TMGF1 de 2

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BARCELONA
DEPARTAMENTO DE GENTICA Y MICROBIOLOGA

FACULTAD DE MEDICINA
Estudio microblolgico, clnico y epidemiolgico de
Yersinia enterocolitica
Tesis presentada para optar al grado de
Doctor por Merc Gurgu Ferrer
Barcelona, Octubre de 1986
Guillermo Prats Pastor, Catedrtico de Microbiologa y
Parasitologa, y Beatriz Mirelis Otero, Profesor Encargado de
Microbiologa y Parasitologa del Departamento de Gentica y
Microbiologa de la Universidad Autnoma de Barcelona,
CERTIFICAN:
Que la Tesis Doctoral titulada "Estudio
microbiolgico, clnico y epidemiolgico de Yersinia
enterocolitca", ha sido realizada bajo su direccin.
Y para que conste, firman este certificado en Barcelona, a 15 de
Septiembre de 1986.
G. Prats B. Mirelis
Al meu fill Miquel.
Als meus pares.
Mi agradecimiento:
AI Profesor Guillem Prats, por su paciente dedicacin, sus
consejos, su capacidad de trabajo y amistad, sin los cuales no
habra podido realizar esta Tesis.
A la Dra. Beatriz Mirelis, compaera y amiga de tantos aos, por
su constante inters y ayuda a lo largo de este trabajo.
Al Profesor Guillem Verger, quien me inici en la Medicina Clnica
y a quien debo mi aficin por las Enfermedades Infecciosas, por
sus enseanzas, su amistad y su apoyo en todo momento.
Este trabajo ha comportado un amplio estudio microbiolgico, clnico
y epidemiolgico desarrollado durante 3 aos.
Es obvio, por ello, que no se habra podido realizar sin la
colaboracin decidida de un amplio grupo de compaeros y amigos
con los que hemos trabajado durante muchas horas en las poyatas
del Servicio de Microbiologa, en la Unidad de Enfermedades
Infecciosas, en los Dispensarios de Reumatologa y Medicina, y en
muy diversos lugares de la geografa de Catalua para recoger
muestras de animales y del medio ambiente.
Quiero agradecer:
A Arantxa Calvo, Clotilde Fernndez y Marta Briz por su
inestimable ayuda tcnica.
AI Dr. Pere Coll y Rosa Rosell por su colaboracin en el estudio
serolgico.
A mis compaeros de la Unidad de Enfermedades Infecciosas,
M9 Luisa Lpez-Valeiras, Antoni Ao y el Dr. Josep Barrio, por su
apoyo, su colaboracin y el agradable ambiente de trabajo que me
ha facilitado la realizacin de esta Tesis.
A los Dres. Esperanza Llorens, Csar Daz, Arturo Rodrguez y
Carme Geli por la seleccin de los pacientes peditricos y
reumatolgicos incluidos en el estudio.
A la Prof. Montserrat Ports por su colaboracin con las muestras
de origen animal para estudio epidemiolgico.
A Josefa Nebot y a Teresa Mora por facilitarme muestras para
estudio.
A todos los compaeros del Servicio de Microbiologa por la ayuda
y colaboracin que siempre me han prestado durante la realizacin
de este trabajo.
Muy especialmente quiero recordar a Pilar Teruel por su paciente y
escrupulosa labor de mecanografa.
A la Fundacin Knickerbocker por el soporte econmico para el
desarrollo de esta Tesis Doctoral.
A todos muchas gracias.
INDICE
pag.
I. Introduccin yobjetivos I
II. Aspectos tericos 5
1. Taxonoma 6
2. Estructura antignica 23
3. Aislamiento. Tcnicas ymedios de cultivo 31
4. Diagnstico serolgico 35
5. Marcadores de patogenicidad 37
6. Sensibilidad de antibiticos HO
7. Manifestaciones clnicas 41
8. Tratamiento 51
III. Trabajo experimental 53
1. Material y mtodos 54
Estudio epidemiolgico 55
Tcnicas de aislamiento 58
Identificacin bacteriana 61
Estudio de patogenicidad 63
Tcnicas serolgicas 66
2. Resultados 75
a. Evaluacin de las tcnicas de cultivo 76
b. Epidemiologa 78
i Muestras humanas 78
ii Muestras animales 88
iii Muestras telricas 91
v Muestras de alimentos 93
c. Clnica 96
i Gastroenteritis 96
ii Manifestaciones reumticas 120
iii Enfermedad inflamatoria crnica 126
d. Patogenicidad 128
e. Caracteres metablicos 133
f. Sensibilidad a los antibiticos 143
IV. Discusin 150
Tcnicas de aislamiento 151
Epidemiologa 153
Clnica 158
Pruebas de patogenicidad 164
Caracteres metablicos 166
Sensibilidad a los antimicrobianos 168
V. Conclusiones 170
VI. Resumen 176
Vil. Bibliografa ' 184
VIII. ndice de tablas 213
IX. ndice de figuras 219
Estudio microbiologia), clnico y epidemiolgico de
I. Introduccin y objetivos
I. Introduccin y objetivos.
El gnero Yersinia fue propuesto por Van Loghen en 1914 (1) en
honor a A.J.E. Yersin. que aisl por primera vez el bacilo de la
peste en Hong Kong en 1894 (2), para reclasificar dicho bacilo y el
de la pseudotuberculosis descrito por Malassez y Vignal en 1883
(3), pertenecientes hasta entonces al gnero Pasteu re I la, (_ P.
pestis y JP. pseudotuberculosis). Thal propuso en 1954 la inclusin
de dicho gnero en la familia Enterobacteriaceae (4).
La descripcin de la primera cepa de la actual especie _ Y.
enterocolitica fue publicada por Schleifstein y Coleman en 1939 (5)
denominndola Bacterium enterocoliticum. Hassing y cois fueron los
primeros en aislarla del hombre en Europa en 1949, denominndola
Pasteu re la pseudotuberculosis rodentium (6). Daniels y
Goudzwaard denominan a unas cepas homologas a las de Hassing
Pasteurella X (7).
Frederiksen en 1964 examina 55 de dichas cepas, incluyendo las
aisladas por Schleifstein y Coleman, Hassing et al, Daniels y
Goudzwaard, presentando similares caractersticas bioqumicas y
patrn de sensibilidad a los antibiticos. No presentaban reacciones
inmunolgicas cruzadas con _ Y. pseudotuberculosis pero s deban
ser incluidas por su semejanza en el mismo gnero Yersinia como
una especie separada: _ Y. enterocolitica (8 ).
El grupo del Instituto Pasteur en Pars y del CDC de Atlanta
estudiando diversas cepas atpicas de _ Y. enterocolitica agrupadas
bajo la denominacin de _ Y. enterocolitica "like" por Knapp y Thal
(9), en base a estudios de homologa gentica, proponen en 1980
la creacin de tres nuevas especies, ^ Y. intermedia, _ Y.
frederiksenii, _ Y. kristensenii y dos grupos innominados X.. y X_
siendo ste ltimo recogido en 1984 bajo la denominacin de _ Y.
aldovae (10).
2
El inters por estas especies depende de mltiples razones. En
primer lugar la peste ha sido una enfermedad con un contenido
dramtico en funcin de su mortalidad en las grandes pandemias.
La primera pandemia descrita en el siglo VI antes de Cristo se
supone que pudo causar la muerte de ms de 100 millones de
personas durante 50 aos. En el siglo XIV, se produce la segunda
pandemia de que se posee noticia, conocida como la peste negra
que acab con un cuarto de la poblacin europea expandindose
por el Oriente Medio. La ltima pandemia tuvo lugar a finales del
siglo XIX en China.
Las particulares caractersticas de esas epidemias y la semejanza
biolgica entre _ Y . pestis y ^ Y . pseudotuberculosis han permitido
especular sobre determinados hechos en torno a las relaciones
evolutivas entre esos patgenos que ha resumido de modo
sugerente Mollaret (11).
La aparicin de una epizootia por _ Y . enterocolitica en los criaderos
de la chinchilla en Europa en 1955 y la deteccin de infecciones en
el hombre, que se han incrementado en los ltimos aos, centr el
inters por la capacidad patgena de esa especie.
Aunque antes de 1965 se han producido casos humanos de
yersiniosis por esta especie, es a partir de esta fecha cuando estas
infecciones caracterizadas por la produccin de enteritis, cuadros
de pseudotuberculosis mesentrica (linfadenitis mesentrica) y
cuadros paradigestivos de patogenia inmune se detectan con mayor
frecuencia.
En efecto, desde la descripcin por Schleifstein y Coleman en 1939
del primer caso de infeccin humana (5) hasta 1966 se
documentaron nicamente 23 casos de infecciones en el hombre
(12). Desde esa fecha hasta la actualidad se han detectado
numerosos casos de infeccin humana.
-3-
El incremento de la incidencia de este microorganismo en patologfa
humana se debe probablemente a dos hechos, por un lado su mejor
conocimiento por parte de los microbilogos y como consecuencia su
aislamiento e identificacin ms frecuente y por otro los cambios en los
hbitos alimentarios de la poblacin incluyendo la refrigeracin de los
alimentos a temperaturas que permiten la multiplicacin de estas
bacterias en sus fuentes habituales.
En los ltimos aos se han revisado y estudiado diversos aspectos
de inters en relacin a estos patgenos. Entre estos se incluyen
las tcnicas de aislamiento, el estudio de la epidemiologa y
patologa en el hombre y los animales, el desarrollo de esquemas de
bioserotipado y el estudio de su patogenicidad en relacin a su
estructura antignica y a otros factores genotpicos y fenotpicos
correlacionados con ella.
A pesar de ello, los conocimientos sobre la epidemiologa de Y.
enterocolitica, en nuestro pais son fragmentarios y la significacin
clnica del aislamiento de determinados serotipos y especies no se
ha podido precisar con exactitud.
En la presente Tesis se evalan las tcnicas de aislamiento de Y.
enterocolitica y especies afines, su epidemiologa y manifestaciones
clnicas en nuestro pas, diagnstico serolgico y factores de
patogenicidad de las cepas aisladas en un estudio desarrollado
durante dos aos.
4-
II. Aspectos tericos
1. Taxonoma.
Las caractersticas biolgicas de Yersinia Van Loghem 1944 (1)
permiten su inclusin en la familia Enterobacteriaceae (4). El
gnero est formado por bacilos o cocobacilos gramnegativos de
0,5-0,8 yttm de dimetro por 1-3 ytt.m de longitud, mviles por
flagelos peritricos excepto Y _ . pestis que es inmvil. Crecen bien
en medios usuales a una temperatura ptima de 28-299C Anaerobios
facultativos, oxidasa negativa y catalasa positiva poseen
nitrato-reductasa de tipo B excepto algunas biovariedades (_Y.
enterocolitica biotipo 5). La glucosa es atacada por va fermentativa
sin produccin de gas o produccin de pequeas cantidades,
algunas caractersticas se expresan a la temperatura ptima de
crecimiento (25-299C) y no se expresan o lo hacen con menor
intensidad a 379C. Poseen antgeno comn de enterobacterias segn
se ha observado en las especies estudiadas y posee un porcentaje
molar de G+C en el ADN de 46-50. La especie tipo es Yersinia
pestis (Sehmann y Neumann 1896) Van Loghem 1944 que est
registrada en la ATCC con el nmero 19428.
La semejanza morfolgica con las pasteurelas (su pequeo tamao y
coloracin bipolar) fue uno de los factores principales que situaron
estos microorganismos (al agente de la peste y la
pseudotuberculosis) en el gnero Pasteurella.
Todas las yersinias excepto ^. pestis crecen a 259C en un medio
sinttico con sales minerales utilizando varios hidratos de carbono
como fuente de carbono y energa. Y _ . pestis requiere L-metionina
y L-fenilalanina. Cuando se incuba a 379C en dicho medio todas las
especies son auxotrficas siendo imprescindible la adicin de biotina
y tiamina. Las exigencias de cultivo (nutritivas) en funcin de la
patogenicidad sern sealadas ms adelante.
Las especies de Yersinia pueden crecer a temperaturas entre 4 y
429C.
-6-
V\ pestis y _ Y pseudotuberculosis toleran pH de 5-9,6 y el resto de
especies de H a 10. El ptimo para el crecimiento se sita para
todas las especies entre 7,2 y 7,1. Y a se ha sealado que la
temperatura ptima de crecimiento es de 289C. A esta temperatura
pueden expresarse determinados caracteres que no se expresan a
379C como la movilidad, la prueba de Voges-Proskauer, la prueba
de la ON PC, la ODC, el crecimiento en citrato de Simmons, la
produccin de indol y la fermentacin de la celobiosa y rafinosa.
Los caracteres bioqumicos propios del gnero, aparte los comunes,
a la familia (Tablas 1, 2 y 3) son: la fermentacin de la glucosa
sin produccin de gas, la reaccin de ONPG positiva, presencia de
pectfnasa,amilasa y ureasa intensa (excepto _ Y . pestis). Las
pruebas negativas incluyen la FDA, LDC, ADH^ produccin de
acetoina (VP) a 37Q C aunque a 289C la producen _ Y . enterocolitica,
_ Y . frederksenii y Y _ . intermedia, la ausencia de crecimiento en
citrato de Simmons a 372C, aunque a 289C crecen _ Y . intermedia,
algunas cepas de _ Y . frederiksenii y las cepas del serogrupo IV de
Y . pseudotuberculosis, ausencia de crecimiento en CNK, malonato y
mucato excepto algunas cepas de Y . intermedia, y no produccin
de SH_ . La produccin de lipasa y DNasa es variable segn
especies o biotipos.
Los trabajos de Bercovier et al. (13), Brenner et al., Ewing et al.
y Ursing et al. han permitido, utilizando tcnicas de hibridacin
ADN-ADN, segregar de la especie Y . enterocolitica un conjunto de
cepas atpicas denominadas Y . enterocolitica "like" y establecer
tres nuevas especies. (Tabla 4).
La especie _ Y . enterocolitica "sensu stricto" incluye las cepas
sacarosa positivas, Voges-Proskauer positivas, ramnosa y melibiosa
negativas. Y _ . intermedia incluye las cepas sacarosa positivas,
ramnosa, melibiosa y rafinosa positivas, Y . frederiksenii' incluye
las cepas sacarosa y ramnosa positiva, melibiosa negativas y _ Y .
kristenseni las cepas sacarosa negativas. Segn datos de homologa
-7-
gentica otros grupos sacarosa negativos como los X.. y X- ( _ Y .
aldovae) (10) se han incluido en el gnero. Y ^ . ruckeri y Y _ .
philomiragia poseen caracteres fenotpicos alejados del gnero
Y ersinia y la ltima no corresponde tampoco genticamente al
gnero.
-8-
Enterobacteriaceae Vibrionaceae Pasteurellaceae
Dimetro celular (mcm) 0.3-1.5
Bacilos rectos +
Bacilos curvos
0.3-1.3
D
D
0.2-0.3
+
-
Movilidad D + -
Flagelos polares - +
Flagelos peritricos +
Prueba de la oxidasa - + +
Necesidad de Na - D
Antgeno comn de enterobacterias + - -
Presencia de menaquinonas D D -
Requerimiento de heme o N.A.D - - D
Necesidad de fuente
orgnica de N - - +
Tabla 1. Caracteres diferenciales de la familia Enterobacteriaceae respecto a
otras bacterias gramnegativas anaerobias facultativas.
+: Positivo; -: Negativo; D: diferentes tipos.
Tomado con modificaciones de Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.
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Fermentacin/Oxidacin +/+
Glucosa/Cas +/-
1)
Movilidad 37Q-/289
Nitratasa +
Oxidasa +
2)
Voges Proskauer -
Pectinasa +
Ureasa +
3)
Amilasa +
Prueba de la O N PC +
Produccin de SH
Fenilalanina desaminasa
Lisina decarboxilasa
Arginina dehidrolasa
r/n
Citrato de Simmons
Crecimiento en CNK
Malonato
Mucato -
5)
Tabla 3. Caracteres generales de las especies del gnero Yersinia.
Reacciones a 379C.
1. Puede producirse una pequea cantidad de gas. 2. Positivo a
282C en Y\ enterocolitica, _ Y. frederkseni, _ Y. intermedia. 3.
Negativa en Y^. pestis. 4. A 289C positivo en _ Y. intermedia y _ Y.
frederiksenii. 5. Positivo en algunas cepas de Y. intermedia.
-11-
Denominacin antigua Sac. Ram. Mel. Denominacin actual
Y. enterocoltica
cepas tpicas (Sac Ram ) + Y. enterocoltica (1-1)
V Y. enterocoltica (5)
{Tre-, N0 ")
cepas atpicas (Sac ) Y. kristensenii
(ODC
X
2
( Y;, aldovae)
cepas atpicas (Ram } Y. frederiksenii
+ Y. intermedia
Tabla 4. Caracteres bioqumicos por los que se definieron las cepas
atpicas de _ Y. enterocoltica.
Sac: sacarosa. Ram: ramnosa. Mel: melibiosa, Tre: trealosa, NO_ ~:
nitrato reductasa, ODC: ornitina decarboxilasa.
(1-4): biotipos 1 a 4, (5): biotipo 5.
-12
Las cepas tpicas de esta especie son maltosa, celobiosa y sacarosa
positivas, xilosa y trealosa variables. Existen diversos esquemas
del biotipado. Uno de los ms utilizados (Bercovier et al.) incluye
el estudio de la lipasa, DNasa, indol, D-xilosa, D-trealosa y
nitratasa, (Tabla 5) (13). Otros esquemas propuestos por Nilenn
(1969), Wauters (1970), Knapp y Thal (1973) y Winblad (1978) no
difieren significativamente del de Bercovier (11).
