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ENSAYO DEMOSTRATIVO SOBRE LA PROPAGACIN I N VI TRO DE LA VIOLETA

AFRICANA (Saintpaulia ionantha Wendl)
Carina Daz Perfecto
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RESMEN
La violeta africana (Saintpaulia ionantha Wendl) es una especie con alto valor ornamental que
actualmente se ha difundido mucho la propagacin in vitro para la obtencin masiva de plntulas,
en general se han obtenido buenos resultados. Para realizar un ensayo del cultivo in vitro de la
especie, se realiz el presente trabajo, cuyo objetivo principal fue: corroborar la capacidad
regenerativa de la violeta africana por cultivo in vitro de fragmentos de hojas bajo las condiciones
de laboratorio. De los 30 explantes sometido a prueba solo una logra formar estructura de races y
hojas. Se concluye que al alto grado de contaminacin de explantes se debi al protocolo de
desinfeccin de explantes y a la desinfeccin previa de la planta madre.
Palabras claves: Violeta africana, esterilizacin, medio de cultivo, contaminacin fngica,
explantes
INTRODUCCIN
La violeta africana (Saintpaulia ionantha) fue descubierta por el Barn Walter von Saint Paul-
Illaire en Tanganyika (ahora Tanzania) en 1892, quien envi las semillas a su padre en Alemania,
un botnico aficionado (Mosquera, 2010).

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Universidad de la Sierra Jurez, Ixtln, Oaxaca Mxico. Ingeniera forestal. cari_dp@hotmail.com
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Es una planta perteneciente ala familia de las Gesnericeas, su tamao no suele superar los 15
cm., posee hojas redondeadas y carnosas de color verde oscuro, flores de color violeta e incluso
de varios colores que aparecen en verano (Mendoza et al., 2012).
Fue cultivada por primera vez como planta de interior y actualmente es una de las plantas de
flor de interior ms populares inicialmente se reproduca por semilla o, sobre todo, por esqueje
foliar (Mosquera, 2010). Hoy la forma ms habitual de reproducirla es el cultivo in vitro que
surge como una alternativa viable para propagar esta clase de plantas ya que se basa en el
concepto de totipotencialidad de las clulas, es decir, que las clulas somticas, dadas las
condiciones apropiadas, pueden desarrollarse en una planta completa sin necesidad de semillas.
Pudiendo obtener plantas a gran escala y en mayor calidad gentica y fitosanitaria en
comparacin con las producidas por mtodos tradicionales, respondiendo de esta forma a las
exigencias de los productores (Tineo, 2010).
Se tienen muchos trabajos de investigacin acerca de estos en el que se resalta la gran
capacidad de micro propagacin de esta especie;
Terenti y Verdes (2011) demostraron que despus de los 33 das desde la siembra se empez a
observar sus primeros indicios de morfognesis y se lograron altas tasas de multiplicacin, a
travs de la morfognesis estimulada por la accin conjunta de auxinas y citocinas.
Bravo y Espinal (2011), en 1990 reportaron el xito en la reproduccin de varias especies
ornamentales entre ellas la violeta africana (Saintpaulia ionantha).
E incluso con los trabajos de Mendoza y Muoz (2012) se produjeron nuevas variedades de
Saintpaulia ionantha mediante variacin somaclonal basado en la micr propagacin in vitro.
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As como tambin, ha sido posible lograr la multiplicacin a partir de callos aspticos
obtenidos por cultivo in vitro, logrndose la brotacin en todos los tratamientos con
fitoreguladores (Tineo 2010).
En general se han obtenido buenos resultados del cultivo in vitro de la especie mencionada y
como una manera de repetir estos experimentos sobre la propagacin de la especie in vitro, se
desarrollo el presente trabajo cuyo objetivo principal es; corroborar la alta capacidad regenerativa
de la violeta africana por cultivo in vitro de fragmentos de hoja en condiciones de laboratorio
qumico - biolgico de la Universidad de la Sierra Jurez.
MATERIALES Y MTODOS
El ensayo se realizaron en el Laboratorio Qumico - Biolgico de la universidad de la Sierra
Jurez, Oaxaca; a partir del Martes 18 de Marzo a Abril de 2014 acatndose al manual de
practicas de laboratorio de microbiologa general de la Universidad Autnoma Metropolitana
(Aquiahuatl y Prez, 2004).
Eleccin de la planta elite
Se compr una maceta de la planta violeta africana (Saintpaulia ionantha) en el vivero Santa
Rosa, ubicada en la carretera internacional 312, Cuauhtmoc, Oaxaca de Jurez, Oaxaca con la
condicin de que la hojas no estuviera muy madura, marchitas o muy tiernas, adems de que la
planta tuviera una amplia gama de hojas.



