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Ecole Royale Militaire

27/11/2009

DEML
[Type paper]

121 Div

FCOS
34 Session

Comparaison des boîtes de


contact, des lames gélosées
et des Pétrifilms ® dans le
cadre du contrôle de
l’hygiène des surfaces non
poreuses.
Trois techniques de prélèvement pour contrôler l’hygiène des surfaces (Rodacs,
Dipslides, Pétrifilms®) ont été comparées. Pour ce faire, des plaques de verre ont
été ensemencées avec des niveaux connus d’E. coli et d’E. hirae. Ces plaques de
verre ont ensuite été échantillonnées trois fois de suite au moyen des trois
méthodes susmentionnées. Les résultats obtenus avec E. coli ne sont pas
interprétables, probablement à cause d’un mauvais taux de récupération dû au
phénomène d’adhésion aux surfaces, influencé par la force capillaire s’exerçant
lors du séchage. Avec E. hirae, les Rodacs apparaissent plus avantageuses que les
deux autres méthodes, car elles récoltent plus de germes, et cela surtout lors du
premier des trois échantillonnages successifs. Néanmoins, d’autres études doivent
confirmer ces résultats préliminaires.

Anthony NOTERMAN
Vétérinaire Capitaine
i

Table des matières

Table des matières.....................................................................................................................i

Listes des annexes.....................................................................................................................v

Introduction...............................................................................................................................1

Chapitre I : Comment contrôler l’hygiène des surfaces ?....................................................3

Un plan de nettoyage et de désinfection doit être validé. Il faut donc décrire quels produits
seront utilisés, comment, quand, par qui et à quelle fréquence. L’efficacité du plan de
nettoyage doit ensuite être démontrée, après quoi un système de surveillance est mis en
place, de manière à vérifier que cette efficacité perdure.

Que ce soit pour la validation de la méthode de nettoyage ou pour la surveillance, il est


indispensable de disposer de méthodes fiables de mesure, qui doivent donc également être
validées.

Plusieurs méthodes, décrites ci-après, existent sur le marché..............................................3

Section 1 : ATP métrie......................................................................................................3

L’ATP métrie consiste à frotter un écouvillon sur une surface de, par exemple, 100 cm². Ce
prélèvement est alors dilué dans un liquide stérile et mis en contact avec des réactifs, dont
la luciférine. Cette enzyme, en présence d’ATP, va provoquer l’émission d’une certaine
quantité de lumière. Les appareils d’ATP métrie mesurent la lumière émise (en RLU),
directement proportionnelle à la quantité d’ATP qui a réagi. L’ATP est une molécule que
l’on retrouve dans toutes les cellules vivantes, ou même parfois peu après leur mort. Il peut
donc provenir de restes alimentaires, de bactéries, de levures, de moisissures ou autres
micro-organismes, et permet donc d’évaluer le « niveau de contamination » d’une surface.3

Cette méthode trouve son intérêt dans la comparaison entre niveaux de contamination avant
et après nettoyage, mais ne permet pas le dénombrement en lui-même des micro-
organismes présents...........................................................................................................4

Section 2 : Les Rodacs ou « boîtes de contact »...............................................................4

............................................................................................................................................4

Les Rodacs sont des boîtes de Petri de 25 cm² remplies d’un milieu de culture
microbiologique, de façon à ce que celui-ci présente une forme convexe. Ce milieu peut
être sélectif ou non, en fonction des germes que l’on désire détecter. La Rodac est
appliquée sur la surface à tester avec une pression (500 g ± 50 g) et une durée (10
secondes) bien décrites dans les normes existantes (NF V 08-037 de mai 2003 et ISO
18593 de juin 2004) ; des applicateurs, comme sur la photo ci-dessus, sont d’ailleurs
souvent utilisés dans le but d’uniformiser cette pression et cette durée d’application. Au
moment de l’application de la gélose sur les surfaces, des restes de désinfectants peuvent
ii

également être récoltés. C’est pourquoi le milieu de culture comporte un complexe


neutralisant les désinfectants (exemple : polysorbate 80 + lécithine ou histidine 1 à 3 %).4

Les Rodacs sont alors incubées pendant un temps et à une température précis, variant en
fonction du milieu de culture utilisé..................................................................................4

Il suffit ensuite de compter les colonies qui ont poussé, exprimées en CFU/25 cm²........4

Section 3 : Les dipslides ou « lames gélosées »................................................................4

Dipslides ou « lames gélosées » (source : Solar Biologicals)..................................................5

Section 4 : L’écouvillonnage............................................................................................5

a : écouvillon (source : Labchem) – b : prélèvement (source : Biocontrol) – c :


ensemencement (source : Biocareers).....................................................................................5

Section 5 : Les Petrifilms®...............................................................................................6

Pétrifilms® et leur conditionnement (source : 3M)..............................................................6

Section 6 : Autres..............................................................................................................6

Le marché fournit toute une série de petits tests, basés le plus souvent sur des principes
différents, et qui visent la rapidité du rendu des résultats, dont voici quelques exemples : . .6

Kit Protect® Hygenius Control (source : cuisine collective)............................................6

Flash® (source : biocontrol).....................................................................................................7

Chapitre II : Normes et critères existants..............................................................................8

Comme mentionné dans le point 2 ci-dessus, les méthodes d’échantillonnage doivent être
validées.

Différentes normes existent, décrivant principalement les modalités de prélèvement, de


transport, d’analyse des échantillons, et de rendu des résultats de ces analyses ; les limites
acceptables en terme de nombre de germes par unité de surfaces, sont, quant à elles,
rarement normalisées. Par exemple, la norme NF V 08-037 de mai 2003 (voir ci-dessous)
mentionne, à propos de l’expression et de l’interprétation des résultats : « en raison des
incertitudes sur les résultats obtenus avec la méthode d’analyse, ainsi que de la variabilité
due aux modalités de prélèvement, l’interprétation des résultats dépendra des objectifs
fixés par les parties concernées ; objectifs inhérents à chaque site de prélèvement, et à
l’entité dont il fait partie »........................................................................................................8

Quelques exemples de normes : ..............................................................................................8

Section 1 : Secteur agro-alimentaire.................................................................................8


iii

Section 2 : Milieu hospitalier ou industrie pharmaceutique.............................................9

Ci-dessous quelques exemples de normes existantes :...........................................................9

D’autres normes sont encore à l’état de projet, notamment :............................................10

Chapitre III : Revue de la littérature et cadre du mémoire...............................................12

Récupération d’E. coli suite à l’échantillonnage de surfaces contaminées artificiellement.


Méthode utilisée : Rodac. Log (contamination) signifie « Logarithme du nombre de
bactéries présentes dans la suspension utilisée pour contaminer les différentes surfaces »
(Niskanen et Pohja, 1977).......................................................................................................14

Chapitre IV : Matériel et méthodes.....................................................................................16

Le protocole expérimental est basé sur les normes NBN EN 13697 : 2001 et ISO 18593 :
2004...........................................................................................................................................17

En annexe I est repris le détail de la composition des différents supports utilisés dans ce
protocole (milieux, bouillons, etc)..........................................................................................17

Section 1 : Matériel.........................................................................................................17

Section 2 : Méthode........................................................................................................17

Section 1 : E. coli.............................................................................................................21

Les résultats obtenus avec E. coli ne sont pas interprétables statistiquement. En effet, que
ce soit en conditions « propres » (0,3 g d’albumine /L) ou « sales » (2,7 g d’albumine/L), la
récupération d’E. coli après ensemencement sur les plaques de verre et après séchage est
très faible, voire nulle. Donc, très peu, voire aucune E. coli n’a poussé, que ce soit sur les
filtres reprenant le nombre de bactéries présentes sur la plaque juste après la phase de
séchage, mais avant la phase de prélèvement, ou que ce soit sur les différents milieux de
prélèvement eux-mêmes (Rodacs, Pétrifilms® , Dipslides). Vu ce manque de résultat et la
lourdeur du protocole, la phase expérimentale a d’ailleurs été avortée pour E. coli après 4
expériences en conditions propres et 2 expériences en conditions sales.
Un inoculum trop faible ou une mauvaise résistance d’E. coli au séchage étant
probablement à l’origine du problème, ces phénomènes seront discutés au point...........22

Section 2 : E. hirae...........................................................................................................22

Ce phénomène sera discuté au point IV................................................................................29

Section 1 : E. coli.............................................................................................................35

Section 3 : E. hirae..........................................................................................................36

Conclusions..............................................................................................................................40
iv

Listes des annexes

Annexe A : Bibliographie
Annexe B : Liste des abréviations
Annexe C :
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Introduction

Ce mémoire s’inscrit dans le cadre des activités du Service Vétérinaire de la Défense. Celui-ci
est constitué comme suit (voir Figure 1) : le bureau spécialisé vétérinaire du COMOPSMED
coordonne les différentes antennes vétérinaires rattachées chacune à un CMO ou à l’EMI Tech
(voir Figure 1). Contrairement à la clinique vétérinaire, où seule la médecine canine est exercée,
les autres antennes sont constituées d’un module hygiène.

Figure 1 : Structure du Service Vétérinaire de la Défense

Le terme « hygiène » s’entend dans un cadre de « Santé Publique ». Le but est de veiller à ce
que, par exemple, la sécurité alimentaire, l’hygiène hospitalière ou encore la prévention des
zoonoses soient optimalisés, de manière à minimiser les risques sanitaires. Cet objectif se traduit
en de nombreuses activités, comme entre autres le contrôle des cuisines de collectivité.
C’est ici qu’entrent en jeu les techniques d’analyse évaluées dans ce document. Pour bien
comprendre comment les vétérinaires et leurs personnels comptent interpréter les résultats
d’analyses obtenus par ces techniques, une description rudimentaire du cadre de travail, du
contexte légal, des normes et des techniques existantes est nécessaire. Si les techniques d’analyse
de surfaces peuvent être utilisées dans de nombreux secteurs (agricole, alimentaire,
pharmaceutique, élevage, hospitalier, etc.), nous allons nous concentrer sur celui des cuisines de
collectivité.
Les différents acteurs de la chaîne alimentaire sont en effet soumis à une législation (nationale
mais surtout européenne) très stricte, exigeant un niveau de maîtrise du risque sanitaire toujours
plus grand, et ce depuis les années nonante, période au cours de laquelle l’opinion publique a été
marquée par la crise de la dioxine.
Sans rentrer dans le détail de cette législation, il est important de connaître deux des principes
fondamentaux sur lesquels elle se base :
La présomption d’innocence n’existe pas : en cas de problème sanitaire, chaque maillon de la
chaîne alimentaire, et donc également le responsable d’une cuisine, doit pouvoir démontrer qu’il
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a tout mis en œuvre pour maintenir le risque sanitaire à un niveau acceptable, et que si problème
sanitaire il y a, il n’en est pas la cause.
L’autocontrôle : dans le même ordre d’idées, il revient au responsable d’une cuisine
d’implémenter un système de contrôle de sa propre production, contrôle visant à garantir la
sécurité alimentaire. Les inspecteurs vétérinaires et leurs personnels ont pour rôle de vérifier que
l’autocontrôle existe et qu’il est efficace.
Pour satisfaire aux exigences légales, plusieurs systèmes d’autocontrôle existent, le plus connu
étant l’HACCP (pour Hazard Analysis and Critical Control Points), d’ailleurs mentionné tel quel
dans la législation. Le Service Vétérinaire a en outre traduit cette dernière dans la réglementation
militaire belge sous forme de l’AO-J 622 A, lui-même mis à jour dans une APG et ses SPS/GID
associées, encore en cours de publication à l’heure actuelle. Cette réglementation militaire se
concentre sur les secteurs directement liés à la Défense, à savoir la fin de la chaîne alimentaire
(transport, stockage, transformations de denrées alimentaires), et vise à implémenter l’HACCP
dans les cuisines de la Défense.
Le but de l’HACCP, comme la traduction de sa signification anglaise l’indique, est de procéder à
une « analyse des dangers » et de « déterminer des points critiques de contrôle » tout au long de
la chaîne de production.
Ainsi, un danger peut être chimique, biologique ou physique. Ce danger a une certaine
probabilité d’apparaître : c’est ce que l’on appelle le « risque ». Un point critique de contrôle, ou
CCP, constitue une étape stratégique de la production où l’on peut intervenir par rapport à un
risque identifié. Pour ce faire, à cette étape précise, on déterminera ce qui est acceptable et ce qui
ne l’est pas, et ce de la façon suivante :
- Que va-t-on mesurer ?
- Quelles valeurs sont acceptables ?
- Comment et à quelle fréquence va-t-on mesurer ces valeurs ?
- Quelles mesures correctives entreprend-on si les valeurs mesurées se trouvent au-dessus
des seuils acceptables ?
Une traçabilité du système d’autocontrôle doit enfin être assurée, sous forme d’un support papier
ou électronique permettant au vétérinaire de connaître les contrôles effectués, leur fréquence, les
problèmes détectés et les actions entreprises.
Ci-dessous deux exemples concrets :