En base a estos caracteres se han diferenciado 5 biogrupos. Existe
una buena correspondencia entre algunos biogrupos y determinados
serotipos como por ejemplo el biogrupo 4 y el serotipo 03. El
biogrupo 5 est formado por cepas aisladas de lepridos y carecen
de nitrato reductasa siendo adems xilosa y trealosa negativas.
Y _ . enterocolitica se ha aislado de diferentes fuentes, aguas (15,16)
alimentos (17,18) y mltiples animales (19-28) y se conoce su
capacidad patgena para las chinchillas, particularmente las cepas
del biotipo 3 serotipo 01, 2a, 3; liebres, biotipo 5 serotipo 02a,
2b, 3 y hombre biotipo 4 serotipo 03, serotipos 08, 09 y otros.
(Tabla 6).
Aparte la correlacin entre los serotipos y la capacidad patgena
cabe sealar la particular distribucin de los serotipos patgenos
para el hombre 03 en Europa, Canad y Sudfrica, 09 en Europa y
08 en USA (29-35). Las cepas patgenas del biogrupo 1, esculina
negativas, se han aislado en USA.
En 1986 ha sido publicado un trabajo en el que se descubre el
aislamiento en 15 pacientes con diversos cuadros clnicos de Y.
enterocolitica del serogrupo 0:8 en Holanda. Esta constituye la
primera referencia de aislamiento de este serogrupo en Europa
(36).
-13-
Pruebas Biotipos
1 2 3 4 5
Lipasa +
DNasa - -
a
-
a
Indol + + - - -
D-xilosa + + + - -
a
Sacarosa + + + + V
D-trealosa + + + + -
Nitratorreductasa + + + + -
Tabla 5. Esquema de biotipado de _ Y . enterocolitica segn Bercover
et al. (13).
+: Positivo; -: Negativo; V: Variable.
En algunas cepas la reaccin se positiviza tardamente a las 72 h.
-14-
Serogrupos
Biotipo 1 08; 013a,13b; 018; 020; 021; 04,32*
Biotipo 2 09; 05,27; 027
Biotipo 3 01,2a,3; 05,27
Biotipo 4 03
Tabla 6. Correlacin entre biotipos y serogrupos de Y. enterocolitica en
cepas de inters mdico.
* Estos serogrupos corresponden a cepas esculina negativa del
biotipo 1.
-15-
Yersinia intermedia
Un grupo de cepas del gnero Yersinia, maltosa, xilosa, trealosa,
celobiosa, sacarosa, ramnosa, melibiosa, rafinosa y
alfa-metil-glucsido positivas, alguna de las cuales crecen en
citrato de Simmons, son ODC positivas e indolgenas conforman una
especie _ Y. intermedia en base a los datos genticos aportados por
Brenner et al. (37).
En la tabla 7 se sealan los cara'cteres bioqumicos de esta especie.
Los caracteres de _ Y. intermedia son ms dependientes de la
temperatura que los de _ Y. enterocolitica, con mayor expresividad
entre 22-289 que a 35-379 C.
Se ha propuesto un esquema de biotipado en base al estudio de
D-melibiosa,L-ramnosa, alfa-metil-glucsido, D-rafinosa y citrato de
Simmons. Hay que tener en cuenta, segn lo dicho, que los
caracteres de crecimiento en citrato de Simmons, ramnosa y
rafinosa son muy dependientes de la temperatura expresndose a
289C. Ocasionalmente cepas de _ Y. frederiksenii pueden ser citrato
positivo y rafinosa positiva as como \_. enterocolitica puede ser
rafinosa, alfa-metil-glucsido, melibiosa o citrato de Simmons
positivo. Por otra parte _ Y. intermedia puede ser ramnosa o
melibiosa negativa.
Como los esquemas antignicos como el desarrollado por Wauters, se
basan en el estudio de cepas tpicas no es de extraar que muchas
cepas de Y. intermedia sean no tipables en base a ese esquema.
Los serogrupos 04 y 017 son los predominantes en esta especie
aunque se han detectado 25 serogrupos ms representados en ella.
Las cepas se han detectado en Europa, Canad, USA, Japn y
Australia. Se aislan en aguas, peces e invertebrados,
particularmente marinos, aunque tambin se han aislado de
roedores y alimentos. Tambin se han aislado del hombre (heces y
otras fuentes) (2 6).
-16-
biotipado
VP ODC Mal Cel Sac Ram* Mel* Raf a-m-g* Cit S Biotipos
+ + + + + + + + + + 1
+ + + + + + + + + - 2
+ + + + + + + + - + 3
+ + + + + - + + + + 4
+ + + + + - + + - V 5
( 6 9 %)
( 20 %)
( )
( 3%)
( 2%)
6 ( 1 %)
7 ( 1 %)
8 ( 1 %)
Tabla 7
Caracteres bioqumicos mnimos de ^Y. intermedia. En base a los cinco
ltimos caracteres expuestos en esta tabla (Ram, Mel, Raf, A-mg,
Cit.S) se definen 8 biotipos*. Todas las cepas de Y _ . intermedia poseen
2 de 3 caracteres definitorios positivos: ramnosa, melibiosa y
alfa-metil-glucsico, lo que permite diferenciar los biotipos de \_ .
intermedia de _ Y. frederiksenii. (a) Tanto por ciento de incidencia de
los biotipos.
+: Positivo; -: Negativo; V: Variable. VP: Voges-Proskauer. ODC:
Ornitina decarboxilasa. Mal: maltosa. Cel: celobiosa. Sac: sacarosa.
Ram: ramnosa. Mel: melibiosa. Raf: rafinosa. a-m-g:
alfa-metil-glucsido. Cit.S.: Citrato de Simmons.
-1 7-
Yersinia frederiksenii.
Esta especie se caracteriza por ser maltosa, xilosa, trealosa,
celobiosa, sacarosa y ramnosa positivas. Presenta una reaccin de
Voges-Proskauer positiva, crecimiento en citrato de Simmons
variable y ODC positiva (38).
En la tabla 8 se sealan los caracteres propios de esta especie. Se
han establecido cuatro biotipos en base a las reacciones en citrato
de Simmons y beta-xilosidasa.
La mayora de las cepas aisladas pertenecen a los serogrupos 016,
01, 02 y 010 y el resto a 16 diferentes serogrupos. El dos por
ciento de 201 cepas de la coleccin del Instituto Pasteur (Pars) no
eran tipables segn el esquema de Wauters.
Ampliamente distribuida en la naturaleza, se aisla del agua, peces
y del hombre, aunque tambin se aisla de ganado vacuno, cerdos y
roedores.
Esta especie con _ Y. intermedia se aisla en ambiente telrico del
agua pero no del suelo.
Las cepas bioqumicamente tpicas de Y _ . frederiksenii forman tres
grupos de hibridacin, sin embargo Ursing et al. (38) incluyen los
tres grupos en la especie ^. frederiksenii porque uno de los
grupos est formado por una sola cepa y por la homogeneidad
bioqumica de dichos grupos.
Yersina kristensenii.
Cepas de _ Y. enterocolitica "like", maltosa, xilosa, trealosa,
celobiosa positivas y sacarosa negativa, se han aislado de
numerosos medios incluyendo animales y el hombre y se han
clasificado como Y. kristensenii. (39).
-18-
VP ODC Mal Cel Sac Ram Mel Raf a-tn-g Cit.S.
+ + V Y _ . frederiksenii
+ + + - - V _ Y . intermdia
+ - Y^. enterocolitica 1-4
V - _ Y . enteriocolitica 5
(Tre-)
- - - - - - Y . kristensenii
V X
2
Y . aldovae)
Tabla 8
Caracteres bioqumicos mnimos de la especie V\ frederiksenii.
+ : positivo; -: negativo; V: variable.
VP: Voges-Proskauer. ODC: Ornitina decarboxilasa. Mal: maltosa. Cel:
celobiosa. Sac: sacarosa. Ram: ramnosa. Mel: melibiosa. Raf: rafinosa.
a-m-g: alfa-metil-glucsido. Cit.S.: Citrato de Simmons.
-19-
Los denominados grupos X- y X_ , as como algunas de las cepas
del biotipo 5 de _Y . enterocolitica tambin son sacarosa negativas.
Los caracteres bioqumicos de Y . kristensenii se sealan en la tabla
9.
El 66% de 115 cepas han sido aglutinables siendo los serogrupos
012, 028 y 011 los detectados con mayor frecuencia.
Estas cepas se aislan en medio telrico incluyendo el suelo y
aguas, alimentos, animales y vegetales.
Las cepas de _Y . kristensenii pertenecen a un slo grupo de
hibridacin y las cepas de _Y . enterocolitica biotipo 5 muestran el
mismo grado de relacin con ese grupo que con los biotipos 1-4 de
\_. enterocolitica.
Las cepas de _Y . kristensenii son VP negativo como X - , sacarosa
negativas como X. . , X _ y Y ^ . enterocolitica 5 de X. . , se diferencia
por la ODC de X_ por el VP, ramnosa y citrato de Simmons, y de
Y _. enterocolitica 5 por el VP, y nitratasa siendo este el nico
grupo trealosa negativo.
Otras especies de Y ersinia.
No es objeto de este trabajo el estudio de _Y . pestis, _Y .
pseudotuberculosis, _Y . philomiragia y _Y . ruckerii.
V\ pestis y Y ^ pseudotuberculosis (40) han presentado por
estudios de hibridacin de ADN una homologa muy elevada. En
base a esos datos as como a la similitud bioqumica (caracteres
diferenciales: movilidad, ureasa y ramnosa) y antignica se ha
propuesto que estos microorganismos sean tratados como
subespecies de una misma especie con la nomenclatura de
-20-
VP ODC Mal Cel Sac Ram Mel Raf a-m-g Cit.S.
V V
_ Y . kristensen
_ Y . enterocolitica 5
X
1
X
2
(Y . aldovae)
Tabla 9. Caracteres bioqumicos de Y _ . kristensen.
+ :positivo; -: negativo; V:variable.
VP: Voges-Proskauer. ODC:Ornitina decarboxilasa. Mal:maltosa.
Cel: celobiosa. Sac:sacarosa. Ram:ramnosa. Mel:melibiosa.
Raf: rafinosa. A-m-g: alfa-metil-glucsido. Cit.S.: Citrato de Simmons.
-21-
_ Y . pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis y _ Y .
pseudotuberculosis subsp. pests (en 1985 han recuperado su
terminologa antigua Int. J. Syst. Bacteriol. 1985, 3J5: 540).
_ Y . philomiragia es una espcie descrita en 1959 por Jensen, Owen
y Jellison (41) en base a una cepa aislada de una musaraa y otras
cuatro aisladas del medio ambiente. Aunque estas cepas muestran
un alto grado de relacin fenotpica y genotpica no presentan
relacin gentica con otras especies de Yersinia o incluso de la
familia Enterobacteriaceae o Pasteurella multocida. Ursing et al.
que han estudiado estas cepas proponen referirse a ellas hasta
nuevos estudios como la bacteria "Philomiragia
11
(42). Su inicial
ubicacin en el grupo se debi a la semejanza morfolgica (Gram) y
cierto grado de homologa del ADN con _ Y . pestis.
_ Y . ruckeri (43) causa la enfermedad denominada "red mouth" en
las truchas. Se ha aislado de estos peces nicamente en Amrica
del Norte. Crece ptimamente a 222C. Aunque posee caracteres
bioqumicos bastante alejados del resto de especies de Yersinia y
posee una capacidad patgena y distribucin geogrfica muy
precisa, se incluye en el gnero por su semejanza en contenido de
G+C y homologa del ADN. El microorganismo es LDC y ODC
positivas, carece de ureasa y la FDA y VP son negativos a 379C y
variable a 22QC, indol negativo, citrato de Simmons positivo y
beta-galactosidasa variable.
-22-
2. Estructura antignica
Tras los estudios iniciales de Knapp y Tha en 1963 y Winblad en
1968, Wauters y colaboradores propusieron en 1971 y 1972 un
esquema antignico para Yersinia incluyendo antgenos O y H.
(44,45).
Como consecuencia de los trabajos publicados en 1971 estos autores
proponen un esquema antignico que incluye 17 serogrupos O con
17 factores (uno de ellos subdividido en dos, ver ms abajo) y 16
serogrupos H con 16 factores antignicos (Tabla 10). Asimismo
demuestran la existencia de un antgeno termolbil de superficie
(K) denominado 1 asociado al serogrupo O10, que lo hace
inaglutinable (46).
Los factores O y K se expresan por nmeros arbigos y los H por
letras minsculas. Los tres primeros serogrupos que Winblad (47)
propuso como 1, 2, 3; 2, 3, y 3 fueron estudiados por estos
autores observando que la expresin de los factores antignicos
dependa de la temperatura de incubacin y que el segundo
serogrupo presentaba otro factor antignico al que denominaron 2b
(siendo el antgeno 2 de Winblad 2a) por lo que la frmula
antignica de esos grupos cuando las cepas respectivas se incuban
a 229C es: 1, 2a, (3); 2a, 2b, 3 y 3. El primer serogrupo a 222C
no produca aparentemente el factor 3 pero tras inoculacin daba
lugar a un antisuero anti 3 por lo que los autores lo sealan entre
parntesis. Cuando el estudio antignico se efectuaba a 299C las
frmulas de esos grupos eran 3; 2b, 3 y 3 respectivamente.
Las reacciones cruzadas entre \_. enterocolitica y otras especies
bacterianas se sealan en la tabla 11.
La reaccin cruzada se presenta entre ^. enterocolitica 0:9 y las
diferentes especies de brcela j. melitensis, J3. abortus, j3. suis
y B. neotomae, aunque existen diferencias cuantitativas entre ellas
siendo la reaccin ms intensa con j3. abortus (48-51).
-23-
Serogrupos O, K y H (1971)
0: 1, 2a, 3
0: 2a, 2b, 3
0: 3
0: 9
0: 15
0: 4
0: 5
0: 6
0: 7, 8
0: 8
0:10(1^)
0:11
0:12
0:13, 7
0:14
0:16
0:17
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
H:
abc
ab
be
(b), c
b, e, f, i
b, c, d, e,
a, b, d, g, i
d, e, f. g, h
be, fi
b, (f)k
I
o
n
m
P
q
Serogrupos 0, K, H (1972)
0: 5, 27
0: 18
0: 20
0: 21
0: 22
0: 28
0: 34
H:
H:
H:
r
s
t
Tabla 10. Serogrupos O, H y K de _ Y . enterocolitica. Tornado de
Wauters, Le Minor y Chaln (1971 y 1972) modificado. Se sealan 17
serogrupos O formados por 17 factores, uno de ellos subdividido en dos
subfactores (2a, 2b) y 16 serogrupos H formados por 16 factores. El
antgeno K. detectado en el serogrupo 010 es termolbil (fimbria). El
serogrupo 05 es desdoblado en 1972 en dos 05 y 05,27 (ver texto).
-24-
Y. enterocolitica 0:9 Brucella
Y. enterocolitica 0:9 Salmonella urbana 0:30
Y. enterocolitica 0:9
Y. enterocolitica 0:12,25
Y. enterocolitica 0: 46
Morganella morganii 0:43
Salmonella bergen 0:17
Morganella morganii 0:44
Y. pseudotuberculosis IV
Tabla 11. Reacciones cruzadas de los antgenos O de Yersnia con
Brucella y otras Enterobacteriaceae.
-25-
Tambin sealan la presencia de reacciones cruzadas menores entre
antgenos somticos de Yersinia y Salmonella 0:9, con 0:30; 0:12,
25 con 0:17(H b,e,f,i con H k; H b,e,f,i con H z5; H b,c,d,e,i
con H z44).
En 1972el grupo de Lovaina y Paris modifican y amplan el
esquema antighico subdividiendo el grupo 05 en dos subgrupos 05
y 05,27 (en correlacin con asociacin a diferentes serogrupos H y
biotipos: 1 y 2 respectivamente) incluyen los nuevos grupos 018,
020, 021, 022, 028y 034 y los Hr, Hs y Ht (Tabla 10).
En 1981 Wauters publica un esquema antignico ampliado (52). En
ese momento ya son conocidos los diversos biotipos de Y.
enterocolitica y se han propuesto tres nuevas especies para el
grupo ^ Y enterocolitica "like", por lo que se forman dos corrientes
de opinin, aquellos que como el propio Wauters proponen mantener
un esquema antignico comn, como se ha mantenido para el gnero
Klebsiella o Salmonella y los que proponen segregar los esquemas
para cada especie o incluso biotipos.
En los grupos 011 y 012 se detectan factores adicionales
denominados 23, 24, 25 y 26 y en los grupos 016, 06 y 04, se
detectan factores accesorios menores denominados 29, 30, 31, 32y
33.
El factor 034 descrito en 1972 es idntico al 010 por lo que se
propone la supresin de aquel.
Asimismo se descubren nuevos factores O, detectados
principalmente de cepas aisladas del ambiente, denominadas con los
numerales 35 a 57.
Existen en las colecciones numerosas cepas con nuevos factores O,
que no han sido investigados desde el punto de vista de su
estructura antignica flagelar.
-26-
En adicin al factor K-, se han descrito nuevos factores K, cuya
naturaleza no es conocida, denominados K_ a K_ , que se detectan
con ms frecuencia entre las cepas telricas de _ Y . intermedia.
Existen en diversas colecciones, cepas con antgenos de tipo K que
no han sido an estudiados.
