Vous êtes sur la page 1sur 45

Ecole Royale Militaire

27/11/2009

DEML

121 Div

FCOS
34 Session

Comparaison des boîtes de


contact, des lames gélosées
et des Pétrifilms ® dans le
cadre du contrôle de
l’hygiène des surfaces non
poreuses.

Anthony NOTERMAN
Vétérinaire Capitaine
i

Table des matières

Table des matières.....................................................................................................................i

Listes des annexes....................................................................................................................iv

Introduction...............................................................................................................................1

Chapitre I : Comment contrôler l’hygiène des surfaces ?....................................................2

Un des points importants à contrôler au cours d’une inspection dans le cadre de la sécurité
alimentaire dans les cuisines de collectivité est la propreté. Pour assurer celle-ci, un plan de
nettoyage et de désinfection doit être conçu et respecté. Le responsable de la cuisine doit
donc décrire avec grande précision les surfaces qui seront nettoyées, à quelle fréquence,
avec quels détergents, avec quels produits de désinfection et avec quel personnel. De même,
il doit valider son plan de nettoyage, c'est-à-dire démontrer qu’il est efficace. Par après, un
système de surveillance est mis en place, de manière à vérifier que cette efficacité perdure.

C’est dans le cadre de cette validation et de cette surveillance que plusieurs outils, présents
sur le marché, peuvent être utilisés. Ils reposent sur la détection et la quantification de
différentes molécules ou micro-organismes, visant in fine à mesurer l’état de propreté
d’une surface, ou tout du moins à apprécier l’efficacité du nettoyage.

Il faut noter que ces méthodes d’analyse doivent elles-mêmes fournir des mesures fiables et
doivent donc également être validées.

Ci-dessous, un aperçu de ce qui existe sur le marché :..........................................................2

Section 1 : ATP métrie......................................................................................................2

L’ATP est une molécule que l’on retrouve dans toutes les cellules vivantes, ou même
parfois peu après leur mort. Il peut donc provenir de restes alimentaires, de bactéries, de
levures, de moisissures ou autres micro-organismes, et permet donc d’évaluer le « niveau
de contamination » d’une surface......................................................................................3

L’ATP métrie consiste à frotter un écouvillon sur une surface de, par exemple, 100 cm². Ce
prélèvement est alors dilué dans un liquide stérile et mis en contact avec des réactifs, dont
le principal est la luciférine. Cette enzyme, en présence d’ATP, va provoquer l’émission
d’une certaine quantité de lumière. Les appareils d’ATP métrie mesurent la lumière émise
(en RLU), directement proportionnelle à la quantité d’ATP qui a réagi...........................3

Cette méthode trouve donc son intérêt dans la comparaison entre niveaux de contamination
(quantité d’ATP mesurée) avant et après nettoyage, mais ne permet pas le dénombrement
en lui-même des micro-organismes présents.....................................................................3

Section 2 : Les Rodacs ou « boîtes de contact »...............................................................3


ii

Les Rodacs sont des boîtes de Petri de 25 cm² remplies d’un milieu de culture
microbiologique (ou gélose), de façon à ce que celui-ci présente une forme convexe. Ce
milieu de culture peut être sélectif ou non, en fonction des germes que l’on désire détecter.
La Rodac est appliquée sur la surface à tester avec une pression (500 g ± 50 g) et une durée
(10 secondes) bien décrites dans les normes existantes (NF V 08-037 de mai 2003 et ISO
18593 de juin 2004) ; des applicateurs, comme sur la figure supra, sont d’ailleurs souvent
utilisés dans le but d’uniformiser cette pression et cette durée d’application. Au moment de
l’application de la gélose sur les surfaces, des restes de désinfectants peuvent également
être récoltés. C’est pourquoi le milieu de culture comporte un complexe neutralisant les
désinfectants (exemple : polysorbate 80 + lécithine ou histidine 1 à 3 %)........................3

Les Rodacs sont alors incubées pendant un temps et à une température précis, variant en
fonction du milieu de culture utilisé..................................................................................4

Il suffit ensuite de compter les colonies qui ont poussé, exprimées en UFC/25 cm²........4

Cette méthode vise donc à quantifier et permet d’éventuellement identifier la population


bactérienne ou fongique présente sur la surface à évaluer.................................................4

Section 3 : Les dipslides ou « lames gélosées »................................................................4

Section 4 : L’écouvillonnage............................................................................................4

Section 5 : Les Petrifilms®...............................................................................................5

Section 6 : Autres..............................................................................................................5

Sur le marché coexistent toute une batterie de petits tests nécessitant peu ou pas
d’équipement de laboratoire, basés le plus souvent sur des principes différents, et qui
visent la rapidité du rendu des résultats, dont voici quelques exemples : ..........................5

Chapitre II : Législation, normes et critères existants.........................................................7

Ci-dessous quelques exemples de normes et de rares critères d’interprétation existants :8

Chapitre III : Revue de la littérature et cadre de la thèse.................................................10

Chapitre IV : Matériel et méthodes.....................................................................................14

Le protocole expérimental est basé sur les normes NBN EN 13697 : 2001 et ISO 18593 :
2004...........................................................................................................................................14

En annexe XXX est repris le détail de la composition des différents supports utilisés dans
ce protocole (milieux, bouillons, etc).....................................................................................14

Section 1 : Matériel.........................................................................................................14

Section 2 : Méthode........................................................................................................15

Chapitre V : Résultats............................................................................................................18
iii

Section 1 : E. coli.............................................................................................................18

Les résultats obtenus avec E. coli ne sont pas interprétables statistiquement. En effet, que
ce soit en conditions « propres » (0,3 g d’albumine /L) ou « sales » (2,7 g d’albumine/L), la
récupération d’E. coli après ensemencement sur les plaques de verre et après séchage est
très faible, voire nulle. Donc, très peu, voire aucune E. coli n’a poussé, que ce soit sur les
filtres reprenant le nombre de bactéries présentes sur la plaque juste après la phase de
séchage, mais avant la phase de prélèvement, ou que ce soit sur les différents milieux de
prélèvement eux-mêmes (Rodacs, Pétrifilms® , Dipslides). Vu ce manque de résultat et la
lourdeur du protocole, la phase expérimentale a d’ailleurs été avortée pour E. coli après 4
expériences en conditions propres et 2 expériences en conditions sales.
Les raisons de ce manque de récupération seront discutées au point................................18

Section 2 : E. hirae...........................................................................................................18

1.Conditions propres (0,3 g albumine/L)........................................................................19

a.Ensemencement.
..........................................................................................................................................19

Ce phénomène sera discuté au ..............................................................................................24

Section 1 : E. coli.............................................................................................................29

II. E. hirae........................................................................................................................30

Conclusions..............................................................................................................................34

D’autres normes sont encore à l’état de projet, notamment :..............................................2


iv

Listes des annexes

Annexe A : Bibliographie
Annexe B : Liste des abréviations
Annexe C : Législation
- 1 / 34 -

Introduction

Ce mémoire s’inscrit dans le cadre des activités du Service Vétérinaire de la Défense. Celui-ci
est constitué comme suit : le bureau spécialisé vétérinaire du COMOPSMED coordonne les
différentes antennes vétérinaires rattachées chacune à un CMO ou à l’EMI Tech (voir Figure 1).
Contrairement à la clinique vétérinaire, où seule la médecine canine est exercée, les autres
antennes sont constituées d’un module hygiène.

