CULTIVO DE BACTERIAS, ACTINOMICETOS Y HONGOS

INTRODUCCIN

La caracterizacin de las poblaciones de organismos que habitan el suelo requiere de la
identificacin de los gneros y especies de bacterias, actinomicetos, hongos y otros
microorganismos nativos del medio y de la posterior cuantificacin de las poblaciones
existentes expresndolas en trminos de una cantidad (masa o volumen) de suelo. La
primera fase de este trabajo: la identificacin de las especies habitantes del suelo,
requiere de que dispongamos previamente de una poblacin elevada de dichos
organismos, de manera tal que al analizar el suelo, tengamos mayor probabilidad de
encontrarlos. Es conveniente entonces incrementar la poblacin microbiana
proporcionndole los nutrientes necesarios para que los organismos prosperen y se
multipliquen, a travs de los medios nutritivos o cultivos de enriquecimiento.

Las bacterias son los organismos ms numerosos en el suelo. Pseudomonas, Bacillus,
Clostridium, Achromobacter, Agrobacterium y Streptomyces son gneros que
predominan. Las especies de Streptomyces son las ms numerosas entre los
Actinomicetos, los cuales son estudiados separadamente debido a su importancia en el
suelo. Ellos producen clulas que se asemejan a los hongos pero son mas pequeas y
usualmente de crecimiento mas lento. Los medios para el aislamiento de bacterias y
actinomicetos son mantenidos a baja energa y se usan mayores diluciones para reducir
la poblacin de hongos.
La mayora de los hongos son filamentosos y se reproducen por esporas asexuales. Ellos
pertenecen principalmente a la clase de los hongos imperfectos. Penicillium y
Aspergillus tienden a predominar. Aunque otras clases de hongos estn presentes
representando a los Ficomicetos, Ascomicetos y Basidiomicetos, son aislados menos
frecuentemente. De hecho, los Basidiomicetos de lento crecimiento son muy rara vez
aislados. Los medios selectivos para hongos usualmente contienen inhibidores tales
como la estreptomicina y rosa bengala o son cidos.

MATERIALES Y MTODOS

A. Materiales
- Muestra de suelo (con humedad de campo)
- Placas de Petri esterilizadas.
- Medios nutritivos agarizados: medio de agar albmina de huevo para bacterias y
actinomicetos y medio de Martin.
- Frasco de vidrio de 90 ml con agua destilada esterilizada.
- Pipetas esterilizadas de 10, 5 y 1 ml.
- Mechero de alcohol.
- Esptulas de metal esterilizadas.

B. Equipo.
- Cmara de flujo laminar
- Incubadora
C. Procedimiento:

1. Se tomara 50 g de suelo de la muestra ingresada y se determinara su % Humedad
gravimtrica (% H.G), a partir de all realizar los clculos para obtener la cantidad
de 10 g. de suelo seco contenido en la humedad del suelo de la muestra.
2. Preparar un plan para sus diluciones y plaqueos. Las bacterias y actinomicetos
debern ser plaqueados a 10
-4
, 10
-5
, 10
-6
y 10
-7
, mientras que los hongos debern ser
plaqueados a 10
-3
, 10
-4
y 10
-5
. Para ello se preparar una dilucin inicial de suelo-
agua de aproximadamente 1/10 (10
-1
).
3. Pesar la muestra fresca la cantidad correspondiente a 10 g de suelo seco y aadir a
un frasco de 90 ml de agua destilada esterilizada (debe determinarse previamente el
contenido de humedad del suelo).
4. Agitar vigorosamente el frasco con agua evitando que la suspensin de suelo-agua
se asiente.
5. Con una pipeta estril, transferir 10 ml de la suspensin a un segundo frasco de 90
ml para preparar la dilucin 10
-2
. Repetir el procedimiento para las sucesivas
diluciones.
6. Separar placas petri estriles y marcar la tapa de cada placa con la siguiente
informacin (Ud. querr ver a travs del agar en la base de la placa para contar
colonias): tipo de medio, nivel de dilucin, numero de repeticin, grupo y fecha.
7. Aadir a cada placa, 1 ml de la dilucin de suelo respectiva, luego aspticamente
aada aproximadamente 15 ml del medio agarizado apropiado (de manera que 3/4
de la base de la placa estn cubiertos con el agar derretido y el medio forme una
pelcula de unos 2 a 3 mm de espesor). La temperatura ideal para el plaqueo es
cuando el medio se encuentra entre los 45 50 C, lo cual coincide cuando el medio
se encuentra lquido pero es manipulable sin causar quemaduras.
8. Mezclar generosamente el agar y el inoculo teniendo cuidado en evitar que el medio
tome contacto con la tapa. Dejar que las placas solidifiquen. Hacer tres repeticiones
por dilucin. Considerar tres repeticiones adicionales sin inocular como muestras
blanco o control.
9. Luego que el agar haya solidificado, invertir las placas para evitar que la humedad
condensada de las tapas caiga sobre el agar y disperse las colonias.
10. Colocar las placas luego de la siembra en cmara de incubacin a 28 30 C por 2-3
das para lectura de bacterias y de 3-7 dias lectura de hongos y actinomicetos .

RESULTADOS
La lectura de las placas se realizar mediante la observacin visual del nmero y forma
de las colonias desarrolladas. Se diferenciar entre colonias de bacterias, hongos y
actinomicetos atendiendo a su forma y apariencia. Se realizar asimismo el conteo del
nmero de unidades formadoras de colonia (ufc). Para el clculo de la poblacin
microbiana se considerarn aquellas placas que contengan entre 30 a 300 ufc.

Conteo de colonias fungales: Usando un contador de colonias cuente el nmero de
colonias fungales despus de asegurarse que puede de hecho distinguirlas.

Conteo de colonias de bacterias y actinomicetos: Examine las placas de bacterias y
actinomicetos despus de una semana. Usando el contador de colonias cuente el nmero
de colonias bacterianas y de actinomicetos. Antes de contar, asegrese que puede
distinguir entre bacterias y actinomicetos considerando las siguientes guas:
a. Las colonias que tienen una superficie pulverulenta blanca, gris o negra son
mayormente actinomicetos. Despus de la esporulacin, las hifas areas producen
conidias que parecen pulverulentas o terrosas y son a menudo pigmentadas.
b. Las colonias observadas sin la ayuda de un microscopio, que tienen un halo distinto
con un interior oscuro son mayormente actinomicetos.
c. Las colonias extendidas, claras o vidriosas son usualmente bacterias.
d. Las colonias que tienen una superficie muy brillante son principalmente bacterias.
e. Las colonias en forma de lente o limn dentro del agar mismo son mayormente
bacterias.
f. Las colonias que tienen una superficie muy delgada son mayormente bacterias.
g. Las colonias de actinomicetos son mas firmes que las de bacterias cuando son
hincadas con una aguja delgada.
Siempre que haya duda sobre la identidad de una colonia, se debe examinar el borde
de la misma con la ayuda del objetivo de menor aumento de un microscopio. Las
colonias de actinomicetos (con muy pocas excepciones) tienen hifas radiales al
borde de la colonia. Las bacterias siempre tienen bordes lisos, aunque algunas
pueden ser onduladas o irregulares. Calcule separadamente el nmero de bacterias y
actinomicetos por gramo de suelo seco a estufa.