Aunque stos (K) pueden presentarse asociados a diversos factores
O las asociaciones en las cepas de referencia son 010:K 08:K
2
;
05 6 -. K 05 7: K; 039: K
C
; 05 2: K
C
.
J 4 3 O
La movilidad de _ Y . enterocolitica vara de acuerdo a sus biotipos,
las cepas del biotipo 1, son usualmente muy mviles, mientras que
las pertenecientes al biotipo 4 y an ms al 5, suelen ser poco
mviles. La temperatura de incubacin desempea un papel
importante en la expresin genotpica de la movilidad, siendo la
mayora de las cepas inmviles a 379C, por lo que la movilidad
debe ser estudiada a 252C y tras sucesivos pases en agar blando.
Aunque los grupos antignicos H son complejos (Tabla 10) pueden
establecerse algunas reglas. As las cepas de los biotipos 2, 3, 4y
5 slo poseen factores a, b y c en diversas combinaciones. Las
cepas del biotipo 1 poseen patrones complejos formados por los
factores de a a k con las frmulas H muy diversificadas incluso
dentro de un nico grupo O. Las cepas de _ Y . intermedia, Y .
kristensenii y Y . frederiksenii no comparten factores antignicos
con _ Y . enterocolitica.
En 1983 Thomas et al. (5 3) estudian las relaciones antignicas
entre _ Y . enterocolitica y JE. coli, salmonela y shigela. Los serotipos
estudiados por esos autores incluyen los 01 a 034 de _ Y .
enterocolitica, los 01 a 016 4de JE. coli, todos los serotipos
establecidos y provisionales de Shigella y los antgenos de
Salmonella 01 a 06 7, detectndose diversas reacciones antignicas
cruzadas. Los antgenos somticos de _ Y . enterocolitica 05 ,27 y 011
fueron idnticos a los de E. coli 097 y 098 respectivamente.
-27-
Aunque confirman las reacciones cruzadas sealadas por Wauters et
al. entre Y\ enterocolitica 012 y Salmonella 047 esta reaccin se
daba a ttulo bajo as como la detectada entre Y_ . enterocolitica 021
y Salmonella OU.
En 1984 Aleksic y Bockemhl proponen un esquema antignico para
_ Y. enterocolitica (54) tras el estudio de 585 cepas de Y_ .
enterocolitica, 43 de _ Y. kristensenii, 40 de _ Y. frederiksenii y 25
de _ Y. intermedia. En ese trabajo muestran que los antgenos
011,23; 011,24; 0:12,25, 0:12,26; 0:12,28 se asocian exclusivamente
a _ Y. kristensenii, el 0:16 a _ Y. kristensenii y _ Y. frederiksenii', los
0:4,33 y 0:17 a _ Y. intermedia, mientras los restantes serogrupos
se asocian a _ Y. enterocolitica.
Asimismo los factores H I, r, s y t son caractersticos de Y.
kristensenii, el p de \_. frederiksenii, el q de _ Y. intermedia y el o
de _ Y. kristensenii, _ Y. frederiksenii y _ Y. intermedia. Los
restantes de a a k, m y n se hallan en _ Y. enterocolitica en
diversas combinaciones, con gran variabilidad (hasta 15 serogrupos
H) para un mismo serogrupo O. Los autores proponen un nuevo
factor H denominado u. En general sugieren la exclusin de los
antgenos O y H no asociados a _ Y. enterocolitica, a diferencia de
los propuesto por Wauters y proponen formalmente un esquema
antignico O simplicado para _ Y. enterocolitica (Tabla 12).
En la discusin particular de sus hallazgos sealan algunos
aspectos de inters.
A pesar de estudiar las cepas de coleccin I. P. 135 y I.P. 178
que poseen los factores 1, 2a y 2b a 229C, los autores encuentran
estos antgenos de expresin dbil e irregular y como seal
Wauters desaparecen tras incubacin a 282C, por ello los autores
proponen combinar los 3 primeros serogrupos del esquema de
Wauters en uno solo con frmula 0:3. Las importantes diferencias
epidemiolgicas entre ellos podran establecerse en base al biotipo
(biotipos 3, 5 y 4 respectivamente). Confirman la identidad entre
0:10 y 0:34.
-28-
Antgeno O Cepa de referencia
3
4, (32)
5
5,27
6, (30)
6, (31)
7,8
8
9
10
13, (7)
14
15
18
19,8
20
21
22
IP 134
IP 96
IP 123
IP 885
IP 102
IP 1477
IP 106
IP 161
IP 383
IP 500
IP 553
IP 480
IP 614
IP 846
IP 842
IP 841
IP 1110
IP 1367
Tabla 12
Esquema antignlco de Aleksic y Bockemuthl (54) para _ Y . enterocolitica.
Los factores entre parntesis pueden estar ausentes.
-29-
Muestran \a presencia de reaccin cruzada entre los serogrupos
0:13 y 0:18 que ha sido posteriormente precisada. El antgeno 29 lo
consideran con una alta reaccin cruzada con el 16 (al que se
asocia para formar el grupo 0:16, 29) hasta el extremo de que
proponen su supresin.
Por lo que respecta a los antgenos H sealan reacciones cruzadas
entre los factores o, p, q y u as como entre el factor a de >.
paratyphi A y el factor g de V\ enterocolitica.
Existe un tanto por ciento de cepas, particularmente telricas que
no pueden ser tipadas con los sueros disponibles, aunque hay que
destacar que los autores no utilizan los antisueros frente a los
serogrupos 0:35 a 0:57 de Wauters.
El estudio antignico de Yersinia no se ha efectuado con el detalle
que se ha realizado en otras enterobacterias y en especial en
Salmonella o _ E. coli donde se conocen bien numerosos subfactores,
su estructura qumica e incluso su codificacin gentica que
depende en algunos de ellos de lisogenizacin.
No es de extraar por ello que los actuales esquemas serolgicos
sufran modificaciones. Recientemente Toma et al. (55) han
recaracterizado los serotipos 0:7,13; 0:18; 0:44 y 0:44, 45
reconvirtindolos en 0:7,13a,13b; 0:18,13b; 0:44, 13a y
0:44,13a,45.
-30-
3. Aislamiento. Tcnicas y medios de cultivo
Las tcnicas de aislamiento de Yersinia son las usuales para
enterobacterias en lo que respecta a recogida y transporte de las
muestras (56).
Para muestras clnicas existen datos objetivos de que el medio de
Cary y Blair es adecuado para el transporte (57) aunque
probablemente lo son otros medios que preserven de la desecacin,
modificaciones de pH y sobrecrecimiento bacteriano. En el caso
especfico de Yersinia, como sucede con otras enterobacterias un
medio tamponado glicerinado resulta adecuado para el transporte y
conservacin de las heces.
Las heces y exudados de origen diverso se recogen en medio de
transporte de modo habitual. El resto de muestras clnicas tambin
debe recogerse segn tcnicas convencionales. Los tejidos de
bipsia y material quirrgico deben transportarse manteniendo la
humedad, para lo que es suficiente incluirlos en un recipiente
estril que cierre hermticamente y al que se haya aadido unas
gotas de suero salino estril.
Las muestras de alimentos y tierras pueden recogerse en
recipientes de plstico estriles, las aguas en botellas estriles.
Para procesar las muestras clnicas debe seguirse las tcnicas
usuales en bacteriologa mdica utilizando los medios selectivos y de
enriquecimiento adecuados.
Los alimentos slidos o semislidos son triturados estrilmente con
homogenizador, los lquidos pueden ser filtrados o centrifugados
(lquidos ms viscosos no filtrables) sembrando directamente en
placas y enriqueciendo en fro incorporando el material al medio
lquido en la proporcin 1/9.
-31-
Las aguas deben ser filtradas a travs de dos filtros de 0,45 m.
(100 mi por membrana), uno para siembra directa y otro para
enriquecimiento.
Las tierras deben ser suspendidas a razn de 20 g/100 mi de agua
destilada con 0,5% Tween 80 agitando durante 1 hora en un
agitador rotatorio, dejando sedimentar despus las partculas
(5-1 Om) y pasando 10 mi de sobrenadante a 90 mi de medio de
enriquecimiento.
Medios de cultivo
Existen diversos medios de cultivo adecuados para el aislamiento de
Yersinia. Entre los convencionales para enterobacterias el medio de
Mac Conkey (Mac.C.) y el de Salmonela-Shigela (SS) son
particularmente adecuados. Wauters (58) recomienda la utilizacin
de SS al que se ha incrementado la concentracin de deoxicolato
sdico en 2 g por 100 mi.
Se han diseado diversos medios con mayor o menor carcter
diferencial y selectivo, entre ellos medios con pectina como el
propuesto por Bowen et al. (59) el medio de celobiosa, arginina,
lisina propuesto por Dudley et al ( 60), el agar oxalato sdico de
Soltsz et al (61) y el agar cefsulodin, irgasan, novobiocina
diseado por Schiemann (CIN) (62).
Tambin se han recomendado diversos medios de enriquecimiento
entre ellos el medio de selenito F (63), caldo gramnegativos, el
medio de Rappaport modificado por la adicin de carbenicilina (1
mg/l) y el enriquecimiento en fri a 4-62C durante 3 semanas en
lampn fosfato cuando se asume como en las heces que la muestra
aporta suficientes nutrientes o alternativamente en caldo triptosa.
Despus de la incubacin pueden utilizarse diversos medios poco
selectivos como el MacC o muy selectivos como el CIN.
-32-
El caldo sorbitol-sales biliares propuesto por Mehlman consiste en
una solucin tamponada con sorbitol y sales biliares y la
modificacin propuesta por Aulisio incorpora peptona. Este medio
ha sido utilizado para el enriquecimiento de alimentos y aguas (64).
El medio con pectina de Bowen et al. posee fundamentalmente
capacidad diferencial siendo escasamente selectivo. El medio de
celobiosa argimna-lisina, es un medio poco selectivo, accin que
depende del deoxicolato sdico, el medio Y de Soltesz incorpora
sales biliares deoxicolato sdico y oxalato sdico como elementos
selectivos y lactosa como sustrato diferencial. El medio de
Schiemann utiliza cefsulodin e irgasan como elementos selectivos y
manitol como sustrato diferencial.
Aunque existen numerosos datos acerca de la eficacia del
enriquecimiento en fro para la recuperacin de yersinias, el
incremento en el nmero de cepas aisladas se hace a expensas de
especies o serotipos de _ Y. enterocolitica considerados no patgenos
para el hombre, no obtenindose incrementos significativos de
cepas con _ Y. enterocolitica 0:3 en casos de enteritis aguda,
aunque si se obtiene un incremento en sujetos con va lese entes o
sanos (65-68).
Aulisio et al. (69) han propuesto un mtodo para el aislamiento de
yersinias consistente en el tratamiento de la muestra, en su caso
alimento, con una solucin de KOH al 0,5% con cloruro sdico al
0,5%. Este mtodo consigue la decontaminacin de las muestras de
otras bacterias permitiendo tras un tratamiento breve de 120
segundos, la recuperacin de yersinia en cultivo puro, Weissfeld
(70) y Sonnenwirth aplicaron con xito este mtodo a las muestras
de heces. Otros autores como Ratnam et al. (71) aunque
consideran el mtodo til no obtienen mejores resultados que con el
enriquecimiento en fro, aunque los resultados son ms precoces.
Es evidente, sin embargo, que la precocidad se ve contrapesada
por la laboriosidad del mtodo.
-33-
La utilizacin de sondas para tcnicas de hibridacin de ADN
utilizando fragmentos de restriccin plasmidicas es una tcnica
prometedora para la deteccin de yersinia que poseen esos
fragmentos de ADN especficos de cepas patgenas (72).
-34-
* * Diagnstico serolgico.
El inters en el diagnstico serolgico de las infecciones por Y.
enterocolitica se inicia alrededor de 1970. Desde la dcada anterior
hasta 1975 las tcnicas ms utilizadas son las de aglutinacin en
tubo (tipo Widal) (73), a partir de 1976 y particularmente al inicio
de la dcada actual (1980) se introducen otras tcnicas como el
radioinmunoanlisis (74-76) y especialmente el enzimoinmunoanlisis
(77-81).
Para el diagnstico de la infeccin por yersinia hay que sealar
que los antgenos seleccionados en cada laboratorio, deben serlo en
funcin de la epidemiologa local. En efecto es bien sabido que en
Europa se aislan los serogrupos 03 y 09 de Y. enterocolitica el
primero de los cuales se detecta tambin en Canad y Japn (as
como en otros pases) el serotipo 09 se detecta en los pases
septentrionales de Europa (Finlanda, Escandinavia, Pases Bajos)
pero no parece detectarse en la Europa Meridional. En U.S.A., por
el contrario, se aisla el serogrupo O8 de _ Y. enterocolitica.
As pues, aparte la seleccin de un antgeno especfico para un
estudio particular, de modo regular deben seleccionarse para el
diagnstico serolgico de la infeccin por _ Y. enterocolitica
antgenos prevalentes en el rea geogrfica estudiada.
Uno de los primeros estudios serolgicos efectuados para el
diagnstico de las infecciones por _ Y. enterocolitica fue realizado
por Winblad, Nilhn y Sternby (82).
Estos autores estudian por tcnica de aglutinacin, utilizando la
cepa "Winblad", aislada por Carlsson et al. en 1964, 431 sueros de
donantes de sangre sanos, 1351 pacientes hospitalizados cuyos
sueros fueron remitidos rutinariamente para el estudio de serologa
lutica, as como 148 pacientes afectos de enteritis aguda o crnica
(colitis ulcerosa), 22 pacientes con enfermedad de Crohn y 95
-35-
pacientes a pend icectom izados de los que 45 fueron verdaderas
apendicitis y el resto ileitis terminal aguda asociada a linfadenitis
mesentrica, 8 con formas limitadas de linfadenitis y 17 sin lesiones
patolgicas.
Los resultados obtenidos pueden resumirse constatando que los
autores encontraron ttulos ms altos en las segundas muestras, del
grupo de pacientes con cuadros agudos, con los siguientes
resultados: ttulos superiores a 1/ 80 en el 70% de las linfadenitis,
con o sin ileitis terminal, 18% en el grupo de apendicectomizados
sin lesiones, 15% en los pacientes con verdaderas apendicitis, 5% en
los pacientes con enteritis aguda o crnica (Crohn o colitis
ulcerosa) y 3% en los pacientes de control (donantes de sangre,
controles de les).
Otro mtodo serolgico utilizado ha sido la hemaglutinacin pasiva
(83- 86) y la tcnica del inmunoblot (87). Maelland y Digranes (84)
han mostrado estudiando 200 sueros de donantes de sangre y de 5
pacientes con infecciones probadas por V\ enterocolitica 0:3, que
en la poblacin normal noruega se detectan anticuerpos
hemaglutinantes frente a los antgenos 0:3 y 0:9 hasta ttulos de
1/ 512 (0:3: ttulos de 1/4 1/ 8, en 14 personas 1/16-1/32, en 103;
1/ 64- 1/ 128 en 73; 1/ 256- 1/ 512 en 10 personas 0:9: ttulos de
1/4-1/8 en 37 personas; 1/16-1/32 en 123; 1/ 64-1/ 128 en 38;
1/ 256- 1/ 512 en 2 personas). Los sueros de los pacientes frente a
0:9 varan de 1/ 32 a 1/ 256 y frente a 0:3 (serotipo infectante) de
1/ 512 a 1/ 2048.
Estos autores fueron capaces de demostrar, sin embargo, que los
anticuerpos frente a 0:9 y 0:3 de los donantes podan ser
adsorbidos en prcticamente la totalidad de los casos por el
antgeno comn de las enterobacterias, obtenindose en todos una
buena especificidad de la prueba.
-36-
5. Marcadores de patogenicidad
Los mecanismos de patogenicidad en Y\ enterocolitica no son
conocidos en profundidad. Sin embargo, una serie de caracteres
fenotpicos codificados por un plsmido de 45 Md se asocian a la
patogenicidad. La prdida de dicho plsmido y por tanto de los
caracteres que codifica da lugar a bacterias desprovistas de
patogenicidad.
Esos caracteres fenotpicos son un antgeno proteico denominado
Vw (88,89), que en la actualidad se considera formado por una
nica protena, V de 40.000 d, ya que el supuesto antgeno W
descrito como una lipoproteina de 140000 d corresponda en realidad
a un lipopolisacrido (90), un conjunto de poiipptidos de la
membrana externa denominados YOPs (Yersinia Outer Proteins) de
los que se han descrito hasta veinte en la actualidad (91).
La demostracin de la presencia de los factores de patogenicidad
puede hacerse por diversos mtodos, unos directos detectando la
presencia del plsmido Vw por electroforesis, la produccin de la
protena V por precipitacin en gel o de las protenas denominadas
YOPs por diversas tcnicas como la electroforesis o western blot.
Sin embargo, estos mtodos son poco tiles en el estudio rutinario
de la patogenicidad debido a la complejidad de las tcnicas
involucradas.
Existen pruebas indirectas de la presencia del plsmido Vw y de
los caracteres fenotpicos que codifica. Entre ellos los ms
utilizados son la calcio dependencia (92-95)y la autoaglutinacin
(96-102).
La calcio dependencia es un fenmeno de inhibicin del crecimiento
que se da en las cepas portadoras del plsmido de patogenicidad
por el cual se inhibe su crecimiento en ausencia de calcio a 379C
en tanto que crecen bien a esa temperatura cuando existe
-37-
suficiente cantidad de calcio en el medio. Esta dependencia no se
produce a 282C, temperatura a la que se produce crecimiento de
las clulas Vw .