Figure 1 : Structure du Service Vétérinaire de la Défense

Le terme « hygiène » s’entend ici dans un cadre de « Santé Publique ». Le but est de veiller à ce
que, par exemple, la sécurité alimentaire, l’hygiène hospitalière ou encore la prévention des
zoonoses soient optimalisés, de manière à minimiser les risques sanitaires. Cet objectif se traduit
en de nombreuses activités, comme entre autres le contrôle des cuisines de collectivité, qui
illustrera les différents thèmes abordés dans ce document.
Un des aspects abordé lors des inspections de cuisine est la propreté des surfaces de travail. Si
l’inspecteur vétérinaire peut apprécier celle-ci de manière visuelle ou au toucher, de nombreuses
techniques d’analyse visent à objectiver cette appréciation, la rendant plus précise et également
moins contestable. Ces techniques sont dons utilisées par les inspecteurs mais peuvent également
l’être par le personnel de cuisine, de manière à ce que celui-ci puisse apprécier la qualité de son
plan de nettoyage et de désinfection (voir .
Quelle technique d’analyse utiliser ? Nous verrons au infra que le marché regorge de tests en tout
genre, aux performances inégales et reposant sur des principes scientifiques différents. Ensuite,
nous verrons dans quelle logique législative ils s’inscrivent, à quelles normes ou quels critères ils
répondent.
Le but ultime des inspections de cuisine est de prévenir les intoxications alimentaires. Le Service
Vétérinaire de la Défense entend donc utiliser, dans le cadre de ses inspections, une technique
d’analyse de surface dirigée vers le dénombrement et éventuellement l’identification des micro-
organismes qui pourraient entrer en contact avec les denrées alimentaires. Comme il existe
plusieurs techniques répondant à ces critères, cette étude vise simplement à déterminer laquelle
d’entre elles est la plus efficace.
- 2 / 34 -

Ainsi, les Pétrifilms®, les Dipslides et les Rodacs seront comparés, selon une méthode
expérimentale bien précise et décrite au infra. Les résultats et leurs implications seront discutés
au XXX.
Cette étude s’inscrit dans le projet qu’a le Service Vétérinaire de la Défense d’établir des critères
microbiologiques de propreté des surfaces de travail dans les cuisines de collectivité, ces critères
étant encore inexistants à ce jour, comme nous le verrons dans le infra.
Ce mémoire n’aurait pu voir le jour sans l’agréable concours des Professeurs DAUBE
(ULg/FMV), DEVLEESCHOUWER (ULB/microbiologie) et HARTEMANN (Faculté de
médecine de Nancy), ainsi que l’appui du Docteur Vétérinaire MASSART en matière de
statistiques.
Je remercie également les promoteurs de ce mémoire, le Vétérinaire Lieutenant Colonel
STEVENS ainsi que le Docteur Vétérinaire VERMEYLEN pour leur appui et leurs remarques
constructives.

Chapitre I : Comment contrôler l’hygiène des surfaces ?

Un des points importants à contrôler au cours d’une inspection dans le cadre de


la sécurité alimentaire dans les cuisines de collectivité est la propreté. Pour
assurer celle-ci, un plan de nettoyage et de désinfection doit être conçu et
respecté. Le responsable de la cuisine doit donc décrire avec grande précision
les surfaces qui seront nettoyées, à quelle fréquence, avec quels détergents, avec
quels produits de désinfection et avec quel personnel. De même, il doit valider
son plan de nettoyage, c'est-à-dire démontrer qu’il est efficace. Par après, un
système de surveillance est mis en place, de manière à vérifier que cette
efficacité perdure.

C’est dans le cadre de cette validation et de cette surveillance que plusieurs


outils, présents sur le marché, peuvent être utilisés. Ils reposent sur la détection
et la quantification de différentes molécules ou micro-organismes, visant in fine
à mesurer l’état de propreté d’une surface, ou tout du moins à apprécier
l’efficacité du nettoyage.

Il faut noter que ces méthodes d’analyse doivent elles-mêmes fournir des
mesures fiables et doivent donc également être validées.

Ci-dessous, un aperçu de ce qui existe sur le marché :

Section 1 : ATP métrie.


- 3 / 34 -

Figure 2 : ATP mètres

L’ATP est une molécule que l’on retrouve dans toutes les cellules vivantes, ou
même parfois peu après leur mort. Il peut donc provenir de restes alimentaires, de
bactéries, de levures, de moisissures ou autres micro-organismes, et permet donc
d’évaluer le « niveau de contamination » d’une surface.

L’ATP métrie consiste à frotter un écouvillon sur une surface de, par exemple, 100
cm². Ce prélèvement est alors dilué dans un liquide stérile et mis en contact avec des
réactifs, dont le principal est la luciférine. Cette enzyme, en présence d’ATP, va
provoquer l’émission d’une certaine quantité de lumière. Les appareils d’ATP
métrie mesurent la lumière émise (en RLU), directement proportionnelle à la
quantité d’ATP qui a réagi.

Cette méthode trouve donc son intérêt dans la comparaison entre niveaux de
contamination (quantité d’ATP mesurée) avant et après nettoyage, mais ne permet
pas le dénombrement en lui-même des micro-organismes présents.

Section 2 : Les Rodacs ou « boîtes de contact ».

Figure 3 : a. Rodac ou « boîte de contact » ; b. et c. prélèvement avec Rodac à l’aide d’un applicateur

Les Rodacs sont des boîtes de Petri de 25 cm² remplies d’un milieu de culture
microbiologique (ou gélose), de façon à ce que celui-ci présente une forme convexe.
Ce milieu de culture peut être sélectif ou non, en fonction des germes que l’on désire
détecter. La Rodac est appliquée sur la surface à tester avec une pression (500 g ± 50
g) et une durée (10 secondes) bien décrites dans les normes existantes (NF V 08-037
de mai 2003 et ISO 18593 de juin 2004) ; des applicateurs, comme sur la figure
supra, sont d’ailleurs souvent utilisés dans le but d’uniformiser cette pression et cette
durée d’application. Au moment de l’application de la gélose sur les surfaces, des
- 4 / 34 -

restes de désinfectants peuvent également être récoltés. C’est pourquoi le milieu de


culture comporte un complexe neutralisant les désinfectants (exemple : polysorbate
80 + lécithine ou histidine 1 à 3 %).

Les Rodacs sont alors incubées pendant un temps et à une température précis,
variant en fonction du milieu de culture utilisé.

Il suffit ensuite de compter les colonies qui ont poussé, exprimées en UFC/25 cm².

Cette méthode vise donc à quantifier et permet d’éventuellement identifier la


population bactérienne ou fongique présente sur la surface à évaluer.

Section 3 : Les dipslides ou « lames gélosées ».

Figure 4 : Dipslides ou « lames gélosées » (source : Solar Biologicals)


Les Dipslides consistent en une plaque en plastique flexible de chaque côté de laquelle se
trouvent des milieux de culture microbiologique. Tout comme les Rodacs, ils s’apposent à la
surface à tester. La pression est exercée en pliant la partie indiquée par la flèche rouge sur la
figure 3. A nouveau, différents types de milieux sont disponibles, ce qui déterminera le temps et
la température d’incubation des Dipslides après prélèvement.

Il suffit alors de compter les UFC. La surface d’un Dipslide est en général de 7 à 10 cm².

Le principe est donc le même que celui des Rodacs.

Section 4 : L’écouvillonnage

a b c
Figure 5 : a. Ecouvillon (source : Labchem) – b. Prélèvement (source : Biocontrol) – c. Ensemencement
(source : Biocareers)
L’écouvillon est une tigette terminée par du coton stérile que l’on va frotter sur la surface à
tester. La façon de frotter (stries dans deux directions perpendiculaires, angle entre 30 et 45°,
pression constante), ainsi que la surface à couvrir (20 ou 100 cm², utilisation d’un gabarit
conseillée) sont à nouveau bien décrites (NF V 08-037 de mai 2003 et ISO 18593 de juin 2004).
Le prélèvement est alors plongé dans une solution stérile, présente dans le tube dans lequel
l’écouvillon est conservé. Cette solution est maintenue à 4°C pour limiter les phénomènes de
multiplication de flore. Le diluent est ensuite agité pour mettre les bactéries en solution et remis
- 5 / 34 -

en culture sur boîte de Pétri. Reste, encore une fois, à incuber le milieu de culture et à compter
les UFC.

