Roma-2007

Tcnicas
Aislamiento y purificacin
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Veremos
Mtodos de aislamiento
Centrifugacin: diferencial, sedicmentacin, equilibrio
de sedimentacin
Separacin de protenas:
Cromatografa en columna: de intercambio inico, de
filtracin en gel y de afinidad
Electroforesis en gel: enfoque isoelctrico y
bidimensional en poliacrilamida
Produccin de anticuerpos, purificacin, monoclonales y
como marcadores moleculares
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Bibliografa
ECB: parte final del Cap. 4. pgs. 129-133 y
160-164.
Lodish: Capl 3.6 Purifying, Detecting and
Characterizing Proteins (5a. Ed. En ingls)
Alberts plateado. Cap. 8 Isolating cells and
growing them in culture, Fractionation of
cells, Analyzing Protein Structue and
Function"
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Separar/romper tejidos y
clulas
Tejido
Rompen clulas
con ultrasonido
Paso de clulas
a travs de
orificios
determinados
Suspensin
celular
Horadar la
mb con
detergentes
Rompimiento de clulas en
tubos con mbolos
ajustados
Organelos intactos
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Separacin de clulas
Citometra de flujo:
Se basa en la luz dispersada por las clulas o la
fluorescencia de las mismas.
Presupone la incubacin de clulas de un tejido
cuyos anticuerpos fluorescentes estn unidos
a antgenos de membrana especficos.
Estas clulas fluorescen cuando son pasadas por
el clasificador de clulas (FACS Fluorescence-
activated cell sorter)
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Separacin de clulas
Citometra de flujo
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Ventajas/Limitaciones
Se necesita trabajar en
condiciones muy controladas de
asepsia
Presupone el conocimiento
especfico de los marcadores y
antgenos especficos de las
clulas de inters
Se pueden separar clulas vivas
para su cultivo posterior
Se puede determinar el
contenido de DNA y RNA
Se puede determinar el tamao
y forma de las clulas
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Centrifugacin
El procedimiento mas comn para separar el
homogeneizado o extracto celular en
diferentes fracciones (ultracentrifugas rotan
hasta una velocidad de 100,000 rpm, y genera
fuerzas de hasta 600,000 g)
Camisa de proteccin Material sedimentado
Refrigeracin Vaco
De ngulo fijo.
Puede procesar
volmenes
mayores forman
pastillas poco
compactas
Los rotores de
columpio,
forman pastillas
compactas pero
procesan menos
volumen.
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Rotores de columpio
centrifugacin
Fuerza centrfuga
Las cubetas de metal giran libremente hacia
afuera mientras el rotor gira. Las partculas
suspendidas en la solucin homogeneizada de
clulas, se precipitarn de acuerdo a su tamao.
centrifugacin
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Centrifugacin diferencial
Centrifugacin repetida con un incremento
progresivo de velocidad.
Separa los componentes celulares con base en su
tamao y densidad.
Las partculas son mas grandes y densas estn ms
expuestas a la influencia de las fuerzas centrfugas
y se movern mas rpido hacia el fondo del tubo
formando una pastilla.
Las partculas menos densas permanecen en sus-
pensin en el sobrenadante
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Centrifugacin diferencial
Ultracentrifugacin
1,000 G 20,000 G 150,000 G 80,000 G
El extracto celular se somete progresivamente
a mayores velocidades. As se separan los
componentes celulares, hasta los de menor
tamao (macromolculas).
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Refrigeracin y vaco
Necesarias a medida que se
incrementan las velocidades de
centrifugacin.
Una fuerza de 100,000g
requiere de unas 50,000 rpm (=
833 rps!!!) se requiere de:
a) Refrigeracin
b) vaco
Porqu considera que stas
concidiones son necesarias?
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Separacin de protenas
Diferentes cromatografas
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Cromatografa en columna
Columna con una matriz slida
permeable, con un solvente.