Etape Danger CCP Limites Méthode de Fréquenc Action Enregistrement


critiques mesure e corrective
Réception Contamination Température < + 4°C Thermomètre A chaque Refus de la Document X
des matières microbiologique trop élevée à sonde réception marchandise
premières l’arrivée
Manipulation Contamination Nettoyage X points Contrôle Quotidien Remarque Document Y
des matières microbiologique insuffisant non visuel au
premières du plan de conformes Contrôle de prestataire
Plan de
sur plan de travail X X surface par
contrôle Nettoyage
travail colonies / gélose
avant
gélose
utilisation
Tableau 1 : Exemple de CCP

Le deuxième exemple du supraTableau 1 lève donc un coin du voile. Un des points critiques de
contrôle dans le processus de préparation des repas est la propreté des plans de travail sur
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lesquels les denrées alimentaires sont manipulées. Il faut donc une méthode qui permet de
mesurer la propreté des plans de travail, ensuite déterminer quels sont les valeurs que l’on
considérera comme acceptables (ce que l’on appelle des « critères »), et décider des mesures
correctives à entreprendre lorsque les critères ne sont pas respectés.
Le but du Service Vétérinaire est de déterminer les critères de propreté des différentes surfaces
avec lesquelles les denrées alimentaires entrent en contact, et ce afin d’avoir des éléments
objectifs permettant de juger de l’efficacité d’un plan de nettoyage dans les cuisines de la
Défense. Dans un premier temps, il faut donc choisir ce qu’on mesure et avec quelle méthode.

Chapitre I : Comment contrôler l’hygiène des surfaces ?

Un plan de nettoyage et de désinfection doit être validé. Il faut donc décrire


quels produits seront utilisés, comment, quand, par qui et à quelle fréquence.
L’efficacité du plan de nettoyage doit ensuite être démontrée, après quoi un
système de surveillance est mis en place, de manière à vérifier que cette
efficacité perdure.

Que ce soit pour la validation de la méthode de nettoyage ou pour la


surveillance, il est indispensable de disposer de méthodes fiables de mesure, qui
doivent donc également être validées.

Plusieurs méthodes, décrites ci-après, existent sur le marché.

Section 1 : ATP métrie.

Figure 2 : ATP mètres

L’ATP métrie consiste à frotter un écouvillon sur une surface de, par exemple, 100
cm². Ce prélèvement est alors dilué dans un liquide stérile et mis en contact avec des
réactifs, dont la luciférine. Cette enzyme, en présence d’ATP, va provoquer
l’émission d’une certaine quantité de lumière. Les appareils d’ATP métrie mesurent
la lumière émise (en RLU), directement proportionnelle à la quantité d’ATP qui a
réagi. L’ATP est une molécule que l’on retrouve dans toutes les cellules vivantes, ou
même parfois peu après leur mort. Il peut donc provenir de restes alimentaires, de
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bactéries, de levures, de moisissures ou autres micro-organismes, et permet donc


d’évaluer le « niveau de contamination » d’une surface.

Cette méthode trouve son intérêt dans la comparaison entre niveaux de


contamination avant et après nettoyage, mais ne permet pas le dénombrement en lui-
même des micro-organismes présents.

Section 2 : Les Rodacs ou « boîtes de contact ».

Les Rodacs sont des boîtes de Petri de 25 cm² remplies d’un milieu de culture
microbiologique, de façon à ce que celui-ci présente une forme convexe. Ce milieu
peut être sélectif ou non, en fonction des germes que l’on désire détecter. La Rodac
est appliquée sur la surface à tester avec une pression (500 g ± 50 g) et une durée (10
secondes) bien décrites dans les normes existantes (NF V 08-037 de mai 2003 et
ISO 18593 de juin 2004) ; des applicateurs, comme sur la photo ci-dessus, sont
d’ailleurs souvent utilisés dans le but d’uniformiser cette pression et cette durée
d’application. Au moment de l’application de la gélose sur les surfaces, des restes de
désinfectants peuvent également être récoltés. C’est pourquoi le milieu de culture
comporte un complexe neutralisant les désinfectants (exemple : polysorbate 80 +
lécithine ou histidine 1 à 3 %).

Les Rodacs sont alors incubées pendant un temps et à une température précis,
variant en fonction du milieu de culture utilisé.

Il suffit ensuite de compter les colonies qui ont poussé, exprimées en CFU/25 cm².

Section 3 : Les dipslides ou « lames gélosées ».


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Dipslides ou « lames gélosées » (source : Solar Biologicals)

Les Dipslides consistent en une plaque flexible de chaque côté de laquelle se trouvent des
milieux de culture microbiologique. Tout comme les Rodacs, ils s’apposent à la surface à tester.
La pression est exercée en pliant la partie indiquée par la flèche rouge sur la figure 3. A nouveau,
différents types de milieux sont disponibles, ce qui déterminera le temps et la température
d’incubation des Dipslides après prélèvement.

Il suffit alors de compter les CFU. La surface d’un Dipslide est en général de 7 à 10 cm².

Des firmes comme Biotrace International ou Combi (Mikrocount®) fournissent ces lames
gélosées.
Section 4 : L’écouvillonnage

a b c

a : écouvillon (source : Labchem) – b : prélèvement (source : Biocontrol) – c : ensemencement


(source : Biocareers)

L’écouvillon est une tigette terminée par du coton stérile que l’on va frotter sur la surface à
tester. La façon de frotter (stries dans deux directions perpendiculaires, angle entre 30 et 45°,
pression constante), ainsi que la surface à couvrir (20 ou 100 cm², utilisation d’un gabarit
conseillée) sont à nouveau bien décrites (NF V 08-037 de mai 2003 et ISO 18593 de juin 2004).
Le prélèvement est alors plongé dans une solution stérile, présente dans le tube dans lequel
l’écouvillon est conservé. Cette solution est maintenue à 4°C pour limiter les phénomènes de
multiplication de flore. Le diluent est ensuite agité pour mettre les bactéries en solution et remis
en culture sur boîte de Pétri. Reste, encore une fois, à incuber le milieu de culture et à compter
les CFU.
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I.A.S.A et Meus sont deux firmes produisant des écouvillons stériles.


Section 5 : Les Petrifilms®

Pétrifilms® et leur conditionnement (source : 3M)

Comme son nom l’indique, le Pétrifilm® est l’équivalent d’une boîte de Pétri, mais est aussi fin
qu’un film. Ce film est constitué d’un film plastique adhésif, d’un agent gélifiant soluble dans
l’eau froide, de nutriments (variables en fonction des germes recherchés), et d’un film plastique
comportant une grille de lecture, facilitant le comptage.
Après adjonction d’un milieu (LPT BR, voir annexe I) stérile, le Pétrifilm® peut être appliqué sur
la surface à tester. Après incubation, les CFU sont comptées.
Comme on le devine sur la figure 5, les Pétrifilms® sont fournis par la firme 3M™.

Section 6 : Autres

Le marché fournit toute une série de petits tests, basés le plus souvent sur des
principes différents, et qui visent la rapidité du rendu des résultats, dont voici
quelques exemples :

Kit Protect® Hygenius Control (source : cuisine collective)


Johnson Diversey a développé un kit de détection des protéines résiduelles sous le nom de « Pro-
Tect® » (Figure 6). Il s’agit d’un écouvillon avec lequel la surface à évaluer est échantillonnée
sur 10 cm². L’écouvillon est alors introduit dans le tube, dans lequel se trouve un indicateur.
Celui-ci, une fois en contact avec le prélèvement, change de couleur après 10 minutes. Cette
couleur est comparée à une échelle colorimétrique présente sur le tube, et comportant quatre
degrés : « ok, douteux, sale ou très sale ». Le seuil de détection des protéines est de 50 µg/cm².
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Spotcheck® et spotcheck plus® (source : MK Scientific)

« Spotcheck® », développé par Hygiena International Ltd, détecte les résidus de glucose et
« Spotchek Plus® », les résidus de lactose en plus (figure 7). Le principe repose sur le fait que si
l’on détecte du glucose (qui se retrouve dans la plupart des denrées alimentaires) sur la surface
analysée, le nettoyage n’a pas été efficace. Le lactose est présent dans le lait, ce pourquoi
Spotcheck Plus® est surtout utilisé dans le contrôle d’hygiène des surfaces en laiterie.

Bacter test ATL® (source : Hygi plus)

« Bacter-Test ATL®» (Figure 8) est un test au cours duquel les surfaces sont échantillonnées à
l’aide d'un écouvillon stérile. Les micro-organismes ainsi prélevés sont incubés pendant 10
heures à 37 °C sur un milieu de culture qui vire du rouge au jaune. Si le temps de virage est
inférieur à 10 heures, la surface est considérée comme contaminée, s'il est supérieur, la surface
est considérée comme suffisamment désinfectée.

Flash® (source : biocontrol)

Autre procédé rapide, dit sensible et simple d'utilisation pour contrôler le nettoyage: le « Flash
Test » (Figure 9), un test de détection des protéines développé par Biocontrol, et basé sur le
développement d'un complexe coloré entre les protéines et certains colorants : si la couleur
obtenue sur la bandelette est jaune, la surface est considérée comme propre. Si une couleur
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bleue/verte atteint les bords de la bandelette, la surface est considérée comme sale. La procédure
dure 10 secondes. La surface de la bandelette est de 4’’ x 4’’.

Hy Rise® (source : AMCO instruments)

Le Hy Rise® (Figure 10), à ne pas confondre avec le Hy Lite® (Figure 1), a été développé par
EMD chemicals et consiste également en un test colorimétrique sur bandelettes : la bandelette est
humidifiée avec la solution A, et frottée sur 30 cm de surface à tester. Les réactifs B et C sont
ensuite ajoutés. Si, après 4-5 minutes, la bandelette se colore, la présence de NAD
(NicotinAmide Dinucléotide), NADH, NADP (NicotinAmide Dinucléotide Phosphate) ou
encore NADPH est détectée. La surface est alors considérée comme sale, car ces molécules
témoignent de la présence de cellules vivantes.

Chapitre II : Normes et critères existants

Comme mentionné dans le point 2 ci-dessus, les méthodes d’échantillonnage


doivent être validées.