Section 5 : Les Petrifilms®

Figure 6 : Pétrifilms® et leur conditionnement (source : 3M)


Comme son nom l’indique, le Pétrifilm® est l’équivalent d’une boîte de Pétri, mais est aussi fin
qu’un film. Ce film est constitué d’un film plastique adhésif, d’un agent gélifiant soluble dans
l’eau froide, de nutriments (variables en fonction des germes recherchés), et d’un film plastique
comportant une grille de lecture, facilitant le comptage.
Après adjonction d’un milieu (LPT BR) stérile, le Pétrifilm ® peut être appliqué sur la surface à
tester. Après incubation, les UFC sont comptées.

Section 6 : Autres

Sur le marché coexistent toute une batterie de petits tests nécessitant peu ou pas
d’équipement de laboratoire, basés le plus souvent sur des principes différents,
et qui visent la rapidité du rendu des résultats, dont voici quelques exemples :

Figure 7 : Kit Protect® Hygenius Control (source : cuisine collective)


Johnson Diversey a développé un kit de détection des protéines résiduelles sous le nom de « Pro-
Tect® » (Figure supra). Il s’agit d’un écouvillon avec lequel la surface à évaluer est
échantillonnée sur 10 cm². L’écouvillon est alors introduit dans le tube, dans lequel se trouve un
indicateur. Celui-ci, une fois en contact avec le prélèvement, change de couleur après 10
minutes. Cette couleur est comparée à une échelle colorimétrique présente sur le tube, et
comportant quatre degrés : « ok, douteux, sale ou très sale ». Le seuil de détection des protéines
est de 50 µg/cm².
- 6 / 34 -

Figure 8 : Spotcheck® et spotcheck plus® (source : MK Scientific)

« Spotcheck® », développé par Hygiena International Ltd, détecte les résidus de glucose et
« Spotchek Plus® », les résidus de lactose en plus (figure supra). Le principe repose sur le fait
que si l’on détecte du glucose (qui se retrouve dans la plupart des denrées alimentaires) sur la
surface analysée, le nettoyage n’a pas été efficace. Le lactose est présent dans le lait, ce pourquoi
Spotcheck Plus® est surtout utilisé dans le contrôle d’hygiène des surfaces en laiterie.

Figure 9 : Bacter test ATL® (source : Hygi plus)

« Bacter-Test ATL®» est un test au cours duquel les surfaces sont échantillonnées à l’aide d'un
écouvillon stérile. Les micro-organismes ainsi prélevés sont incubés pendant 10 heures à 37 °C
sur un milieu de culture qui vire du rouge au jaune. Si le temps de virage est inférieur à 10
heures, la surface est considérée comme contaminée, s'il est supérieur, la surface est considérée
comme suffisamment désinfectée.

Figure 10 : Flash® (source : biocontrol)


Autre procédé rapide, dit sensible et simple d'utilisation pour contrôler le nettoyage: le « Flash
Test », un test de détection des protéines basé sur le développement d'un complexe coloré entre
les protéines et certains colorants : si la couleur obtenue sur la bandelette est jaune, la surface est
considérée comme propre. Si une couleur bleue/verte atteint les bords de la bandelette, la surface
est considérée comme sale. La procédure dure 10 secondes. La surface de la bandelette est de 4’’
x 4’’.
- 7 / 34 -

Figure 11 : Hy Rise® (source : AMCO instruments)

Le Hy Rise® consiste également en un test colorimétrique sur bandelettes : la bandelette est


humidifiée avec la solution A, et frottée sur 30 cm de surface à tester. Les réactifs B et C sont
ensuite ajoutés. Si, après 4-5 minutes, la bandelette se colore, la présence de NAD, NADH,
NADP ou encore NADPH est détectée. La surface est alors considérée comme sale, car ces
molécules témoignent de la présence de cellules vivantes.

Chapitre II : Législation, normes et critères existants

Les différents acteurs de la chaîne alimentaire sont soumis à une législation (nationale mais
surtout européenne, en annexe C) très stricte, exigeant un niveau de maîtrise du risque sanitaire
toujours plus grand, et ce depuis les années nonante, période au cours de laquelle l’opinion
publique a été marquée par la crise de la dioxine.
Sans rentrer dans le détail de cette législation, il est important de connaître deux des principes
fondamentaux sur lesquels elle se base :
- La présomption d’innocence n’existe pas : en cas de problème sanitaire, chaque maillon
de la chaîne alimentaire, et donc également le responsable d’une cuisine, doit pouvoir
démontrer qu’il a tout mis en œuvre pour maintenir le risque sanitaire à un niveau
acceptable, et que si problème sanitaire il y a, il n’en est pas la cause.
- L’autocontrôle : dans le même ordre d’idées, il revient au responsable d’une cuisine
d’implémenter un système de contrôle de sa propre production, contrôle visant à garantir
la sécurité alimentaire. Les inspecteurs vétérinaires et leurs personnels ont pour rôle de
vérifier que l’autocontrôle existe et qu’il est efficace.
Pour satisfaire aux exigences légales, plusieurs systèmes d’autocontrôle existent, le plus connu
étant l’HACCP, d’ailleurs mentionné tel quel dans la législation. Le Service Vétérinaire a en
outre traduit cette dernière dans la réglementation militaire belge sous forme de l’AO-J 622 A,
lui-même mis à jour dans une APG et ses SPS/GID associées, encore en cours de publication à
l’heure actuelle. Cette réglementation militaire se concentre sur les secteurs directement liés à la
Défense, à savoir la fin de la chaîne alimentaire (transport, stockage, transformations de denrées
alimentaires), et vise à implémenter l’HACCP dans les cuisines de la Défense. Les techniques
d’analyse de surfaces s’inscrivent dans cette logique d’autocontrôle.
Ces méthodes d’analyse doivent répondre à des normes, décrivant principalement les modalités
de prélèvement, de transport, d’analyse des échantillons, et de rendu des résultats de ces
analyses. Mais les normes s’arrêtent souvent là, laissant libre l’interprétation des résultats.
Par exemple, la norme NF V 08-037 de mai 2003 (voir ci-dessous) mentionne, à propos de
l’expression et de l’interprétation des résultats : « en raison des incertitudes sur les résultats
obtenus avec la méthode d’analyse, ainsi que de la variabilité due aux modalités de prélèvement,
l’interprétation des résultats dépendra des objectifs fixés par les parties concernées ; objectifs
inhérents à chaque site de prélèvement, et à l’entité dont il fait partie ». C’est la raison pour
- 8 / 34 -

laquelle le Service Vétérinaire tient à fixer lui-même, mais sur des bases scientifiques solides,
des critères d’interprétation des surfaces de travail en cuisine collective.