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Esterilizacin del material para siembra
La esterilizacin del material y preparacin del medio se llevaron acabo en la primera semana.
Se revis que el material de cristalera estuviera limpio (las probetas de 1000, 500 y 25 ml; los
vasos de precipitados de 500 y 250 ml; los 10 frascos de vidrio tipo gerber de 110 g; las dos cajas
Petri con base y tapa; los dos matraces Erlenmeyer de 500 ml y el agitador de vidrio), aquellos
que no estuvieran en estn condiciones se prosigui a enjuagarlos con agua y detergente, se
utiliz fibra y escobilln, evitando dejar resto de detergente en el interior de los recipientes. Se
secaron con la ayuda de la servitoalla. Una vez secas se separaron los materiales aquellas que se
iban a utilizar para el medio de cultivo y aquellas que se iban a meter a esterilizar directamente;
por lo que los materiales para este ultimo fin como son; los vasos, los matraces con agua
corriente y las probetas se les hizo una tapa con papel aluminio, se procuro que abarcaran toda la
boca y se coloco un pedazo de cinta testigo con la finalidad de que nos indique que han sido
sometido a esterilizacin (Gutirrez, 2008) en el caso de las cajas Petri, el papel bond y la tela
absorbente se envolvi con bolsas de polipapel , cerrndolas con un nudo y tambin colocando la
cinta testigo. Bajo estas condiciones los materiales estaban listas para esterilizarlas en el a
autoclave por 20 minutos a 120C.
Medio de cultivo para violeta africana
Adems de los materiales, tambin se esteriliz el medio de cultivo y esta preparacin se llev
acabo de la siguiente manera;
En la balanza analtica se pesaron; 1.1 g de Medio Ms, 7.5 g de sacarosa, 2.25 g de agar y 0.05
g de carbn activado; en un vaso de precipitado de 500 ml se coloc 200 ml de agua destilada y
se mezcl con el medio MS, se agit y se puso a calentar en un horno de microonda por 60
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segundos, al observar grumos en la solucin se repiti el proceso anterior, una vez que quedo
bien diluido la solucin se agreg la sacarosa y se volvi a disolver. Posteriormente con la ayuda
de la probeta se afor a 200 ml con agua destilada, se vaco nuevamente al vaso de precipitado y
se midi el pH, con el pHmetro, al resultar neutro no hubo necesidad de ajustarlo con solucin
de Hcl1N o NaOH1N.Se prosigui a agregar el agar, se meti a calentar al horno de microondas
por 20 segundos, una vez que esta solucin tomara un color transparente se agrego el carbn
activado y se volvi a agitar.
Finalmente se reparti con ayuda de la probeta de 50 ml aproximadamente entre 20 y 25 ml de
la solucin (medio) en frascos de gerber; se espero a que solidificara y se prosigui a taparlos y
colocarle la cinta testigo.
Junto con los materiales preparados en la seccin anterior se meti en el autoclave por 20
minutos y 120c.
Desinfeccin de los explantes
Para la desinfeccin de explantes y la siembra de explantes se llevo acabo durante la semana 2.
Todos los pasos debern de realizaron en el rea de los mecheros colocados en la mesa de
trabajo, se desinfect el rea de trabajo con alcohol al 70%, se us cubre boca, bata y se
desinfectaron las manos.
Los explantes para cultivo se obtuvieron de las hojas (seleccionndolo por su estado de salud y
vigor aparente). Las hojas se lavaron con agua de la llave y jabn durante 5 minutos, se utiliz un
vaso de pp de 500 ml. Se sumergi en una solucin de etanol al 70% por 30 s, se prosigui a
enjuagarlas con agua estril.
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Se pas las hojas a una solucin al 10% de hipoclorito de sodio comercial (100 ml de
hipoclorito ms 900 ml de agua destilada estril), se dejo actuar por 10 minutos. Transcurrido el
tiempo se enjuag 3 veces con agua destilada estril y finalmente se dejaron las hojas en agua
corriente estril hasta antes de su utilizacin.
Siembra de los explantes
Con las pinzas de diseccin estriles se tom una hoja y se coloc en un cuadro de papel bond
estril, usando una navaja de bistur nueva para fraccionar la hoja en cuadros (explantes) de 1cm2
aproximadamente. En seguida se prosigui a colocar 3 explantes con el envs hacia abajo por
frasco, para esto se procur abrir el frasco cerca de la flama del mechero (para evitar
contaminacin del ambiente), realizando rpidamente esta operacin e inmediatamente cerrar el
frasco al trmino de la colocacin de los explantes.
Se colocaron una banda de kleen-pack en todas las tapas, adems fue necesario rotular los
frascos con ayuda de un pedazo de masking tap; fecha, especie, medio.
Se colocaron los frascos sobre un anaquel, luz natural y a temperatura ambiente despus de la
primera semana se obtuvieron resultados.
Las variables evaluadas fueron numero de frascos contaminados, numero de explantes
contaminados, medio de cultivo contaminacin y numero de brotes.
RESULTADOS Y DISCUSIN
De los diez frascos sometidos a este ensayo de micropropagacin in vitro tan solo uno de ellos
logro formar una planta que representa el 10% del total de los frascos. En cada semana se
registraron el numero de frascos con algn brote y contaminados por hongos u oxidados, los
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resultados se muestran en el cuadro 1, en el cual se puede observar que en la quinta semana hubo
un frasco con indicios de formacin de plntulas.
Cuadro 1. Numero de frascos con contaminacin de explantes.