Différentes normes existent, décrivant principalement les modalités de


prélèvement, de transport, d’analyse des échantillons, et de rendu des résultats
de ces analyses ; les limites acceptables en terme de nombre de germes par
unité de surfaces, sont, quant à elles, rarement normalisées. Par exemple, la
norme NF V 08-037 de mai 2003 (voir ci-dessous) mentionne, à propos de
l’expression et de l’interprétation des résultats : « en raison des incertitudes sur
les résultats obtenus avec la méthode d’analyse, ainsi que de la variabilité due
aux modalités de prélèvement, l’interprétation des résultats dépendra des
objectifs fixés par les parties concernées ; objectifs inhérents à chaque site de
prélèvement, et à l’entité dont il fait partie ».

Quelques exemples de normes :

Section 1 : Secteur agro-alimentaire


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1. Norme belge NBN EN 13697 (2001) : « Antiseptiques et désinfectants chimiques – Essai


quantitatif de surface non poreuse pour l’évaluation de l’activité bactéricide et/ou fongicide
des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine de l’agro-alimentaire, dans l’industrie,
dans les domaines domestiques et en collectivité – Méthode d’essai sans action mécanique et
prescriptions » : cette norme décrit donc le protocole expérimental (germes, matériel à
utiliser, etc) à mettre en œuvre pour évaluer l’efficacité des désinfectants. C’est cette norme
qui a d’ailleurs inspiré le protocole expérimental mis au point dans ce mémoire.
2. Norme française NF V 08-037 (mai 2003): « Microbiologie des aliments - Surfaces
d’environnement agro-alimentaire – Prélèvement d’échantillons destinés à l’analyse
microbiologique ». Cette norme décrit comment prélever à l’aide d’un écouvillon (ou de
gaze ou encore d’une chiffonnette) ou de boîtes de contact. Elle décrit également le
transport, l’analyse et le rendu des résultats.
3. Norme française NF ISO 17604 (2003) : « Microbiologie des aliments – Prélèvement
d’échantillons sur des carcasses en vue de leur analyse microbiologique ».
4. Norme ISO 18593 (juin 2004) : « Microbiologie des aliments – Méthodes horizontales pour
les techniques de prélèvement sur des surfaces, au moyen de boîtes de contact et
d’écouvillons » : à nouveau, les modalités de prélèvement, de transport, d’analyse et de
rendu de résultats sont décrites ; par contre, aucune limite n’est fixée quant au nombre de
germes acceptables.

Cependant, quelques chiffres sont parfois avancés au niveau législatif, par exemple dans la
Décision de la Commission Européenne du 8 juin 2001 (transposée dans l’Arrêté Royal du 28
août 2002) établissant les règles applicables au contrôle régulier de l'hygiène générale, effectué
par les exploitants d’ateliers de découpe (viande fraîche, volaille) : ainsi, plusieurs types de
surfaces sont mentionnés (couteaux, tables de grattage, etc). Ces surfaces sont testées à l’aide de
Rodacs ou d’écouvillons, après nettoyage et désinfection. Le tableau ci-dessous reprend les
valeurs acceptables et inacceptables.

Valeurs moyennes du nombre de colonies pour les tests de surface (Décision de la Commission Européenne du 8
juin 2001)

Section 2 : Milieu hospitalier ou industrie pharmaceutique

Ci-dessous quelques exemples de normes existantes :

1. NF EN ISO 14698-1 (2003) : Salles propres et environnements maîtrisés apparentés –


Maîtrise de la biocontamination – Partie 1 : Principe généraux.
2. NF EN ISO 14698-2 (2004) : Salles propres et environnements maîtrisés apparentés –
Maîtrise de la biocontamination – Partie 2 : Evaluation et interprétation des données de
biocontamination.
3. NF EN ISO 14698-3 (2003) : Salles propres et environnements maîtrisés apparentés –
Maîtrise de la biocontamination – Partie 3 : Méthodologie de mesurage de l’efficacité de
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procédés de nettoyage et/ou de désinfection de surfaces inertes portant des souillures


humides biocontaminées ou des biofilms.

4. NF EN 1631-1 : Contamination de matériaux, appareils, personnel, surfaces, par des fluides,


gaz ou par des particules viables

1. EN 1632-1 : Technologie des salles propres - Maîtrise de la biocontamination. Méthodes


d’analyse et de mesurage de la biocontamination des surfaces dans les zones à risque

D’autres normes sont encore à l’état de projet, notamment :

1. ISO 14698-6 : Salles propres et environnements maîtrisés apparentés – Maîtrise de la


biocontamination – Partie 6 : Evaluation et interprétation de la mesure des données de suivi
de contamination microbienne des zones à risque.

2. ISO 14698-7 : Salles propres et environnements maîtrisés apparentés – Maîtrise de la


biocontamination – Partie 7 : Principes de validation de procédés de nettoyage et de
désinfection des surfaces.

Toutes ces normes portent donc, pour la plupart, comme déjà mentionné plus haut, sur les
modalités d’analyse. Les deux projets de norme ci-dessus illustrent l’absence actuelle de normes
internationales chiffrant le nombre de germes acceptables dans des conditions précises de travail.
Par contre, dans le cadre du système qualité, des limites acceptables ou critères peuvent être
posés par l’équipe responsable de l’hygiène. Le tableau 2 ci-après constitue un exemple de ce
que l’on peut retrouver en hygiène hospitalière.
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Critères d’interprétation proposés pour les prélèvements de surface en hôpital (Ministère de la Santé, de la Famille
et des Personnes Handicapées, Direction Générale de la Santé, Direction de l’Hospitalisation et de l’Organisation
des Soins, Comité Technique National des Infections Nosocomiales(France) : « Surveillance microbiologique de
l’environnement dans les établissements de santé :Air, eaux et surfaces », 2002)

Le tableau 3 reprend les seuils présentés dans le « guide du bionettoyage », en fonction du risque
sanitaire que représente le local hospitalier pour le patient :

Critères microbiologiques après prélèvements de surface dans les locaux, en fonction du risque sanitaire qu’ils
représentent (Guide du bionettoyage GPEM/SL N°5670).
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Dans ce tableau, le niveau cible est défini comme le niveau de qualité qui vise à assurer et à
maintenir des conditions normales de fonctionnement dans le contexte d’un environnement
maîtrisé.
Le niveau d’alerte est le niveau permettant une première alerte en cas de dérive par rapport aux
conditions normales. Lorsque ce seuil d’alerte est dépassé, des recherches supplémentaires
doivent être mises en place, afin de vérifier les résultats observés et de s’assurer que le processus
et/ou l’environnement sont toujours maîtrisés. Compte tenu des délais d’analyse, les premières
mesures correctives peuvent être prises.
Le niveau d’action est le niveau devant impérativement déclencher, lorsqu’il est dépassé, une
réaction immédiate avec analyse des causes du dysfonctionnement et mise en oeuvre d’actions
correctives.

Chapitre III : Revue de la littérature et cadre du mémoire.


Nous avons donc vu qu’il existe différents moyens d’évaluer le degré de contamination des
surfaces. Certaines des méthodes d’échantillonnage et d’analyse sont normalisées. Les
inspecteurs, qu’ils travaillent pour le compte d’organismes certificateurs ou d’inspection,
utilisent d’ailleurs, pour la plupart, l’une ou l’autre des méthodes présentées au point 2.

L’une des trames de fond de ce mémoire est le Ministère de la Défense, au sein duquel le Service
Vétérinaire assure les inspections relatives à l’hygiène alimentaire. Dans le cadre de ces
inspections, la plupart des méthodes d’analyse précitées sont utilisées (ou ont été utilisées) de
façon plus ou moins fréquente, et ce en vue d’appuyer, à l’aide d’éléments objectifs, les
appréciations émises quant à l’hygiène des surfaces chez les fournisseurs, dans les endroits de
stockage, ou dans les zones de transformation ou de fabrication des denrées alimentaires.

En effet, comme plusieurs auteurs le mentionnent, l’évaluation visuelle de l’état de propreté des
surfaces sous-estime largement la contamination microbienne réelle de celles-ci, et beaucoup
d’entre elles, d’apparence propre, seraient considérées comme sales après analyse
microbiologique (Moore et Griffith, 2002). De plus, cette évaluation visuelle, subjective, est
facilement contestable par les exploitants ou producteurs.

Comme vu au point 3, la loi mentionne des critères applicables au contrôle du nettoyage et de la


désinfection des surfaces dans les ateliers de découpe de viandes et les centres hospitaliers
déterminent eux-mêmes de tels critères pour leurs différents locaux. Un des projets du Service
Vétérinaire de la Défense est d’établir également des critères pour les complexes culinaires
dépendant de son Ministère. Ces critères permettraient de définir une surface sur le point d’être
utilisée comme « propre » ou « sale » en fonction du (non) dépassement d’une limite fixée,
exprimée en CFU/ x cm2 (germes totaux ou germes spécifiques).

De tels critères ont d’ailleurs déjà été suggérés, mais pour l’industrie agro-alimentaire en général
(ex : 2,5 CFU/cm2 après nettoyage) (Moore et Griffith, 2002). Le but est donc de considérer des
surfaces plus précises (planche de découpe, poignée de frigo, couteau, assiette, plan de travail,
etc), dont les critères microbiologiques seraient repris dans le manuel de qualité des complexes
culinaires.

Pour ce faire, il faut :

- Déterminer la méthode d’analyse à utiliser.


- Déterminer les germes à rechercher.
- 13 / 39 -

- Effectuer des campagnes de mesures dans les cuisines.


- Analyser les résultats.
- Fixer les critères.

Ce mémoire porte donc sur la première étape de ce processus, à savoir décider de la méthode
d’analyse microbiologique des surfaces qui sera utilisée. En effet, la multiplicité des méthodes
d’analyse disponibles est en soi problématique. De fait, dans le cadre de la validation d’une
procédure de contrôle d’un CCP, et dans le cadre du monitoring qui fait suite à cette validation
(cfr point 2), il est indispensable de disposer de méthodes d’analyse fiables. Le problème, avec
les techniques de prélèvement de surface, c’est qu’il n’existe pas réellement de « Golden
Standard », ce qui rend l’interprétation des résultats difficiles, vu qu’il n’y a pas de méthode
universellement reconnue avec laquelle on peut comparer la méthode utilisée. Il existe par
exemple de nombreux modèles d’ATP-mètres, mais ceux-ci sont le plus souvent testés par les
fabricants eux-mêmes, et ne sont pas toujours comparables entre eux. Une étude (Colquhoun &
al, 1998) a bien comparé trois modèles d’ATP-mètres, mais le développement de procédures
normalisées d’évaluation de la propreté des surfaces par la mesure de l'ATP n’est pas encore
d’actualité.

Il serait donc intéressant, dans un premier temps, de comparer les performances des méthodes
entre elles, de façon à déterminer si l’une d’entre elle est plus appropriée à l’établissement des
critères souhaités.

Le Service Vétérinaire dispose de plusieurs méthodes d’analyses de surfaces, utilisées la plupart


du temps de façon « aléatoire », au gré de l’utilisateur ou sur base d’éléments pratiques, relatifs à
leur « facilité d’utilisation » ; ces méthodes sont :

- Les Dipslides
- Les Rodacs
- Les Pétrifilms®
- Les écouvillonnages

Le Hy-Lite et le Hy-Rise, qui, eux, mesurent d’autres paramètres (voir point 2) sont également
disponibles mais ne sont donc pas considérés dans ce mémoire.

En effet, vu la similarité de leur principe (application d’un milieu de culture contre la surface à
évaluer), les 3 techniques à comparer choisies pour ce mémoire sont donc les Dipslides, les
Rodacs et les Pétrifilms®, avec milieu de culture non sélectif.

Plusieurs études ont déjà comparé différentes méthodes d’échantillonnage entre elles.

