UNIVERSIDAD POLITCNICA METROPOLITANA

DE PUEBLA

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

PROYECTO DESARROLLADO:
Caracterizacin de Vibrio cholerae en
muestras de camarn coctelero en la
ciudad de Puebla.


ALUMNAS

MARA FERNANDA DEL POZO GONZLEZ
LORENA GRATE VLEZ
DIANA VALERIA GONZLEZ MONTESINOS


PUEBLA DE ZARAGOZA A 30 DE ABRIL DEL 2014







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NDICE pgs.

I. INTRODUCCIN 3
II. MARCO TERICO
2.1 Agente etiolgico: Vibrio cholerae 5
2.2 Clera 5
2.3 Composicin genmica 6
2.4 Causa: toxina colrica 6
III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 8
IV. OBJETIVO GENERAL 9
V. OBJETIVOS ESPECFICOS 9
VI. MATERIALES Y MTODOS 10
6.1 Obtencin de cepas
a) Preparacin del medio de cultivo 11
b) Esterilizacin 12
c) Muestreo de camarn 13
d) Pesado y pre enriquecimiento 13
e) Sembrado por goteo 15
6.2 Conteo celular 15
6.3 Resembrado de cepas 16
VII. RESULTADOS Y DISCUSIN 18
VIII. CONCLUSIN 20
IX. REFERENCIAS 21









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Caracterizacin de Vibrio cholerae en
muestras de camarn coctelero en la
ciudad de Puebla.

I. Introduccin
ibrio est conformado por varias especies, que tienen repercusiones en la salud
pblica, relacionadas con enfermedades gastrointestinales, particularmente con
enfermedades transmitidas por alimentos de origen marino (OPS, consultado el
27 de abril de 2014).
Las especies del gnero Vibrio, son bacilos curvos gram negativos de vida libre y
crecimiento rpido, no producen esporas y se mueven de forma errtica debido a que
tienen un flagelo, son aerobios y anaerobios facultativos, fermentadores de glucosa y
oxidasa positivo. Son tolerantes a pH alcalino y algunas especies necesitan medios altos
en salinidad para su ptimo desarrollo (Garca-Lzaro, 2010).
Vibrio cuenta con un antgeno flagelar H que no distingue entre vibriones patgenos y no
patgenos, y un antgeno somtico O que si logra esta distincin (Garca-Lzaro, 2010).
Estn presentes en gran parte de ambientes acutico, ya sea en agua dulce o salada por
largas temporadas. Es comn encontrarlas en aguas templadas y aislarse en mariscos y
pescados.
Pero hasta el momento se han encontrado ms de 35 especies del genero Vibrio, de las
cuales, 12 son vibriones marinos que no se les ha encontrado una relacin directa con
alguna patologa humana. Y el resto de las especies, entre ellas: V. cholerae, V.
parahemolyticus, V. vulnificus etc; son causantes de enfermedades gastrointestinales,
infeccin de heridas y tejidos blandos y sepsis (OPS, consultado el 27 de abril de 2014).
Las especies patgenas mencionadas, Vibrio cholerae es la ms comn, la cepa O1 es la
responsable de clera pandmico, relacionada a una enfermedad gastrointestinal
infecciosa, generalizado por los siguientes sntomas: vmito, diarrea y por consecuencia
deshidratacin grave (OPS, consultado el 27 de abril de 2014).

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La bacteria entra al organismo con el agua o los alimentos contaminados. La
enfermedad es endmica en por lo menos 80 pases con epidemias que ocurren en varias
regiones, incluyendo frica, Sudamrica y el sur y sudeste de Asia. V. cholerae O1,
biotipo El Tor es el responsable de la sptima pandemia que se inici en 1961 cuando
apareci la bacteria como causa de epidemia de clera en Celebes (Sulawesi), Indonesia.
La enfermedad se propag rpidamente a otros pases de Asia del este y lleg a
Bangladesh en 1963, a India en 1964, y a la URSS, Irn e Irak en 1965-1966. En 1970 el
clera invadi el oeste de frica, la cual no haba experimentado la enfermedad por ms
de 100 aos. La enfermedad se dispers rpidamente a varios pases de frica y se
convirti en endmica en casi todo el continente. En 1991 el clera golpe a
Latinoamrica, en donde tambin haba estado ausente por ms de un siglo. Su ingreso
fue por Per. En el primer ao se propag a 11 pases, y subsecuentemente a travs del
continente (OPS, consultado el 27 de abril de 2014).
En general el continente que ms casos tiene es frica, seguido por Asia y por ultimo
Amrica (Ilustracin 1).