Otro fenmeno dependiente de dicho plsmido es el de la
autoaglutinacin de las clulas Vw que se produce cuando son
cultivadas a 3 7 Q C y no a 289C en un medio lquido como el de
Clark y Lubs.
Ambas pruebas han sido empleadas como criterio de patogenicidad
de las cepas aisladas y se correlacionan con la capacidad patgena
"in vivo".
Recientemente Kandolo y Wauters (103 ) han demostrado que la
actividad pirazinamidasa a 282C se asocia a las cepas no patgenas
en tanto que las patgenas carecen de este fenotipo.
La produccin de acido pirazinoico por accin de la pirazina
carboxilamidasa puede detectarse en un medio con pirazinamida en
presencia de sales ferrosas.
Un hecho interesante de este fenmeno es que la presencia del
fenotipo negativo en los grupos patgenos no se modifica por la
prdida del plsmido Vw. Por el contrario la inclusin de un
plsmido de patogenicidad en una cepa apatgena tampoco modifica
su carcter de positividad previa.
En base a los estudios clnicos y de patogenicidad experimental y
su correlacin con los factores sealados se han determinado como
patgenos los siguientes bioserotipos: _ Y . enterocolitica, biotipo 1
(cepas esculina negativas), serogrupos: 08; 013a,13b; 018; 020;
021; 04,3 2; biotipo 2 serogrupos: 09 y 05,27 ; biotipo 3 serotipo
01,2,3 y 05,27 y biotipo 4 serogrupo: 03. (Tabla 13).
-38-
Y. enterocolitica
Biotipo Serogrupo
1 4,32; 8; 13a,13b; 18; 20; 21*
2 5,2 7; 9
3 1,2,3; 5,27
1 3
Tabla 13
Serogrupos patgenos de _ Y. enterocolitica.
* Cepas esculina negativa
-39-
6. Sensibilidad a los antibiticos
La mayora de las cepas de Y. enterocolitica son resistentes a las
penicilinas y cefalosporinas por produccin de beta-Iactamasas.
Tambin son resistentes a eritromicina, bacitracina y novobiocina,
antibitico que se ha incorporado con el cefsulodin a algunos
medios selectivos (CIN) (104-107).
Esta especie es sensible a ceftazidima, moxalactam y
N-formimidoil-tienamicina {108-117).
Por el contrario la mayora de las cepas son sensibles a
cloramfenicol, y tetraciclinas, que constituye uno de los
medicamentos de eleccin en las infecciones de localizacin entrica,
aminoglicsidos que constituyen con el cloramfenicol los
medicamentos de eleccin de las formas septicmicas y al
co-trimoxazol que tambin se utiliza en las infecciones entricas
(118).
Se ha sealado la mayor sensibilidad de _ Y. kristenseni a ampicilina
y carbenicilina, como carcter diferencial respecto a otras especies
de Yersinia (119,120).
-40-
7. Manifestaciones clnicas
Yersinia enterocolitica puede causar cuadros de enterocolitis,
adenitis mesentrica, ileitis terminal, artritis reactiva, eritema
nodoso y septicemias con abscesos hepatoesplnicos (121-132). Las
formas clnicas de las infecciones por Y. enterocolitica varan
segn la edad, sexo y estado inmunitario del husped (Tablas 14 a
16).
Se han descrito casos de portadores asintomticos y se han
publicado brotes epidmicos (133-136), intrafamiliares (137-139) o
nosocomiales (140,111).
Gastroenteritis. - Es la manifestacin clnica ms frecuente
(121-128,142) de la infeccin digestiva por _ Y. enterocolitica, que
aparece en el 50-60% de los casos. Suele afectar con mayor
frecuencia a lactantes y nios de menos de 5 aos (edad media 24
m) sin que haya diferencias significativas en cuanto al sexo.
Este cuadro a menudo indistinguible del causado por otros
enteropatgenos enteroinvasivos como Shigella o Salmonella se
caracteriza por fiebre (4 0%), diarrea (80-90%) y dolor abdominal
(25 -70%). Ocasionalmente aparecen nauseas y lo vmitos).
El perodo de incubacin, tras la contaminacin oral, oscila entre 3
y 10 das. En general el inicio de la diarrea es muy agudo, con
6-8 deposiciones al da, casi siempre lquidas y que a veces se
acompaan de moco o sangre (10-25%) y leucocitosis fecal (60-80%).
Durante los primeros das es frecuente la presencia de fiebre
(38-38' 5 %) y de dolor abdominal difuso o localizado en epigastrio o
fosa ilaca derecha.
Una caracterstica que la distingue de otras gastroenteritis (143)
es la duracin relativamente prolongada de la diarrea. Aunque la
-41-
Edad Clnica
5 aos Gastroenteritis
5-15 aos Adenitis mesentrica
10-20 aos lleitis terminal
Adultos Gastroenteritis
Eritema nodoso
Artritis reactivas
Tabla 11
Presentaciones clnicas de la infeccin por Y _ . enterocolitica
relacionadas con la edad.
-42-
Mujeres Hombres
Gastroenteritis + +
Ileitis terminal + +
Adenitis mesentrica - ++
Artritis reactivas ++ +
Eritema nodoso ++
Tabla 15
Presentaciones clnicas de la infeccin por yersinia relacionadas con el
sexo.
-43-
HUSPED SANO
Formas clnicas:
Gastroenteritis
Adenitis mesentrica
Artritis reactivas
Eritema nodoso
HUSPED CON ENFERMEDAD DE BASE
(Diabetes, leucosis, hemocromatosis, insuficiencia renal, cirrosis,
hemopatas: talasemia, aplasia, anemia).
Formas clnicas:
. Septicemias
Abscesos hepatoesplnicos
Tabla 16
Formas clnicas de la infeccin por _ Y . enterocolitica segn la ausencia o
presencia de enfermedad de base.
-44-
intensidad y duracin de los sntomas es variable (de una a tres
semanas) casi siempre el cuadro se autolimita y resuelve
espontneamente en 6-10 das. Ocasionalmente y una vez resuelta la
diarrea puede persistir el dolor abdominal durante 1 mes.
Excepcionalmente se han descrito casos de diarreas crnicas (144)
y de enteritis con lceras intestinales mltiples (143),
perforaciones y peritonitis.
En nios desnutridos, con talasemia o disfuncin esplnica la
gastroenteritis puede complicarse con sepsis y/o abscesos
mestastsicos.
El diagnstico microbiologa) se basa en el aislamiento de ^ Y .
enterocolitica a partir del coprocultivo. En las enteritis causadas
por el serotipo 0:3 puede ser til el estudio serolgico. Las
seroaglutinaciones se positivizan al cabo de 6-10 das despus del
inicio de la infeccin, alcanzan su ttulo mximo a las 2-3 semanas
y posteriormente disminuyen progresivamente durante los meses
siguientes incluso si el paciente continua eliminando Y.
enterocolitica en las heces.
La excrecin fecal de _ Y . enterocolitica puede durar semanas
despus de la remisin de los sntomas. Sin embargo, no se han
descrito portadores asintomticos prolongados o crnicos.
lleitis terminal.- Esta forma clnica que simula una enfermedad
intestinal inflamatoria crnica (115) suele presentarse en
adolescentes o adultos jvenes. Se caracteriza por diarrea aguda o
crnica acompaada de dolor abdominal, que persiste o remite con
exacerbaciones durante semanas o meses. En estos casos el colon y
el len terminal pueden estar afectados por lesiones (146) que
tanto radiolgicamente como endoscpicamente pueden confundirse
con la enfermedad de Crohn (146-149). Los estudios radiolgicos
con bario (150,151), de las ileitis por Yersinia demuestran un
-45-
engrasamiento difuso de los pliegues de la mucosa con defectos
nodulares de llenado y lceras que se extienden en los 10-20 cm de
len terminal. En contraste con la enfermedad de Crohn no hay
estenosis fibrticas ni formacin de fstulas.
El diagnstico de la ileitis por Yersinia se basa en el aislamiento
del microorganismo de las heces o de la bipsia intestinal o en la
deteccin de anticuerpos especficos en el suero.
El seguimiento a largo plazo de los pacientes con ileitis por
Yersinia enterocolitica diagnosticada microbiolgica o
serolgicamente no ha demostrado que evolucione hacia una
enfermedad de Crohn; y al contrario, los pacientes con enfermedad
de Crohn no tienen evidencia microbiolgica ni serolgica de
infeccin por Yersinia (149). Sin embargo, las dos enfermedades
pueden darse simultneamente y las infecciones intercurrentes por
Yersinia enterocolitica, al igual que las producidas por otros
enteropatgenos, pueden desencadenar nuevos brotes en los
pacientes con enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa (145).
Adenitis mesentrica.- Este cuadro, a menudo indistinguible de una
apendicitis aguda (152-154) es ms frecuente en nios mayores o
adolescentes del sexo masculino. En general se caracteriza por
dolor abdominal en fosa ilaca derecha (155), con fiebre alta y
leucocitosis con desviacin a la izquierda. La enfermedad puede
iniciarse con sntomas inespecficos; cefalea, fiebre, artralgias o
diarrea seguido de dolor abdominal difuso que al cabo de horas o
pocos das se localiza en fosa ilaca derecha. A la exploracin
fsica, la palpacin del punto de McBurney es dolorosa con
hipersensibilidad de rebote. En algunos casos puede palparse una
masa dolorosa en esa zona que puede orientar el diagnstico (forma
pseudotumoral). Sin embargo, la mayora de las veces se
diagnostica de apendicitis y se efecta una laparotoma (156). En
estos casos el apndice casi siempre es normal o un poco enrojecido
-46-
con el ciego e leon terminal Inflamados, edematosos e hipermicos.
Los ganglios mesentricos ileocecales suelen estar muy aumentados
de tamao e inflamados as como el mesenterio que les rodea.
Tambin puede encontrarse lquido libre en poca cantidad en la
cavidad peritoneal.
El estudio histopatolgico de los ganglios muestra una inflamacin
aguda con hiperplasia folicular y a veces con microabscesos.
El diagnstico especfico puede hacerse por aislamiento del
microorganismo directamente de la bipsia del ganglio y/o de las
heces. Tambin es til el diagnstico serolgico.
Artritis.- En los ltimos aos se han descrito mltiples casos de
artritis no purulentas en individuos jvenes asociadas a la infeccin
P
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s
'
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a
enterocolitica (34, 157-159). De hecho en algunos
pases, parece ser una de las causas principales de artritis
reactivas. Sin embargo, su frecuencia es muy variable en distintas
reas, as es frecuente en los pases escandinavos y es raro en G.
Bretaa o en los Estados Unidos. La artritis reactiva por Yersinia
al igual que las producidas por Salmonella o Shigella y que todas
las artritis seronegativas (espondilitis anquilopoytca, artritis
psorisica, sndrome de Reiter, etc. ) se asocia con mayor
frecuencia al antgeno de histocompatibilidad HLA-B27.
En Finlandia se ha visto que el 80% de los pacientes con artritis
por Yersinia son HLA B-27 positivos, lo que significa que los
individuos con dicho antgeno tienen un riesgo de desarrollar
artritis 25 veces superior que los individuos HLA-B27 negativos
(159).
Tambin se ha visto que los pacientes HLA B27 negativos con
artritis, tienen los sntomas ms leves, durante menos tiempo, se
afectan menos articulaciones y raramente presentan manifestaciones
-47-
extraarticulares (conjuntivitis, uretritis y carditis). Al contrario
los pacientes con artritis por _ Y . enterocolitica asociada al eritema
nodoso casi nunca tienen el HLA-B27 positivo.
La mayora de los casos con artritis por Y ersinia refieren haber
presentado previamente (de 1 a 6 semanas) un cuadro diarreico
acompaado de otros sntomas generales como astenia, fiebre o
febrcula, cefalea, artromialgias, dolores abdominales y que muchas
veces se confunden con un cuadro gripal.
El inicio de la clnica articular suele ser agudo y se acompaa de
fiebre y una poliartritis asimtrica que puede afectar caderas,
rodillas, tobillos, dedos y muecas. Puede ser monoarticular (160)
pero lo ms frecuente es que se afecten dos o ms articulaciones
simultnea o sucesivamente en un perodo que va de los 2 a los 20
das (161-163).
Clnicamente se manifiesta con dolor e impotencia funcional de las
articulaciones afectadas, que pueden estar tumefactas y con calor
local. Es frecuente la aparicin de un derrame articular que
muestra una pleocitosis discreta ( 4. 25.000 cels/mm ) con un
60-90% de polimorfonucleares. Adems de los sntomas inflamatorios
de las articulaciones con artritis, no es raro que los pacientes
refieran artralgias en varias articulaciones y que pueden ser
migratorias.
Los pacientes con artritis por _ Y . enterocolitica pueden presentar
concomitantemente otras manifestaciones extraarticulares en general
de buen pronstico. As, un 5-10% pueden presentar carditis
benignas (164), iritis y/o conjuntivitis en el 10-15% (165) y
anormalidades nefrourolgicas en el 5-20%. Aproximadamente un 5%
de los pacientes desarrollan un sndrome de Reiter (artritis,
conjuntivitis y uretritis) durante la fase aguda de la artritis
(166-168). El eritema nodoso se asocia en un 4-10% de los casos
(159 ).
-48-
Los sntomas de la artritis persisten unas 4 semanas (60%) y en
algunos casos (20-30%) pueden durar hasta 4 meses o ms. Las
artralgias prolongadas son frecuentes y algunos pacientes pueden
presentar nuevos brotes de artritis reactivas en los meses o aos
sucesivos.
El diagnstico definitivo se basa en el aislamiento del
microorganismo o la aparicin de anticuerpos especficos (169-170).
El coprocultivo puede ser positivo incluso en ausencia de diarrea
durante las 2 primeras semanas del inicio de los sntomas. El
cultivo del lquido sinovia! nunca es positivo.
Los anticuerpos especficos aparecen a los pocos das del inicio del
cuadro y generalmente desaparecen entre los 2 y 6 meses (80).
Eritema nodoso y otras manifestaciones cutneas.- Las lesiones
caractersticas del eritema nodoso pueden aparecer
concomitantemente o al cabo de unos das de un sndrome febril
acompaado o no de gastroenteritis o dolor abdominal (34). Las
lesiones eritematosas nodulares y dolorosas (171) suelen localizarse
en las piernas y brazos pero tambin pueden afectarse las manos,
pies y cuello. Es frecuente que se acompae de artralgias y puede
asociarse a artritis reactiva (4%) (153,159).
El eritema nodoso es ms frecuente en el sexo femenino y el 50% de
los casos aparece en edades superiores a los 40 aos (171). En
general, se resuelve antes de un mes aunque en algunos casos
puede recidivar.
El diagnstico es bsicamente serolgico o ms raramente por
aislamiento de Y. enterocolitica a partir del coprocultivo.
Tambin se han descrito otras manifestaciones cutneas como rash
maculo-papular, eritema multiforme en el curso de una infeccin
por Y. enterocolitica (172,173).
-49-
Septicemia.- Las sepsis por _ Y . enterocolitica son raras y se han
descrito casi exclusivamente en pacientes inmunodeprimidos
(diabetes, cirrosis heptica, hemopatas, neoplasias, leucosis,
hemocromatosis, ancianos) (174-179).
Esta forma clnica, que es la ms grave con una mortalidad del 50%
puede manifestarse como una sepsis aguda con fiebre alta (180),
dolor abdominal y diarrea, a veces muy parecida a una fiebre
tifoidea. Es ms frecuente la aparicin de metstasis spticas
hepticas, esplnicas (181,182), urinarias, pleurales (183),
osteoarticulares (181) o meningocerebrales. El diagnstico etiolgico
en estos casos se basa en el aislamiento de Y . enterocolitica del
hemocultivo y del pus de los abscesos metastsicos.
Manifestaciones poco frecuentes.- Se han descrito epidemias de
faringoamigdalitis purulentas (185) en las que se ha aislado Y .
enterocolitica del frotis farngeo o de la bipsia amigdalar (186).
Otras afectaciones ms raras son miocarditis (121,187), endocarditis
(188,189), uretritis (121), glomerulonefritis (121,190), mielitis y
polineuritis (191), linfadenitis supurada (192,193), neumona y
absceso pulmonar (194), peritonitis (195), hepatitis (196,197),
vulvovaginitis (198).
La manifestacin ms frecuente de la infeccin por _ Y .
pseudotuberculoss en el hombre es la adenitis mesentrica
(199-201) con clnica de pseudoapendicitis (202,203). Tambin
puede causar eritema nodoso, poliartritis y ms raramente
gastroenteritis. Las formas septicmicas (204-206) al igual que las
producidas por _ Y . enterocolitica son muy graves con una
mortalidad del 75% y aparecen casi exclusivamente en los pacientes
con una enfermedad de base inmunosupresora.
-50-
8. Tratamiento
_ Y . enterocolitica suele ser sensible in vitro a los aminoglucosidos,
cloramfenicol, tetraciclinas, cotrimoxazol y cefalosporinas de tercera
generacin. Casi siempre es resistente a penicilina, ampicilina,
carbenicilina y cefalosporinas de primera generacin.
El tratamiento antibitico en las infecciones por _ Y . enterocolitica
est muy controvertido ya que en general suelen ser autolimitadas
y evolucionan independientemente del tratamiento. De hecho aunque
se han descrito xitos teraputicos con diversos regmenes, la
droga de eleccin no se ha establecido y no existen estudios
controlados que demuestren una mayor eficacia con uno u otro
antibitico o sin ellos (126).