Numero de
frascos
SEMANAS
1
01/04/014
2
08/04/014
3
15/04/014
4
22/04/014
5
29/04/014
6
06/05/014
7
13/05/014
Contaminados
u oxidados

4/10

7/10

9/10

/

10/10

10/10

10/10
Con brotes 0/10 0/10 0/10 / 1/10 1/10 1/10

Sin embargo despus de la quinta semana dos explantes presentaron contaminacin fngica y el
tercero empez a formar pequeas races y las hojas empezaron a tomar un estructura se muestra
en la figura 1; pero, en la sptima semana este explante se contamin por hongos, este registro
puede apreciarse en el cuadro 2.





Figura 1. Contaminacin fngica de explantes y formacin de una plntula a partir del
explante.
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Cuadro 2. Numero de explantes contaminados por semana.

Numero de
explantes
SEMANAS
1
01/04/014
2
08/04/014
3
15/04/014
4
22/04/014
5
29/04/014
6
06/05/014
7
13/05/014
Contaminados
u oxidados

12/30

21/30

26/30

/

29/30

30/30

30/30
Con brotes 0/30 0/30 0/30 / 1/30 1/30 1/30

En cuanto a la contaminacin por fenoles reaccion bien el carbn activado ya que en los
explantes hubo muy poca oxidacin, este compuesto fungi como antioxidante ante la presencia
de compuestos fenlico y taninos presentes en los explantes que se presenta al momento de que
se fragmenta la hoja (Fernndez 2011).
Al comparar el total de medios de cultivo contaminado y total de explantes contaminados por
semana nos damos cuenta que en ninguno de los caso hubo contaminacin de medios de cultivo.
Lo resultados se muestran en el siguiente cuadro 3.
Cuadro 3. Contaminacin fngica del medio de cultivo y de los explantes.


