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UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL









CICLO: V

ASIGNATURA: Microbiologa Agroindustrial

PRACTICA: N05

NOMBRE: Lucio Roberth Vargas Zamata

DOCENTE: Ing. Hugo Calisaya Ccosi

FECHA: 26 de Junio del 2014

CODIGO: 2012102007



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Contenido

INTRODUCCION .............................................................................................................................. 3
I. TITULO ....................................................................................................................................... 4
II. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 4
2.1. OBJETIVOS GENERALES ............................................................................................. 4
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS .......................................................................................... 4
III. MARCO TEORICO ............................................................................................................... 4
3.1. MATERIA PRIMA ............................................................................................................. 4
3.2. MATERIALES, INTRUMENTOS, EQUIPOS Y MAQUINAS DEL PRODUCTO ..... 5
IV. MATERIALES Y METODOS .............................................................................................. 6
4.1. MATERIALES UTILIZADOS ........................................................................................... 6
4.2. METODOLOGIA ............................................................................................................... 6
VI. RESULTADOS ...................................................................................................................... 7
VII. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 7
VIII. DISCUSION ........................................................................................................................... 8
IX. RECOMENDACIN ............................................................................................................. 8
X. BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................................... 8
XI. ANEXOS ................................................................................................................................ 9










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INTRODUCCION

La Tincin Gram es de gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes
grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento radica
en la diferente estructura de pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una
gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de
peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacarido externa. Tras la tincin con el primer colorante
(Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-),
mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las clulas permanecern azules. Las
clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan
observarse.

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PRACTICA N 03
I. TITULO

Tincin de Gram
II. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVOS GENERALES
Identificacin de clulas Gram positivas y Gram negativas
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Recordar el manejo del microscopio ptico para la observacin de
bacterias(importancia del objetivo de inmersin)
Utilizar la tcnica de tincin diferencial con el colorante cristal violeta y
safranina.
Observar las diferentes formas de la estructura microbiolgica, obtenidas en el
aislamiento de microorganismos.
Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer
comparaciones entre tamaos de procariotas y de eucariotas.
III. MARCO TEORICO
3.1. MATERIA PRIMA
La tcnica se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias
Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una capa gruesa de
peptidoglicano, adems de dos clases de cidos teicoico: Anclados en la cara
interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el
cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado
solamente en el peptidoglicano (tambin conocido como murena)
Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin
distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de
peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana
exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacarido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas
diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el
material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas
lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la
membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como
por ejemplos la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee
es demasiado delgada como pared para retener el complejo de cristal violeta/yodo
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que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la
coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una
pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando
los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violeta.

Reactivos
Agua destilada.- La destilacin es un mtodo de separacin, que se utiliza en la
de produccin de agua destilada (Pura) donde bsicamente se separan los
componentes lquidos de una mezcla. Por lo tanto, el agua destilada es H2O sin
compuestos aadidos. (Ciget, 2013)
Aceite de inmersin.- Utilizado como medio de inclusin en microscopa.
Se utiliza colocando una gota en el objetivo para facilitar la visin del microscopio
al entrar en contacto con el cubre-objetos (I.C.T, 2013)
Solucin de cristal violeta.-Comnmente denominado cristal violeta o violeta de
genciana, es un compuesto qumico empleado como indicador de pH y colorante.
Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil p-
rosanilinas.
Solucin de safranina etanol 95%.- La safranina O es un colorante biolgico
tambin conocido como dimetil safranina y rojo bsico 2. Al ser una molcula
cargada positivamente (catin) es capaz de combinarse con elementos celulares
de cargas negativas. La tincin de safranina O es de contraste, ya que se usa para
diferenciar una estructura celular previamente teida con otro colorante. Se utiliza
en distintas tcnicas histolgicas que detectan clulas enterocromafines del tracto
gastrointestinal, el protoplasma y ncleo de microorganismos patgenos.
(Snchez, 2012)
Lugol.- Es una disolucin de yodo molecular I
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y yoduro potsico KI en agua
destilada. Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y
antisptico, para la desinfeccin de agua en emergencias y como un reactivo para
la prueba del yodo en anlisis de laboratorio. (Vidaurre, 2011)
Alcohol acetona.- Lquido incoloro de olor caracterstico. Se evapora fcilmente,
es inflamable y es soluble en agua.