Las formas ms frecuentes de yersiniosis, la gastroenteritis aguda
(20 7 ,20 8) y la adenitis mesentrica a menudo son leves y
autolimitadas y no requieren tratamiento. En los casos crnicos o
ms severos se han utilizado tetraciclinas o cotrimoxazol con buenos
resultados (209-213).
El tratamiento de las artritis reactivas o el eritema nodoso es
bsicamente sintomtico ya que parece ser que el tratamiento
antibitico no varia su evolucin. Los sntomas articulares se
alivian con antiinflamatorios no esteroideos y con el reposo
(211,213).
Los pacientes con una sepsis por V\ enterocolitica deben tratarse
con antibiticos ya que a menudo estn inmunodeprimidos y la
mortalidad en esta forma de la infeccin es alta (50%). Aunque no
hay un tratamiento de eleccin se recomienda utilizar gentamicina
(5 mg/Kg/da), cloramfenicol (50 mg/kg/da) o una cefalosporina de
tercera generacin (214). Los casos complicados con abscesos
spticos deben drenarse quirrgicamente (211-213).
-51-
Y. pseudotuberculosis es sensible in vitro a ampicilina,
tetraciclinas, cloramfenico!, cefalosporinas y los aminoglucosidos.
Aunque probablemente no es necesario tratar los pacientes con
adenitis mesentrica se recomienda tratar los pacientes con
septicemia con ampicilina 200 mg/kg/da o estreptomicina 20-30
mg/kg/da o tetraciclinas 20-30 mg/kg/da (211,212).
-52-
III.Trabajo experimental.
1. Material y mtodos
1. Material y mtodos.
Estudio epidemiolgico.
Para conocer la epidemiologa de Yersinia se han practicado
aislamientos a partir de muestras fecales de controles sanos,
de pacientes afectos de enteritis y de diversos animales, as como
de alimentos y del medio ambiente particularmente habitats
acuticos.
Epidemiologa humana.
Controles sanos. En 208 personas asintomticas se estudi la
incidencia de Yersinia en muestras fecales por tcnicas directas.
Pacientes con enteritis. Desde abril de 1983 hasta diciembre de
1984 se ha estudiado la incidencia de Yersinia en 5199 pacientes
afectos de enteritis aguda por coprocultivo, segn las tcnicas
descritas ms abajo.
Epidemiologa animal.
En 554 animales se estudiaron muestras fecales para la deteccin de
Yersinia. Dado el inters epidemiolgico del estudio se utiliz
nicamente tcnica de enriquecimiento.
Los animales estudiados fueron, aves: 50 gallinas, 120 palomas;
mamferos: 74 vacas, 110 cerdos, 100 conejos, 110 perros y 220
micromamferos ( Arvcola terrestris 85; Apodemus sylvaticus 57;
Rattus norvergicus 52; Mus musculus 10; Arvcola sapidus 8; Mus
spetrus 6; Crocidura russulae 2).
-55-
Epidemiologa en alimentos.
Se estudiaron 66 muestras de alimentos- vegetales aportados por
voluntarios de frigorficos domsticos incluyendo: tomates,
lechugas, rbanos, judas verdes, coles, zanahorias, apios,
puerros y pimientos.
Ante la gran diversidad de material estudiado, se efectuaron
mezclas de los productos provenientes de cada frigorfico y se
guardaron congeladas muestras originales con el objeto de repetir
individualizadamente la prueba caso de aislar cepas de las que
interesara conocer su procedencia exacta.
Se estudiaron tambin diversas muestras de carnes incluyendo 2 4 de
pollo, 19 de vacuno, 6 de ovino y 34 de porcino, as como 125 muestras
de lengua de cerdo las cuales no eran de origen domstico como las
anteriores sino de mataderos.
Tambin se han estudiado 25 muestras de pescados y crustceos:
merluza 7, calamar 7, rape 6, salmonetes 1, gambas 1, y cigalas 3.
Epidemiologa del medio ambiente.
En este trabajo se hace referencia a los resultados obtenidos en 106
muestras de aguas provenientes de un estudio de contaminacin
ambiental realizado en la Ctedra de Microbiologa de la Facultad de
Biologa de la Universidad de Barcelona (16).
Todos estos datos se recogen en la tabla 17.
-56-
Tipos de muestra Nmero estudiado
Humanos (heces)
Pacientes 5199
Controles sanos 208
Animales (heces)
Aves
Gallinas 50
Palomas 120
Mamferos
Vacas 7 4
Cerdos 110
Conejos 100
Perros 110
Micromamferos 220
Alimentos
Vegetales 66
Carnes 208
Pescados 25
Telricas 106
TOTALES 6596
Tabla 17. Tipo y nmero de muestras estudiadas.
-57-
Tcnicas de aislamiento.
Antes de iniciar el trabajo de campo se realiz una evaluacin de la
eficacia de los medios de MacConkey (MacC), agar salmonela-shigela
(SS) medio de cefsulodin-irgasan-novobiocina (CIN) as como de
tcnica de tratamiento con lcali (KOH) para el aislamiento de
Yersnia en coprocultivos inoculados experimentalmente.
Evaluacin de los medios de cultivo de la tcnica de tratamiento con
lcali.
Cepas utilizadas. Se han utilizado diez cepas de origen humano.
Nueve pertenecen a la especie Y _ . enterocolitica serogrupo 3, cinco
de las cuales corresponden al biotipo 4, lisbtipo VIII, no
habindose determinado el biotipo en las cuatro restantes. La cepa
de Y. pseudotuberculosis corresponde al serogrupo I.
Muestras experimentales. Se han separado heces formes recibidas
en el laboratorio cuyo coprocultivo convencional para salmonela,
shigela, yersinia, vibrio y campilobacter fue negativo y daban
lugar a un crecimiento abundante y variado en medio de MacC.
Se han mezclado tres o ms de stas para preparar una muestra
experimental de consistencia lquida aadiendo 100 g de la mezcla
de heces a 600ml de solucin salina fisiolgica (SSF). La
suspensin se ha repartido en tubos de 22 x 220 mm a razn de 9
ml. por tubo.
A lo largo de la experiencia se han preparado por el mtodo
sealado tres lotes de heces. No existan diferencias obvias entre
los lotes aunque no fueron objeto de estudio cualitativo ni
cuantitativo respecto a la flora existente.
Cada una de las diez cepas a estudiar se ha incubado 18 horas a
372C en caldo triptona, diluyndose posteriormente en 9 mi de SSF
-58-
a 10 y efectuando pases sucesivos de 1 ml a partir de esa
dilucin a cuatro tubos conteniendo 9 ml de SSF obtenindose
-2 -3 -4 -5
diluciones de 10 , 1 0 , 1 0 , 1 0 . De cada uno de estos tubos
se ha pasado 1 ml a los tubos conteniendo 9 mi de muestra de
O fi
heces, obtenindose en los mismos concentraciones de 10 a 10
del cultivo original de cada cepa.
Preparacin del KOH. Se ha utilizado una solucin de KOH
(Probus) al 0' 5% en SSF. La solucin se ha preparado el mismo da
de su utilizacin.
Preparacin de los medios de cultivo. Los medios utilizados Mac
Conkey (Difco Ref: 0075-01-9), Salmonella-Shigella Agar (Difco
Ref. 0074-01-0), Cefsulodin-irgasan-novobiocina preparado a partir
de Yersinia Selective Agar Base (Oxoid CM 653) y Yersinia
Selective Supplement (Oxoid SR 109) y Tryptone Soya Broth
(Oxoid CM129), se han preparado siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Tcnica de trabajo. De cada uno de los cincuenta tubos inoculados
artificialmente (10 cepas x 5 diluciones) se han tomado dos
muestras de 1 mi que se han introducido en sendos tubos de 12 x
120 mm. A uno de los tubos se le ha aadido 2 mi de SSF
sembrndose, tras agitacin, con asa calibrada en los medios de
McC, SS y CIN. Al otro tubo se ha aadido 2 mi de la solucin de
KOH. Se ha agitado durante 90 segundos y se han sembrado con
pipeta un volumen de 0,01 mi los mismos medios de cultivo.
Las placas se han incubado 24 horas a 372C y 24 horas adicionales
a 229C, practicndose la lectura de las mismas a las 48 horas de su
siembra.
Se han estudiado tres colonias por cada placa.
Los resultados se han comparado y evaluado estadsticamente por el
mtodo de la ji-cuadrado.
-59-
Aislamientos de origen humano (heces).
Se efectuaron siguiendo el mtodo convencional de nuestro
laboratorio sembrando las heces en MacConkey (Mac C), agar
xilosa-lisina-deoxcolato (XLD), agar salmonela-shigela (SS) medio
de cefsulodin-irgasan-novobiocina (CIN) y por enriquecimiento en
caldo triptosa incubado durante 3 semanas en la nevera a 4-69C,
seguido de centrifugacin a 3000 rpm durante 15 minutos y
tratamiento con lcali (ver ms arriba).
La muestra tratada con KOH se sembr en medio de MacConkey.
En tcnica directa (MacC, XLD, SS y CIN) se estudi una colonia
de cada tipo morfolgico, compatible con Yersina. A partir del
enriquecimiento (CT 42C. MacC) se estudiaron todas las colonias
morfolgicamente diferentes.
En los controles sanos solo se estudiaron las muestras de heces por
siembra directa.
Aislamientos de muestras animales, alimentos y medio ambiente.
Las heces de origen animal se procesaron por la misma tcnica de
enriquecimiento utilizada para las heces humanas.
Los alimentos se homogenizaron por trituracin y se sembraron en
proporcin de 1/10 (v/v) en caldo triptona enriquecindose por
cultivo en fro y tratndose segn el mtodo sealado (KOH).
Las muestras de agua se procesaron en volmenes de 100 mi que se
centrifugaron a 3000 rpm durante 30 m. El sedimento se
resuspendi en 200 mi de caldo triptosa tamponado incubndose a
|-69C durante 3 semanas. De este cultivo se toman 15 mi que se
centrifugan a 3000 rpm durante 20 minutos y el sedimento se trata
con lcali segn la tcnica sealada.
-60-
Identificacin bacteriana.
Las cepas aisladas fueron identificadas en base al estudio de sus
caracteres bioqumicos que incluyen: 1} oxidasa, 2) nitratasa, 3)
fermentacin de la glucosa, 4) produccin de gas a partir de la
glucosa 5) movilidad a 37 QC, 6) movilidad a 282C, 7)
Voges-Proskauer a 379C, 8) Voger-Proskauer a 282C, 9) ureasa,
10) fenilalanina-desaminasa, 11) produccin de SH_, 12) gelatinasa,
13) lisina decarboxilasa, 14) ornitina decarboxilasa, 15) arginina
dehidrolasa, 16) citrato de Simmons, 17) produccin de indol, 18)
DNAsa, 19) pectinasa, 20) utilizacin de malonato, y 21) mucato,
22) prueba de ONPG, produccin de cido a partir de la 23)
lactosa, 24) maltosa, 25) celobiosa, 26) trealosa, 27) sorbitol, 28)
sacarosa, 29) ramnosa, 30) rafinosa, 31) alfa metil glucsido, 32)
melibiosa, 33) xilosa y 34) produccin de pigmento en TSA (Tabla
18). Todas estas pruebas se han realizado segn tcnicas
estandarizadas (215-217) previamente descritas.
Estos caracteres permiten identificar las especies de Yersinia y sus
biotipos.
Las cepas de serotipo 0:3 fueron tipadas en nuestro laboratorio con
un antisuero preparado por nosotros con la cepa de referencia _Y.
enterocolitica 0:3 (134 I. Pasteur). El serotipo y lisotipo de las
dems cepas aisladas fue determinado por FF. Mollaret en el Centro
Internacional de Referencia de Yersinia (I.P. Pars).
-61-
Pruebas realizadas:
Oxidasa
Ntratasa
Fermentacin de la glucosa
Produccin de gas en glucosa
Movilidad a 379C y 289C
Voges-Proskauer a 379C y 289C
Ureasa
Fenilalanina-deaminasa
Produccin de SH
Lisina-decarboxilasa
Ornitina-decarboxilasa
Argin ina-dehidrolasa
Gelatinasa
DNA asa
Lipasa
Pectinasa
Produccin de indol
Crecimiento en citrato de Simmons
Utilizacin de malonato
Utilizacin de mucato
Prueba de la ONPG
Acido a partir de:
Lactosa
Maltosa
Celobiosa
Trealosa
Sorbitol
Sacarosa
Ramnosa
Rafinosa
Alfa-metilglucsido
Melibiosa
Xilosa
Produccin de pigmento
Tabla 18. Identificacin metablica de las cepas de Yersinia.
Pruebas utilizadas.
-62-
Estudio de los caracteres asociados a patogenicidad.
Las cepas aisladas se sometieron a estudio de algunos caracteres
correlacionados con la capacidad patgena: 1) crecimiento en medio
con oxalato, 2) autoaglutinacin y 3) presencia de pirazinamidasa.
El trabajo se ha efectuado de modo secuencial estudiando la calcio
dependencia y evaluando la autoaglutinacin y presencia de
pirazinamidasa a partir de dos colonias grandes y dos pequeas
cuando apareca disociacin y dos colonias cuando no exista
disociacin.
Prueba de crecimiento del medio con oxalato (92).- Se siembra por
duplicado con asa calibrada alrededor de 100 clulas bacterianas en
dos placas de MOX (Magnesium Oxalate Mdium) modificado (Blood
agar base (Oxoid, Ref. CM55) 40 g, agua destilada 830 mi.
Esterilizar a 1212C 15 minutos, aadir estrilmente 80 mi de
solucin de cloruro magnsico (Magnesium chlorid Merck 5833) a
2,38 g/100 mi, 10 mi de solucin de glucosa (D-glucose
monohydrat. Merck 8342) 18 g/100 ml y 80 mi de solucin de
oxalato sdico (Merck 6 5 5 5 ) a 4,4 g/100 mi. Repartir en placas a
razn de 25 mi por placa).
Se incuban a 372C y 28Q C durante 48 horas. La aparicin de un
nmero significativamente menor de colonias o la marcada
disminucin del tamao a 372C en relacin a 282C se considera como
calcio dependencia.
Autoaglutinacin (98). Se suspende cada colonia a estudiar en 4 mi
de solucin salina (CINa al 0,9% p/v) y se inoculan 0' 2 ml de esta
suspensin en dos tubos con 10 mi de medio de Clark y
Lubs.(MR-VP mdium, Difco 0016-02-0)
Se incuba a 37Q C y 289C durante 18 horas y se observa el patrn
de crecimiento para detectar autoaglutinacin. La prueba es
positiva cuando la autoaglutinacin aparece a 379C y no a 28Q C.
-63-
Estudio de la pirazinamidasa (103). Se siembra la pendiente del
medio para estudio de la pirazinamidasa (Trypticase Soy Agar BBL
11043 30 g.. Yeast Extract Oxoid L21 3g., pyrazine carboxamide
Merck PY021 1g., Trizma Malate Sigma T3128 0,2M pH 6, Agua
destilada 1000ml. Se reparte en tubos a razn de 5 ml por tubo, se
esteriliza a 1152C 20 minutos y se solidifica inclinado).
Se incuba 48 horas a 282C. Se aade a cada tubo un ml de
solucin de sulfato ferroso amnico al 1/100 p/v. AI cabo de 15
minutos se lee la reaccin. Se considera accin pirazinamidasa
positiva la aparicin de un color rojo por presencia de cido
pirazinoico. Tabla 19.
-64-
Cepa a estudiar
v
T S B
18 h 28QC
Dilucin a 10
-5
10 mel 10mcl
MOX
18 h. 282C
MOX
48h. 379C
Tomar 4 colonias
1(G) Autoaglutinacin, Pirazinamidasa
2(G) Autoaglutinacin, Pirazinamidasa
3(p) Autoaglutinacin, Pirazinamidasa
Autoaglutinacin, Pirazinamidasa
Tabla 19. Protocolo de trabajo para el estudio de los caracteres
asociados a patogenicidad.
TBS: Triplicase Soy Broth, MOX: Magnesium Oxalate Medium. (Ver texto),
-65-
Tcnicas serolgicas
Obtencin del antgeno (218): Para la obtencin del antgeno de _ Y .
enterocolitica 0:9 y de _ Y . enterocolitica 0:3 se han utilizado las
cepas de referencia 336 y 134 I. P. del Instituto Pasteur (Paris).
Los dems antgenos fueron preparados con cepas aisladas en
nuestro laboratorio cuyo serotipo y biotipo fue determinado por
H. H. Mollaret en el Centro Internacional de Referencia de Y ersinia
(I. P. , Paris).
De una siembra por agotamiento en agar sangre de estas cepas, se
seleccionaron colonias lisas comprobndose que no autoaglutinaban
en porta al suspenderlas en una solucin salina al 2%. Se sembr
un caldo Triplicase de cada cepa que se incuba 48 horas a 289C.
Con el crecimiento obtenido se inocula un frasco Roux con 250 mi
de agar de infusin de cerebro y corazn incubndose 48 h a
282C. Se suspendi el cultivo del frasco de Roux en solucin salina
estril hirvindose al bao maria durante 2 horas y media.
Posteriormente se realizaron tres lavados con solucin salina estril
centrifugando a 3000 r. p. m. durante 30 minutos. Despus del
ltimo lavado se desech el sobrenadante y se resuspendi el
g
sedimento a una turbidez de aproximadamente 10 clulas por mi de
solucin salina estril formolizada al 0. 3%. Se practic un control
de esterilidad. Se conserv en nevera a 49C.