D’après ces différentes études, il apparaît que les Rodacs sont plus adaptées pour les surfaces
planes et dures (voir graphiques 1 et 2 ci-après), plus performantes (c-à-d au niveau sensibilité et
répétabilité) que les écouvillons ou le papier collant sur supports inox ou plastique peu
contaminés, surtout si l’on travaille avec E. coli. En effet, après avoir effectué 143 prélèvements
en vue de la détection d’E. coli sur différents types de surfaces, les Rodacs donnent des résultats
positifs dans 11,2 % des cas vs 5,6 % des cas pour les écouvillons (Tebutt, 1990). D’autres
études nuancent ces résultats et donnent les Rodacs gagnantes pour les coques Gram+, perdantes
pour les bâtonnets Gram- par rapport à l’écouvillon (Graphique 3). Les Rodacs donneraient par
ailleurs une image plus fidèle de la contamination en surface, car, contrairement à l’écouvillon,
elles ne séparent pas les éléments formant des colonies (Tamminga et Kampelmacher, 1977).
D’autres auteurs estiment que cela présente un désavantage plutôt qu’un avantage : en effet, si
l’empreinte, la disposition des bactéries sur la surface à échantillonner est reproduite plus
- 14 / 39 -

fidèlement avec la Rodac, en ce qui concerne le dénombrement des bactéries, les Rodacs ne
distinguent pas un organisme isolé d’une microcolonie, alors que l’écouvillon disloque ces
microcolonies par action mécanique (Tebutt, 1990). Les limites supérieures de l’utilisation des
Rodacs se situeraient aux alentours des 450 CFU / 25 cm2, au-delà desquelles la différence de
contamination entre surfaces devient impossible à mettre en évidence (Scott & al, 1984). De
même, pour chaque type de surface, un coefficient de récupération doit être déterminé
(Hartemann & al, 1980) : comme seule une partie des germes se trouvant sur la surface à tester
sont récupérés par les Rodacs, ce coefficient de récupération est appliqué aux résultats du
comptage des CFU, ce qui permet d’estimer la contamination réelle de la surface au moment de
l’échantillonnage.
4
Log des UFC/cm²
après analyse

3 Log (contamination) = 5
2 Log (contamination) = 6
1 Log (contamination) = 7

0
Bois Plastic Inox
Type de surface échantillonnée

Récupération d’E. coli suite à l’échantillonnage de surfaces contaminées artificiellement.


Méthode utilisée : Rodac. Log (contamination) signifie « Logarithme du nombre de bactéries
présentes dans la suspension utilisée pour contaminer les différentes surfaces » (Niskanen et
Pohja, 1977)
Log UFC/cm² après

2
1,5 Log (contamination) = 5
analyse

1 Log (contamination) = 6
0,5 Log (contamination) = 7

0
Bois Plastic Inox
Type de surface échantillonnée

Récupération d’E. coli suite à l’échantillonnage de surfaces contaminées artificiellement. Méthode utilisée :
Ecouvillon. Log (contamination) signifie « Logarithme du nombre de bactéries présentes dans la suspension utilisée
pour contaminer les différentes surfaces » (Niskanen et Pohja, 1977)
- 15 / 39 -

tifs 80
60
Ecouvillon
posi
% de 40
20 Rodac
0
Coques Gram+ Bâtonnets Ecouvillon
Gram- et Rodac

Détection des Gram + et


Gram -

Détection de bactéries Gram + et Gram – après échantillonnages de diverses surfaces (en chambre d’hôpital) avec la
méthode Rodac et/ou l’écouvillon (Lemmen & al, 2001)

Plus récemment, les Dipslides ont été comparés aux Rodacs et aux écouvillons, donnant selon
les auteurs des résultats similaires au niveau reproductibilité et répétabilité, pour différents
niveaux de contamination, lors de la mesure de la flore aérobie totale (Salo & al, 2000) ou lors
du comptage des coliformes (graphiques 4 et 5).

25
20
15 Germes totaux
10 Entérobactéries
% de récupération
5
0
Hygicult Rodac Ecouvillon
Dipslide
Méthode d'échantillonnage

Pourcentage de récupération obtenu après échantillonnage d’une surface en inox moyennement contaminée (B.
cereus et E. coli, ~ 10,7 CFU/cm², dont 74,4 % d’E. coli) selon 3 méthodes (Salo & al, 2002)

25
20
15 Germes totaux
10
% de récupération Entérobactéries
5
0
Hygicult Rodac Ecouvillon
Dipslide
Méthode d'échantillonnage

Pourcentage de récupération obtenu après échantillonnage d’une surface en inox fortement contaminée (E. cloacae
et S. warneri, ~ 43,6 CFU/cm², dont 28,7 % d’E. cloacae) selon 3 méthodes (Salo & al, 2002)
- 16 / 39 -

Le tableau 4 ci-dessous reprend les résultats d’une étude visant à comparer les Dipslides avec
d’autres méthodes d’évaluation de la propreté de surfaces.

Concordance entre les résultats obtenus après contrôle d’hygiène de surfaces


Méthodes ATP ATP Détection
comparées métrie/Dipslide métrie/Détection protéines/Dipslide
protéines
Avant nettoyage 42,2 % 66,7 % 68,9 %
Après nettoyage 55,6 % 48,9 % 57,6 %
Critères posés :
- acceptable : Dipslide < 2,5 CFU/cm², ATP < 500 RLU, Protéine : grade couleur 1
- Alerte : Protéine : grade couleur 2
- Inacceptable : Dipslide > 2,5 CFU/cm², ATP > 500 RLU, Protéine : grades couleur 3
et 4
Comparaison de résultats obtenus après analyse de surfaces selon 3 méthodes : ATP bioluminescence, microbiologie
(Dipslide) et détection des protéines, en vue d’établir l’état hygiénique de 45 plans de travail en industrie, avant et
après nettoyage (Moore & Griffith, 2002).

Les Pétrifilms®, eux, ont été validés dans le cadre de leur utilisation pour diverses analyses
alimentaires, mais peu de données sont disponibles quant à leur utilisation pour l’analyse de
surfaces de travail. Ils ont néanmoins été validés dans le cadre de l’analyse de surfaces pour
l’industrie pharmaceutique, par comparaison avec les Rodacs et l’écouvillon (Dal Maso & al,
1993). Les Pétrifilms® auraient des performances comparables à ces deux méthodes, mais
seraient moins encombrants, plus rapides d’utilisation, et présenteraient une grande
reproductibilité.

Il était donc intéressant d’aligner ces trois méthodes (Pétrifilm®, Dipslide, Rodac), et de
comparer leurs performances. La méthode d’investigation choisie s’est basée sur les normes
NBN EN 13697 (cfr point 3) (La méthode adaptée utilisée s’arrête bien sûr au comptage de
colonies présentes au départ sur le support. La phase de mesure après désinfection n’a donc pas
lieu) et ISO 18593 : 2004 (cfr point 3). L’expérience présentée dans ce mémoire vise donc à
ensemencer une quantité connue de bactéries sur une surface non poreuse. Par la suite, ces
surfaces seront prélevées à l’aide des 3 méthodes à comparer. Les performances des 3 techniques
d’analyse sont alors évaluées.

Le support non poreux qui a été choisi pour cette expérience est le verre, car il est facile de s’en
procurer, de le nettoyer et de le stériliser.
Deux germes contaminants alimentaires ont été sélectionnés : Enterococcus hirae et Escherichia
coli. Ces germes font en effet partie de l’annexe D de la norme NBN EN 13697, annexe
reprenant les souches de références pouvant être utilisées. Ces deux bactéries constituent par
ailleurs des indicateurs de contamination fécale, et pourraient éventuellement être retrouvées sur
des surfaces de travail en cuisine. Ils correspondent donc à une certaine « réalité de terrain ».
Une substance interférente a été choisie, visant à mimer un état de « propreté » ou de « saleté »
des surfaces : c’est l’albumine bovine.

Chapitre IV : Matériel et méthodes


- 17 / 39 -

Le protocole expérimental est basé sur les normes NBN EN 13697 : 2001 et
ISO 18593 : 2004.

En annexe I est repris le détail de la composition des différents supports utilisés


dans ce protocole (milieux, bouillons, etc).

Section 1 : Matériel
1. Souche Enterococcus hirae ATCC 8043
2. Souche E. coli ATCC 10 536
3. Tryptone sel bouillon, tubes 9 ml (NF EN ISO 6887-1(Biorad®)
4. Tryptone sel, flacons 100 ml (Biorad®)
5. Boîte de Petri (BP) 90 mm, milieu TSA
6. Albumine bovine
7. Applicateur Rodacs (bio-Mérieux®)
8. Rodacs 25 cm², milieu TSA
9. Dipslides 25 x 50 mm (Biotrace international®) Nutrient + TTC (Total viable count with red
spots)
10. Pétrifilms® (3M) Flore totale
11. Milieu Pétrifilm® LPT BR (Tritium)
12. Plaques de verre 50 x 50 mm, 3 mm d’épaisseur (vitrerie VMC®, Etterbeek)
13. Bechers
14. Micropipeteurs et tips
15. Filtres stériles (Millipore®) 47 mm, 0,45 µ
16. Milieu de culture Rapid E. coli 2 (Biorad®) – gélose
17. Milieu de culture Rapid Enterococcus (BioRad®) – gélose
18. Billes de verre
19. Solutions de Mc Farland (BaCl2 et H2SO4)
20. Compteur de colonies (IUL instruments®)
21. Autoclave (PBI Stematic III®)
22. Agitateurs (Labinco®) Press to mix 524
Section 2 : Méthode
1. La souche de référence (E. coli ou E. hirae) est repiquée 2 fois et conservée au congélateur,
sur morceaux de gélose TSA et dans de la paraffine, en vue d’une utilisation ultérieure.
2. Afin de revivifier les bactéries avant leur utilisation, celles-ci sont à nouveau repiquées 2 fois
sur BP (Boîte de Pétri) de milieu TSA à 37 ± 1°C pendant 24 heures. Le repiquage consiste à
frotter doucement la gélose, sur laquelle sont conservées les souches, et cela sur toute la
surface de la BP.
3. Les bactéries sont prélevées de la BP avec une anse stérile et mises en suspension dans un
tube contenant 9 ml de bouillon tryptone sel. La suspension est homogénéisée à l’aide d’un
agitateur.
4. La quantité de bactéries à diluer est estimée par comparaison visuelle de la turbidité obtenue
avec celle d’une solution de Mc Farland 1 (0,1 ml BaCl2 1% + 9,9 ml H2SO4 1 %). Le
nombre de bactéries est alors estimé à 3 x 108 / ml.
- 18 / 39 -

5. Une dilution sérielle en tubes de tryptone sel est effectuée. La suspension de départ est
portée à 10-5. Le nombre théorique de bactéries est donc de 3 x 103 / ml.