Ci-dessous quelques exemples de normes et de rares critères d’interprétation


existants :

1. Norme belge NBN EN 13697 (2001) : « Antiseptiques et désinfectants chimiques – Essai


quantitatif de surface non poreuse pour l’évaluation de l’activité bactéricide et/ou fongicide
des désinfectants chimiques utilisés dans le domaine de l’agro-alimentaire, dans l’industrie,
dans les domaines domestiques et en collectivité – Méthode d’essai sans action mécanique et
prescriptions » : cette norme décrit donc le protocole expérimental (germes, matériel à
utiliser, etc) à mettre en œuvre pour évaluer l’efficacité des désinfectants. C’est cette norme
qui a d’ailleurs inspiré le protocole expérimental mis au point dans ce mémoire.
2. Norme française NF V 08-037 (mai 2003): « Microbiologie des aliments - Surfaces
d’environnement agro-alimentaire – Prélèvement d’échantillons destinés à l’analyse
microbiologique ». Cette norme décrit comment prélever à l’aide d’un écouvillon (ou de
gaze ou encore d’une chiffonnette) ou de boîtes de contact. Elle décrit également le
transport, l’analyse et le rendu des résultats.
3. Norme française NF ISO 17604 (2003) : « Microbiologie des aliments – Prélèvement
d’échantillons sur des carcasses en vue de leur analyse microbiologique ».
4. Norme ISO 18593 (juin 2004) : « Microbiologie des aliments – Méthodes horizontales pour
les techniques de prélèvement sur des surfaces, au moyen de boîtes de contact et
d’écouvillons » : à nouveau, les modalités de prélèvement, de transport, d’analyse et de
rendu de résultats sont décrites ; par contre, aucune limite n’est fixée quant au nombre de
germes acceptables.
5. D’autres normes, sortant du secteur agroalimentaire, existent. Elles sont reprises en annexe.

Quelques chiffres permettant d’interpréter les résultats sont parfois avancés au niveau législatif,
par exemple dans la Décision de la Commission Européenne du 8 juin 2001 (transposée dans
l’Arrêté Royal du 28 août 2002) établissant les règles applicables au contrôle régulier de
l'hygiène générale, effectué par les exploitants d’ateliers de découpe (viande fraîche, volaille) :
ainsi, plusieurs types de surfaces sont mentionnés (couteaux, tables de grattage, etc). Ces
surfaces sont testées à l’aide de Rodacs ou d’écouvillons, après nettoyage et désinfection. Le
tableau infra reprend les valeurs acceptables et inacceptables.

Valeurs moyennes du nombre de colonies pour les tests de surface


Acceptable Inacceptable
Comptages viables totaux (TVC) 0-10/cm² >10/cm²
Entérobactéries 0-1/cm² >1/cm²
Tableau 1 : Valeurs moyennes du nombre de colonies pour les tests de surface (Décision de la Commission
Européenne du 8 juin 2001)

Contrairement au secteur agro-alimentaire, un nombre important de critères relatifs au


niveau de contamination des surfaces existent déjà dans les secteurs pharmaceutique et
hospitalier, comme illustré par les tableaux ci-dessous.

Zones protégées Résultats en UFC/25cm²


- 9 / 34 -

Aspergillus ou autre Germes totaux*


champignon filamenteux
Salle d’opération Cible : <1 Cible : < 5 et absence de
Salle de radiologie Alerte : 1 germes pathogènes
interventionnelle Action : 1 Action : > 5 ou présence de
germes pathogènes
Chambre d’isolement
protecteur avec flux laminaire
Hottes à flux laminaire
*Prélèvements effectués après bionettoyage et hors activité humaine

Tableau 2 : Critères d’interprétation proposés pour les prélèvements de surface en hôpital (Ministère de la
Santé, de la Famille et des Personnes Handicapées, Direction Générale de la Santé, Direction de
l’Hospitalisation et de l’Organisation des Soins, Comité Technique National des Infections
Nosocomiales(France) : « Surveillance microbiologique de l’environnement dans les établissements de
santé :Air, eaux et surfaces », 2002)

Le tableau 3 reprend les seuils présentés dans le « guide du bionettoyage », en fonction du risque
sanitaire que représente le local hospitalier pour le patient :

Guide du bionettoyage ASPEC Recommandation 1999


Zone UFC/25 cm² Zone à très hauts risques
4 <5 Niveau Bactéries Moisissures
(UFC/boîte) (UFC/boîte)
Action 10 1
Alerte 5 1
Cible <1 <1
3 <5 Zones à hauts risques
Niveau Bactéries Moisissures
(UFC/boîte) (UFC/boîte)
Action 25 1
Alerte 10 1
Cible 5 <1
2 <50
1 <125

Tableau 3 : Critères microbiologiques après prélèvements de surface dans les locaux, en fonction du risque
sanitaire qu’ils représentent (Guide du bionettoyage GPEM/SL N°5670).

Dans ce tableau, le niveau cible est défini comme le niveau de qualité qui vise à assurer et à
maintenir des conditions normales de fonctionnement dans le contexte d’un environnement
maîtrisé.
Le niveau d’alerte est le niveau permettant une première alerte en cas de dérive par rapport aux
conditions normales. Lorsque ce seuil d’alerte est dépassé, des recherches supplémentaires
doivent être mises en place, afin de vérifier les résultats observés et de s’assurer que le processus
et/ou l’environnement sont toujours maîtrisés. Compte tenu des délais d’analyse, les premières
mesures correctives peuvent être prises.
Le niveau d’action est le niveau devant impérativement déclencher, lorsqu’il est dépassé, une
réaction immédiate avec analyse des causes du dysfonctionnement et mise en œuvre d’actions
correctives.
- 10 / 34 -

Chapitre III : Revue de la littérature et cadre de la thèse.


Nous avons donc vu qu’il existe différents moyens d’évaluer le degré de contamination des
surfaces.

Tout d’abord, il y a l’évaluation visuelle. Mais nombre d’études ont déjà démontré que l’œil
humain sous-estime largement la contamination microbienne réelle des surfaces. Beaucoup
d’entre elles, d’apparence propre, sont considérées comme sales après analyse microbiologique
(Moore et Griffith, 2002 ; Tebbutt et al, 2006). Outre son caractère subjectif, l’évaluation
visuelle est par ailleurs facilement contestable par les personnes dont l’établissement est
inspecté.

C’est pourquoi différentes techniques d’analyse ont été développées (voir . Parmi la gamme
étendue de techniques disponibles sur le marché, certaines sont normalisées (voir ). Si de
nombreux critères ont été fixés dans les secteurs pharmacologique et hospitalier, ils sont encore
rares dans l’agro-alimentaire. Le Service Vétérinaire de la Défense a donc lancé un projet visant
à fixer des critères de propreté des surfaces de travail dans les cuisines de collectivité. De tels
critères ont déjà été suggérés au cours d’études, mais pour l’industrie agro-alimentaire en général
(ex : 2,5 UFC/cm² après nettoyage) (Moore et Griffith, 2002). Le projet du Service Vétérinaire
vise à catégoriser les surfaces de manière précise (planche de découpe, poignée de frigo, couteau,
assiette, plan de travail, etc.), et, pour chacune d’elles, de fixer des critères. Ces critères seraient
repris dans la réglementation militaire.

Pour ce faire, il faut d’abord déterminer la méthode d’analyse qui sera utilisée, ensuite les
paramètres à mesurer. Par après, il faudra procéder à des campagnes de prélèvements dans les
cuisines, analyser les résultats obtenus pour pouvoir enfin décider de critères.

Nous nous trouvons donc au début du processus, et devons choisir la méthode d’analyse qui sera
utilisée. En effet, devant la multiplicité des méthodes d’analyse disponibles sur le marché, il faut
en trouver une qui soit la plus fiable possible. Aucune technique n’est à l’heure actuelle
considérée comme le « Golden Standard », ce qui rend l’interprétation des résultats difficiles, vu
qu’il n’y a pas de méthode universellement reconnue avec laquelle on peut comparer la méthode
utilisée. Il existe par exemple de nombreux modèles d’ATP-mètres, mais ceux-ci sont le plus
souvent testés par les fabricants eux-mêmes, et ne sont pas toujours comparables entre eux. Une
étude (Colquhoun et al, 1998) a bien comparé trois modèles d’ATP-mètres, mais le
développement de procédures normalisées d’évaluation de la propreté des surfaces par la mesure
de l'ATP n’est pas encore d’actualité.