1. Carga la muestra
2. Pasa a travs de bastante solvente
3. Las protenas interactan con la
matriz y se retarda la velocidad de
trayectoria
4. Se colectan separadamente
Se usan diferentes tipos de matriz para empacar la
columna como pequeas esferas
La purificacin se obtiene por electroforesis en gel
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Separa compuestos basado en tamao y carga.
Utiliza en la secuenciacin de DNA
http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e17/17f.htm
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Electroforesis
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HPLC
Por sus siglas en ingls: High-performance
liquid chromatography.
Utiliza pequeas esferas en el empaque (de 3 a
10 micras de dimetro)
Dado el tipo de empaque y lo pequeo de las
esferas, es necesario aplicar altas presiones
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Ventajas/Limitaciones
Excelente grado de
pureza
Presupone el
conocimiento
especfico de las
molculas de inters
para que interacten
con el empaque de la
columna
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Cromt. de intercambio de iones
Separa protenas de acuerdo a su carga. La
columna se empaca con pequeas esferas
que poseen una carga (contraria a la de la
molcula de inters).
La asociacin entre la matriz y
la protena de inters depende
de:
pH
fuerza inica de la solucin
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Cromt. de filtracin en gel
Separa protenas de acuerdo a su tamao. La
matriz de esferas tiene poros muy pequeitos.
Pequeas protenas entran
entre los poros de las esferas,
retrasando su trayectoria. Se
colectan separadamente al final
de la corrida.
Se puede estimar el tamao de
la protena
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Cromt. de afinidad
Las esferas de la matriz contienen otra molcula
acoplada covalentemente, la cual interacta con
la protena de inters.
Las protenas atrapadas, son
eludas por medio de un cambio
de pH con una solucin muy
concentrada de alguna sal. Las
protenas recuperadas por
este mtodo tienen un alto
grado de pureza
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Electroforesis en gel
Se corre bajo un campo
elctrico. Las molculas migran
en una direccin a una velocidad
que refleja su tamao y carga
neta.
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SDS-Page
Se utiliza Dodecil Sulfato de Sodio
(SDS-siglas en ingls) para solubilizar
las protenas.
Las cadenas individuales de un
polipptido forman un complejo con las
molculas de carga negativa del SDS,
el complejo protena-SDS de carga
negativa, migra a travs del block de
gel de poliacrilamida.
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De foco isoelctrico
Las protenas tienen un pH especfico en el cual no
presentan carga que se denomina punto isoelctrico.
Una vez que este punto es alcanzado, bajo un campo
elctrico, las protena no se mover dentro de ese
campo.
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Punto de foco isoelctrico
En una electroforesis de
poliacrilamida en gel (en
forma de tubo) con un
gradiente de pH (en
presencia de una mezcla
de soluciones
amortiguadoras)
Las protenas migran
hasta el punto que les
corresponde su punto
isoelctrico y no migran
mas all.
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Geles en dos dimensiones
Para mezclas complejas de protenas:
1. En un gel angosto, las protenas nativas se
separan de acuerdo a su carga intrnseca
2. Un gel en tubo es colocado en un glocke de
gel y se corre una SDS-PAGE tube, (se
corre en forma perpendicular)
3. Cada protena del complejo migra de
acuerdo a su tamao y carga neta
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Gel en dos dimensiones
Primera separacin :
De acuerdo al punto iesoelctrico (de izquierda a derecha (arriba)
Segunda separacin:
De acuerdo a su peso molecular (de arriba hacia abajo)
Protenas en E.
coli. Cada punto
representa una
cadena de
polipptidos
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Secuenciacin
Se rompe la molcula en pequeas cadenas de
pptidos
Se liga un reactivo qumico con el grupo amino
libre
En presencia de un sol ligeramente cida, el
qumico rompe el siguiente enlace peptdico
El aa libre es colectado e identificado por
cromatografa en columna
Se repite nuevamente el proceso una y otra
vez hasta secuenciar toda la molcula
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Por medio de digestores proteicos se va separando la
cadena polipeptdica
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Secuenciacin...