6. La suspension 10-5 est mélangée à de l’albumine. Pour ce faire, nous disposons d’une
solution de 0,3 g albumine / 100 ml. Le but est d’obtenir une suspension de 300 germes/ml
contenant également 0,3 g d’albumine / litre (conditions « propres ») ou 2,7 g d’albumine /
litre (conditions « sales »). Concrètement : solution propre : 1 ml solution albumine + 1 ml
suspension bactérienne à 10-5 + 8 ml tryptone sel. Solution sale : 1,8 ml solution albumine +
200 µl suspension bactérienne à 10-5.
7. 100 µl de la solution finale sont prélevés à l’aide d’une micropipette et déposés sur une
plaque en verre stérile. La goutte est étalée sur la surface de la plaque en verre à l’aide d’un
étaleur en « L » stérile. L’opération est répétée 10 fois de suite, ce qui prend environ 20
minutes.
8. 100 µl de la solution sont également filtrés sur membrane. La membrane est placée sur un
milieu de gélose Rapid E. coli 2 (s’il s’agit d’E. coli) ou Rapid Enterococcus (s’il s’agit d’E.
hirae). Le milieu est incubé à 37 ± 1°C.
9. Les plaques sont mises à sécher sous flux laminaire pendant environ 15 minutes.
10. 1 millilitre de LPT BR stérile (voir annexe I) sont versés sur chaque Pétrifilm ® pendant que
les plaques de verre sèchent.
11. Pour chaque souche, et pour chaque condition (« propre » ou « sale »), 3 plaques sont
prélevées chacune
a. 3 fois de suite avec des Rodacs TSA : la Rodac est insérée dans un applicateur
permettant d’appliquer la gélose sur la plaque en verre durant 10 secondes avec une
pression de 500 ± 50 grammes.
b. 3 autres 3 fois de suite avec des Dipslides : les 2 faces gélosées du Dipslide sont
appliquées contre la lame en verre l’une après l’autre. La pression est exercée en pliant
la membrane à l’endroit désigné par la flèche rouge sur la figure 3, pendant 10 secondes.
c. 3 dernières 3 fois de suite avec des Pétrifilms® : l’échantillonnage consiste en
l’ouverture du Pétrifilm® et en l’application du milieu contre la lame en verre pendant 10
secondes. La pression est exercée à la main.

Cette étape dure à nouveau 20-25 minutes


12. Une dixième plaque, servant de témoin, n’est pas prélevée.
13. Les Rodacs, Pétrifilms® et Dipslides, après prélèvement, sont placés à 37 ± 1°C pendant 5
jours.
14. Les plaques, après prélèvement, ainsi que la plaque témoin après séchage, sont placées, à
l’aide d’une pince stérilisée à la flamme, dans un bécher stérile contenant des billes de verres
stériles et 50 ml de tryptone-sel. Le Becher est ensuite agité pendant une minute.
15. La suspension de tryptone-sel, contenant alors normalement les bactéries qui sont restées sur
la plaque en verre, est filtrée sur membrane.
16. La membrane est placée sur un milieu en gélose Rapid E. coli 2 (s’il s’agit d’E. coli) ou
Rapid Enterococcus (s’il s’agit d’E. hirae). Le milieu est incubé à 37 ± 1°C.
17. Les étapes n-o-p prennent 3/4 heure.
18. Le comptage des colonies se fait quotidiennement, 5 jours de suite, pour tous les milieux
incubés, à l’aide d’un compteur de colonies.
- 19 / 39 -

19. La stérilisation de la verrerie s’effectue à l’autoclave à 121°C, 2 bars, pendant 15 minutes.

Ce protocole a été réalisé en quatre étapes :

1. Avec la souche d’E. hirae, en conditions « propres » (0,3 g


albumine/litre).
2. Avec la souche d’E. hirae, en conditions « sales » (2,7 g albumine/litre).
3. Avec la souche d’E. coli, en conditions « propres ».
4. Avec la souche d’E. coli, en conditions « sales ».

Chacune des étapes, préparation du matériel incluse, correspond à environ 3 heures de


manipulation.
La méthode d’analyse est schématisée par la Figure 11.
- 20 / 39 -

Schéma du protocole expérimental.

Les résultats obtenus sont analysés selon la méthode statistique suivante : les statistiques
descriptives sont calculées et illustrées à l’aide du logiciel Microsoft Excel® ; les statistiques
analytiques sont réalisées à l’aide du programme informatique SAS® (pour « Statistical Analysis
System »), module STAT, procédure MIXED (test de comparaison des moyennes).
- 21 / 39 -

Il y a en fait quatre analyses statistiques :

- L’une portant sur les résultats obtenus avec E. coli en conditions propres.
- Une deuxième portant sur les résultats obtenus avec E. coli en conditions sales.
- Une troisième sur les résultats obtenus avec E. hirae en conditions propres.
- La dernière portant sur les résultats obtenus avec E. hirae en conditions sales.

Pour chacune de ces quatre analyses, les variables suivantes sont étudiées :

- Dénombrement des bactéries présentes dans la suspension de départ (inoculum).


- Dénombrement des bactéries présentes sur les plaques de verre témoin, après séchage,
mais avant échantillonnage.
- Dénombrements suite aux échantillonnages successifs réalisés avec les Rodacs, les
Pétrifilms® et les Dipslides.
- Dénombrement des bactéries restant sur les plaques de verre après ces échantillonnages
successifs.

Dans un premier temps, la comparaison entre le dénombrement des bactéries présentes dans
l’inoculum et celui des bactéries présentes sur les plaques témoins après séchage est effectué.
Deux paramètres sont pris en compte lors du traitement de ces données :

- Le « numéro d’ordre » de l’expérience, vu que les expériences ont été répétées plusieurs
fois.
- Le jour du comptage (pour rappel, celui-ci se déroule quotidiennement pendant 5 jours) :
en effet, on ne peut pas considérer chaque variable comme étant indépendante, car il
s’agit de mesures répétées 5 fois de suite.

Dans un deuxième temps, les dénombrements faisant suite aux différents échantillonnages sont
comparés. Quatre paramètres sont cette fois pris en compte :

- Le « numéro d’ordre » de l’expérience, pour la même raison que ci-dessus.


- Le jour du comptage, comme ci-dessus.
- La méthode d’échantillonnage : Rodac, Dipslide ou Pétrifilm®.
- Le moment du prélèvement : 1er, 2ème, ou 3ème prélèvement sur une même plaque de verre.

Enfin, le dénombrement des bactéries restant sur les plaques de verre après la série
d’échantillonnages est analysé. Trois paramètres sont pris en compte :

- Le numéro d’ordre de l’expérience.


- Le jour du comptage.
- La méthode d’échantillonnage : Rodac, Dipslide ou Pétrifilm®.

Un intervalle de confiance de 95 % a été choisi, ce qui fait que quand une différence est
significative, la valeur [ Pr > |t| ] est < à 5%, donc < 0,05. Cette valeur est mentionnée à plusieurs
reprises, entre parenthèses, au point III.

Chapitre V : Résultats

En annexe II sont repris les résultats des diverses expériences sous leur forme « brute », sans
interprétation statistique.

Section 1 : E. coli
- 22 / 39 -

Les résultats obtenus avec E. coli ne sont pas interprétables statistiquement. En


effet, que ce soit en conditions « propres » (0,3 g d’albumine /L) ou « sales »
(2,7 g d’albumine/L), la récupération d’E. coli après ensemencement sur les
plaques de verre et après séchage est très faible, voire nulle. Donc, très peu,
voire aucune E. coli n’a poussé, que ce soit sur les filtres reprenant le nombre
de bactéries présentes sur la plaque juste après la phase de séchage, mais avant
la phase de prélèvement, ou que ce soit sur les différents milieux de
prélèvement eux-mêmes (Rodacs, Pétrifilms® , Dipslides). Vu ce manque de
résultat et la lourdeur du protocole, la phase expérimentale a d’ailleurs été
avortée pour E. coli après 4 expériences en conditions propres et 2 expériences
en conditions sales.
Un inoculum trop faible ou une mauvaise résistance d’E. coli au séchage étant
probablement à l’origine du problème, ces phénomènes seront discutés au point.

Section 2 : E. hirae

Les résultats obtenus avec E. hirae sont eux, par contre, bien interprétables au niveau statistique.
Ils sont issus d’une série de 8 expériences en conditions propres et d’une série de 6 expériences
en conditions sales.

Dans un souci de facilité de lecture des résultats, les statistiques descriptives sont présentées
principalement sous forme de graphiques. En ordonnée de ces graphiques, nous retrouvons une
valeur que l’on nomme « coefficient de récupération ». Celui-ci est calculé de manière simple,
selon la formule suivante :

nombre de CFU présentes sur un milieu après prélèvement


X 100
nombre de bactéries présentes sur la plaque de verre témoin au départ

Ce rapport est donc exprimé en %. Le calcul est effectué pour chacun des 3 prélèvements, et
pour chacune des méthodes d’échantillonnage. Par exemple, si j’ai 100 bactéries au départ sur la
plaque en verre, et si, lors de mes 3 prélèvements successifs, j’obtiens :

- 50 bactéries pour le 1er prélèvement


- 15 bactéries pour le 2ème prélèvement
- 10 bactéries pour le 3ème prélèvement

Les coefficients de récupération respectifs seront de :

- 50 % pour le 1er prélèvement


- 15 % pour le 2ème prélèvement
- 10 % pour le 3ème prélèvement.

Les statistiques descriptives relatives à l’effet « séchage » sont, quant à elles, exprimées sous
forme de tableau.

Suivra, directement après la statistique descriptive, et ce pour chaque effet étudié, la statistique
analytique, effectuée selon un test de comparaison des moyennes (procédure MIXED, cfr point
II, 2). Les valeurs ainsi obtenues sont mentionnées entre parenthèses : elles correspondent à la
probabilité que les variables étudiées soient équivalentes. Comme mentionné au point II, 2,
quand cette valeur est < 0,05, une différence significative est mise en évidence. Les résultats
- 23 / 39 -

seront rendus de manière « brute » et interprétés succinctement dans ce chapitre. La discussion


fera l’objet du chapitre IV.

1. Conditions propres (0,3 g albumine/L)


Avant séchage Après séchage % de bactéries
survivant sur plaques
témoins
Nombre de CFU 11 4 36%
50 26 52%
54 39 72%
29 24 83%
43 35 81%
72 54 75%
51 34 67%
61 43 70%
Moyennes 46 39 67%
Médianes 51 35 71%
Ecarts-type 19 15 16%

Nombre de CFU présentes dans la suspension d’essai (avant séchage) et sur la plaque témoin après séchage pour
chacune des expériences avec E. hirae en conditions propres

Le tableau 5 reprend donc le nombre de CFU dénombrées sur les plaques témoins avant séchage
(correspondant en fait à 100 µl de la suspension d’essai que l’on fait passer sur un filtre, filtre
que l’on place sur un milieu de culture) et après séchage (correspondant donc à une suspension
de bactéries filtrée ; cette fois, la suspension est obtenue en plaçant une plaque témoin dans une
solution de tryptone-sel, et en extrayant les bactéries présentes sur la plaque à l’aide de billes de
verre stériles, par agitation).

- Effet séchage : le nombre de CFU présentes dans la suspension d’essai et le nombre de


CFU présentes sur la plaque en verre après séchage (tableau 5) est significativement
différent (0,0006). L’ensemencement s’est donc déroulé de manière correcte : même si
quelques pertes sont occasionnées lors du séchage, le nombre de bactéries présentes sur
les plaques de verre reste tout à fait raisonnable : en effet, en moyenne 67 % des bactéries
survivent sur les plaques témoin.
- 24 / 39 -

180,00%
170,00%
160,00%
150,00%

Coefficient de récupération
140,00%
130,00%
120,00%
110,00%
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
Rodac Pétrifilm® Dipslide

Méthodes
Coefficient de récupération moyen, en fonction des 3 méthodes d'échantillonnages évaluées, sans tenir compte du
moment de prélèvement, après ensemencement réalisé avec E. hirae en conditions propres (0,3 g/ L d’albumine).
Les barres verticales représentent 2 écarts-types, la ligne bleue horizontale le coefficient de récupération moyen,
toutes méthodes confondues.

- Effet méthode : il n’y a pas de différence significative entre les Pétrifilms® et les
Dipslides (0,0586), ni entre les Pétrifilms® et les Rodacs (0,7928), mais bien entre les
Dipslides et les Rodacs (0,0324). Le nombre de CFU comptées après prélèvement avec
les Rodacs ou les Dipslides n’est donc pas équivalent.