Il serait donc intéressant, dans un premier temps, de comparer les performances des méthodes
entre elles, de façon à déterminer si l’une d’entre elle est plus appropriée à l’établissement des
critères souhaités.

A l’image de la réalité du marché, le Service Vétérinaire dispose de plusieurs méthodes


d’analyses : les Dipslides, les Rodacs, les Pétrifilms ®, les écouvillons, le Hy-Lite et le Hy-Rise.
Notre principale préoccupation étant le risque de contamination des aliments par des micro-
organismes, nous avons décidé de choisir une méthode d’analyse basée sur la recherche directe
de ces derniers. Restaient donc les Dipslides, les Rodacs, les Pétrifilms ® et les écouvillons.
Contrairement aux écouvillons, les trois premières techniques fonctionnent exactement selon le
même principe, à savoir appliquer un milieu de culture microbiologique directement sur une
surface, de manière à y piéger les micro-organismes. La logique veut donc que, dans un premier
temps, l’on détermine laquelle de ces trois techniques est la plus performante.
- 11 / 34 -

Que trouve-t-on dans la littérature à ce sujet ? Plusieurs études ont déjà comparé différentes
méthodes d’échantillonnage entre elles, mais les conclusions restent somme toute assez
divergentes.

Ainsi, il apparaît que les Rodacs sont plus adaptées pour les surfaces planes et dures (voir
graphiques 1 et 2), plus performantes (sensibilité et répétabilité meilleures) que les écouvillons
ou le papier collant sur supports inox ou plastique peu contaminés, surtout si l’on travaille avec
E. coli. En effet, après avoir effectué 143 prélèvements en vue de la détection d’E. coli sur
différents types de surfaces, les Rodacs donnent des résultats positifs dans 11,2 % des cas contre
5,6 % des cas pour les écouvillons (Tebutt, 1990). D’autres études nuancent ces résultats et
donnent les Rodacs gagnantes pour les coques Gram+, perdantes pour les bâtonnets Gram- par
rapport à l’écouvillon (Graphique 3). Les Rodacs donneraient par ailleurs une image plus fidèle
de la contamination en surface, car, contrairement à l’écouvillon, elles ne séparent pas les
éléments formant des colonies (Tamminga et Kampelmacher, 1977). D’autres auteurs estiment
que cela présente un désavantage plutôt qu’un avantage : en effet, si l’empreinte, la disposition
des bactéries sur la surface à échantillonner est reproduite plus fidèlement avec la Rodac, en ce
qui concerne le dénombrement des bactéries, les Rodacs ne distinguent pas un organisme isolé
d’une microcolonie, alors que l’écouvillon disloque ces microcolonies par action mécanique
(Tebutt, 1990). Les limites supérieures de l’utilisation des Rodacs se situeraient aux alentours des
450 UFC / 25 cm2, au-delà desquelles la différence de contamination entre surfaces devient
impossible à mettre en évidence (Scott et al, 1984), contrairement à l’écouvillonnage, technique
permettant d’effectuer des dilutions préalables (Russel et al, 1997). De même, pour chaque type
de surface, un coefficient de récupération doit être déterminé (Hartemann et al, 1980) : comme
seule une partie des germes se trouvant sur la surface à tester sont récupérés par les Rodacs, ce
coefficient de récupération est appliqué aux résultats du comptage des UFC, ce qui permet
d’estimer la contamination réelle de la surface au moment de l’échantillonnage. Les Rodacs
offriraient un taux de récupération supérieur (E. coli : 80 %, A. niger : 67 %) à celui de
l’écouvillon (E. coli : 1 %, A. niger : 26 %) quel que soit le microorganisme (Foschino, 2003).
Ce taux de récupération dépendrait également du degré d’humidité de la surface, ainsi que de la
nature de la solution mouillante (Moore et Griffith, 2007).

4
Log des UFC/cm²
après analyse

3 Log (contamination) = 5
2 Log (contamination) = 6
1 Log (contamination) = 7

0
Bois Plastic Inox
Type de surface échantillonnée

Graphique 1 : Récupération d’E. coli suite à l’échantillonnage de surfaces contaminées artificiellement.


Méthode utilisée : Rodac. Log (contamination) signifie « Logarithme du nombre de bactéries présentes dans
la suspension utilisée pour contaminer les différentes surfaces » (Niskanen et Pohja, 1977)
- 12 / 34 -

Log UFC/cm² après


2
1,5 Log (contamination) = 5
analyse
1 Log (contamination) = 6
0,5 Log (contamination) = 7

0
Bois Plastic Inox
Type de surface échantillonnée

Graphique 2 : Récupération d’E. coli suite à l’échantillonnage de surfaces contaminées artificiellement.


Méthode utilisée : Ecouvillon. Log (contamination) signifie « Logarithme du nombre de bactéries présentes
dans la suspension utilisée pour contaminer les d+ifférentes surfaces » (Niskanen et Pohja, 1977)

tifs 80
60
Ecouvillon
posi
% de 40
20 Rodac
0
Coques Gram+ Bâtonnets Ecouvillon
Gram- et Rodac

Détection des Gram + et


Gram -

Graphique 3 : Détection de bactéries Gram + et Gram – après échantillonnages de diverses surfaces (en
chambre d’hôpital) avec la méthode Rodac et/ou l’écouvillon (Lemmen et al, 2001)

Les Dipslides ont également été comparés aux Rodacs et aux écouvillons, donnant selon les
auteurs des résultats similaires au niveau reproductibilité et répétabilité, pour différents niveaux
de contamination, lors de la mesure de la flore aérobie totale (Salo et al, 2000) ou lors du
comptage des coliformes (graphiques 4 et 5).

25
20
15 Germes totaux
10 Entérobactéries
% de récupération
5
0
Hygicult Rodac Ecouvillon
Dipslide
Méthode d'échantillonnage

Graphique 4 : Pourcentage de récupération obtenu après échantillonnage d’une surface en inox


moyennement contaminée (B. cereus et E. coli, ~ 10,7 UFC/cm², dont 74,4 % d’E. coli) selon 3 méthodes (Salo
et al, 2002)
- 13 / 34 -

25
20
15 Germes totaux
10
% de récupération Entérobactéries
5
0
Hygicult Rodac Ecouvillon
Dipslide
Méthode d'échantillonnage

Graphique 5 : Pourcentage de récupération obtenu après échantillonnage d’une surface en inox fortement
contaminée (E. cloacae et S. warneri, ~ 43,6 UFC/cm², dont 28,7 % d’E. cloacae) selon 3 méthodes (Salo et al,
2002)
Le tableau ci-dessous reprend les résultats d’une étude visant à comparer les Dipslides avec
d’autres méthodes d’évaluation de la propreté de surfaces.

Concordance entre les résultats obtenus après contrôle d’hygiène de surfaces


Méthodes comparées ATP métrie/Dipslide ATP métrie/Détection Détection
protéines protéines/Dipslide
Avant nettoyage 42,2 % 66,7 % 68,9 %
Après nettoyage 55,6 % 48,9 % 57,6 %
Critères posés :
- acceptable : Dipslide < 2,5 UFC/cm², ATP < 500 RLU, Protéine : grade couleur 1
- Alerte : Protéine : grade couleur 2
- Inacceptable : Dipslide > 2,5 UFC/cm², ATP > 500 RLU, Protéine : grades couleur 3 et 4
Tableau 4 : Comparaison de résultats obtenus après analyse de surfaces selon 3 méthodes : ATP
bioluminescence, microbiologie (Dipslide) et détection des protéines, en vue d’établir l’état hygiénique de 45
plans de travail en industrie, avant et après nettoyage (Moore et Griffith, 2002).