ILUSTRACIN 1 DISTRIBUCIN MUNDIAL DE LOS BROTES DE CASOS DE CLERA EN LOS AOS 2011-2012 ( OMS,2013)






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II. Marco terico

2.1 Agente etiolgico: Vibrio cholerae
Vibrio cholerae es un bacilo Gram negativo, mvil, flagelado que no forma esporas, que
sobrevive en medios alcalinos a temperaturas entre 22 y 40C. Agente etiolgico del
clera epidmico y pandmico humano, se clasifica con base en su antgeno somtico O,
actualmente se conocen 198 serogrupos. Cada serogrupos se define por su suero
monoespecfico; Vibrio cholerae O1 se define con este nombre ya que aglutina con el
suero O1, mientras que los otros 198 restantes serogrupos se les denomina
genricamente como NO-O1 (Koneman et al., 2001; SSA, 2001).

2.2 Enfermedad: Clera
La infeccin por Vibrio cholerae es adquirida por la ingestin de agua o alimentos
contaminados consumidos crudos o insuficientemente cocidos. La posibilidad de que se
desencadene un brote de clera en una regin dada depende de varios factores: el
nmero de individuos susceptibles, la exposicin a aguas cloacales o aguas no tratadas y
alimentos contaminados, y la presencia de un reservorio acutico de Vibrio cholerae
(Caffer et al., 2007) (Ilustracin 2).
El ser humano es un husped incidental y transitorio pero es quien disemina la bacteria
hacia las fuentes de agua y alimentos (SSA, 2001), los Vibrios se desarrollan como
clulas de vida libre en los reservorios de estuarios marinos. Mejorar las condiciones
sanitarias puede hacer posible un control eficaz de la enfermedad (Murray et al., 2006).

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ILUSTRACIN 2. PRINCIPALES EVENTOS EPIDEMIOLGICOS DE CLERA OCURRIDOS DESDE 1817. (LENDON ET AL, 2006)

2.3 Composicin genmica
El genoma de Vibrio cholerae contiene 3885 marcos de lectura abiertos distribuidos en
dos cromosomas circulares, el cromosoma 1 (2.96 millones de pares de bases) y el
cromosoma 2 (1.07 millones de pares de bases). El primer cromosoma contiene genes
para funciones celulares esenciales como la replicacin del ADN, la transcripcin y la
sntesis de protenas, adems de contener la mayora de los genes de virulencia como el
gen de la toxina del clera que est localizado en el fago CTX integrado en este
cromosoma. El segundo cromosoma tambin contiene genes esenciales como genes de
protenas ribosomales y genes de transporte (Prescott et al., 2002).

2.4 Causa: toxina colrica
La toxina colrica es una enterotoxina de tipo A-B y est constituida por un componente A
de 27,200 Da y por cinco subunidades B, cada una de 11,600 Da, la subunidad B
contiene el sitio de unin a travs del cual la toxina colrica se combina especficamente
con el ganglisido GM1 en la membrana citoplasmtica epitelial, la accin txica
corresponde a la cadena A que activa la enzima celular adenilato ciclasa que transforma
el ATP en AMP cclico (cAMP), el aumento en los niveles de cAMP lleva consigo la

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secrecin activa en el intestino de iones cloruro y bicarbonato procedentes de las clulas
mucosas que van al lumen del intestino. Este cambio en el equilibrio inico origina la
secrecin de grandes cantidades de agua, la intensidad de la perdida acuosa en el
intestino delgado es mayor que la reabsorcin del agua en el intestino grueso (Ilustracin
3), (Fernndez, 2008; Madigan et al., 2003).


ILUSTRACIN 2 MTODO DE INFECCIN DE VIBRIO CHOLERAE (RODRGUEZ ET AL, 2000)












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III. Planteamiento del problema
Los resultados obtenidos mediante el aislamiento microbiolgico permiten determinar la
cantidad de microorganismos patgenos como Vibrio cholerae presente en el camarn,
sin embargo, es necesario evaluar la cantidad de este microorganismo dentro de las
muestras a analizar as como otros factores de patogenicidad con la finalidad de
determinar si es un agente causal de clera.



