90%
85%
80%
75%
70%
Coefficient de récupération

65%
60%
55%
50%
45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
Prélèvem ent 1 Prélèvem ent 2 Prélèvem ent 3

Moment du prélèvement

Coefficient de récupération moyen, en fonction du moment du prélèvement, indépendamment de la méthode


d'échantillonnage utilisée, après ensemencement avec E. hirae en conditions propres (0,3 g albumine/L). Les barres
- 25 / 39 -

verticales correspondent à 2 écarts-types, la ligne bleue horizontale à la moyenne du coefficient de récupération,


tous prélèvements confondus.

- Effet prélèvement : il y a une différence significative entre le premier et le deuxième


prélèvement (0,0001) et entre le premier et le troisième prélèvement (< 0,0001), mais pas
entre le deuxième et le troisième (0,0563), cela toutes méthodes confondues. Une fois le
premier prélèvement effectué, ceci en moyenne et sans tenir compte de la méthode
utilisée, les 2 prélèvements suivants extraient donc moins de bactéries de leur support, ce
qui paraît a priori logique ; il est cependant intéressant de constater une absence de
différence entre les 2ème et 3ème prélèvements.

140%
130%
120%
110%
100%
90%
80%
70%
Coefficient de récupération

60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
-1 0 %
-2 0 %
Rodac 1 Rodac 2 Rodac 3 Pétr ifilm Pétr ifilm Pétr ifilm Dipslide Dipslide Dipslide
® ® ® s1 s2 s3
1 2 3

M é t h o d e s e t m o m e n t s d e p r é lè v e m e n t s
Coefficient de récupération pour chacun des prélèvements successifs réalisés, et pour chacune des trois méthodes,
après ensemencement avec E. hirae en conditions propres (0,3 g/L albumine). Les barres verticales représentent 2
écarts-types, et la ligne bleue horizontale le coefficient de récupération moyen, toutes méthodes et prélèvements
confondus. Rodac 1 signifie par exemple qu’il s’agit du premier prélèvement effectué sur une plaque avec un milieu
Rodac.
- 26 / 39 -

Prélèvements et méthodes Valeurs de Pr > |t|


Dipslide 1 – Dipslide 2 0,1638
Dipslide 1 – Dipslide 3 0,0749
Dipslide 1 – Pétrifilm® 1 0,4205
Dipslide 1 - Rodac 1 <0,0001
Dipslide 2 – Dipslide 3 0,6875
Dipslide 2 – Pétrifilm® 2 0,0893
Dipslide 2 - Rodac 2 0,7062
Dipslide 3 - Pétrifilm® 3 0,4254
Dipslide 3 - Rodac 3 0,3941
Pétrifilm® 1 – Pétrifilm® 2 0,6236
Pétrifilm® 1 – Pétrifilm® 3 0,0735
Pétrifilm® 1 - Rodac 1 0,001
Pétrifilm® 2 -Pétrifilm® 3 0,1888
Pétrifilm® 2 - Rodac 2 0,1825
Pétrifilm® 3 - Rodac 3 0,1021
Rodac 1 - Rodac 2 <0,0001
Rodac 1 - Rodac 3 <0,0001
Rodac 2 - Rodac 3 0,1062

Tableau récapitulatif combinant les différences entre méthodes et prélèvements : Rodac 1 signifie par exemple qu’il
s’agit du premier prélèvement effectué sur une plaque avec un milieu Rodac. Les différences significatives sont
reprises en rouge sur fond jaune – conditions propres.

- Effet méthode et effet prélèvement combinés : le tableau 6 est très intéressant pour
l’étude que nous réalisons. Il permet en effet de comparer les méthodes et leurs
performances « de récupération ». En effet, pour rappel, chaque plaque en verre est
ensemencée avec une quantité connue de bactéries. Après séchage, chacune de ces
plaques est prélevée 3 fois de suite selon une même méthode. En se référant au tableau 6,
« Dipslide 1 » signifie par exemple qu’il s’agit du premier prélèvement effectué sur la
plaque en verre avec un Dipslide. Rodac 3 signifie qu’il s’agit du troisième prélèvement
effectué sur une plaque en verre, avec la méthode Rodac. Et ainsi de suite. On peut donc
voir dans ce tableau s’il existe des différences non seulement entre les méthodes,
globalement, mais aussi si ces différences se manifestent de façon précise, en terme de
prélèvement.

Concrètement, si on regarde les différences significatives reprises en rouge gras sur fond
jaune dans le tableau 6, on constate tout d’abord que l’effet « méthode » mentionné ci-
dessus se vérifie principalement lors du premier prélèvement. Il y a donc bien une
différence significative entre les méthodes, mais cette différence se situe lors du premier
prélèvement sur la plaque de verre.
En effet, il y a une différence entre les CFU comptées sur Dipslide 1 et Rodac 1, mais
plus sur Dipslide 2 – Rodac 2, ni même sur Dipslide 3 – Rodac 3.

Il en est exactement de même si on compare Pétrifilms® et Rodacs : dans ce cas-ci, la


différence entre les deux méthodes, sans se préoccuper du moment de prélèvement,
n’avait même pas été mise en évidence (graphique 6). Par contre si on compare
Pétrifilms® et Rodacs en ne tenant compte cette fois que du premier prélèvement (tableau
6), il y a bien une différence entre Pétrifilm® 1 et Rodac 1. Cette différence disparaît lors
des prélèvements suivants.
- 27 / 39 -

Pour terminer, c’est surtout Rodac 1 qui est significativement plus grand que Rodac 2 et
3. Ce qui signifie que c’est le premier prélèvement qui extrait le plus grand nombre de
bactéries, les 2 prélèvements suivants s’équivalant. A nouveau, « l’effet prélèvement »
mentionné ci-dessus ne se vérifie plus que pour les Rodacs, quand on regarde les choses
plus en détail. En effet, ni Pétrifilm® 1 – Pétrifilm® 2, ni Dipslide 1 – Dipslide 2 ne
diffèrent.

La graphique 8 illustre donc bien ce qui est constaté ci-dessus, à savoir l’effet « méthode »,
où la méthode Rodac se distingue des 2 autres méthodes, et « l’effet prélèvement », où le
premier prélèvement effectué avec la méthode Rodac recueille plus de bactéries que :

● Le premier prélèvement effectué avec les deux autres méthodes


● Les deuxième et troisième prélèvements également effectués avec la méthode
Rodac

Lors de l’analyse statistique des résultats, 2 autres effets sont par ailleurs observés :

Jours comparés Valeur de Pr > |t|


1 et 2 < 0,0001
1 et 3 0,0028
1 et 4 0,0041
1 et 5 0,0126
2 et 3 0,758
2 et 4 0,4642
2 et 5 0,5491
3 et 4 0,4686
3 et 5 0,6074
4 et 5 1
Comparaison entre les valeurs obtenues lors des comptages quotidiens des CFU, après incubation des milieux
ensemencés avec E. hirae en conditions propres (0,3 g d’albumine/L). Les différences significatives sont mises en
évidence en rouge sur fond jaune.

- Effet temps : le comptage des CFU étant systématiquement ré-effectué toutes les 24
heures pendant 5 jours. Le 1er comptage diffère significativement du deuxième (<0,0001)
et des autres, mais plus les autres entre eux. Cela veut donc dire que si on compte au 2 ème
jour, on obtient encore des résultats différents par rapport au premier comptage. Mais par
après, les résultats restent identiques au 2ème comptage.

- Effet répétition : un effet répétition a été mis en évidence, sous-entendant que les
expériences ou les conditions dans lesquelles sont réalisées les expériences successives
ne sont pas à chaque fois tout à fait identiques. Ceci sera discuté au point IV.
- 28 / 39 -

 Subsistance des bactéries sur les plaques de verre.

Après avoir effectué les 3 prélèvements, il fallait bien sûr savoir s’il restait ou non des bactéries
sur la plaque de verre, ou si tout avait été extrait. Pour ce faire, les bactéries restantes sont
extraites par agitation à l’aide de billes de verre, mises en culture, et les CFU comptées (cfr point
II). L’analyse statistique a également porté sur ces résultats.

40%

30% Rodac
%
bactéries 20% Petrifilm
restantes Dipslides
10%

0%
1
Méthodes

Pourcentage de bactéries subsistant sur le support après 3 prélèvements successifs, pour chacune des 3 méthodes. E.
hirae en conditions propres (0,3 g/L albumine). Les barres verticales représentent 2 écart-types, de part et d’autre de
la moyenne.

Germes restants Pr > |t|


Rodac - Pétrifilm® 0,0056
Rodac - Dipslide 0,0037
Pétrifilm® - Dipslide 0,8374
Différences entre méthodes pour le nombre de germes qu’elles laissent sur la plaque en verre après 3 prélèvements
successifs. Les différences significatives sont en rouge sur fond jaune. E. hirae en conditions propres (0,3 g
d’albumine/L).

En ce qui concerne le nombre de CFU subsistant sur la plaque en verre après des séries de 3
prélèvements, 2 effets significatifs ont été mis en évidence :

- Effet méthode : dans les conditions propres, la méthode Rodac se distingue


significativement des 2 autres (voir tableau 7 et graphique 7) : il apparaît qu’avec les Rodacs, il
reste moins de bactéries sur la plaque en verre après les 3 prélèvements successifs. Les méthodes
Pétrifilm® et Dipslide s’équivalent à nouveau sur ce point.

- Effet temps : cette fois-ci, des différences significatives apparaissent entre les jours 2 et
3 (0,0254). Ce n’est qu’après le troisième comptage des CFU que les résultats restent
identiques.
- 29 / 39 -

170,00%
160,00%
150,00%
140,00%

Coefficients d'extraction cumulés


130,00%
120,00%
110,00%
100,00%
90,00% G er m es r estan t
80,00% su r plaqu e
P r élèvem en t 3
70,00%
P r élèvem en t 2
60,00%
P r élèvem en t 1
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
R odac Pétrifilm® D ipslide
Mé th od es
Synthèse des effets observés pour les 3 méthodes d'échantillonnage évaluées, après ensemencement avec E. hirae en
conditions propres (0,3 g d'albumine/L)
Si on regarde attentivement le graphique 10, et que l’on fait la somme des bactéries détectées, on
arrive à un total supérieur à 100 %. On aurait donc détecté en tout plus de germes qu’il n’y en
avait au départ. En effet, si on fait la somme des CFU comptées après 5 jours pour chacun des 3
prélèvements + les CFU qui restent sur la plaque, on obtient, en moyenne :

- Pour la méthode « Rodac » : 159 % du nombre de germes, par rapport au nombre de


germes présents au départ sur la plaque, après séchage.
- Pour la méthode « Pétrifilm® » : 171 % du nombre de germes, par rapport au nombre de
germes présents au départ sur la plaque, après séchage.
- Pour la méthode « Dipslide » : 122 % du nombre de germes, par rapport au nombre de
germes présents au départ sur la plaque, après séchage.

Ce phénomène sera discuté au point IV.

1. Conditions sales (2,7 g albumine/L)

La même analyse statistique (voir point II, 2) a évidemment été appliquée pour la série
d’expériences effectuées avec E. hirae ensemencé sur les plaques de verre, mais cette fois dans
un environnement « sale » ; le but étant de voir si les performances des différentes méthodes
utilisées étaient ou non affectées par la présence d’une plus grande quantité de matières
organiques. Les chiffres mentionnés entre parenthèses reprennent à nouveau la valeur de Pr > |t|.

