalgene Sistema
100TM, Microkit Iberica SL, Madrid, Espaa) y fueron restablecidos mediante la
colocacin de una perla en infusin cerebro corazn suplementado con 0,6%
de extracto de levadura (BHIYE, Oxoid, Unipath Ltd., Reino Unido) y luego se
incubaron a 37 C durante 24 h. La pureza de cada caldo de cultivo se verific
mediante siembra de ellos en cerebro corazn de agar de infusin que tambin
contena 0,6 g / L de extracto de levadura (bhaye, Oxoid). Un mililitro del caldo
se verti en 9 ml de BHIYE y se deja de 18 a 24 h a 37 C para obtener clulas
en fase estacionaria de crecimiento. La suspensin se centrifug 15 min a 3000
rpm. Las clulas recogidas se lavaron dos veces y finalmente se
resuspendieron en 9 ml de tampn de fosfato salino (PBS, Oxoid). La
concentracin final fue de aproximadamente 9-log CFU / ml.

2.3. La pasteurizacin de la leche
La leche cruda se recogi de una granja local y transportados en condiciones
de refrigeracin en menos de 1 h en el laboratorio. A continuacin se
pasteuriza (30 min a 65 C), rpidamente se enfra y se almacena por debajo
de 4 C hasta la fabricacin del queso.

2.4. Fabricacin de quesos modelo
Modelo quesos de cuajada lavada fueron fabricados en condiciones
microbiolgicas controladas despus de una modificacin del protocolo de Ur-
Rehman (Ur-Rehman, Fox, McSweeney, Madkor, y Farkye, 2001), segn lo
descrito por Lo'pez-Pedemonte, Roig-Sague 's, Capellas, Trujillo y Guamis
(2003). Ocho litros de leche pasteurizada fue llevado a 31 C en un bao de
agua. Las cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp.
cremoris (Ezal de la MAO 11, Rhodia Iberia SA, Madrid, Espaa) que no
producen bacteriocinas, se aadieron como motor de arranque de 2% (v / v),
junto con 0,01% (v / v) de un 35% (w / v ) Solucin de cloruro de calcio (Arroyo,
Santander, Espaa), para mejorar la coagulacin. Un 0,02% (v / v) de extracto
de cuajo lquido de origen de ternera (520 mg / L de quimosina activa, Arroyo,
Santander, Espaa) se utiliz como agente coagulante. La leche se vierte en
botellas previamente tratadas en autoclave centrfugas de cuello largo de 225
ml que contienen 1 ml de S. aureus inculos. La misma leche se verti en una
serie de botellas no inoculados con S. aureus con el fin de obtener los quesos
en blanco. La coagulacin se llev a cabo a 31 C. Despus de 45 min, la
cuajada se cortaron suavemente con herramientas de acero inoxidable
estriles y se calent durante 15 min a 37 C. Alrededor del 40% de suero de
leche fue descartado y reemplazado por el agua del grifo estril. Las botellas se
centrifugaron a 7000 g durante 40 min a temperatura ambiente. A continuacin,
se les mantuvo en un bao de agua a 37 C hasta que el pH alcanz 5,5. El
suero de leche se desech y salmuera al 20% estril (200 g de NaCl por litro de
agua del grifo) se aadi directamente en la botella. Despus de 15 min,
salmuera se elimin y los quesos fueron sacados de las botellas y se sec con
papel estril. Todas estas condiciones se ajustaron previamente para obtener
modelo quesos de aproximadamente 23 g, 55% de materia seca, 1,5% de
contenido de sal-en-humedad y un pH final de aproximadamente 5. Los quesos
fueron envasados al vaco en bolsas de plstico (bb4.l, Cryovac Embalaje, Sant
Boi de Llobregat, Espaa) y almacenados a 8 C. El tiempo mximo de
almacenamiento de las muestras fue de 30 das. Los inculos nivel de S.
aureus fue de aproximadamente 7.5-log CFU / g de queso.