Seroaglutinacin
La seroaglutinacin se ha realizado en placas de microtiter de 96
pocilios con fondo en V (Nunc Demarc). De cada suero se estudian
11 diluciones dobles progresivas en solucin salina que abarcan
desde la dilucin 1/16 hasta la 1/16384 en volmenes de 50 mcl por
pocilio aadindose a continuacin 50 mcl por pocilio de la
suspensin antignica. Cada placa incluye un control de antgeno
en el que los 50 mcl de suero se sustituyen por 50 mcl de solucin
salina.
-66-
En cada anlisis se incluyen un suero positivo de ttulo conocido y
un suero negativo como control.
Se agitan las placas durante un minuto, incubndose durante 24
horas a 372C en una cmara hmeda practicndose posteriormente
su lectura.
Fijacin de complemento
Marcha de la reaccin:
Suero: Una vez absorbidos e inactivados a 569C 30' se realizan
diluciones dobles progresivas de los sueros en placas de microtiter
de fondo en U (Nunc Demarc) siendo el volumen final de 25 mcl.
Como diluyente de todos los reactivos se utiliza tampon veronal
(T.V.).
Como control de suero se ha utilizado una dilucin inicial que es de
1/4.
Antgeno: Se dispensa 25 mcl de la suspensin antignica en todos
los pocilios excepto en la columna de control de suero (C.S.) y en
la columna de control de complemento (CC
1
). Tambin se dispensan
25 mcl de la suspensin antignica en la columna de control de
complemento con antgeno (CC' A).
Complemento: Se diluyen el complemento (Behring Rf. RAY 15) en
T.V. a la dilucin ptima y se dispensan 25 mcl en todos los
pocilios.
Control CC
1
. Se enfrentan 4, 2, 1, 0.5 y O DH50 a la mezcla
hemolftica sustituyendo el antgeno y el suero por T.V.
Control CC'A. Igual que el control CC
1
pero dispensando antgeno
en todos los pocilios.
Una vez dispensados el suero, el antgeno y el complemento se
agita la placa durante 1 minuto en un microagitador y se incuba
toda la noche a 42C.
-67-
Mezcla hemoltica: Los hemates de carnero se lavan tres veces con
T.V. y se ajustan al 2% segn hematocrito.
La hemolisina (Behring Rf. RAY 25) se diluye a la dilucin ptima
con T.V.
La sensibilizacin de los hemates se realiza mezclando a partes
iguales la hemolisina y los hemates de carnero, se dejan 30
minutos a temperatura ambiente y se incuban toda la noche a 49C.
Al da siguiente se lleva la mezcla hemoltica al bao de 37 Q C y la
placa a la estufa de 37 2C durante 30 minutos. Se dispensan 25 mcl
de la mezcla hemoltica en todos los pocilios, se agita durante 1
minuto en el microagitador y se incuba a 37 9C durante 30 minutos,
agitando 1 minuto en la mitad de la incubacin. Posteriormente se
incuba la placa a 49C hasta la lectura que se realiza transcurridas
de 2 a 4 horas.
Titulacin del complemento, hemolisina y antgenos: La titulacin
del complemento y hemolisina se efecta utilizando, en las
proporciones sealadas y al volumen total indicado para la reaccin
final, diluciones progresivas del complemento que varan de 1/30 a
1/280 segn una tcnica descrita previamente (219).
Las diluciones utilizadas corresponden a las mayores diluciones de
hemolisina y complemento que presentan mayor actividad hemoltica.
Titulacin del antgeno: Se efecta frente a un suero positivo
conocido utilizando las dosis de hemolisina y complemento
previamente valoradas. Se efectan series de reaccin con dicho
9
suero utilizando diluciones progresivas de antgeno puro (^10
clulas/mi) desde 1/4 a 1/128. Los antgenos de Yersinia se han
utilizado a la dilucin 1/16.
-68-
Tratamiento de los sueros: Absorcin de los sueros: Los sueros se
absorben con hmaties de carnero para eliminar posibles aglutininas
del suero, que interferiran en la lectura de la reaccin.
La absorcin de los sueros se realiza dispensando una gota de
hmaties de carnero (previamente lavados) por mi de suero, se
dejan 30 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se
centrifugan los sueros a 4000 rpm durante 10 minutos
recuperndose el sobrenadante.
En algunos sueros en los que persiste una cierta hemaglutinacin a
pesar de la absorcin descrita se ha realizado una absorcin en
fri en un intento de eliminar posibles crioaglutininas, ya que en
el ensayo de fijacin de complemento la incubacin de la mezcla
hemoltica se realiza a 42C para ello se aade una gota de hmaties
de carnero por mi de suero y se deja toda la noche a 49C, al da
siguiente se centrifuga a 4000 rpm durante 10 minutos
recuperndose el sobrenadante.
Tratamiento de los sueros anticomplementarios: Los sueros
anticomplementarios se trataran por el mtodo de Sachs modificado:
Se toma 0' 5 mi de suero a inactivar y se le aade 4'1 ml de N/ 300
CIH, se agita y se deja 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente se centrifuga a 4000-5000 r.p.m. durante 10 minutos
y se toma el sobrenadante. Finalmente se aade 0' 4 mi de NaCI 10%
al lquido sobrenadante. No es necesaria la neutralizacin.
Enzimoinmunoanlisis
La tcnica empleada utiliza un antgeno particulado y un conjugado
de peroxidasa a inmunoglobulinas anti-lg totales humanas (Miles
Yedra LTD. Rf. 61-230).
-69-
Antgeno: Despus de una evaluacin entre la tcnica de adsorcin
simple y la fijacin por glutaraldehido se ha seleccionado esta
ltima con la que se han obtenido mejores resultados comparativos.
Esquemticamente se colocan 50 mcl de poli-L-lisina a 10 mcg/ml en
PBS seguido de 100 mcl de antgeno que en la reaccin final se
utiliza a una concentracin valorada previamente por microscopa
ptica para obtener una capa homognea. Se utiliz 5 mcg/ml (peso
seco) en PBS. Posteriormente se aaden 100 mcl por pocilio de
glutaraldehido (Sigma G-6257) al 0' 5% en PBS que acta durante 15
minutos lavando despus 3 veces en PBS.
Titulacin del conjugado: Se ha evaluado el ttulo ptimo del
conjugado incluyendo a diluciones de 1/3000, 1/6000, 1/12000 y
1/21000 en reacciones frente a un suero positivo y otro negativo
incluidos a diluciones dobles progresivas de 1/100 a 1/12800. Se ha
considerado ptima la dilucin del conjugado que ha positivizado la
mxima dilucin del suero positivo con el menor fondo en el
negativo. La dilucin ptima ha sido 1/6000.
Elaboracin de un estndar: Se ha considerado como estndar a la
dilucin de un pool de tres sueros positivos cuya D.O.600 a los 20
minutos de incubacin sea aproximadamente de 1000. La dilucin
apropiada del pool de sueros fue de 1/1600. Asi pues, este pool ha
sido diluido a 1/1600, alicuotado y guardado a -202C. El estndar
se ha introducido en cada placa por duplicado a las concentraciones
del 100%, 75%, 501 y 25%. A las D.O.600 obtenidas con estas
diluciones se les atribuye arbitrariamente el valor de 100, 75, 50 y
25 unidades/mi respectivamente, obtenindose una recta de
correlacin entre absorbancias y unidades por mi.
Mediante la ecuacin de la recta se podran transformar todos los
valores de D.O.600 de los sueros problemas a valores de unidades
por mi.
-70-
Marcha de la reaccin:
Fijacin del antgeno: El antgeno valorado se resuspende con PBS
a la concentracin de 5 meg por ml y se procede a la
sensibilizacin de la plaa.
Sensibilizacin de la placa: se sensibilizan placas de poliestireno
(Flat-bottom, Dynatech M-129-B, Switzerland) siguiendo el mtodo
de fijacin con glutaraldehido.
Bloqueo: Se aaden 200 mcl por pocilio de PBS con 0.05% Tween 20
y 1% de seroalbmina bovina (PBS-T-S). Se deja incubar 1 hora a
temperatura ambiente en cmara hmeda.
Lavado: Se desecha el contenido de la placa y se lava tres veces
con PBS-T. Despus del tlimo lavado puede congelarse la placa a
-202C hasta su uso.
Adicin del suero: Los sueros a estudiar son diluidos con PBS-T-S
a las diluciones adecuadas. En nuestro caso se efectan diluciones
dobles progresivas desde 1/200 hasta 1/12800.
Se colocan 100 mcl por pocilio y se deja incubar 2 horas a
temperatura ambiente en cmara hmeda. Transcurridas las dos
horas se procede al lavado 3 veces con PBS-T.
Adicin controles:
En cada placa se ha introducido el estndar por duplicado a las
concentraciones de 100%, 75% , 50% y 25% .
Tambin se ha introducido en cada placa un control de conjugado
en el cual se aade PBS-T-S en lugar de suero problema. A este
control de conjugado se le considera como el blanco de la reaccin.
-71-
Adicin del conjugado: Se diluye el conjugado antiinmunoglobulinas
humanas a 1/6000 en PBS-T-S. Se colocan 100 mcl por pocilio y se
deja incubar toda la noche a 49C en cmara hmeda. Al da
siguiente se procede al lavado, tres veces con PBS-T.
Adicin del substrato: El sustrato se prepara como una mezcla de 3
metil-2-benzatiozolinona hidrazona (Sigma No. M-8006) 0' 3646 g/l en
tampn fosfato pH 6'25 y cido 3-dimetilamino-benzoico (Sigma No.
D-1643), 13'3 g/l en tampn fosfato pH 7 a cantidades de 10 mi
cada reactivo con 5 mcl de H_ O_ al 30% repartiendo 200 mcl por
pocilio.
Parada de la reaccin: La reaccin se para aadiendo 50 mcl por
pocilio de SO
(
H
2
2N.
La lectura se realiza en un espectofotmeto (Titertek Multiskan) a
una longitud de onda de 600 nm.
Expresin de los resultados: La expresin de los resultados se ha
efectuado en unidades por intrapolacin a la ecuacin de la recta
obtenida por medio de los estandars internos de cada placa.
-72-
Sueros estudiados
1. Grupo control:
Para conocer los ttulos de la poblacin sana y poder evaluar los
resultados serolgicos de los pacientes infectados por Y _ .
enterocolitica se estudiaron los ttulos de 72 controles sanos
frente a _ Y . enterocolitica 03 por seroaglutinacin, fijacin de
complemento y enzimoinmunoanlisis. Tambin se estudiaron por
aglutinacin directa los ttulos de esta poblacin sana frente al
serogrupo 09 de _ Y . enterocolitica.
2. Gastroenteritis:
Con coprocultivo positivo para Y ersinia enterocolitica 0:3
Se han estudiado 22 enfermos con un cuadro de gastroenteritis
aguda en los que se les haba aislado Y ersinia enterocolitica 0:3
en el coprocultivo.
Con coprocultivo positivo para Y ersinia enterotoltica de otros
serogrupos
Tambin se han estudiado 18 enfermos con un cuadro de
gastroenteritis aguda en los que se les haba aislado Y ersinia
enterocolitica de otros serogrupos.
En cada uno de estos pacientes la serologa se orient a la
bsqueda de anticuerpos especficos para el serogrupo de _ Y .
enterocolitica aislada del coprocultivo.
Estos sueros fueron estudiados por tcnica de seroaglutinacin,
fijacin de complemento y enzimoinmunoanlisis para el antfgeno
03 y seroaglutinacin y fijacin de complemento para los dems
antgenos.
El estudio serolgico se efectu conjuntamente con todos los
sueros disponibles para facilitar la comparacin de resultados.
-73-
3. Enfermedades reumticas relacionadas con la infeccin por _ Y .
enterocoltica;
En 97 pacientes afectos de diversas enfermedades que se han
relacionado con la infeccin por Y ersinia se estudi
serolgicamente una (o ms) muestras de suero frente a los
antgenos de _ Y . enterocolitica 0:3 y 0:9 para conocer la posible
participacin de estos patgenos en dichos cuadros clnicos. Las
tcnicas utilizadas fueron la seroaglutinacin y el
enzimoinmunoanlisis para el antgeno 0:3 y seroaglutinacin
para el antgeno 0:9.
4. Enfermedad inflamatoria crnica de intestino:
En 1*1 enfermos con enfermedad de Crohn en brote agudo y con
coprocultivo negativo se estudi la presencia de anticuerpos
especficos frente al serogrupo 03 de _ Y . enterocolitica por
tcnicas de aglutinacin directa y enzimoinmunoanlisis y frente
al serogrupo 09 por aglutinacin directa.
-74-
2. Resultados
2. Resultados
a Evaluacin de las tcnicas de cultivo.
En la tabla 20 se presentan los resultados obtenidos en los 3 medios de
cultivo utilizados, MacC, SS y CIN tras siembra directa y despus de
tratamiento con KOH de las muestras fecales inoculadas con Yersina.
Al comparar entre s los medios utilizados en la siembra de las muestras
de heces sin tratar con KOH (siembra directa) destaca la superioridad
del medio de CIN, con el que se detectan 42 muestras como positivas de
las 50 estudiadas respecto al de SS en el que se detectan 14 como
positivas. La diferencia es estadsticamente significativa (p<_0' 001). En
el medio de MacC por tcnica de siembra directa nicamente se detectan
3 de las 50 muestras positivas.
En las muestras tratadas con KOH las diferencias entre los diversos
medios carecen de significacin y los resultados son equivalentes a los
del mejor medio en siembra directa (CIN). Al comparar los resultados
del medio con mejor rendimiento en tcnica directa (CIN: 12) con el
mejor tras tratamiento con lcali (MacC: 41) no se observan diferencias
estadsticamente significativas (p > 0' 5). Ello indica que el tratamiento
de las heces con KOH eleva el rendimiento de los medios menos
inhibidores, siendo en valores absolutos el de MacC el que permite
mayor nmero de aislamientos tras tratamiento (MacC: 11 positivas; SS:
41 y CIN: 37 sobre las 50 estudiadas).
La cepa de _Y. pseudotuberculosis estudiada se aisl tras tratamiento con
KOH a todas las diluciones (10 a 10 ) en los tres medios estudiados.
Sin tratamiento se aisl a todas las diluciones en CIN y nicamente a
10~
2
en SS y 10~
3
en MacC.
De las 150 placas sembradas tras tratamiento (10 cepas x 5 diluciones x
3 medios) en 123 se obtuvieron cultivos puros de yersinia, 26 fueron
negativos y en 2 se obtuvieron cultivos mixtos. De las placas sembradas
-76-
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77
sin tratamiento, las 100 correspondientes a MacC y SS mostraron
cultivos mixtos. En 33 de las 50 de Cl N se obtuvieron asimismo cultivos
mixtos. Ello da idea del valor selectivo del tratamiento con lcali.
b. Epidemiologa
i Epidemiologa humana.
Controles sanos
En 208 personas asintomticas estudiadas por tcnica directa no se
aisl ninguna cepa de Yersnia.
Pacientes con enteritis
Los resultados obtenidos en los 5199 coprocultivos realizados desde
abril de 1983 hasta diciembre de 1984 se sealan en la Tabla 21.
El nmero de cepas de yersinia aisladas fue de 139, lo que representa
el 2,6 % de los coprocultivos realizados y el 12,1% de los enteropatgenos
aislados.
Las especies detectadas se recogen en la tabla 22.
La mayora de las cepas aisladas pertenecen a la especie _ Y.
enterocolitica.
Los biotipos de _ Y. enterocolitica aislados han sido: biotipo 1, 77 cepas;
biotipo 4, 42 cepas y biotipo 3, 5 cepas (tabla 23).
Los serotipos detectados se recogen en las tablas 24 y 25.
Algunas cepas se aislaron simultneamente a otros enteropatgenos. En
la tabla 26 se recogen las asociaciones detectadas.
-78-
Coprocultivos realizados 5199 (100)
Salmonelas gastroenterticas 482 (9,2)
j>. typhi 6 (0,1)
Campylobacter jejuni 424 (8,1)
Shgella 190 (3,6)
S. sonnei 171
^. flexneri 12
. boydi 7
E. coli EP (1984) 42 (1,4)
JE. coli El (1984) 1 (0,03)
JE. coli ET (1984) O (0)
Yersinia 139 (2,6)
Tabla 21. Resultados globales de los coprocultivos efectuados desde
abril de 1983 a diciembre de 1984.
-79-
Total de cepas aisladas 139
_ Y . enterocolitica 124
_ Y . frederiksenii 11
Y\ kristensenii 2
Y . intermedia 2
Tabla 22. Especies de Y ersinia aisladas en personas sintomticas.
-80-
_ Y . enterocolitica blotipo 1 77
botipo 4 42
botipo 3 5
Tabla 23. Biotpos de _ Y . enterocolitica aislados en personas
sintomticas.
-81-
Serotipo N2 de cepas
Biotipo 1
Biotipo 3
Biotipo 4
3
5
6
*6, 30
7, 8
*7, 8, 13
*7, 8, 13, 19
*7, 13, 19
*10, 34
*10, 34, K
1
*10, 37. K
1
*13
14
25, 35
*25, 35, 28
*28
*30
*34
*36
39, 41
39, 41, 42 (41, 43)
No tipables
No tipadas
7, 8
*16, 34
No tipables
3
pos de Y enterocolitica
1
16
11
1
5
1
3
2
2
1
1
3
2
5
3
1
9
1
2
1
2
2
2
1
3
1
42
aisla
Se seala por * los serotipos descritos por primera vez en nuestro pais.