3.2. MATERIALES, INTRUMENTOS, EQUIPOS Y MAQUINAS DEL PRODUCTO


Mechero Bunsen.- Instrumento
Asa de Siembra o aguja enmangada.-Instrumento para tomar la bacteria de la
Placa Petri
Muestras Bacterianas.
Microscopios.- Equipo que permite ver cosas pequeas que no se puede ver a
simple vista.
Porta-objetos.- Fragmento de vidrio que soporta a la muestra.
Cubre objetos.- Fragmento que cubre en la parte superior del portaobjetos para
que se pueda analizar.
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Cuchilla o bistur.-Instrumento que da cortes al material a fin de que pueda facilitar
la extraccin de la muestra a estudiar.
Pinzas de diseccin.- Instrumento que ayuda a coger la muestra.
IV. MATERIALES Y METODOS
4.1. MATERIALES UTILIZADOS

Microscopio
Porta objetos
Azul de Metileno
Cuchillo
Pinzas
Muestras de origen vegetal
Soporte de tincin
Goteros
Gasas
Palillos

Reactivos

Agua destilada
Aceite de inmersin
Solucion de Cristal Violeta
Solucion de safranina etanol 95%
Lugol
Alcohol acetona

4.2. METODOLOGIA

Desarrollar la prctica teniendo en cuenta el siguiente procedimiento:

Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero.
Colocar una gota de agua destilada o solucin salina sobre el portaobjetos y
luego esterilizar el asa bacteriologa.
Tomar una pequea muestra de la cepa y diluirla en el portaobjetos.
Posteriormente esterilizar el asa.
Fijar la muestra al calor flamendola en el mechero, cuidando no quemar la
muestra. Colocar el portaobjetos sobre un soporte.
Cubrir la muestra con cristal violeta. Esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir
y enjuagar.
Cubrir la muestra con solucin lugol y esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir
y enjuagar.
Cubrir la muestra con alcohol cetona. Esperar que transcurran 5 segundos.
Escurrir y enjuagar.
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Cubrir la muestra con safranina y esperar que transcurra 1 minutos. Escurrir y
enjuagar.
Dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de inmersin y observar en
el microscopio a 10X, 100X,etc

V. PROCEDIMIENTO

Se limpi el porta objetos con agua destilada y luego lo limpiamos con algodn para
que no halla contaminacin debido a otros usos anteriores, colocamos nuestra bacteria
que se encontraba en nuestra Placa Petri y lo colocamos en la Porta-objetos todo esto
con nuestra Asa de siembra que fabricamos, luego lo pusimos en el mechero pero sin
dejarlo en el mismo lugar, lo estbamos moviendo de un lado a otro para que no se
caliente en exceso cierto punto, esperamos a que se enfre para que echemos el cristal
violeta y con ayuda de un cronometro esperamos 1 minuto y luego escurrimos en el
cao, luego hicimos lo mismo con el lugol, luego con el alcohol acetona, y por ultimo
vertimos safranina , lo que no hecho fue el aceite de inmersin porque no lo tenamos
pero usamos aceite de Recino.
Por ltimo paso fuimos donde el microscopio y pusimos a 10X la visin para ver los
Gram y luego a 100X cada uno regulamos el microscopio para recordar su uso y su
observacin de sus caractersticas fsicas.

VI. RESULTADOS


En nuestra nica muestra se podido encontrar cocos y estreptocos, a la vez se hall un
bacilos que son los alargados. Se presentaron como una capa gruesa y homognea,
denominada pared celular. En el interior de la membrana plasmtica se encuentra el
citoplasma que est constituido por una disolucin acuosa, tambin se encontraban
agregados de macromolculas, y en el centro se ubicaba el nucleoide aunque no se
vea por teora sabamos que se hallaba, que contiene una madeja de hebras difcil de
distinguir y cuyo principal componente es el ADN.

VII. CONCLUSIONES

Se record el manejo del microscopio en la utilizacin de encontrar bacterias Gram. y el beneficio
que da el aceite.
Se pudo utilizar y conocer la funcin de la safranina y el cristal de violeta.
Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren mucho
qumicamente esta diferencia qumica es los que permite distinguir las bacterias por Tincin, pues
generalmente, el colorante reacciona con la clula bacteriana, pero no reacciona con su medio
exterior. Permitiendo el estudio de las estructuras internas de la clula bacteriana, tales como
paredes celulares, vacuolas o cuerpos celulares.
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VIII. DISCUSION
Las estructuras no encontraban muy definidas por lo que solo pudimos ver
ms su forma pero por anteriores estudios de la microbiologa supimos lo que
tena que estar presente en estas bacterias, adems de solo tener una
muestra no tuvimos mucha comparacin con respectos a otros debido a la
poca produccin de colonias en nuestra Placa Petri
IX. RECOMENDACIN

Se necesita saber con mucha anticipacin que materiales vamos a usar para
no tener que acoplarnos o reemplazar aquellos que no tenemos como el caso
del aceite de inmersin.
Se necesitaba ms orden en laboratorio al momento de usar los reactivos, ya
que por tener limitados uno se atrasaba ms que el otro. Provocando asi
errores en la muestra.