Cette fois encore, plusieurs effets ont pu être mis en évidence :

Avant séchage Après séchage Rapport après/avant


séchage
Nombre de CFU 70 48 69 %
- 30 / 39 -

37 26 70 %
29 29 100 %
58 42 72 %
38 21 55 %
53 37 70 %
Moyennes 48 34 73 %
Médiane 46 33 70 %
Ecarts-type 15 10 15 %
Nombre de CFU présentes dans la suspension d’essai (avant séchage) et sur la plaque témoin après séchage pour
chacune des expériences avec E. hirae en conditions sales (2,7 g albumine/L)

- Effet séchage : le nombre de CFU présentes dans l’inoculum diffère significativement du


nombre de CFU comptées sur la plaque de verre, après que celle-ci ait été séchée
(0,0065). La survie des germes sur les plaques de verre après séchage est comparable à
celle obtenue dans les conditions propres ; en effet, il reste, après séchage, en conditions
« sales », 73 % des germes ensemencés au départ.

180,00%
170,00%
160,00%
150,00%
Coefficient de récupération

140,00%
130,00%
120,00%
110,00%
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
Rodac Pétrifilm® Dipslide

Méthodes
Coefficient de récupération moyen, en fonction des 3 méthodes d'échantillonnages évaluées, sans tenir compte du
moment de prélèvement, après ensemencement réalisé avec E. hirae en conditions sales (2,7 g/ L d’albumine). Les
barres verticales représentent 2 écarts-types, la ligne bleue horizontale le coefficient de récupération moyen, toutes
méthodes confondues.

- Effet méthode : tout comme ce qui a été observé en conditions « propres », les Dipslides
et les Pétrifilms® ne diffèrent toujours pas (0,5495) entre eux. Par contre, cette fois-ci, on
observe déjà une différence à la fois entre les Rodacs et les Pétrifilms ® (0,0007), et entre
les Rodacs et les Dipslides (0,0037). Les Rodacs se distinguent donc des 2 autres
méthodes.
- 31 / 39 -

85,00%
80,00%
75,00%

Coefficient de récupération
70,00%
65,00%
60,00%
55,00%
50,00%
45,00%
40,00%
35,00%
30,00%
25,00%
20,00%
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
-5,00%
Prélèvement 1 Prélèvement 2 Prélèvement 3

Moment du prélèvement

Coefficient de récupération moyen, en fonction du moment du prélèvement, indépendamment de la méthode


d'échantillonnage utilisée, après ensemencement avec E. hirae en conditions sales (2,7 g albumine/L). Les barres
verticales correspondent à 2 écarts-types, la ligne bleue horizontale à la moyenne du coefficient de récupération,
tous prélèvements confondus.

- Effet prélèvement : en se focalisant donc sur les premiers, deuxièmes et troisièmes


prélèvements, indépendamment de la méthode utilisée, le premier prélèvement récolte
significativement plus de germes que les 2 suivants (<0,0001). Tout comme en conditions
« propres », les 2 derniers prélèvements récoltent un nombre comparable de germes
(0,0713).
- 32 / 39 -

1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
Coefficient de récupération

0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0, 1
-0, 2
Rodac 1 R od a c 2 R o d a c 3 P é trifilm ® 1P é t rifilm ® 2P é trifilm ® 3 D ip slid e 1 D ip slid e 2 D ip slid e 3
M é th od e s e t m o m en ts d e p ré lè v e m e n t
Coefficient de récupération pour chacun des prélèvements successifs réalisés, et pour chacune des trois méthodes,
après ensemencement avec E. hirae en conditions sales (2,7 g/L albumine). Les barres verticales représentent 2
écarts-types, et la ligne bleue horizontale le coefficient de récupération moyen, toutes méthodes et prélèvements
confondus. Rodac 1 signifie par exemple qu’il s’agit du premier prélèvement effectué sur une plaque avec un milieu
Rodac.

Prélèvements et milieux Pr > |t|


Dipslide 1 - Dipslide 2 0,0538
Dipslide 1 - Dipslide 3 0,0026
Dipslide 1 - Pétrifilm® 1 0,1906
Dipslide 1 - Rodac 1 <0,0001
Dipslide 2 - Dipslide 3 0,2278
Dipslide 2 - Pétrifilm® 2 0,9631
Dipslide 2 - Rodac 2 0,7458
Dipslide 3 - Pétrifilm® 3 0,7413
Dipslide 3 - Rodac 3 0,8118
Pétrifilm® 1 - Pétrifilm® 2 0,4864
Pétrifilm® 1 - Pétrifilm® 3 0,1294
Pétrifilm® 1 - Rodac 1 <0,0001
Pétrifilm® 2 -Pétrifilm® 3 0,4027
Pétrifilm® 2 - Rodac 2 0,781
Pétrifilm® 3 - Rodac 3 0,5705
Rodac 1 - Rodac 2 <0,0001
Rodac 1 - Rodac 3 <0,0001
Rodac 2 - Rodac 3 0,2619

Tableau récapitulatif combinant les différences entre méthodes et prélèvements : Rodac 1 signifie par exemple
qu’il s’agit du premier prélèvement effectué sur une plaque avec un milieu Rodac. La différence est
significative quand la valeur statistique est < 0,05 (ici en rouge sur fond jaune) – conditions sales.
- 33 / 39 -

- Effet méthode et effet prélèvement combinés : le tableau 10 reprend le détail des valeurs
statistiques. La lecture du tableau 10 se fait de manière identique à celle du tableau 6.

Dans les conditions « sales », on retrouve les mêmes effets qu’en conditions propres. Le 1er
prélèvement effectué avec la méthode Rodac se distingue donc des premiers prélèvements
effectués avec les 2 autres méthodes. Les 2ème et 3ème prélèvements s’équivalent quasi toujours,
quelle que soit la méthode utilisée. A nouveau, le premier prélèvement effectué avec la méthode
Rodac se distingue des 2ème et 3ème prélèvements effectuées avec cette même méthode.

A noter qu’un effet supplémentaire apparaît : Les premiers et troisièmes prélèvements effectués
avec les Dipslides diffèrent, cette fois-ci. Ceci sera discuté au point IV.

A nouveau, une quantification de ces différences constatées a été effectuée sous forme de
« coefficients de récupération ». Le graphique 13 reprend ces valeurs, pour chacun des 3
prélèvements, et pour chacune des méthodes. Pour ne rien changer dans la lecture des figures,
Rodac 1, par exemple, signifie toujours : 1er prélèvement effectué sur la plaque avec la méthode
Rodac.

Le graphique 13 permet d’arriver aux mêmes conclusions que celles présentées pour la série
d’expériences effectuées dans des conditions « propres ».

Deux autres effets ont par ailleurs encore été observés :

- Effet temps : le comptage des CFU étant systématiquement ré-effectué toutes les 24
heures pendant 5 jours. Le 1er comptage diffère significativement du deuxième (0,0022)
et des autres, mais plus les autres entre eux. Le phénomène est donc le même que celui
observé en conditions « propres ».

- Effet répétition : tout comme pour les conditions « propres », un effet répétition a été mis
en évidence, sous-entendant que les expériences ou les conditions dans lesquelles sont
réalisées les expériences successives ne sont pas à chaque fois tout à fait identiques. Ceci
sera discuté au point IV.
- 34 / 39 -

• Bactéries subsistant sur la plaque de verre.

En ce qui concerne le nombre de CFU subsistant sur la plaque en verre après série de 3
prélèvements, 1 seul effet significatif persiste : l’effet temps.

50%
40%
% de 30% Rodac
bactéries Petrifilm
restantes 20% Dipslides
10%
0%
1
Méthodes

Pourcentage de bactéries subsistant sur le support suite aux 3 prélèvements successifs effectués pour chacune des 3
méthodes, avec E. hirae en conditions sales (2,7 g/L albumine).

- Effet méthode : dans les conditions « sales », aucune différence significative n’existe
plus entre les différentes méthodes. Cette fois, les 3 prélèvements successifs laissent un
nombre semblable de CFU sur la plaque, quelle que soit la méthode utilisée. Le
graphique 14 illustre cette absence d’effet. C’est la plus grande différence observée par
rapport aux résultats obtenus en conditions propres.

- Effet temps : seuls les jours 3 et 4 diffèrent significativement (0,0202).


- 35 / 39 -

Coefficients de récupération cumulés


1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9 Germes
0,8 restant sur
0,7 plaque
0,6 Prélèvement 3
0,5 Prélèvement 2
0,4 Prélèvement 1
0,3
0,2
0,1
0
Rodac Pétrifilm Dipslide
®
Méthodes
Synthèse des effets observés pour les 3 méthodes d'échantillonnage évaluées, après ensemencement avec E. hirae en
conditions sales (2,7 g d'albumine/L)
Si on regarde attentivement le graphique 15, et qu’on fait la somme des bactéries détectées, on
arrive à un total supérieur à 100 %. On aurait donc détecté en tout plus de germes qu’il n’y en
avait au départ. En effet, si on fait la somme des CFU comptées après 5 jours pour chacun des 3
prélèvements + les CFU qui restent sur la plaque, on obtient, en moyenne :

- Pour la méthode « Rodac » : 171 % du nombre de germes, par rapport au nombre de


germes présents au départ sur la plaque, après séchage.
- Pour la méthode « Pétrifilm® » : 124 % du nombre de germes, par rapport au nombre de
germes présents au départ sur la plaque, après séchage.
- Pour la méthode « Dipslide » : 128 % du nombre de germes, par rapport au nombre de
germes présents au départ sur la plaque, après séchage.

Ce phénomène sera discuté au point IV.

Chapitre VI : Discussion

Au vu des résultats, la discussion sera scindée en 2 parties : l’une concernant la série


d’expériences effectuées avec E. coli, l’autre concernant E. hirae.
Section 1 : E. coli
- 36 / 39 -

Les résultats obtenus avec la souche d’E. coli utilisée ne sont donc pas interprétables. Cependant,
les 2 repiquages initiaux de la souche n’ont pas posé de problème. La mise en suspension des
germes dans le tryptone-sel n’est par ailleurs pas connue pour avoir des effets délétères sur E.
coli.
Deux éléments peuvent expliquer la très faible récupération de la bactérie sur la plaque de verre
après la phase de séchage :

- L’inoculum utilisé n’est pas suffisamment important.


- La dessiccation peut également avoir une influence non négligeable sur la capacité de
survie de la bactérie.

Certaines études ont démontré que sur un support en ciment, par exemple, le taux de survie d’E.
coli était d’en moyenne 22,9 % (Avery & Buncic, 2003), avec des minima atteignant 1,2 % pour
certaines souches, après dessiccation pendant 24 heures.
Sur le verre, certaines souches d’E. coli survivent plus de 5 heures, mais les prélèvements
effectués dans le cadre de l’expérience visant à étudier ce temps de survie ont été effectués en
plein air, et non en laboratoire (Marshall et al, 1988).
A titre d’exemple, selon les données de l’ICMSF (International Commission on Microbiological
Specifications for food, 1996), l’activité de l’eau minimale (awmin) pour qu’E. coli O157:H7
survive dans des aliments est de 0,95, l’aw idéale pour sa croissance se situe aux alentours de
0,995.
Le degré d’hygrométrie du laboratoire n’a pas constitué un point d’attention particulier du
protocole. Il serait donc intéressant de réitérer cette expérience, mais cette fois dans des
conditions de température, de pH et d’hygrométrie bien contrôlées, avec plusieurs niveaux
d’inoculation. L’influence du degré d’hygrométrie et celle de la taille de l’inoculum doivent en
effet être étudiées plus en profondeur.