Les Pétrifilms®, eux, ont été validés dans le cadre de leur utilisation pour diverses analyses
alimentaires, mais moins de données sont disponibles quant à leur utilisation pour l’analyse de
surfaces de travail. Ils ont néanmoins été validés dans le cadre de l’analyse de surfaces pour
l’industrie pharmaceutique, par comparaison avec les Rodacs et l’écouvillon (Dal Maso et al,
1993). Les Pétrifilms® auraient des performances comparables à ces deux méthodes, mais
seraient moins encombrants, plus rapides d’utilisation, et présenteraient une grande
reproductibilité. D’autres prêtent aux Pétrifilms® de moindres performances que les Rodacs
(Corrégé et al, 1995 ; Salo et al, 2000 ; Salo et al, 2002 ; Foschino et al, 2003), contrairement à
une étude plus récente (Deckers, 2008).

Les études menées en laboratoire montrent que les techniques ne fournissent pas les mêmes
résultats et n’ont pas les mêmes performances d’une étude à l’autre. Or, il est important de
connaître les performances et les limitations des techniques utilisées afin d’interpréter
correctement les résultats obtenus sur le terrain. Il est dès lors nécessaire de comparer les
techniques entre elles afin de mieux comprendre les résultats observés sur le terrain où les
comparaisons sont plus difficiles étant donné que les conditions de contamination sont inconnues
L’intérêt de cette thèse par rapport aux études précédentes est qu’elle est la première à
comparer, dans un même temps, les trois méthodes principales disponibles sur le marché, et
basées sur le principe d’ « empreinte microbiologique » des surfaces.
- 14 / 34 -

Chapitre IV : Matériel et méthodes


L’expérience présentée dans ce mémoire vise donc à ensemencer une quantité connue de
bactéries sur une surface non poreuse. Par la suite, ces surfaces seront prélevées à l’aide des 3
méthodes à comparer. Les performances des 3 techniques d’analyse sont alors évaluées.

Le support non poreux qui a été choisi pour cette expérience est le verre, car il est facile de s’en
procurer, de le nettoyer et de le stériliser.
Deux germes contaminants alimentaires ont été sélectionnés : Enterococcus hirae et Escherichia
coli. Ces germes font en effet partie de l’annexe D de la norme NBN EN 13697, annexe
reprenant les souches de références pouvant être utilisées. Ces deux bactéries constituent par
ailleurs des indicateurs de contamination fécale, et pourraient éventuellement être retrouvées sur
des surfaces de travail en cuisine. Ils correspondent donc à une certaine « réalité de terrain ».
Une substance interférente a été choisie, visant à mimer un état de « propreté » ou de « saleté »
des surfaces : c’est l’albumine bovine.

Le protocole expérimental est basé sur les normes NBN EN 13697 : 2001 et
ISO 18593 : 2004.

En annexe XXX est repris le détail de la composition des différents supports


utilisés dans ce protocole (milieux, bouillons, etc).

Section 1 : Matériel
1. Souche Enterococcus hirae ATCC 8043
2. Souche E. coli ATCC 10 536
3. Tryptone sel bouillon, tubes 9 ml (NF EN ISO 6887-1(Biorad®)
4. Tryptone sel, flacons 100 ml (Biorad®)
5. Boîte de Petri (BP) 90 mm, milieu TSA
6. Albumine bovine
7. Applicateur Rodacs (bio-Mérieux®)
8. Rodacs 25 cm², milieu TSA
9. Dipslides 25 x 50 mm (Biotrace international®) Nutrient + TTC (Total viable count with red
spots)
10. Pétrifilms® (3M) Flore totale
11. Milieu Pétrifilm® LPT BR (Tritium)
12. Plaques de verre 50 x 50 mm, 3 mm d’épaisseur (vitrerie VMC®, Etterbeek)
13. Bechers
14. Micropipeteurs et tips
15. Filtres stériles (Millipore®) 47 mm, 0,45 µ
16. Milieu de culture Rapid E. coli 2 (Biorad®) – gélose
17. Milieu de culture Rapid Enterococcus (BioRad®) – gélose
18. Billes de verre
19. Solutions de Mc Farland (BaCl2 et H2SO4)
20. Compteur de colonies (IUL instruments®)
21. Autoclave (PBI Stematic III®)
- 15 / 34 -

22. Agitateurs (Labinco®) Press to mix 524


Section 2 : Méthode
1. La souche de référence (E. coli ou E. hirae) est repiquée 2 fois et conservée au congélateur,
sur morceaux de gélose TSA et dans de la paraffine, en vue d’une utilisation ultérieure.
2. Afin de revivifier les bactéries avant leur utilisation, celles-ci sont à nouveau repiquées 2 fois
sur BP (Boîte de Pétri) de milieu TSA à 37 ± 1°C pendant 24 heures. Le repiquage consiste à
frotter doucement la gélose, sur laquelle sont conservées les souches, et cela sur toute la
surface de la BP.
3. Les bactéries sont prélevées de la BP avec une anse stérile et mises en suspension dans un
tube contenant 9 ml de bouillon tryptone sel. La suspension est homogénéisée à l’aide d’un
agitateur.
4. La quantité de bactéries à diluer est estimée par comparaison visuelle de la turbidité obtenue
avec celle d’une solution de Mc Farland 1 (0,1 ml BaCl2 1% + 9,9 ml H2SO4 1 %). Le
nombre de bactéries est alors estimé à 3 x 108 / ml.
5. Une dilution sérielle en tubes de tryptone sel est effectuée. La suspension de départ est
portée à 10-5. Le nombre théorique de bactéries est donc de 3 x 103 / ml.
6. La suspension 10-5 est mélangée à de l’albumine. Pour ce faire, nous disposons d’une
solution de 0,3 g albumine / 100 ml. Le but est d’obtenir une suspension de 300 germes/ml
contenant également 0,3 g d’albumine / litre (conditions « propres ») ou 2,7 g d’albumine /
litre (conditions « sales »). Concrètement : solution propre : 1 ml solution albumine + 1 ml
suspension bactérienne à 10-5 + 8 ml tryptone sel. Solution sale : 1,8 ml solution albumine +
200 µl suspension bactérienne à 10-5.
7. 100 µl de la solution finale sont prélevés à l’aide d’une micropipette et déposés sur une
plaque en verre stérile. La goutte est étalée sur la surface de la plaque en verre à l’aide d’un
étaleur en « L » stérile. L’opération est répétée 10 fois de suite, ce qui prend environ 20
minutes.
8. 100 µl de la solution sont également filtrés sur membrane. La membrane est placée sur un
milieu de gélose Rapid E. coli 2 (s’il s’agit d’E. coli) ou Rapid Enterococcus (s’il s’agit d’E.
hirae). Le milieu est incubé à 37 ± 1°C.
9. Les plaques sont mises à sécher sous flux laminaire pendant environ 15 minutes.
10. 1 millilitre de LPT BR stérile (voir annexe XXX) sont versés sur chaque Pétrifilm® pendant
que les plaques de verre sèchent.
11. Pour chaque souche, et pour chaque condition (« propre » ou « sale »), 3 plaques sont
prélevées chacune
a. 3 fois de suite avec des Rodacs TSA : la Rodac est insérée dans un applicateur
permettant d’appliquer la gélose sur la plaque en verre durant 10 secondes avec une
pression de 500 ± 50 grammes.
b. 3 autres 3 fois de suite avec des Dipslides : les 2 faces gélosées du Dipslide sont
appliquées contre la lame en verre l’une après l’autre. La pression est exercée en pliant
la membrane à l’endroit désigné par la flèche rouge sur la figure 4), pendant 10
secondes.
c. 3 dernières 3 fois de suite avec des Pétrifilms® : l’échantillonnage consiste en
l’ouverture du Pétrifilm® et en l’application du milieu contre la lame en verre pendant 10
secondes. La pression est exercée à la main.