-82-
Serotipo N9 de cepas
Y. frederikseni *3
Y. kristensen
Y. intermedia
H. 10, 14, 16
*35
*52 (52, 53)
No tipables
*12
*3, 37
*18
Tabla 25. Serotipos de Y_ . kristensen, _ Y. frederiksenii, _ Y. intermedia
aislados en personas sintomticas.
Se seala por * los serotipos descritos por primera vez en nuestro pas.
-83-
Yersinia Asociaciones N9 de cepas
Y. enterocolitica
0:3
0:3
0:3
0:3
0:3
0:5
0:5
0:6
0:7, 8, 13,
0:7, 13,19
0:34
!
C.
S.
E.
Y.
C.
Y.
C.
19 C.
S.
Y.
enteritidis
jejuni
sonnei
coli EP (026 K60)
frederiksenii NT
jejuni, S. enteritidis
intermedia 0:18
jejuni, S. sonnei
jejuni
enteritidis
enterocolitica 0:39,41,42
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
kristensenii
0:11
frederiksenii
0:3
C. j ej uni
C. j ej uni
.0:52(52, 53) C. jejuni
NT _ Y. enterocolitica 0:5
Y. intermedia
0:3, 37 S. sonnei
Tabla 26. Asociaciones de Yersinia con otros patgenos detectados en
los coprocultivos de pacientes sintomticos.
-84-
Medios de cultivo.
Aunque la capacidad selectiva de los medios de cultivo se ha
estudiado en muestras artificiales inoculadas con Yersinia segn se
ha sealado anteriormente, el rendimiento de dichos medios
utilizados en siembra directa y su comparacin con la tcnica de
enriquecimiento en fri seguida de tratamiento con lcali se evalu
a lo largo del estudio.
El resultado de los aislamientos en los distintos medios de cultivo
se exponen en relacin a los biotipos.
En la tabla 27 pueden observarse los resultados obtenidos. En ella
puede verse que las cepas de ^f. enterocolitica del biotipo 4 se
aislan con frecuencia variable (30,9-76,1%) de los diversos medios
de cultivo por siembra directa, en tanto que el resto de biotipos y
otras especies de Yersinia se aislan casi exclusivamente por
enriquecimiento en fro.
Dado el retardo que significa la incubacin durante 3 semanas de la
tcnica de enriquecimiento comparamos dicha tcnica con el
enriquecimiento en el mismo medio a temperatura ptima de crecimiento
289C, durante 48 horas, tratando el sedimento de ambos cultivos con
KOH en 63 muestras de heces de cerdo y 61 muestras de lenguas de
dichos animales.
Los resultados obtenidos se recogen en la tabla 28 donde puede
observarse que la tcnica clsica aporta mejores resultados
detectando el 12% de las muestras como positivas en tanto que el
enriquecimiento a 282C slo detecta como positivos el 2,4% de
dichas muestras.
-85-
Cepas Siembra directa Enriquecimiento
Especie
Biotipo (N9) MacC SS Cl N CT 4-69 KOH
MacC
_ Y . enterocolitica
Biotipo 1 (42) 13 (30,9) 27 (64,2) 32 (76,1) 39 (92,8)
Biotipo 3 (5) O O O 5 (100)
Biotipo 1 (77) 2 (2,6) O 1 (1,3) 77 (100)
Y . frederiksenii (11) O O 1 (10) 11 (100)
Y . kristensenii (2) 0 0 0
Y . intermedia (2) 0 0 0
2 (100)
2 (100)
TOTAL 139 15 27 34 136
Tabla 27. Aislamiento de Y ersinia en los diversos medios utilizados.
-86-
Muestras (N2) Especie/biotipo CT289C/KOH CT49C/KOH Total
2 das 3 semanas
Heces de cerdo (63)
Y _ . enterocoltica b. 4 1 3 4
b. 1 O 4 U
' pseudotuberculosis 1 1 2
Lenguas de cerdo (61)
e"terocolitica b. 1 1 6 7
_ Y . intermedia O 1 1
Total 3(2, 4) 15(12) 18
Tabla 28. Comparacin del tratamiento con KOH tras 3 semanas de enriqueci-
miento a 42C y 2 das a 289C.
-87-
i Epidemiologa animal
Aves
Gallinas: De las 50 gallinas estudiadas se aisl 1 cepa (2%) de _ Y .
enterocolitica biotipo 1.
Palomas: De las 120 palomas se aislaron 2 cepas ( 1, 6%) de Y .
enterocolitica biotipo 1 (Tabla 29) .
Mamferos
Bovidos: De las 74 vacas estudiadas se aislaron 34 cepas en 30
vacas ( 40. 5%) correspondientes a 4 especies distintas segn se
recoge en la tabla 29. En 4 animales se detect asociacin de Y .
enterocolitica biotipo 2 con Y . frederiksenii, Y . enterocolitica
biotipo 3 con Y ^ frederiksenii, _ Y . intermedia biotipo 1 con 2 y Y _ .
intermedia 4 con una cepa no tipada de la misma especie NT.
(Tabla 2 9) .
Cerdos: De las 110 muestras de heces procedentes de cerdos se
aislaron 13 cepas de tres especies diferentes de 12 animales
( 10, 9%) . Entre ellas se aisl una cepa de \_. pseudotuberculosis
asociada a _ Y . enterocolitica 1. Hay que destacar que se detectaron
adems 6 cepas del biotipo 4 serotipo 03. (Tabla 2 9) .
Conejos: De los 100 animales estudiados se aisl 1 cepa ( 1%) de _ Y .
enterocolitica biotipo 1. (Tabla 2 9) .
Perros: De los 110 animales estudiados se aislaron 3 cepas en 3
animales ( 2,7%) pertenecientes a tres especies diferentes. (Tabla
2 9) .
Micromamferos: Los estudios efectuados en diversos micromamferos
permitieron demostrar la alta tasa de infestacin de estos animales
segn se recoge en la tabla 30, aunque no se han detectado cepas
correspondientes al serotipo 3.
-88-
ANIMALES Cepas aisladas
Tubo digestivo N.E Positivos(TpC) N9C: Especie, biotipo
AVES
Gallinas 50 1 (2) 1: Y. enterocolitica b.1
Palomas 120 2 (1,6) 2: Y. enterocolitica b.1
MAMFEROS
Vacas 30 (40,5) 7: Y. enterocolitica
(4: b.1, 3:b.3)
7: Y. frederiksenii
2
;
Y. kristensenn
18: Y. intermedia
, 12:b.2, 1:b.4, 2NT)
Cerdos 110
Conejos 100
Perros 110
12 (10,9) 1: _ Y. pseudotuberculosis
11: Y. enterocolitica
(6:b.4, 5:b.1)
1: Y. intermedia b.1
1 (1) 1: _ Y. enterocolitica b.1
3 (2,7) 1: Y_. enterocolitica b.4
1: Y. frederiksenii
Tabla 29. Epidemiologa de Yersinia en animales de abasto y domsticos.
-89-
ANIMALES Cepas aisladas
MICROMAMI PEROS N2.E. Positivas(TpC) N9C Especie, biotipo
Apodemus sylvaticus 57 19(33%)
(Ratn de campo)
Rattus norvergicus 52 34(65,3%)
(Rata de alcantarilla)
Arvcola terrestris 85 2(2,3%)
(Rata topera)
Arvcola sapidus 8 2(25%)
(Rata de agua)
Mus musculus 10 3(30%)
(Ratn domstico)
Mus spretus 6 1(16,5%)
(Ratn de campo)
Crocidura russulae 2 2(100%)
(Musaraa comn)
23 15:
8:
54 14:
34:
2:
4:
2 1:
1:
2 2:
3 2:
1:
1 1:
3 2:
1:
Y.
(15
Y.
Y.
Y.
(6:
Y.
Y.
(4:
Y.
Y.
Y.
Y.
Y.
Y.
Y.
Y.
enterocolitica
: b.1)
kristensenii
frederiksenii
enterocolitica
b.1)
kristensenii
intermedia
b.1)
enterocolitica b.1
frederiksenii
intermedia
enterocolitica b.1
frederiksenii
enterocolitica b.1
enterocolitica b.1
kristensenii
Tabla 30. Epidemiologa de Yersinia en micromamferos.
-90-
Muestras telricas
Las muestras de origen telrico fueron fundamentalmente de aguas
litorales, de cursos de rio y colectores. En todas ellas, excepto
colectores, pudo detectarse la presencia de Yersinia, particularmente
abundante en aguas de litoral superficiales, segn se recoge en la
tabla 31.
-91-
TELRICAS Cepas aisladas
N9E Positivas (TpC) N2C:Especie, biotipo
ROS
2 24 13 (54,2) 14: Y.
Y.
Y.
enterocolitica b.1
frederiksenii
intermedia
: 6
: 6
: 2
Lineas de playa
7 40 13 (32,5) 16: _ Y: enterocolitica b.1 :11
Y_ . frederiksenii : 3
Y. intermedia : 2
Litorales
Superficie 19
Sedimentos 20
16 (84,2) 28: Y_ . enterocolitica b.1
Y. intermedia
Y. frederiksenii
Yersinia spp.
12 (60) 15: Y. enterocolitica b.1
Y. intermedia
Y. frederiksenii
9
5
2
8
6
1
Colectores O (0)
Tabla 31. Epidemiologa de Yersinia en muestras de aguas de cursos
naturales, colectores y marinas.
-92-
v Epidemiologa en alimentos
Verduras. Se estudiaron 66 muestras diferentes de verduras de
consumo. En 11 muestras ( 16, 6%) se aislaron 11 cepas de tres
especies diferentes.
Carnes. De las 24 muestras de carne de pollo, 4 ( 16, 6%) fueron
positivas para 2 especies diferentes.
De las 19 muestras de carne de vacuno 2 (10%) fueron positivas
aislndose 2 especies diferentes.
De las 34 muestras de porcino estudiadas (no incluyen lenguas), 5
fueron positivas ( 14, 7%) para Y. enterocolitca.
Se estudiaron asimismo 125 muestras de lengua de cerdo
procedentes de matadero de las que 42 ( 33.6% ) fueron positivas
para 3 especies diferentes incluyendo una cepa de _ Y.
pseudotuberculosis y 8 de _ Y. enterocolitica biotipo 4, serogrupo
03.
De las 6 muestras de carne de ovino 2 ( 33%) fueron positivas para
2 especies diferentes.
Pescados. Se estudiaron 25 muestras de diversos pescados
resultando 9 ( 36%) positivos para 3 especies diferentes.
En la tabla 32 se recogen los aislamientos a partir de los diversos
alimentos estudiados.
En la tabla 33 se recogen las cepas de Yersinia aisladas de todos
los orgenes correspondientes a los apartados sealados
anteriormente.
-93-
ALIMENTOS Cepas aisladas
Heces N9E Positivos(TpC) N2C: Especie, biotipo
VERDURAS 66
CARNES
Pollos 2 U
11 (16,6) 3: _ Y . enterocolitica
(l:b.1, 2:b. 3)
7: Y. intermedia
(6:b. 6, 1:b. 4)
1: Y. kristensenii
U (16,6) 3: Y _ . intermedia
(1:b. 1, 2:b. 2)
1: Y. kristensenii
Vacuno 19 2 (10) 1: _ Y . enterocolitica
2: Y . intermedia
Porcino
Lenguas 125
Otros
42 (33,6) 1: Y _ . pseudotuberculosis
31 : _ Y . enterocolitica
(8:b. 4, 23: b. 1)
13: Y. intermedia
(6:b. 1, 7:b. 2)
5 (14,7) 5: Y . enterocolitica b. 1
Ovino 2 (33,3) 1: _ Y . enterocolitica b. 1
PESCADO 25 9 (36) 8: Y . intermedia
1 : _ Y . frederiksenii
1: Y. kristensenii
Tabla 32. Epidemiologa de Yersinia en alimentos.
-94-
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i Pacientes con gastroenteritis
En las tablas 34 a 42 se recogen los datos de la clnica,
aislamiento, evolucin, epidemiologa y serologa de los 41 pacientes
de los que se dispusieron estos datos y en los que se haba aislado
_ Y . enterocolitica.
Dado que los aislamientos se han efectuado en todo caso de
pacientes sintomticos, los nicos criterios para involucrar las
cepas de Y ersinia aisladas en el proceso patolgico eran la
respuesta inmune (serologa) del paciente y el estudio de los
caracteres de patogenicidad de las cepas que se desarrolla ms
adelante.
Las pruebas serolgicas por aglutinacin, fijacin de complemento y
enzimoinmunoanlisis se realizaron en los pacientes con enteritis
frente a las cepas homologas excepto en el caso de Y ^.
enterocolitica 0:3 que se utiliz la cepa 1.P.134 como se ha
sealado en el apartado de material y mtodos.
Para conocer los valores serolgicos normales de la poblacin sana
se estudiaron los ttulos por esos mtodos en 72 personas de
diversas edades frente al antgeno 0:3.
En la tabla 43 se recogen los resultados de ese estudio que
permiten constatar que el 97.2% de la poblacin sana presenta
ttulos iguales o inferiores a 1/ 64 por aglutinacin directa, el 98.6%
presenta ttulos iguales o inferiores a 1/8 por fijacin de
complemento y el 95 .8% de dicha poblacin sana presenta valores de
15 .000 a 20.000 U por tcnica de enzimoinmunoanlisis.
Los niveles considerados significativos en base a estos datos han
sido para la aglutinacin directa ttulos^ a 1/128, para la fijacin
de complemento ttulos )> a 1/16, y para enzimoinmunoanlisis
valores > / 20.000 U.
-96-
Con respecto a los otros antgenos no se ha estudiado poblacin
sana evalundose nicamente la aparicin de una respuesta
inmunolgica.
er|
terocolitica serogrupo 3 (Tabla 34 y 44).
De los 22 pacientes con coprocultivo positivo para _ Y . enterocolitca
0:3, 20 presentaron un cuadro de gastroenteritis aguda con
deposiciones lquidas (sanguinolentas en 2 casos) y que causaron
una deshidratacin importante que requiri ingreso hospitalario en
dos. Las nuseas y los vmitos no fueron sntomas importantes.
Diez pacientes presentaron fiebre alta al inicio del cuadro que se
autolimit al cabo de 24-48 horas.
Diez enfermos referan dolor abdominal que fue difuso en ocho y
localizado en fosa ilaca derecha en dos. En los dos casos con dolor
pseudoapendicular se detect una leucocitosis con neutrofilia y
desviacin a la izquierda.
Dos pacientes presentaron eritema nodoso en un caso asociado a la
gastroenteritis y en otro precedido de una artritis
metacarpofalngica.
En 20 pacientes se aisl el microorganismo por tcnica directa y en
2 por tcnica de enriquecimiento.
De los 22 pacientes infectados por _ Y . enterocolitca 0:3, 19
presentaron seroaglutinacin positiva a ttulos iguales o superiores
a 1/128 (en un paciente no se estudi); la fijacin de complemento
fue positiva > / 1/16 en 12 (en uno no se estudi) y la prueba de
EIA fue positiva > / 10000 U. en 18. En 2 casos la serologa fue
negativa por las tres tcnicas. En las figuras 1, 2 y 3 se muestran
los ttulos de aglutinacin directa, fijacin de complemento y
-97-
enzimoinmunoanlisis de los pacientes con coprocultivo positivo por
. enterocolitica 03 en relacin con los ttulos del grupo control.
En la figura 4 se recogen los ttulos por las tres tcnicas en
relacin con el momento de la extraccin respecto el cuadro clnico.
Se pudo constatar el estado de portador en 7 pacientes en perodos
que oscilaban entre 9 y 35 das.
El perodo ms corto en que se detect la erradicacin del
microorganismo fue de 4 das aunque este paciente presentaba
serologa negativa y estaba infectado simultneamente por G.
lamblia.
En 15 de 22 pacientes infectados por el serotipo 0:3 se estudi la
epidemiologa de los contactos prximos y solo pudo detectarse en 2
pacientes, en un hermano que presentaba asimismo un cuadro de
enteritis, y en la madre y hermano asintomticos del otro paciente.
Las manifestaciones clnicas de estos pacientes se recogen en la
tabla 44.
Otros serogrupos {Tablas 35-42)
De los 19 pacientes estudiados infectados por otros serogrupos 05;
06; 07,13,1; 013; 025,35; 025,35,28; 030 y 039,41 de _ Y .
enterocolitica, 15 presentaron una gastroenteritis acompaada de
dolor abdominal en 9 casos y que en 1 caso se present en una
paciente afecta de una enfermedad de Crohn.
Cuatro paciente debutaron con una artritis reactiva, en ningn
caso acompaada o precedida por diarrea y que en 1 caso fue
seguida por la aparicin de un eritema nodoso en extremidades
inferiores. En 1 caso la artritis apareci en un paciente afecto de
una espondilitis anquilopoytica y en otro caso apareci en un
paciente HLA-B27 positivo.
-98-
Todas las cepas se aislaron tras enriquecimiento, excepto una cepa
del serogrupo 025, 35, 28 que se aisl por tcnica directa.
Todos los pacientes presentaron serologa negativa frente al
antgeno homlogo a la cepa aislada.
En todos los pacientes el coprocultivo efectuado de control fue
negativo excepto en un caso en que se aisl . j'ejuni y que se
trataba de una paciente con una hipogammaglobulinemia con
diarreas recurrentes por distintos enteropatgenos.
Todos los contactos familiares fueron negativos.