CONTAMINACION FUNGICA/ SEMANA
1
01/04/014
2
08/04/014
3
15/04/014
4
22/04/014
5
29/04/014
6
06/05/014
7
13/05/014
Medio (MS) 0 0 0 / 0 0 0
Explantes 1 1 1 / 1 1 1
El 0 representa ausencia de contaminacin y el 1 la presencia de contaminacin.
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Segun Ecured (2008) la contaminacin in vitro de los tejido vegetales puede originarse de dos
fuentes fundamentales: una llevada a cabo por microorganismos en la superficie o en los tejidos
de los explantes, o por deficiencias en la manipulacin de los operadores en los laboratorios, y la
contaminacin del medio bsicamente esta dada por este ultimo factor, por lo que se puede decir
que a pesar de no contar con los equipos que garantizan ampliamente la esterilizacin se pudo
trabajar de manera asptica en el cultivo de la violeta africana, y el problema de la alta
contaminacin fngica de los explantes pudiera deberse a la contaminacin de la planta madre y
particularmente de las hojas, la caracterstica de las hojas de esta especie es que presenta
vellosidad y son mucilaginosos el contacto directo de las yemas con el suelo por su ubicacin y
segn EcoRed (2004) y Barker, et a.l (1979) los hongos y las bacterias pueden desarrollarse
bajo estas condiciones porque impide que se desinfecte de manera adecuada, adems se
desconoce el tratamiento de la planta dentro del vivero ya que la contaminacin se favorece aun
mas cuando las planta madre crecen directamente en el campo sin previo tratamiento de
desinfeccin al pasar al laboratorio para su siembra (Barker, et al. 1979). La presencia de
microorganismos contaminantes en la fase de establecimiento in vitro ocurre sobre todo cuando
la planta donante crece directamente en el campo y est expuesta a plagas, enfermedades, polvo y
otros agentes, sin ningn tipo de control ambiental (Ramrez y Salazar 1997).
Segn EcoRed (2008) otro factor que tambin pudo influir en la contaminacin rescatando su
relevancia son los mtodos de desinfeccin ya que estos no siempre eliminan las poblaciones de
microorganismos asociados a los tejidos de las plantas, muchos son capaces de permanecer
latentes en el interior de las clulas, en los espacios intercelulares o en los haces conductores; por
lo que Snchez y Salaverria (2004) menciona que debe comprobarse distintos tiempos de
desinfeccin con el cloro, pues en su experimento se observ que a medida que se aumentaron la
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concentracin de cloro comercial y el tiempo de inmersin, la contaminacin de los explantes
disminuy.
Ante estos resultados se recomienda insistentemente el uso de fungicidas y antibiticos en la
planta madre (Alvarado 1998 y Jimnez 1998) es una de las opciones empleadas para disminuir o
eliminar la accin de los microorganismos fungosos en las plantas donadoras de explantes
durante la fase cero o preparativa de la micropropagacin de plantas (Alvarado 1998).
Adems es muy necesaria la existencia de un banco de donantes que garantice la calidad
fitosanitaria de la planta (Jimnez, E. 1998).
Hay que tener en cuenta que el explante de la violeta africana (Saintpaulia ionantha) que
form estructuras de hojas y races, por la presencia del hongo no garantiza su desarrollo y
crecimiento al menos que se cambie a un nuevo medio de cultivo suministrando fitoreguladores
para acelerar su crecimiento y buen desarrollo (Terenti y Verde 2001).