2.5. Tratamientos HHP
Despus de 24 h de almacenamiento a 8 C, las muestras de queso fueron
HHP tratados en 5 o 20 C. HHP se realiz con equipos HHP discontinua
(Modelo S-FL-850-9-W, Stansted Fluid Power, Essex, Reino Unido). Este
buque de prensa estilo mbolo con intensificador de alta presin interna
(relacin entre la presin de impulsin y la alta presin 21:1), tiene una
construccin de cilindros con el barril de acero de aleacin exterior y
resistentes a la corrosin barril de revestimiento de acero. La relacin del
agujero interno a dimetro externo del buque es 3,7:1, siendo la pared interior
41 mm de espesor. La cmara de presin tiene 37 mm Dimetro interior 245
mm de largo y tiene en el interior del recipiente de carga de producto. El cuerpo
del recipiente y en el interior de fluido de transmisin de presin (agua) se
mantuvieron a la temperatura de tratamiento por circulacin de agua a travs
de una chaqueta de transferencia de calor integral montado en el exterior del
conjunto de barril de alta presin. La temperatura se control con un termopar
colocado en el lquido de la transmisin en la parte superior de la cmara. En
cada ejecucin, 4 muestras de quesos envasados al vaco (volumen total de
unos 150 cm3) se colocaron en el interior del recipiente de producto. Ellos se
estabilizaron a la temperatura requerida y luego se someten inmediatamente a
10 min HHP tratamiento de 300, 400 o 500 MPa (segn se mide en los
indicadores digitales y de presin analgica). Quesos inoculados modelo no
sometidos a ningn tratamiento HHP fueron llamados controles. Las muestras
de control siguieron el mismo patrn de variacin de tiempo / temperatura que
las muestras a presin (a excepcin de los cambios de temperatura HHP
buque durante el tratamiento). Se colocaron en un conjunto de bao de agua a
5 o 20 C. Tiempo para alcanzar la presin deseada fue del 75, 90 y 110 s
para las tres presiones ensayadas; tiempo de despresurizacin era de 30-35 s.
Las temperaturas mximas del fluido de transmisin (calentamiento adiabtico)
para las tres presiones ensayadas fueron como sigue: 11,0 0,3, 15,0 0,2 y
17 0,5 C, respectivamente, para 5 tratamientos C HHP??
Para los tratamientos de 20 C HHP eran 26,0 0,4, 28,0 0,4 y 30,0 0,6 C,
respectivamente.
2.6. Anlisis microbiolgico
Anlisis queso microbiolgica se realiz inmediatamente despus del
tratamiento HHP (da 1) y despus de 2, 15 y 30 das de almacenamiento a 8
C, homogeneizando 10 g de muestra en 90 ml de BHIYE (Oxoid) en una
licuadora electromecnico (BagMixer?, Interscience, Francia). Diluciones
decimales de 1% de agua de peptona (Oxoid) eran propagacin superficial en
agar Baird Parker RPF (Oxoid) y se incubaron a 37 C durante 24 - 48 h para
evaluar S. aureus que cuenta. La dilucin inicial restante se incub durante 18
h a 32? C con el fin de determinar si la inactivacin completa de S. aureus se
logr o no. Se incluyeron muestras en blanco (no inoculados con S. aureus)
para evaluar la eficacia de la pasteurizacin y el proceso de fabricacin. Las
reducciones de los recuentos de todos los das el anlisis se calcularon como
la diferencia entre los logaritmos del conteo de las muestras sometidas a
presin y las muestras de control.