-99-
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Aglutinacin Fijacin de complemento Enzimoinmunoanlisis
Ttulo N2S % A Ttulo N9S % A Ttulo N9S % A
1/16 37 51.3 1/4 50 69.4 5000 24 33.4
1/16 13 69.4 1/4 14 88.8 5000-10000 34 80.5
1/32 17 93 1/8 7 98.6 10000-15000 7 90.2
1/64 2 97.2 1/16 O 100 15000-20000 4 95.8
1/128 2 100 1/32 1 100 20000-25000 O 95.8
1/128 O 100 1/32 25000-30000 2 98.6
30000 1 100
n72 x =75.8 - 62
Tabla 43. Ttulos de aglutinacin, fijacin de complemento y
enzimoinmunoanlisis en 72 controles sanos frente al antgeno de
_ Y . enterocolitica 0:3.
N9 S: Nmero de sueros.
%A: Tantos por ciento acumulativos. ^
-114-
enterocolitica 0:3 (22 pacientes)
Sexo: 7 varones
15 mujeres
Edad media: 18 aos (11 m. a 81 a.)
Manifestaciones clnicas N9 pacientes %
Diarreas
Fiebre
Dolor abdominal difuso
Dolor abdominal pseudoapendicular
Vmitos
Deshidratacin
Eritema nodoso
Artritis reactiva
20
10
8
2
3
2
2
2
91
45
36
9
13
9
9
9
Tabla 44. Manifestaciones clnicas de los pacientes con infeccin
por Y. enterocolitica 0:3.
-115-
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35
30
25
20
15
10
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con t rol
Figura 1. Resultados obtenidos con la prueba de aglutinacin
directa en la deteccin de anticuerpos especficos para
Y. enterocolitica 03 en 22 enfermos de gastroenteritis con
coprocultivo positivo y en 72 sueros control.
-116-
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copro Ye03
control
Figura 2. Resultados obtenidos con la prueba de fijacin de
complemento en la deteccin de anticuerpos especficos para
Y. enterocolitica 03 en 22 enfermos de gastroenteritis con
coprocultivo positivo y en 72 sueros control.
-117-
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copro Ye03
control
Figura 3. Resultados obtenidos conla prueba de E.L.I.S.A. enla
deteccinde anticuerpos especficos para _ Y . enterocolitica 03 en22
enfermos de gastroenteritis concoprocultivo positivo y en72
sueros control.
-118-
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ii Pacientes con manifestaciones reumticas
Se han estudiado 97 pacientes afectos de enfermedades reumticas
en relacin a la infeccin por Y. enterocolitica y de los que en 92
casos se obtuvieron los datos clnicos (Tabla 45).
De estos 92 pacientes, 64 presentaban una artritis seronegativa
mono o poliarticular sin otras manifestaciones clnicas. En 4 casos
la artritis iba asociada a un eritema nodoso y en 1 caso se
acompaaba de un cuadro diarreico. Seis enfermos estaban afectos
de un sndrome de Reiter y 16 pacientes presentaban una
sacroileitis, de los cuales el HLA-B27 se estudi en 8 casos siendo
positivo en 6 y que en un caso se acompa de una
gastroenteritis. Una paciente afecta de una 'artritis y que
posteriormente se diagnostic de lupus eritematoso diseminado
tambin se ha incluido en el estudio.
De estos 92 pacientes en 58 se efectu un coprocultivo que en 3
casos fue positivo para _ Y. enterocolitica biotipo 4 y serogrupo 3.
En todos los casos se efectu estudio serolgico frente _ Y.
enterocolitica 0:3 por aglutinacin directa y EIA y frente \_.
enterocolitica 0:9 por aglutinacin directa. Las manifestaciones
clnicas y resultados de la serologa en los casos que fue positiva
frente al serotipo 3 se resumen en la Tabla 46. Ningn paciente
present seroaglutinacin positiva frente al serotipo 9.
En la tabla 47 se relacionan las manifestaciones clnicas y los
resultados de las seropositividades segn fueran por tcnica de
EIA sola o EIA y aglutinacin directa.
-120-
Manifestaciones clnicas N9 pacientes
Artritis reactiva seronegativa
Artritis y Eritema nodoso
Artritis y Diarrea
Sndrome de Reiter
Sacroileitis
Sacroileitis y Diarrea
Artritis - LED
64
4
2
6
15
1
1
69
4
1
6.5
16
1
1
92 pacientes: Sexo: 56 mujeres; 36 varones
Edad media: 36 aos (12 a. a 74 a.)
Tabla 45. Manifestaciones clnicas en 92 pacientes afectos de
enfermedad reumtica.
-121-
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MANIFESTACIONES SEROLOCIA POSITIVA
CLNICAS EIA + AD Solo EIA
Artritis seronegativa
Artritisy Gastroenteritis
Artritisy Eritema nodoso
Sacroileitis
L.E.D. Artritis
S. Reiter
Sin datos clnicos
64
1
4
15
1
6
5
4
1
1
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5
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0
1
1
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Total pacientes: 97
Tanto por ciento de sueros positivos por EIA: 15.4%
Tanto por ciento de sueros positivos por AD: 8'2%
Tabla 47. Relacin entre las manifestaciones clnicas y la serologa
positiva en los 97 pacientes afectos de enfermedades reumticas.
EIA: Enzimoinmunoanlisis. AD: Aglutinacin directa.
-125-
Pacientes con enfermedad inflamatoria crnica del intestino
Tambin se han estudiado 14 enfermos afectos de enfermedad de
Crohn en brote agudo, con coprocultivos negativos en todos los
casos y a los que se efectu estudio serolgico frente a _ Y -
enterocolitica serotipo 3 por aglutinacin directa y por
enzimoinmunoanlisis y a _ Y . enterocolitica serotipo 9 por
aglutinacin directa. Los pacientes presentaron serologa negativa
frente a ambos serotipos. Estos resultados se presentan en la tabla
48.
-126-
Enfermedad de Crohn
14 pacientes
Coprocultivos negativos en todos los casos.
N2 AD 0:3 EIA 0:3 AD 0:9
643
639
375
1079
1019
2063
1854
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1290
1366
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Neg
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Neg
Neg
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1/ 32
Neg
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11534
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Tabla 48. Resultado del estudio serolgico en los pacientes afectos
de enfermedad de Crohn.
AD: Aglutinacin directa.
EIA: Enzimoinmunoanlisis.
-127-
d Patogenicidad.
En todas las cepas aisladas de pacientes de los que se dispuso de
datos clnicos y serolgicos, se estudiaron 3 marcadores de
patogenicidad "in vitro": la calcio dependencia a 372C, la
autoaglutinacin a 372C y la presencia de pirazinamidasa.
En las tablas 49 y 50 se recogen los resultados del estudio. De las
21 cepas del serogrupo 03, 19 mostraron disociacin colonial a 372C
respecto al control a 28QC. Cuando se estudiaron las cepas
dependientes de calcio presentaron autoaglutinacin excepto una, y
todas fueron pirazinamidasa negativa. Una cepa no mostr
disociacin ni autoaglutinacin aunque fue pirazinamidasa negativa
y otra present las tres pruebas de patogenicidad 'negativas.
Las cepas estudiadas de los dems serotipos fueron negativas
excepto la 150-C del serogrupo 030 que present disociacin y
pirazinamidasa negativa aunque no aglutinaban y corresponda a
una paciente de la que se aisl la cepa por enriquecimiento y
presentaba serologa negativa.
-128-
Calcio dependencia Autoaglutinacin Pirazinamidasa
Cepas Disociacin
379C/289C
508-C +
296-C +
148-C +
99-C +
486-C +
411-C +
736-C +
978-C +
91-C +
297-C +
451-C +
673-C +
790-C Neg
779-C +
263-C +
758-C +
337-C +
111-C +
479-C Neg
456-C +
415-C +
Tabla 49. Marcadores
Tipo colonia
379C
G/p
G/p
G/p
G/p
P
G/p
P
P
P
P
P
G/p
G
P
P
P
G/p
G/p
G
P
P
de patogenicidad en
Colonias
G. p.
Neg +
Neg +
Neg +
Neg +
+
Neg +
+
+
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Neg +
Neg
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+
Neg +
Neg Neg
Neg
+
+
Y. enterocolitica
Colonias
G. p.
Neg Neg
Neg Neg
Neg Neg
+ Neg
Neg
Neg Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg Neg
Neg
Neg
Neg
Neg
Neg Neg
Neg Neg
+
Neg
Neg
biotipo 4
serogrupo 03. G.: colonias grandes; p.: colonias pequeas.
Positivo: +. Negativo: Neg.
-129-
Calcio dependencia
Cepas Disociacin Tipo colonia
372C/ 289C 379C
Autoaglutinacin
Colonias
G. p.
Pirazinamidasa
Colonias
C. p.
965-C
968-C
Neg
Neg
G
G
Neg
Neg
Y. enterocoMtica 0:25, 30
571-C
573-C
Neg
Neg
G
G
Neg
Neg
Y. enterocolitica 0:25, 35
581-C Neg Neg
Y. enterocolitica 0:25, 35, 28
903-C Neg
Neg
Tabla 50. Marcadores de patogenicidad en otros serogrupos de _ Y. enterocolitica.
Positivo: +. Negativo: Neg.
-130-
Calcio dependencia Autoaglutinacin Pirazinamidasa
Cepas Disociacin
372C/289C
576-C Neg
559-C Neg
605-C Neg
592-C Neg
150-C +
332-C Neg
852-C Neg
661-C Neg
841-C Neg
987-C Neg
575-C Neg
576-C Neg
Tipo colonia
372C
G
C
C
G
G/ p
G
G
G
G
G
G
G
Colonias
G. p. G. p.
Neg +
Neg +
Neg +
Neg +
Neg Neg + Neg
Neg +
Neg +
Neg +
Neg +
Neg +
Neg +
Neg +
76-C Neg G
Tabla 50 (continuacin).
Neg
-131-
Calcio dependencia
Cepas Disociacin Tipo colonia
379C/282C 379C
Autoaglutinacin Pirazinamidasa
Colonias
C. p.
Colonias
G. p.
Y. enterocolitica 0:7, 13, 19
961-C N eg N eg
479-C Neg N eg
954-C Neg Neg
777-C Neg
Neg
921-C Neg
Neg
Tabla 50 (continuacin).
-132-
e Caracteres metablicos.
Todas las cepas aisladas fueron identificadas en base a los caracteres
metablicos segn tcnicas y criterios descritos por Brenner et al.,
Bercovier et al. y Ursing et al. (12-15).
Los resultados de las pruebas bioqumicas efectuadas en 138 cepas
de origen humano se recogen en la tabla 51. Los resultados se han
agrupado por especies y biotipos.
En la tabla 52 se sealan las atipias de las cepas aisladas en
relacin a la ureasa, lactosa y ONPC, caracteres que usualmente se
utilizan como screening.
En las tablas 53, 54 y 55 se recogen los resultados del estudio
bioqumico de 149 cepas aisladas del tracto digestivo (heces) de
diversos animales, 36 aisladas de distintos alimentos y 51
procedentes de lengua de cerdo.
En la tabla 56 se sealan las atipias de estas cepas en relacin a la
produccin de gas en glucosa, ureasa, lactosa y ONPG.
Asimismo se destacan 14 cepas correspondientes a 4 especies que
han presentado pigmento amarillo.
Dado que no hemos podido constatar en la bibliografa consultada la
existencia de cepas con este carcter se describen con detalle
(tabla 57) las caractersticas metablicas y el serogrupo y lisotipo
de estas cepas (tabla 58).
-133-
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Atipla N2 de cepas Especie, biotipo.
Lactosa 10 7: Y. enterocolitica b.1
1: Y. enterocolitica b.H
2: Y. intermedia
ONPG 3 3: Y. enterocolitica b.4
Ureasa 3 3: Y. enterocolitica b.l
Tabla 52. Atipias en los caracteres metablicos de identificacin
presuntiva en 138 cepas de Yersinia de origen humano.
-135-
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Atipla N9 de cepas Especie, biotipo
Lactosa 1 : _Y. kristensen 1
3: \_. enterocolitica 2 b.1
1 b. 2
ON PC 2: _ Y . enterocolitica 1 b.1
1 b.2
1: Y. kristensen
Ureasa 1: Y. intermedia b.2
Gas glucosa 1: Y. enterocolitica b.1
Pigmento
amarillo 1 : Yersinia sp
4: V\ enterocolitica 3 b.1
1 b.3
1: Y. frederiksenii
: Y. kristensen
4: Y. intermedia 2 b.1
2 b.4
Tabla 56. Atipias en los cara'cteres metablicos de identificacin
presuntiva en 236 cepas de Yersinia de orgeno no humano.
-139-
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Salchicha
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A. sylvaticus
A. sylvaticus
C. russulae
Lechuga
C. russulae
A. sapidus
Vaca
Vaca
Vaca
Merluza
A. sylvaticus
Tabla 58. Biotipo, serogrupo, lisotipo y procedencia de las 14 cepas de
Yersinia con pigmento amarillo.
-142-
f Sensibilidad a los antimcrobianos
El estudio de la sensibilidad a los antibiticos se ha efectuado
dividiendo las cepas en 2 grupos segn su procedencia. Por una
parte se han evaluado las cepas de origen humano incluyendo 77
cepas de Y\ enterocolitica del biotipo 1, 4 cepas de Y.
enterocolitca del biotipo 3, 37 cepas de ^f. enterocolitica del
biotipo 4, 2 cepas de Y _ . intermedia, 2 cepas de Y. kristensenii y
9 cepas de Y _ . frederiksenii.
Por lo que respecta a las cepas de origen no humano se han
estudiado 105 cepas de _ Y. enterocolitica del biotipo 1, 5 cepas de
en
terocolitica del biotipo 3, 17 cepas de Y ^ . enterocolitica del
biotipo 4, 63 cepas de _ Y. intermedia, 16 cepas de ^f. kristensenii,
29 cepas de _ Y. frederiksenii y 2 cepas de _ Y. pseudotuberculosis.
La tcnica utilizada ha sido la difusin en agar con discos cargados
con cantidades estndar de antibiticos (220).
Los antibiticos utilizados han sido ampicilina, carbenicina,
mezlocilina, azlocilina, piperacilina, cefalotina, cefoxitina,
cefotaxima, cloramfenicol, tetraciclinas, colistina, gentamicina,
tobramicina, amikacina, netilmicina, kanamicina, neomicina,
estreptomicina, espectinomicina, sulfamidas, trimetoprim y
cotrimoxazol.
En las tablas 59 y 60 se recogen los resultados de la sensibilidad
frente a estos antibiticos de las cepas de origen humano y de las
cepas de origen no humano respectivamente.
Todas las cepas de origen no humano (NH) fueron sensibles a los
aminoglucsidos estudiados en este grupo (gentamicina, tobramicina
y amikacina). Las cepas de origen humano (H) fueron sensibles a
dichos antibiticos, asi como a netilmicina y kanamicina. Solo se
encontraron resistencia entre las cepas de Y. enterocolitica biotipo
-143-
H (0:3) a estreptomicina 60%, espectmomicma 8% y neomicina 3% y
en _ Y , enterocolitica del biotipo 1 a estreptomicina 3%. El resto de
cepas de origen humano fueron sensibles a estos antibiticos.
Todas las cepas de origen NH fueron sensibles al cloramfenicol, sin
embargo entre las cepas de origen humano se encontraron 3 cepas
de Y _ . enterocolitica biotipo 1 y 3 del biotipo 4 que fueron
resistentes.
Se detectaron 2 cepas resistentes a tetraciclinas de ^ Y .
enterocolitica del biotipo 1 y 1 de Y . frederiksenii de origen NH,
encontrndose 2 cepas de Y . enterocolitica biotipo 1 resistentes a
tetraciclinas entre las de origen H, aunque todas las cepas de _ Y .
enterocolitica del biotipo 4 fueron susceptibles.
Entre las cepas de origen NH se encontraron 2 cepas resistentes a
sulfamidas en Y _ . enterocolitica biotipo 4 y 3 en el biotipo 1, 2 de
las cuales fueron resistentes a cotrimoxazol. La incidencia de
resistencia a sulfamidas solo se detect en 17 cepas (4 6%) de _ Y .
enterocolitica biotipo 1 de origen humano, 6 de las cuales fueron
adems resistentes a cotrimoxazol.
Por ltimo todas las cepas fueron sensibles a colistina, excepto las
dos cepas de Y _ . pseudotuberculosis aisladas. Estas dos cepas
fueron sensibles a todos los antimicrobianos estudiados incluyendo
los beta-lactmicos.
En la tabla 61 se presenta la sensibilidad de todas las cepas de
Y ersinia frente a los antibiticos beta-lactmicos. Con respecto a
estos antibiticos hay que sealar los siguientes resultados:
Y ersinia enterocolitica biotipo H . Todas las cepas fueron
resistentes a ampicilina, carbenicilina y cefalotina y sensibles
a cefotaxima. Un nmero muy limitado fueron resistentes a
cefoxitina (6% de NH y 3% de H).
-144-
_ Y . enterocoltica biotipo 1. Todas fueron resistentes a
ampicilina y cefalotina. La mayora de las cepas fueron
resistentes a carbenicillna y cefoxitina y todas fueron
sensibles a cefotaxima.
Y . enterocolitica biotipo 3. Presentaron un patrn semejante a
las anteriores aunque fueron regularmente sensibles a
carbenicilina.
Y . kristensenii. Algunas cepas fueron sensibles a ampicilina
( 5 6 %) y todas fueron sensibles a carbenicilina. En cuanto a
las cefalosporinas todas fueron resistentes a cefalotina y
sensibles a cefoxitina y cefotaxima.
_ Y . frederiksenii y _ Y . intermedia. Presentaron un patrn
semejante con algunas cepas sensibles a ampicilina,
carbenicilina, cefalotina y cefoxitina y todas ellas sensibles a
cefotaxima.
-145-
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