Cette étape dure à nouveau 20-25 minutes


12. Une dixième plaque, servant de témoin, n’est pas prélevée.
- 16 / 34 -

13. Les Rodacs, Pétrifilms® et Dipslides, après prélèvement, sont placés à 37 ± 1°C pendant 5
jours.
14. Les plaques, après prélèvement, ainsi que la plaque témoin après séchage, sont placées, à
l’aide d’une pince stérilisée à la flamme, dans un bécher stérile contenant des billes de verres
stériles et 50 ml de tryptone-sel. Le Becher est ensuite agité pendant une minute.
15. La suspension de tryptone-sel, contenant alors normalement les bactéries qui sont restées sur
la plaque en verre, est filtrée sur membrane.
16. La membrane est placée sur un milieu en gélose Rapid E. coli 2 (s’il s’agit d’E. coli) ou
Rapid Enterococcus (s’il s’agit d’E. hirae). Le milieu est incubé à 37 ± 1°C.
17. Les étapes n-o-p prennent 3/4 heure.
18. Le comptage des colonies se fait quotidiennement, 5 jours de suite, pour tous les milieux
incubés, à l’aide d’un compteur de colonies.
19. La stérilisation de la verrerie s’effectue à l’autoclave à 121°C, 2 bars, pendant 15 minutes.

Ce protocole a été réalisé en quatre étapes :

1. Avec la souche d’E. hirae, en conditions « propres » (0,3 g


albumine/litre).
2. Avec la souche d’E. hirae, en conditions « sales » (2,7 g albumine/litre).
3. Avec la souche d’E. coli, en conditions « propres ».
4. Avec la souche d’E. coli, en conditions « sales ».

Chacune des étapes, préparation du matériel incluse, correspond à environ 3 heures de


manipulation.
- 17 / 34 -

Figure 12 : Schéma du protocole expérimental.

Les résultats obtenus sont analysés selon la méthode statistique suivante : les statistiques
descriptives sont calculées et illustrées à l’aide du logiciel Microsoft Excel® ; les statistiques
analytiques sont réalisées à l’aide du programme informatique SAS®. Il s’agit d’une analyse de
variance qui tient compte du fait que les mesures sont répétées. Cette méthode statistique permet
d’étudier les différences de moyennes entre plusieurs populations, en tenant compte des
interactions éventuelles entre différents paramètres. Un effet significatif est mis en évidence
lorsque la valeur p (probabilité de l’hypothèse nulle) est inférieure à 0,05, auquel cas l’hypothèse
nulle est rejetée.

Au regard du protocole expérimental, l’analyse statistique portera sur les quatre phases de
l’expérience, à savoir la récolte d’E. coli en conditions propres, d’E. coli en conditions sales,
d’E. hirae en conditions propres et d’E. hirae en conditions sales. Les statistiques purement
descriptives s’attarderont sur le dénombrement des bactéries présentes dans la suspension de
départ (inoculum), celui des bactéries présentes sur les plaques de verre témoin, après séchage,
mais avant échantillonnage, le dénombrement suite aux échantillonnages successifs réalisés avec
les Rodacs, les Pétrifilms® et les Dipslides et enfin le nombre de bactéries restant sur les plaques
de verre après ces échantillonnages successifs.

Les paramètres dont les effets sont étudiés sont les suivants : tout d’abord, bien entendu, les
techniques de prélèvement en elles-mêmes ainsi que les différents dénombrements (solution de
départ, après séchage, au cours des prélèvements et après ces derniers). Ensuite, le « numéro
- 18 / 34 -

d’ordre » de l’expérience : dans un souci de puissance statistique, les expériences ont été
répétées plusieurs fois ; il s’agit donc de vérifier qu’elles aient toutes été effectuées dans les
mêmes conditions. Les UFC sont comptés durant cinq jours consécutifs ; le jour du comptage a
donc également son importance, la question étant de savoir si le dénombrement diffère à partir
d’un moment donné ou non.

Chapitre V : Résultats

Section 1 : E. coli

Les résultats obtenus avec E. coli ne sont pas interprétables statistiquement. En


effet, que ce soit en conditions « propres » (0,3 g d’albumine /L) ou « sales »
(2,7 g d’albumine/L), la récupération d’E. coli après ensemencement sur les
plaques de verre et après séchage est très faible, voire nulle. Donc, très peu,
voire aucune E. coli n’a poussé, que ce soit sur les filtres reprenant le nombre
de bactéries présentes sur la plaque juste après la phase de séchage, mais avant
la phase de prélèvement, ou que ce soit sur les différents milieux de
prélèvement eux-mêmes (Rodacs, Pétrifilms® , Dipslides). Vu ce manque de
résultat et la lourdeur du protocole, la phase expérimentale a d’ailleurs été
avortée pour E. coli après 4 expériences en conditions propres et 2 expériences
en conditions sales.
Les raisons de ce manque de récupération seront discutées au point.

Section 2 : E. hirae
Les résultats obtenus avec E. hirae sont eux, par contre, bien interprétables au niveau statistique.
Ils sont issus d’une série de 8 expériences en conditions propres et d’une série de 6 expériences
en conditions sales.

Dans un souci de facilité de lecture des résultats, les statistiques descriptives sont présentées
principalement sous forme de graphiques. En ordonnée de ces graphiques, nous retrouvons une
valeur que l’on nomme « coefficient de récupération ». Celui-ci est calculé de manière simple,
comme illustré dans le tableau ci-dessous :

Nombre de bactéries Nombre de bactéries Formule appliquée Coefficients de


ensemencées sur la plaque récoltées lors des récupération
de verre (X) prélèvements successifs (Yi) correspondants (%)
100 50 (X/Yi) x 100 50
15 15
10 10
254 158 62
42 17
33 13
Tableau 5 : mode de calcul du coefficient de récupération

Les statistiques descriptives relatives à l’effet « séchage » sont, quant à elles, exprimées sous
forme de tableau.

Pour chaque effet étudié, les statistiques analytiques suivront immédiatement les statistiques
descriptives. Les valeurs de p (voir ) ainsi obtenues sont mentionnées entre parenthèses : elles
- 19 / 34 -

correspondent à la probabilité de l’hypothèse nulle (absence d’effet du paramètre étudié). Une


différence statistiquement significative apparaît lorsque p < 0,05.
1. Conditions propres (0,3 g albumine/L)

a. Ensemencement.

Avant séchage Après séchage Pourcentage de bactéries


survivant sur plaques
témoins
Nombre d’UFC 11 4 36%
50 26 52%
54 39 72%
29 24 83%
43 35 81%
72 54 75%
51 34 67%
61 43 70%
Moyennes 46 39 67%
Médianes 51 35 71%
Ecarts-type 19 15 16%
Tableau 6 : Nombre d’UFC présentes dans la suspension d’essai (avant séchage) et sur la plaque témoin
après séchage pour chacune des expériences avec E. hirae en conditions propres

Le Tableau 6 reprend donc le nombre d’UFC dénombrées sur les plaques témoins avant séchage
et après séchage (voir ).