Section 3 : E. hirae
C’est sur les résultats obtenus avec Enterococcus que reposent les différents effets mis en
évidence dans ce mémoire. En effet, le taux de survie de la bactérie après séchage sur la surface
est satisfaisant, et l’ensemencement réalisé est donc par conséquent tout à fait valable. Au vu des
résultats, la méthode Rodac présente plusieurs avantages par rapport aux Dipslides et aux
Pétrifilms®.
En effet, lors des prélèvements de surface sur le terrain, dans l’industrie alimentaire,
pharmaceutique, dans les hôpitaux ou dans les cuisines, il est nécessaire de disposer d’une
méthode fiable, reproductible, et qui soit représentative de la contamination microbiologique
réelle de la surface à évaluer, et ce, si possible, dès un premier prélèvement. De fait, toutes les
normes citées au point I.3. ne mentionnent qu’un seul prélèvement par endroit.
Pour rappel, il apparaît ici que la méthode « Rodac » se distingue des 2 autres méthodes sur
plusieurs points, et, dans l’ensemble, le fait que la surface de départ soit propre ou sale ne
modifie pas grand-chose aux conclusions qu’on peut tirer. Les Rodacs extraient donc plus de
germes de la surface que les 2 autres méthodes. De même, c’est le premier prélèvement qui est le
plus fructueux, ce qui est recherché en pratique, sur le terrain.

Plusieurs facteurs pourraient expliquer les meilleures performances obtenues avec la méthode
Rodac :
- 37 / 39 -

- Temps de contact lors du prélèvement : l’intervalle de temps pendant lequel les Rodacs
restent en contact avec la surface à évaluer est moins sujet à variation que pour les
méthodes Dipslides ou Pétrifilms®. En effet, si, pour ces dernières, le temps de contact
est mesuré avec une montre à trotteuse, en ce qui concerne les
Rodacs, c’est l’applicateur qui émet un signal sonore une fois que la durée de contact
nécessaire est atteinte.

- Pression : à nouveau, la pression exercée avec les Rodacs sur les différentes surfaces est
uniformisée grâce à l’applicateur. Pour les Dipslides, la plicature de la membrane,
comme désigné par la flèche rouge sur la figure 3, définit la pression exercée. Cependant,
il faut maintenir le Dipslide sur la plaque de verre en posant son doigt à l’autre extrémité
de celui-ci. Cette manipulation peut faire varier légèrement la pression exercée. Pour les
Pétrifilms®, la pression est uniquement effectuée manuellement, et est donc sujette à de
grande variations d’un échantillonnage à l’autre.

- Composition du milieu : la composition du milieu de culture des trois méthodes diffère


légèrement (cfr annexe I). Cependant, il s’agit dans les trois cas de milieux « germes
totaux », non sélectifs, à pH quasi équivalent. Ce facteur ne devrait normalement
interférer avec les résultats que de manière minime, négligeable.

Néanmoins, ces résultats sont à remettre dans leur contexte, car plusieurs points peuvent être
sujets à débat.

Tout d’abord, l’expérience en elle-même : on ne peut évidemment pas généraliser les différences
constatées. Il s’agit ici d’une expérience que l’on qualifiera de préliminaire, effectuée avec un
germe particulier, à un faible niveau de contamination, avec une température et une durée
d’incubation constantes. La validation des Dipslides (Salo & al, 2000 et Salo & al, 2002), par
exemple, s’est effectuée dans plusieurs laboratoires, avec plusieurs sortes de germes, à des
niveaux de contamination faible, moyen et élevé, avec des températures et des durées
d’incubation différentes.
Par contre, l’expérience effectuée dans le cadre de ce mémoire est une première en ce qui
concerne l’alignement des 3 méthodes Rodac, Dipslide et Pétrifilm ® pour l’analyse des surfaces
de travail. En effet, comme mentionné dans l’introduction, les Rodacs ont souvent été comparées
à d’autres méthodes, dont effectivement les Dipslides et les Pétrifilms ®, mais également les
écouvillons, les ATP-mètres, le papier collant, et d’autres encore. Cependant, jamais les 3
méthodes n’ont été reprises dans une même étude.

Deuxièmement, un effet répétition a été constaté, cela aussi bien pour la série d’expériences
effectuées en conditions propres que pour celles effectuées en conditions sales, suggérant que les
conditions d’expérimentation ne sont pas tout à fait identiques d’expérience en expérience. Au
vu des résultats bruts (annexe II), l’explication la plus probable serait la variabilité du nombre de
germes ensemencés au départ. En effet, vu que la turbidité de la solution de Mc Farland (servant
d’échelle pour estimer le nombre de germes mis en suspension après double repiquage) est trop
élevée que pour être mesurable par les turbidimètres dont dispose le laboratoire, la comparaison
entre la solution de Mc Farland et la suspension bactérienne avant dilution se fait à l’œil nu. Ce
qui fait qu’après les dilutions sérielles, le nombre théorique de 30 germes/100µl a rarement été
atteint. Néanmoins, le nombre de germes au départ s’est toujours inscrit dans le même
logarithme, et si une différence significative a été détectée statistiquement, elle n’est pas si
importante aux yeux du microbiologiste.
Bien sûr, il est toujours possible que d’autres paramètres soient en cause.
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L’effet temps d’incubation, mentionné à diverses reprises dans les résultats, n’a pas beaucoup
d’importance en pratique, et n’est là qu’à titre informatif. En effet, en fonction du germe
recherché, les durées et températures d’incubation sont quasi toujours normalisées.

Une différence a été observée au niveau des résultats obtenus dans les conditions sales par
rapport aux conditions propres : dans les conditions sales, le premier prélèvement effectué avec
les Dipslides est significativement plus important que le troisième. Par contre, il n’y a pas de
différence entre les 1er et 2ème, ni entre les 2ème et 3ème prélèvements effectués avec le Dipslide.
Mais si on regarde la première ligne du tableau 10, cette absence de différence se joue de peu
(valeur Pr > |t| = 0,0538, donc très proche de 0,05) ; on peut donc en déduire que le premier
prélèvement effectué avec le Dipslide tend tout de même à être plus fructueux par rapport aux 2
suivants, dans les conditions sales. Mais cette différence est loin d’être aussi marquée qu’avec
les Rodacs.

De plus, on s’aperçoit que si on fait la somme des bactéries prélevées avec celles qui restent sur
la plaque, on a « récolté » plus de germes que l’on en a initialement « semés ». Si on peut
accepter une certaine marge de manœuvre (30 % de différence pouvant constituer une erreur
acceptable) en microbiologie, cette différence dépasse tout de même parfois les 50 % (voir point
III).
Ce phénomène a plusieurs explications possibles : tout d’abord, le nombre de bactéries de départ
(présentes sur la plaque après séchage) a pu être sous-estimé. La technique utilisée et prescrite
par la norme NBN EN 13697 peut en effet être un facteur limitant du protocole (voir point II) :
les billes de verre, dont le rôle est d’extraire les bactéries de leur support par agitation, peuvent
ne pas avoir mis tous les germes en suspension ; une partie de cette suspension subsiste
systématiquement, par capillarité, entre les billes. La suspension qui est donc filtrée peut ne pas
contenir toutes les bactéries initialement présentes sur le support.
De plus, si le facteur temps d’incubation dont on parle ci-dessus (différences entre les comptages
quotidiens) n'a pas beaucoup d'importance en pratique, le temps que prennent toutes les
manipulations, lui, peut influer d’une façon non négligeable le nombre de germes détectés sur
les plaques après séchage, après les prélèvements, etc. En effet, les bactéries ne sont pas des
éléments statiques, et se multiplient dès qu’elles le peuvent, ce qui peut provoquer une différence
entre les niveaux de contamination théorique et réel.
Une autre limitation de ce protocole est le nombre de plaques témoin choisi : une seule plaque
témoin par expérience semble insuffisant a posteriori : même si la suspension de départ est
homogénéisée, il aurait été intéressant de voir s’il y avait une variation dans l’estimation du
nombre de germes au départ.
La contamination est bien sûr une autre explication potentielle de la différence observée entre le
nombre de germes ensemencés et prélevés. Ce phénomène est difficile à évaluer dans cette
étude : seuls des milieux sélectifs ont été choisis pour estimer le nombre d’Enterococcus présents
sur les plaques ou dans l’inoculum. Il aurait été intéressant de coupler ces contrôles avec
d’autres, sur milieu non sélectif.
En effet, la probabilité de contamination croisée au cours de l’expérimentation, malgré toutes les
précautions prises, n’est jamais exclue à 100 %. On pourrait imaginer que, malgré le
renouvellement des filtres stériles, certains Enterococcus subsistent sur la tête de filtration et
contaminent les filtres suivants, provoquant une surestimation du nombre de germes subsistant
sur la plaque.
S’il n’y a ni sous-estimation, ni contamination, peut-être faut-il envisager un facteur de
correction des résultats obtenus, en fonction de la méthode choisie, de façon à rendre un résultat
qui soit représentatif de la flore réellement présente sur la surface prélevée. D’ailleurs, les
résultats obtenus sont dans ce cas-ci en contradiction avec Salo et al (2000), qui ont un taux de
récupération nettement moindre: sur un support en inox, avec une flore aérobie, et par rapport à
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la solution de départ (avant ensemencement), ils n’obtiennent que 16 % (haut niveau de


contamination au départ) à 30 % (faible niveau

de contamination de départ) au mieux de germes récupérés, que ce soit avec les Rodacs, les
Dipslides ou les écouvillons (aucune différence n’a d’ailleurs été constatée par les auteurs entre
les 3 méthodes). Dans une seconde étude sur ces mêmes trois méthodes, Salo & al (2002)
avancent cette fois-ci des coefficients de récupération plus proches de ceux que nous avons
trouvé : de 15 % (pour les surfaces en inox fortement contaminées avec des Enterobacteriaceae,
et incubation sur milieu VRBGA) à 100 % (surfaces faiblement contaminées) pour les Rodacs, et
de 15 à 150 % pour les Dipslides. De même Hartemann & al (1980), après avoir effectué,
comme dans le cadre de ce mémoire, plusieurs prélèvements successifs à un même endroit sur
plusieurs types de surfaces à l’aide de la méthode Rodac, étaient également arrivés à la
conclusion qu’il fallait appliquer un coefficient de récupération aux résultats, afin d’estimer la
contamination réelle de la surface : par exemple, un premier prélèvement sur du carrelage
présentait une efficacité de récupération de 39 % ; cependant, ils échantillonnaient des surfaces
naturellement contaminées, non comparables avec le faible inoculum utilisé dans le cadre de ce
mémoire. Le coefficient de récupération à appliquer serait propre à chaque type de matériau.
Whyte & al (1989), quant à eux, font intervenir ce coefficient de récupération dans une équation
reprenant également le nombre d’échantillons effectués, afin de déterminer le niveau de
contamination initial d’un plan de travail.
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Conclusions
Les boîtes de contact (Rodacs) apparaissent plus performantes que les lames de contact
(Dipslides) et les Pétrifilms®, dans les conditions posées lors de cette expérience.
Il s’agit cependant d’une étude préliminaire, et des investigations à plus grande échelle, avec
différents niveaux de contamination et différents germes doivent confirmer ces résultats.
D’autre part, il faudrait réitérer l’expérience avec E. coli, mais en contrôlant mieux les conditions
environnementales de l’expérimentation (notamment l’humidité), et en utilisant différents
niveaux d’inoculation.
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abcd…
1. efgh…
a. zz
b. zzz
(1) zzz
(2) zzz
c. gggg
d. klmn…
1. vvv
2. opqr
Annexe [B?]
IRSD – 119 Div
Appendice [1?]
[Titre]
- 1 / [Nb3?]-

[Titre de l'annexe ou de l'appendice]

zzzz
Annexe [B?]
IRSD – 119 Div
Appendice [1?]
[Titre]
- 2 / [Nb3?]-

mmmmm