RESULTADOS

3.1. Las reducciones de los recuentos de S. aureus, inmediatamente despus
Tratamientos HHP (da 1)
Se puede ver en la figura. 1 que las reducciones (recuentos de las muestras
tratadas con respecto a las muestras de control) claramente aumentaron con
incrementos de presin. Si bien las reducciones obtenidas para tratamientos
HHP en 5 C difera significativamente entre 300, 400 y 500 MPa en ambas
cepas de S. aureus, de 20 C HHP tratamientos diferencias no fueron
importantes despus de aplicar presin 500 MPa.
Nuestros resultados difieren de las reducciones iniciales que se encuentran en
el trabajo de O'Reilly et al. (2000) que implica S. aureus ATCC 6538 inocul en
una matriz de queso Cheddar. Obtuvieron ms de 4-log CFU / g reduccin
inmediatamente despus de la aplicacin de 500 MPa a 20 C por 20 min.
Estas diferentes reducciones iniciales pueden ser explicadas por las diferentes
cepas, composicin del queso y de las fases de crecimiento especialmente
diferentes de clulas de S. aureus (Patterson et al, 1995;. O'Reilly et al, 2000;.
O'Reilly, Kelly, Murphy, y Beresford, 2001). En nuestro trabajo, HHP se aplic a
las clulas en la fase estacionaria de crecimiento (24 h despus de la
fabricacin de queso), mientras que en su modelo de Cheddar quesos algunas
de las clulas estaban en la fase logartmica de crecimiento. Nuestros
resultados tambin difieren de los anteriormente informado de S. aureus
reducciones en otros sustratos tales como PBS (2 mmol / l, pH 7) y jugo de
naranja (Takahashi, 1992; Alpas, Kalchayanand, Bozoglu, y Ray, 2000). Sin
embargo, los resultados obtenidos son similares a los presentados por Gervilla
et al. (1999) con S. aureus CECT 534 en la leche de oveja (6% de grasa) se
trat a 500 MPa (10 y 15 min a 25 C?), Con reducciones de aproximadamente
2-3 - log CFU / ml. Adems, estos resultados tambin son comparables a los
obtenidos por Patterson y Kilpatrick (1998), que utiliza la misma cepa de S.
aureus (ATCC 13565) se inocul en leche UHT y trat a 500 MPa (15 min a
20? C ), la obtencin de reducciones superiores a 2-log CFU / ml.


3.2. Evolucin de los recuentos durante 30 das de maduracin a 8 C

Condes de muestras de control, tanto para las cepas de S. aureus, no difirieron
significativamente durante todo el perodo de almacenamiento (Fig. 2). Por el
contrario, los recuentos de muestras presurizadas mostraron una disminucin
significativa en condiciones de almacenamiento; cuanto mayor sea la presin
aplicada ms altos son los descensos observados. Para 300 MPa muestras
tratadas, los recuentos de S. aureus CECT 4013 presurizado a 20 C
mostraron una disminucin significativa despus de 15 das de
almacenamiento, mientras que en las muestras de HHP trat a 5 C se
observ una disminucin significativa de los recuentos exclusivamente en el da
30. Por 400 MPa muestras tratadas se observ una tendencia a la disminucin
en el conteo despus de 15 das de almacenamiento; la diferencia en los
recuentos fue significativa desde el da 15 para los tratamientos de HHP en 5
C y se hizo significativo en da 30 para los tratados a 20 C. Por ltimo, 500
MPa tratamientos indujeron reducciones significativas en el recuento de esta
cepa a da 15, a ambas temperaturas de tratamiento. Como se ve tambin en
la figura. 2, los patrones de inactivacin debido al nivel de presin durante el
tiempo de almacenamiento muestran comparable
Reducciones medias Mximo (log CFU / g de queso) se alcanzaron para 500
tratamientos MPa despus del perodo de maduracin de 30 das a 8 C. A los
5 C, encontramos 6,0 0,1 para S. aureus CECT 4013 y 4,7 0,5 para S.
aureus ATCC 13565. Durante 500 tratamientos MPa a 20? C alcanzaron
respectivamente 5,6 0,1 log UFC / g, y 4,6 0,2-log CFU / g de queso. Para
ambas cepas y temperaturas en 500 tratamientos MPa, los recuentos de 30
das de S. aureus a menudo cayeron por debajo del lmite de cuantificacin de
la tcnica (1,7-log CFU / g). Sin embargo, no se logr la inactivacin completa.
Despus de incubar la dilucin inicial de las muestras en BHIYE durante 18 h a
32 C y la difusin en agar Baird Parker FPR, se observaron colonias de S.
aureus caractersticos.
Como se dijo antes, los recuentos de muestras de control no variaron
significativamente durante el almacenamiento a 8 C. Este comportamiento
muestra que cuando S. aureus se encuentra en grandes cantidades dentro de
un queso, que tiene la capacidad de mantener sus recuentos incluso en la
presencia de activo Lactococcus spp. clulas. De esta manera, la capacidad de
HHP de causar dao de la membrana y la perturbacin de las enzimas de los
microorganismos puede inducir una cierta prdida de la tolerancia a pH cido,
cidos orgnicos (consecuencia del proceso de maduracin que se lleva a
cabo) y el iniciador aadido, y puede ser responsable de la reducciones
observadas de S. aureus Cuenta durante el almacenamiento.

