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Licence-Master Bioinformatique

Contrle continu 06/03/06


Correction
- Vraies questions de cours
- fausses questions de cours: questions pour voir si pouviez imaginer une
rponse crdible qui ntait pas de faon claire dans le cours
- Vrais exercices dont la rponse tait trouvable si le cours tait assimil ou
de logique pure
- faux exercices, danticipation par rapport au cours venir, mais faisant appel
des notions de biologie trs mdiatises, permettant de voir quel est votre recul
maintenant par rapport ces notions
Thme 1 : Les protines
On donne la squence dune protine :
Ile-Ala-His-Thr-Tyr-Gly-Pro-Phe-Glu-Ala-Ala-Met-Cys-Lys-Trp-Glu-Glu-Glu-Pro-
Asp-Gly-Met-Glu-Cys-Ala-Phe-His-Arg
Question 1 : Dfinissez une protine. Quelle est limportance de connatre sa
squence ?
Vraie question de cours
Question 2 : Comment peut-on obtenir la squence dune protine ?
On peut faire un squenage direct par des mthodes chimiques bases sur les
proprits chimiques diffrentes des acides amins que lon peut ainsi identifier:
non prsent en cours, devin par un tudiant.
On peut purifier lARNm, on le rtrotranscrit en cDNA, on squence le cDNA, on
fait une traduction in silico en appliquant le code gntique. Tout le monde a
peu prs dit cela
MAIS il faut tre capable de purifier le bon ARNm, donc de lidentifier. Pour cela
- il faut un indice: un fragment de squence pour pouvoir faire un
Northern-blot.
- On peut aussi faire des banques dexpression
Dtermination chimique de la squence dune
protine par la mthode de la dgradation dEdman.
Dans une premire tape, on fait ragir lextrmit N-
terminale de la protine avec du phenylisothiocyanate
(PITC), un compos fluorescent. Lextrmit COOH ne
peut pas ragir avec ce compos.
Dans une deuxime tape, on fait subir la protine
marque une hydrolyse acide lgre. Dans cette
condition, Le PITC a tendance se cycliser et ainsi se
cliver du reste de la protine. Le produit cyclis sappelle
le phenylthiohydantoin (PTH). Lhydrolyse acide gnre
donc un PTH associ lacide amin N-terminal et une
protine raccourcie de son acide amin N-terminal et
prsentant une nouvelle extrmit N-terminale.
Lacide amin fix au PTH est ensuite identifi par
chromatographie liquide, sur la base de ses proprits
chimiques.
Le restant de la protine est soumise de nouveau aux
deux tapes prcdentes. Ainsi les acides amins N-
terminaux sont identifis successivement gnrant la
squence de la protine.
Faire une banque de cDNA. Les ARNm totaux sont extraits et purifis de cellules en culture ou dorganes. La
retrotranscription par la reverse transcriptase (une enzyme virale capable de polymriser de lADN partir dune matrice ARN)
est amorce laide dun primer oligo(dT). La RNase H (une enzyme qui dgrade uniquement lARN dans les hybrides
ADN/ARN) est ensuite utilise pour liminer lADN. Lextrmit 3 end du cDNA rsultant a tendance former une petite
pingle cheveux; cette petite pingle sert de primer naturel pour amorcer la polymrisation du 2
me
brin dADN. La
nuclase S1 permet ensuite de couper la liaison interbrin. Le cDNA double brin ainsi gnr est ligu ses deux extrmits
un linker, cest--dire un petit fragment dADN contenant un site de restriction pour EcoRI. Une digestion EcoRI permettra de
linsrer dans un vecteur plasmidique ouvert par EcoRI. Le clonage des bactries puis le squenage individuel de chaque
insert plasmidique permettra de dterminer les gnes exprims dans les cellules dorigine.
Principe gnral de clonage dun fragment dADN dans un vecteur
plasmidique.
Un plasmide est un petit chromosome bactrien, autonome, qui contient
des gnes de rsistance aux antibiotiques (non montr). On sait extraire
les plasmides des bactries et les purifier. On y insre in vitro le
fragment dADN cloner. On rintroduit le plasmide recombinant dans
des bactries dpourvues de plasmide par transfection. Les bactries
effectivement transfectes sont slectionnes grce leur rsistance
aux antibiotiques. Les bactries transfectes sont ensuite mise en
culture de faon individuelle. Chaque bactrie se multiplie sous forme
dun clone. Le fragment dADN insr a donc t amplifi.
Identification et isolement dun cDNA codant une protine
dintrt (par exemple un rcepteur membranaire) dans une
banque dexpression.
Les ARNm totaux sont extraits de cellules qui expriment le
rcepteur membranaire dintrt. Ils sont rtrotranscrits en cDNA.