1. Rompen molculas
2. Liga un reactivo
3. Rompe enlace
peptdico
4. Colecta el aa libre
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Secuenciacin
5. Identificacin del aa por
cromatografa
6. Se contina con el
siguiente aa hasta
terminar el pptido
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Aa de blancos especficos
Se utilizan agentes que rompen en aa
especficos
Tripsina ataca el grupo COO
-
entre Lys o
Arg
Bromuro de ciangeno rompe el siguiente
enlace peptdico siguiente a la Met
Los pptidos mas pequeos, pueden as
secuenciarse
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Aa especficos de blanco
1. Agentes que
rompen enlaces
especficos
2. Tripsina ataca el
COO
-
de Lys o Arg
3. Bromuro de
ciangeno rompe el
siguiente enlace
peptdico a la Met
4. Pptidos pequeos
pueden
secuenciarse
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Cristalografa de RX
Determina la estructura 3-D de las protenas a
una resolucin atmica
Patrones de dispersin se refuerzan unos a
otros a ciertos puntos, lo que resulta en
patrones de difraccin especficos
Cristal de alto
grado de orden
o una protena
pura
cristalizada
La posicin e intensidad de los patrones, revelan la posicin de
los tomos en el cristal. Esta informacin es interpretada por
computadoras y confrontada con la secuencia de aa para
reconstruir la estructura 3D de las protenas.
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Anticuerpos
Los anticuerpos son fciles de inducir
en modelos animales
Se inyectan en el flujo sanguneo para
provocar una respuesta inmune de las
clulas B.
Los anticuerpos son cosechados del
torrente sanguneo
Se usan ratones, conejos, chivos y
pollos entre otros.
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Inmunidad pasiva
http://www.sirinet.net/~jgjohnso/immune.html
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Anticuerpos policlonales
Se inyectan varias dosis a intervalos
regulares durante varias semanas.
Se estimula la produccin de grandes
cantidades de anticuerpos Anti-A por
las clulas B.
Los anticuerpos son liberados al
torrente sanguneo y cosechados..
El antgeno estimula a varias cluls
b (diferentes). Por lo tanto, la
sangre contendr una variedad de
anticuerpos anti-A (que se enlazan a
A en forma ligeramente diferente
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Anticuerpos monoclonales
ClulasB de ratn + Clulas B de tumor
Divide
indefinidamente
Produce anti-A, no se
divide indefinidamente
Hbrido
Produce anti-A
Divide indefinidamente
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Purificacin de molculas
La caracterstica del alto grado de
especificidad de los anticuerpos es
usada para purificar diferentes tipos
de molculas
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Immunoprecipitacin
Las molculas A se
unen al las
molculas de
antgeno anti-A,
posteriormente
son colectadas por
centrifugacin
Se agrega el
anticuerpo
especfico
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Inmunoafinidad
Cromatografa en columna
Perlas cubiertas con
anticuerpos anti-A
Columna
empacada con
perlas
cubiertas
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Cromt. en columna de
inmunoafinidad
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Marcadores
moleculares
Las molculas pueden marcarse con
anticuerpos acoplados a otras
molculas especficas o a partculas de
oro coloidal.
Anticuerpos
especficos
Anticuerpos
marcados
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Marcadores moleculares
Anticuerpo fluorescente
se une al antgeno-A en
el tejido. Se detecta
con microscopa de
fluorescencia
El anticuerpo marcado
con oro se une al
antgeno-A en el tejido.
Se puede detectar al
MET o al microscopio
ptico de campo claro
Antigen: pectin in plant cells
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Marcadores moleculares
Incubacin con
una marca (une a
a A) revela la
posicin del
antgeno
Antigeno A se
separa de otras
molculas por
electroforesis
Sensibilidad incrementada: al usar
capas mltiples de anticuerpos.
Realza la respuesta y se usa cuando
se cuenta con muy pocas A: avidina