X. BIBLIOGRAFIA

Ciget, Maria. 2013. Ecured. [En lnea] 08 de Abril de 2013. [Citado el: 24 de Mayo de 2014.]
http://www.ecured.cu/index.php/Agua_destilada.
I.C.T, S.L. 2013. Instrumentacion Cientifico Tecnica. [En lnea] 14 de Abril de 2013. [Citado el: 25
de Mayo de 2014.] http://ictsl.net/mobile/pda/productos/instrumental/0000009c41092fc4d.html.
Snchez, Hilda Isabel Aguirre. 2012. www.mediagraphic.org.mx. [En lnea] Setiembre-Diciembre
de 2012. [Citado el: 25 de mayo de 2014.] http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-
2012/ir122f.pdf.
Sarath Stephany Trejos, Emilia Urriola. 2012. http://laboratoriodemicrobiologia.weebly.com/. [En
lnea] 2012. [Citado el: 26 de Mayo de 2014.]
http://laboratoriodemicrobiologia.weebly.com/cuestionario3.html.
Vidaurre, Jhonatan Max Asalde. 2011. es.scribd.com. [En lnea] 23 de Mayo de 2011. [Citado el:
25 de mayo de 2014.] http://es.scribd.com/doc/56079718/Lugol.



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XI. ANEXOS

CUESTIONARIO
Indicar la utilidad de los reactivos utilizados en la prctica.
Su utilidad de cada reactivo es fundamental, cada uno ayuda a mantener a la muestra en buen
estado, el agua destilada ayuda a dejar limpio el portaobjetos, el cristal violceo, ayuda como
indicador y es un colorante violeta, el lugol ayuda a retener el colorante cristal violeta. El I2
entra en las clulas y forma con el colorante cristal violeta un complejo insoluble en agua. El
alcohol cetona como solvente orgnico es soluble en la capa externa de la membrana de
bacterias Gram negativa hacindolo que pierda parte de su coloracin mientras que en las
Gram positivas, hace que cierre sus poros hacindolo que no pierda su coloracin. La
safranina es un colorante que ayuda dar color a las muestras que ya tuvieron otro indicador y
que lo perdieron debido a su solubilidad es muy eficaz y adecuado justo para las bacterias
Gram negativas que perdieron su coloracin debido al alcohol acetona. Por ltimo se us el
reactivo de aceite de Recino que cumple casi la misma funcin que el de inmersin, es decir de
facilitar el contacto con el cubre-objeto, para tener una mejor visin al usar el microscopio.

Causas que alteran la tincin de Gram
Edad de la bacteria, debido a su edad estas puede que hayan perdido su pared peptidoglicano,
Errores del operador es cuando hay errores de dosificacin o algn error que genera al
momento de trabajar con la bacterias, como el tiempo prolongado de enjuagarlo y el uso de
antibiticos es decir que por causa de uno los reactivos mate a las bacterias y pierdan sus
caractersticas como Gram.
Indicar las bacterias resistentes a la tincin Gram
Las Mycobacterias (estn encapsuladas), Mycoplasmas (no tienen pared), Formas L (prdida
ocasional de la pared), Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared,
respectivamente).
Cules son las fuentes de errores ms comunes de error en la Tincin de Gram.
Es la persona de quien est manipulando, los reactivos si son tal como pide en la prctica o
son sustitutos aproximados. La cantidad de reactivo que se est poniendo en las bacterias, pH
inadecuado. Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros, tiempo de tincin incorrecto,
temperatura insuficiente.
Explique qu reaccin de Gram darn las levaduras. Estos tendrn la misma importancia
que las bacterias.
El color depende de la composicin de la pared celular de la levadura y no tiene tanta
importancia como las bacterias ya que en ellas existe toda una clasificacin por medio del
Gram lo que no sucede con las levaduras. (Sarath Stephany Trejos, 2012)
Explique el fundamento de la tincin negativa realizada en la prctica. Qu tipo de
informacin se obtiene.
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La tincin negativa es el resultado de las bacterias que no tienen una pared celular gruesa, y
de ello parte que tiene poca peptidoglicano, por lo que presenta una caracterstica principal es
ver la presencia de las capsulas alrededor de las clulas bacterianas.
Investigue otra tcnica de Tincin selectiva que permita observar otras estructuras
bacterianas.
En general se pueden clasificar en:
Simples (utilizan un solo colorante). Por ejemplo: azul de metileno para observacin de
levaduras y protozoos intestinales
Diferenciales (utilizan ms de un colorante y permiten la agrupacin de las bacterias de
acuerdo a su diferente afinidad tintorial). Destacan la tincin de Gram que agrupa a las
bacterias en dos grandes bloques, bacterias gram positivas y bacterias gram negativas, y la de
Ziehl-Neelsen utilizada, entre otros, para la tincin de mico bacterias.
Especiales: tinciones fluorescentes, tinciones de determinadas estructuras como la tincin del
esporo, tincin de flagelos.
Tinciones negativas (Tinta china). No son una verdadera tincin. Se llaman as porque lo que
realmente se tie es el fondo sobre el que estn los microorganismos apareciendo los
microorganismos sin teir. Se emplea para ver la cpsula de S. pneumoniae y Cryptococcus
neoformans en LCR.
A qu se debe el distinto comportamiento de las bacterias segn sean Gram+ o Gram-?
Se debe a la capa peptidoglicano o conocido tambin como murena, ya que una es ms
gruesa que la otra, y puede retener ms el indicador haciendo una clasificacin muy importante
en cuanto a bacterias.

















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Fig.1.Bacterias Gram positivas a 10X Fig.2. Bacterias Gram negativas a 100X