3.3. Evaluacin de la formacin de enterotoxina
De ambas cepas utilizadas en este trabajo, slo ATCC 13565 fue descrito
previamente como SE produciendo (SEA, en particular). Su capacidad para
formar enterotoxina se evidencia claramente en los ensayos realizados con
partes alcuotas de 10 ml de leche pasteurizada inoculados con S. aureus.
Como se puede ver en la Tabla 1, SE se detect positivamente en la leche se
incuba a 20, 30 y 37 C. Por el contrario, no se detect la formacin de SE en
las muestras se incubaron durante 48 h a 8, 10 y 48 C. SE no se detect ya
sea en cualquiera de las muestras inoculadas con la cepa CECT 4013 en todas
las temperaturas de incubacin.

Condiciones en las que las toxinas de S. aureus pueden ser producidos
comprenden temperaturas que van desde 10? C a 48 C, pH superior a 4,0, y
0,84 como lmite de actividad del agua. Una carga de S. aureus mayor que 5-
log CFU / g de alimento ha sido utilizado como una figura que permita
suficiente formacin de SE para causar la enfermedad (Annimo, 2003; de
Asperger, 1994; Belay y Rasooly, 2002). Todas estas condiciones existan en la
leche y la cuajada durante la elaboracin del queso en nuestros experimentos.
Estas condiciones tambin existan en los quesos, a excepcin de la
temperatura de almacenamiento, que era inferior a 10? C. Elegimos 8? C, ya
que es una temperatura comn para la maduracin de quesos espaoles y
para prevenir la produccin de enterotoxina en
caso de que no se haba producido durante la fabricacin de queso. A pesar de
no producir SE en la alcuota de 10 ml de leche se incuba a 8 y 10 C, SE se
detect tanto en el Control y HHP tratado quesos inoculados con la cepa ATCC
13565 despus de 30 das de almacenamiento a 8? C (ver Tabla 1). De hecho,
en las muestras analizadas antes de ser presentado al HHP (donde todas las
clulas iniciadoras eran ciertamente activo), SE ya fue detectado. La
temperatura (31-37 C) que la leche y la cuajada alcanzado durante el proceso
de fabricacin del queso y de la alta carga de S. aureus puede dar cuenta de la
produccin de SE en esta etapa (aproximadamente 210 minutos de duracin).
Esto est de acuerdo con el trabajo de Belay y Rasooly (2002), donde

SEA se detect en BHI que contena la misma cepa de S. aureus despus de 2
h a 37 C. Se asume comnmente que HHP no afecta a los enlaces
covalentes, pero la posibilidad de modificar hidrofbico, se ha informado de
Van der Waals, y vinculantes en macromolculas hidrgeno. (Cheftel, 1992;
Smelt, 1998; Trujillo, Capellas, Saldo, Gervilla, y Guamis, 2002). Todava no
est claro si la SE gener conserva su actividad txica o no despus de los
tratamientos de HHP, y si su cantidad es lo suficientemente alta como para
causar intoxicaciones de origen alimentario. En este estudio se demostr que
incluso a temperaturas suaves y las condiciones de presin corto de tiempo,
una reduccin significativa de S. aureus (alrededor de 5-log CFU / g de quesos
de pasta blanda) se puede obtener por medio de HHP acoplados a un tiempo
de maduracin adecuado ( superior a 30 das) a la temperatura de
almacenamiento baja (8 C). Tratamientos HHP puede ser visto como una
mejora en trminos de seguridad de queso, en particular para la produccin de
queso de leche cruda que las preocupaciones acerca de la suficiencia de curar
como un paso de patgenos de control se intensifica (Altekruse, Timbo,
Mowbray, Bean, y Potter, 1998). Por otra parte, se cree que la leche cruda
utilizada para la fabricacin de productos lcteos que no contienen los
recuentos de bacterias totales superiores a 5,5-log CFU / ml, ni de S. aureus
cuenta mayor que 3,3-log CFU / ml (Annimo, 1992). Sin embargo, teniendo en
cuenta la formacin de SE en quesos modelo utilizado en este estudio (con S.
aureus ATCC 13565 en las condiciones descritas) y el efecto incierto del HHP
sobre la actividad SE, el control estricto de parmetros durante el proceso de
fabricacin del queso todava sigue siendo necesario.
CONCLUSIONES