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IV. Objetivo General:

Aislar Vibrio cholerae del camarn coctelero a partir de los puntos de venta ms
representativos de la ciudad de Puebla.


V. Objetivos especficos:

Disear la metodologa ptima de muestreo para que sea representativo
Desarrollar la metodologa de aislamiento as como realizar la conservacin de
cepas.
Identificar las especies de Vibrio en el aislamiento en medio TCBS
Establecer el nmero de UFC obtenidas en cada muestreo.












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V. Materiales y mtodos

Descripcin del material
CANTIDAD NOMBRE
2 Mechero Bunsen
3 Vasos de precipitado (250 mL)
3 Matraz Erlenmeyer ( 500 mL)
100 Puntas amarillas para
micropipeta
2 Probetas (200mL)
80 Tubos Eppendorf
20 Tubos Falcon
2 Asas bacteriolgicas
2 Esptulas
50 Cajas Petri
1 Bistur
1 Pinzas de diseccin
1 Pipeta
1 Perilla

Descripcin del equipo
CANTIDAD NOMBRE
1 Parrilla con agitacin
3 Micropipetas 2-20L/ 20-200 L/
100- 1000 L c/u
1 Balanza granataria
1 Autoclave
1 Incubadora
1 Balanza analtica
1 Campana de flujo laminar
1 Contador de clulas


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Descripcin de los reactivos
NOMBRE
Agar TCBS (Tiosulfato, citrato, sales
biliares y sacarosa)
Peptona de casena
NaCl
Extracto de levadura
Agua destilada
Alcohol etlico al 70%


6.1 Obtencin de cepas
Para la produccin de las cepas de Vibrio cholerae en el presente estudio se llev a cabo
el mismo procedimiento para cada una de las 20 muestras con sus respectivas rplicas.
a) Preparacin de medios de cultivo
TCBS (Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa)
Para la elaboracin del medio de cultivo se utiliz 1 L de agua destilada la cual se llev a
una temperatura aproximada de 94C, posteriormente se pesaron y agregaron 89g de
agar TCBS diluyndose a una temperatura controlada en la parrilla de agitacin hasta que
se observara una dilucin homognea.
Se vertieron 20mL de agar TCBS en cada una de las cajas bajo condiciones de
esterilidad hasta obtener un total de 50 cajas con medio de cultivo (Ilustracin 4).

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LB (Luria Bertani)
Para su elaboracin en un volumen de 200mL se pesaron 10g de NaCl, 10g de Extracto
de levadura y 10g de peptona a los cuales se disolvieron en 200mL de agua destilada
(Ilustracin 5).

b) Esterilizacin
Los tubos falcon junto con matraz se esterilizaron en autoclave a 15 libras de presin y
120C por 15 minutos; durante este lapso estas condiciones fueron vigiladas para evitar
errores y accidentes. Despus de ese tiempo el equipo se apag y desconect en espera
de que las condiciones de esterilizacin regresaran a su estado inicial, en consecuencia
se retir el material del equipo prximo a utilizarse.

ILUSTRACIN 4. PREPARACIN DE MEDIO DE CULTIVO
SLIDO TCBS, MEDIO PREFERENTE PARA EL AISLAMIENTO
DE MICROORGANISMOS DEL GNERO VIBRIO
ILUSTRACIN 5. PREPARACIN DE MEDIO DE CULTIVO
LQUIDO LB, MEDIO QUE FUE UTILIZADO PARA EL
ENRIQUECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

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c) Muestreo de camarn
La toma de muestras se realiz dentro de la ciudad de Puebla de forma representativa,
abarcando as los principales puntos de venta de camarn coctelero con una distribucin
adecuada de los mismos (Ilustracin 6).
Cada una de las muestras fue transportada en hielo al laboratorio para ser procesadas
como se describe a continuacin.

d) Pesado y pre enriquecimiento
Se pesaron 3g de camarn de cada una de las muestras, posteriormente se adicionaron
10mL de agar LB en cada uno de los tubos falcon a los que se vertieron los 3g de
camarn con la ayuda una pinzas dentro de la campana de flujo laminar y un mechero
para mantener las condiciones de inocuidad adecuadas (Ilustracin 7). Cada tubo fue
etiquetado y llevado a la incubadora a una temperatura de 30C por un perodo de 24
horas.