(a) La totalit des cDNAs sont insrs dans des plasmides
modifis de tel sorte que le cDNA puisse tre transcrit et traduit
dans des cellules eucaryotes (ajout dun promoteur eucaryote et
de signaux de polyadnylation).
(b) Les plasmides sont transfects dans une population
population de cellules en culture eucaryotes qui nespriment pas
le rcepteur dintrt. Donc seules les cellules qui ont reu le
cDNA codant pour le rcepteur lexpriment. Pour reprer ces
cellules, on incube la population cellulaire avec le ligand de ce
rcepteur marqu radioactivement.
Cette approche peut-tre gnralise lisolement de cDNA
exprimant nimporte quelle protine, dans la mesure o lon
dispose danticorps permettant le reprage de ces protines.
Question 3 : Quelle partie de cette protine vous attendez-vous trouver sous la
configuration dune hlice alpha ?
Prsence relative des acides amins dans les diffrentes structures secondaires
0.88 0.99 0.96 Arg
1.91 0.64 0.52 Pro
1.28 0.76 0.90 Asn
1.41 0.72 1.04 Asp
1.33 0.95 0.82 Ser
1.64 0.92 0.56 Gly
1.03 1.21 0.82 Thr
0.75 1.14 0.99 Trp
1.05 1.25 0.72 Tyr
0.58 1.32 1.07 Phe
0.51 1.45 0.97 Ile
0.47 1.49 0.91 Val
0.96 0.77 1.23 Lys
0.69 1.08 1.22 His
0.97 0.80 1.27 Gln
1.00 0.75 1.44 Glu
0.39 0.97 1.47 Met
0.59 1.02 1.30 Leu
0.80 0.74 1.11 Cys
0.78 0.90 1.29 Ala
Tour Feuillet beta Hlice alpha Acide amin
La connaissance de ces frquences permet de faire de la prdiction de structure secondaire partir de la squence
Ile - Ala - His - Thr - Tyr - Gly - Pro - Phe - Glu - Ala - Ala - Met -
0.97 1.29 1.22 0.82 0.72 0.56 0.52 1.07 1.44 1.29 1.29 1.47
Cys - Lys - Trp - Glu - Glu - Glu - Pro - Asp - Gly - Met - Glu - Cys -
1.11 1.23 0.99 1.44 1.44 1.44 0.52 1.04 0.56 1.47 1.44 1.11
Ala - Phe - His - Arg
1.29 1.07 1.22 0.96
Intrt:
-Prmices de comment construire un logiciel de prdiction
-Longueur minimale? Voir dans ce qui est connu
-Voir si hlices connues ayant un Trp au milieu
Thme 2 : ADN
On isole le matriel gntique dun virus. Ce matriel gntique est compos
dune molcule dADN.
Question 4 : Expliquez ce quest un virus
Vu trs rapidement en cours
Nouveaux lments dans la suite
On isole le matriel gntique dun virus. Ce matriel gntique est compos
dune molcule dADN.
Lors dune premire exprience, on digre cet ADN du virus par lenzyme de
restriction EcoRI. Le produit de digestion est mis migrer sur un gel
dlectrophorse. La migration acheve, on observe une bande de masse
molculaire 3,4 10
6
.
Question 6 : Quelle est la structure gnrale de cette molcule dADN ?
Circulaire
Nombreuses rponses: pas de site, sous-entendu linaire MAIS
Question 8 : Comment pourrait-on faire pour positionner le site EcoRI par rapport
aux trois sites HpaI ?
Lors dune deuxime exprience on digre cet ADN par une autre enzyme de
restriction, HpaI, on fait migrer les produits de digestion sur gel dlectrophorse, et
on observe 3 bandes de masse molculaire 1,4 10
6
, 0,7 10
6
et 1,3 10
6
Question 7 : Reprsenter schmatiquement la position des trois sites de restriction
sur lADN viral
1,4 10
6
+ 0,7 10
6
+ 1,3 10
6
=3,4 10
6
3,4 10
6
0,7
1,3
1,4
Positions relatives
Question 8 : Comment pourrait-on faire pour positionner le site EcoRI par rapport
aux trois sites HpaI ?
On fait les 2 digestions, une des trois bandes doit tre fragmente. Le site EcoRI
est donc dans cette rgion. La taille des fragments indique la proximit ou pas des
sites
Sur ce principe, on tablit des cartes de restriction qui peuvent ensuite
-servir de marqueurs lors dun assemblage de fragments squencs
-Servir de sites de clonage
-
On connat une deuxime souche de ce virus qui a une pathognicit diffrente de
la prcdente. Lorsque lon digre son ADN par HpaI, on obtient uniquement deux
bandes.
Question 9 : Quelle est la plus simple explication qui rend compte de ce
changement ?
Question 10 : Quel peut-tre lintrt de connatre cette diffrence entre les deux
souches virales ?