CONCLUSIONES
Al obtener un explante desarrollado de este ensayo de micro propagacin de la violeta africana
(Saintpaulia ionantha) a partir de un fragmento de hoja, se concluye que las clulas de esta planta
es totipotente capaz de generar una nueva planta a partir de un fragmento de la hoja.
El alto grado de contaminacin de los explantes se debi bsicamente, por falta de un
tratamiento previo de desinfeccin de la panta madre en el vivero; as como tambin por la falta
de seguimiento de distintos tratamientos con diferentes protocolos de desinfeccin.
Se manipulo los materiales de la manera ms asptica posible pues no hubo contaminacin del
medio de cultivo, es decir, no se propago el hongo fuera de los explantes.
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Los materiales usados para el desarrollo de este ensayo de micropropagacin no influyeron en
la contaminacin de explantes.
LITERATURA CITADA
Alvarado, Y. 1998. Contaminacin microbiana en el cultivo in vitro de plantas. In Prez P, JN. ed.
Propagacin y Mejora Gentica de Plantas por Biotecnologa. Santa Clara, CU, Instituto de
Biotecnologa de las Plantas. p. 81-104.
Aquiahuatl R., MA. Chabela P. M. 2004. Manual de prcticas de laboratorio de microbiologa
general. UAM. Mxico.
Barker, PK.., Fossard RA., 1979. Propagacin clonal de Eucalyptus cultivo in vitro.
Comb.Proc.Int. Plant. Prop. Soc. 27:546-556.
Bravo, MA. D Espinal. 2011. Contribuciones del Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de
Zamorano a la Micropropagacin y Propagacin de Plantas Libres de Patgenos. Ceiba.
52(1):193-198.
EcuRed (Enciclopedia cubana de la red). 2008. Contaminacin microbiana in vitro (Tejidos
vegetales) recuperado el 16 de Junio de 2014, del sitio web
http://www.ecured.cu/index.php/Contaminaci%C3%B3n_microbiana_in_vitro_(Tejidos_vegetale
s).
Fernndez, R. 2011. Composicin de medio de cultivo. Recuperado el 15 de Marzo de 2014 del
sitio web scribd:esSccribd.com/doc/58589856/composicin-Medios-de-cultivo.
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Gutirrez, S. Mtodos de esterilizacin. Recuperado el 15 de Marzo de 2004. Del sitio Web
Universidad Central de Venezuela: http:
www.ucv.ve./fileadmin/user.../16_metodos_de_esterilizacion.pdf.
Jimnez, E. 1998. Cultivo de pices y meristemos. In Prez P, JN. ed. Propagacin y Mejora
Gentica de Plantas por Biotecnologa. Santa Clara, CU, Instituto de Biotecnologa de las Plantas.
p. 45-56.
Mendoza F., JI., MA Muoz S. I. Parra I., S. Villazala M.2012. Produccin de nuevas variedades
de Saintpaulia ionantha mediante variacin somaclonal. Ambiociencias. 10: 38-51.
Mosquera D., K. 2010. Cultivo in vitro de hojas Violeta Africana (Saintpaulia ionantha) para la
induccin a organognesis directa. Escuela Politcnica del Ejrcito, Sangolqu-Ecuador. 5p.
Ramrez, M., Salazar E. 1997. Establecimiento in vitro de segmentos nodales de guayabo
(Psidium guajava L.). Revista de la Facultad de Agronoma (Venezuela) 14:497-506.
Sanchez-Cuevas, MC., JL. Salaverria.2004. Control de la oxidacin y la contaminacin en el
cultivo in vitro de fresa (Fragaria X ananassa). Revista UDO Agrcola. 4 (1): 21-26. 2004.
Terenti, C. Verdes P. 2001. Micropropagacin de Saintpaulia ionantha H.Wendel var. Bangle
Blue. Huayllu-Bios. 5: 69-70.
Tineo G., L. 2010. Multiplicacin in vitro de clulas callosas de violeta africana (Saintpaulia
ionantha Wendl). La sociedad Academica. 36:28-32.