ILUSTRACIN 6. MUESTREO DE CAMARN PACOTILLA.
PARA EVITAR UNA MAYOR PROLIFERACIN DE
MICROORGANISMOS LAS MUESTRAS FUERON
PROCESADAS EL MISMO DA QUE SE OBTUVIERON.

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e) Serie de diluciones
Las diluciones se realizaron como se explica en el siguiente diagrama (Ilustracin 8):




ILUSTRACIN 7. ADICIN DE LA MUESTRA AL MEDIO DE
CULTIVO LB PARA UN ENRIQUECIMIENTO ADECUADO DE
LOS MICROORGANISMOS.
ILUSTRACIN 8. DILUCIN DE LA MUESTRA CONCENTRADA, LO QUE PERMITE QUE
EN EL MOMENTO DE SEMBRADO LA DISTRIBUCIN Y CONTEO DE LAS COLONIAS SEA
MEJOR

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f) Sembrado por goteo
Se dividieron cada una de las cajas por la mitad para el aprovechamiento de espacio y se
marc cada una de las diluciones desde la 10
-1
hasta la 10
-3
, abriendo las mismas dentro
de la campana de flujo laminar para deshidratarlas por lo menos 20 minutos;
posteriormente se tomaron 20L de cada una de estas diluciones por medio de una
micropipeta y se coloc dicha cantidad en el lugar sealado en forma de gota colocando
en el centro de las disoluciones la misma cantidad de muestra sin diluir (Ilustracin 9). De
esta forma se realizaron 4 rplicas por muestra de camarn.
Al finalizar este proceso las cajas se etiquetaron y sellaron para posteriormente incubarlas
a 30C durante 24 horas.

6.2 Conteo celular
Por medio de un equipo cuenta colonias se procedi a contar el total de ufc (unidades
formadoras de colonias) en cada una de las diluciones (Ilustracin 10), donde
posteriormente y por medio de una frmula es posible obtener el resultado estimado de
colonias por mililitro de solucin.


ILUSTRACIN 9. TCNICA DE SEMBRADO POR GOTEO, DE
ESTA MANERA ES POSIBLE TENER UNA MAYOR CONTROL
EN LAS DILUCIONES YA QUE NO HAY UNA DISPERSIN DE
LA MUESTRA EN EL MEDIO DE CULTIVO.
IMAGEN TOMADA DE HARLEY, PRESCOTT, LABORATORY EXERCISES IN MICROBIOLOGY

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6.3 Resembrado de cepas
Posterior al crecimiento de los microorganismos en el medio de cultivo, debe realizarse un
resembrado de las cepas obtenidas, es decir, bajo condiciones de esterilidad con la
ayuda de la campana de flujo laminar, mechero y un asa bacteriolgica, se tom una
cantidad adecuada de inculo y posteriormente se sembr por tcnica de estriado en un
espacio dentro de la caja en la cual se marc el rea empleada y los datos del sembrado;
con la finalidad de conservar las mismas cepas por tiempos prolongados al adicionar a las
bacterias los nutrientes necesarios para que continen su crecimiento (Ilustracin 11).
Al finalizar este proceso las cajas se etiquetaron y sellaron para posteriormente incubarlas
a 30C durante 24 horas.

ILUSTRACIN 10. CONTEO DE CLULAS EN
UN PERODO DE CRECIMIENTO POSTERIOR
A LAS 24 HORAS
ILUSTRACIN 11. SEMBRADO Y AISLAMIENTO
DE CEPAS DE INTERS, LAS CUALES PUEDEN
CONSERVARSE POR STA TCNICA PARA
ANLISIS POSTERIORES.

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En trminos generales, el proceso realizado fue el siguiente (Diagrama 1)

DIAGRAMA 1. PROCESO GENERAL DEL AISLAMIENTO MICROBIOLGICO UTILIZADO EN ESTE ESTUDIO




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VII. Resultados y discusin.
















ILUSTRACIN 12. SEMBRADO DE COLONIAS EN CULTIVO TCBS DE LOS
MICROORGANISMOS AISLADOS A PARTIR DE LAS MUESTRAS DE CAMARN
COCTELERO.

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En total se analizaron 20 muestras de diferentes
supermercados y mercados del estado de Puebla, dando
un porcentaje mayor positivo a Vibrio cholerae la cual es
una bacteria infecciosa en el ser humano, se puede inferir
que una de las principales causas por la cual las
muestras de camarn contenan este microorganismo, es
debido al mal manejo salubre del vendedor o la
decadencia que tienen los servicios de sanidad o calidad
dentro de las empresas, sin embargo en el mismo estudio
otras muestras fueron negativas, lo cual indica que en
ciertos establecimientos, es de suma importancia la
calidad e inocuidad de los alimentos frescos.
Cabe mencionar que la cantidad de Vibrio cholerae es
bastante mayor a la cantidad de colonias encontradas de
Vibrio parahemolyticus (5%), sin embargo no se descarta
la presencia de ellas, si no que su carga bacteriana es
muy baja.
En el caso de Vibrio cholerae, el nmero de unidades
formadoras de colonias en los ensayos realizados se
encuentra en un rango de 10
5
a 10
7,
en un 75 % de los
mismos, alcanzando valores ms altos que en estudios
realizados en 2013; en otras 3 muestras analizadas, la
cantidad de colonias no exceda de 100 por lo que su
presencia en las diluciones era escasa. Considerando
que la cantidad mnima para adquirir la enfermad de
clera, es 1 x 10
4
bacterias por gramo de marisco, es
posible que la cantidad reportada sea suficiente para desencadenar sntomas y la
enfermedad si no se mantiene la higiene necesaria.
Nmero de ufc de bacterias

muestra aisladas/ml

1 Negativa

2 3.7 x 10
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3 3.6x 10
5


4 Negativa

5 4.4 x 10
4


6 Negativa

7 2.5 x 10
4


8 6.8 x 10
5


9 2.5 x 10
4


10 Negativa

11 Negativa

12 3.7x 10
5


13 0

14 2.5 x 10
4


15 0

16 8.2 x 10
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17 8.1 x 10
5


18 0

19 6.7 x 10
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20 3.1x 10
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TABLA 1. AISLAMIENTO DE V. CHOLERAE
EN MUESTRAS DE CAMARN COCTELERO.

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Cabe mencionar que las cantidades reportadas en comparacin con las muestras
analizadas en el 2013 (Rojas y col, 2013) presentan una carga bacteriana mucho mayor,
sin embargo la presencia de Vibrio parahemolyticus es menor.

VIII. Conclusin

El utilizar tcnicas microbiolgicas para un anlisis de calidad es de gran utilidad ya que
nos es posible determinar de forma rpida si existe un cumplimiento de la misma. Cabe
mencionar que aunque Vibrio cholerae se encuentra de forma natural en ambientes
acuticos, la carga bacteriana que presentan los alimentos en este estudio es mayor, por
lo tanto, la prevencin desde el manejo, conservacin y coccin de los mismos es
imprescindible en estas circunstancias.
Adems, mediante el anlisis peridico que permite establecer un seguimiento de los
resultados, es posible comparar la cantidad de microorganismos en el ambiente en
ciertas temporadas, por lo que el control y prevencin durante este tiempo podran ser
ms adecuados tomando las medidas necesarias.











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IX. Referencias


OPS Ao del Centenario1902-2002 Noticias de Salud Semana a Semana Comunicado N 7 OPS Ao
del Centenario.htm [ Consultado 27 de abril de 2014]

Garcia Lzaro, M. (2010). Facmed. Recuperado el 27 de Abril de 2014, de
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/pdf/Colera_actualizaci%C3%B3n_Medicina20
10.pdf
Leal Rodrguez, R. (2000). Biomed. Recuperado el 28 de Abril de 2014, de
http://www.uady.mx/~biomedic/revbiomed/pdf/rb98915.pdf

Lendon, T. (27 de Noviembre de 2006). Redalyc. Recuperado el 28 de Abril de 2014, de
http://www.redalyc.org/pdf/1812/181221557015.pdf

Rojas- Ruiz, N. E., Muoz, G., Grate, L., Gnzlez, D., & Del Pozo, M. F. (2013). Aislamiento
microbiolgico de Vibrio cholerae y Vibrio parahemolyticus en muestras de camarn
coctelero de la ciudad de Puebla. Enfermedades Infecciosas y Microbiologa, 147-151.
Harley, Prescott, Laboratory Exercises in Microbiology, 5th Edition