Effet séchage : le nombre d’UFC présentes dans la suspension d’essai et le nombre d’UFC
présentes sur la plaque en verre après séchage (Tableau 6) est significativement différent
(0,0006). L’ensemencement s’est donc déroulé de manière correcte : même si quelques pertes
sont occasionnées lors du séchage, le nombre de bactéries présentes sur les plaques de verre reste
tout à fait raisonnable : en effet, en moyenne 67 % des bactéries survivent sur les plaques témoin.

b. Prélèvements

180,00%
170,00%
160,00%
150,00%
Coefficient de récupération

140,00%
130,00%
120,00%
110,00%
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
Rodac Pétrifilm® Dipslide

Méthodes

Graphique 6 : Coefficient de récupération moyen, en fonction des 3 méthodes d'échantillonnages évaluées,


sans tenir compte du moment de prélèvement, après ensemencement réalisé avec E. hirae en conditions
- 20 / 34 -

propres (0,3 g/ L d’albumine). Les barres d’erreur représentent 2 écarts-types, la ligne bleue horizontale le
coefficient de récupération moyen, toutes méthodes confondues.

Effet méthode : il n’y a pas de différence significative entre les Pétrifilms ® et les Dipslides
(0,0586), ni entre les Pétrifilms® et les Rodacs (0,7928), mais bien entre les Dipslides et les
Rodacs (0,0324). Le nombre d’UFC comptées après prélèvement avec les Rodacs ou les
Dipslides n’est donc pas équivalent.

90%
85%
80%
75%
70%
Coefficient de récupération

65%
60%
55%
50%
45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
Prélèvem ent 1 Prélèvem ent 2 Prélèvem ent 3

Moment du prélèvement

Graphique 7 : Coefficient de récupération moyen, en fonction du moment du prélèvement, indépendamment


de la méthode d'échantillonnage utilisée, après ensemencement avec E. hirae en conditions propres (0,3 g
albumine/L). Les barres d’erreur correspondent à 2 écarts-types, la ligne bleue horizontale à la moyenne du
coefficient de récupération, tous prélèvements confondus.

Effet prélèvement : une différence significative est mise en évidence entre le premier et le
deuxième prélèvement (0,0001) et entre le premier et le troisième prélèvement (< 0,0001), mais
pas entre le deuxième et le troisième (0,0563), cela toutes méthodes confondues. Une fois le
premier prélèvement effectué, ceci en moyenne et sans tenir compte de la méthode utilisée, les 2
prélèvements suivants extraient donc moins de bactéries de leur support ; il est cependant
intéressant de constater une absence de différence entre les 2ème et 3ème prélèvements.
- 21 / 34 -

Graphique 8 : Coefficient de récupération pour chacun des prélèvements successifs réalisés, et pour chacune
des trois méthodes, après ensemencement avec E. hirae en conditions propres (0,3 g/L albumine). Les barres
d’erreur représentent 2 écarts-types, et la ligne bleue horizontale le coefficient de récupération moyen, toutes
méthodes et prélèvements confondus. Rodac 1 signifie par exemple qu’il s’agit du premier prélèvement
effectué sur une plaque avec un milieu Rodac.

Prélèvements et méthodes Valeurs de P


Dipslide 1 – Dipslide 2 0,1638
Dipslide 1 – Dipslide 3 0,0749
Dipslide 1 – Pétrifilm® 1 0,4205
Dipslide 1 - Rodac 1 <0,0001
Dipslide 2 – Dipslide 3 0,6875
Dipslide 2 – Pétrifilm® 2 0,0893
Dipslide 2 - Rodac 2 0,7062
Dipslide 3 - Pétrifilm® 3 0,4254
Dipslide 3 - Rodac 3 0,3941
Pétrifilm® 1 – Pétrifilm® 2 0,6236
Pétrifilm® 1 – Pétrifilm® 3 0,0735
Pétrifilm® 1 - Rodac 1 0,001
Pétrifilm® 2 -Pétrifilm® 3 0,1888
Pétrifilm® 2 - Rodac 2 0,1825
Pétrifilm® 3 - Rodac 3 0,1021
Rodac 1 - Rodac 2 <0,0001
Rodac 1 - Rodac 3 <0,0001
Rodac 2 - Rodac 3 0,1062

Tableau 7 : Tableau récapitulatif combinant les différences entre méthodes et prélèvements : Rodac 1 signifie
par exemple qu’il s’agit du premier prélèvement effectué sur une plaque avec un milieu Rodac. Les
différences significatives sont reprises en rouge sur fond jaune – conditions propres.

Effet méthode et effet prélèvement combinés : le Tableau 7 est très intéressant pour l’étude que
nous réalisons. Il permet en effet de comparer les méthodes et leurs performances « de
récupération ». On peut donc voir dans ce tableau s’il existe des différences non seulement entre
les méthodes, globalement, mais aussi si ces différences se manifestent de façon précise, en
terme de prélèvement.
- 22 / 34 -

Concrètement, si on regarde les différences significatives reprises en rouge gras sur fond jaune
dans le Tableau 7, on constate tout d’abord que l’effet « méthode » mentionné ci-dessus se
vérifie principalement lors du premier prélèvement. Il y a donc bien une différence significative
entre les méthodes, mais cette différence se situe lors du premier prélèvement sur la plaque de
verre.
En effet, il y a une différence entre les UFC comptées sur Dipslide 1 et Rodac 1, mais plus sur
Dipslide 2 – Rodac 2, ni même sur Dipslide 3 – Rodac 3.

Il en est exactement de même si on compare Pétrifilms ® et Rodacs : dans ce cas précis, si aucune
différence n’apparaît lorsque l’on ne se penche que sur les techniques (Graphique 6), cette
différence apparaît tout de même lorsque l’on ne considère que le premier prélèvement (Tableau
7), c-à-d Pétrifilm® 1 et Rodac 1. Cette différence disparaît lors des deux prélèvements suivants.

Pour terminer, c’est surtout Rodac 1 qui est significativement plus grand que Rodac 2 et 3. Ce
qui signifie que c’est le premier prélèvement qui extrait le plus grand nombre de bactéries, les 2
prélèvements suivants s’équivalant. A nouveau, « l’effet prélèvement » mentionné ci-dessus ne
se vérifie plus que pour les Rodacs, quand on regarde les choses plus en détail. En effet, ni
Pétrifilm® 1 – Pétrifilm® 2, ni Dipslide 1 – Dipslide 2 ne diffèrent.

La Graphique 8 illustre donc bien ce qui est constaté ci-dessus, à savoir l’effet « méthode », où la
méthode Rodac se distingue des 2 autres méthodes, et « l’effet prélèvement », où le premier
prélèvement effectué avec la méthode Rodac recueille plus de bactéries que :

- Le premier prélèvement effectué avec les deux autres méthodes


- Les deuxième et troisième prélèvements également effectués avec la méthode Rodac

Lors de l’analyse statistique des résultats, 2 autres effets sont par ailleurs observés.

Jours comparés Valeur de P


1 et 2 < 0,0001
1 et 3 0,0028
1 et 4 0,0041
1 et 5 0,0126
2 et 3 0,758
2 et 4 0,4642
2 et 5 0,5491
3 et 4 0,4686
3 et 5 0,6074
4 et 5 1
Tableau 8 : Comparaison entre les valeurs obtenues lors des comptages quotidiens des UFC, après incubation
des milieux ensemencés avec E. hirae en conditions propres (0,3 g d’albumine/L). Les différences
significatives sont mises en évidence en rouge sur fond jaune.

Effet temps : le comptage des UFC est systématiquement répété toutes les 24 heures pendant 5
jours. Le 1er comptage diffère significativement du deuxième (<0,0001) et des autres, mais plus
les autres entre eux. Cela signifie donc que si l’on compte les UFC au 2 ème jour, les résultats
diffèrent encore du premier comptage. Mais par après, les résultats restent stables.

Effet répétition : un effet répétition a été mis en évidence, sous-entendant que les expériences ou
les conditions dans lesquelles sont réalisées les expériences successives ne sont pas à chaque fois
tout à fait identiques. Ceci fera l’objet de la discussion ().
- 23 / 34 -

c. Subsistance des bactéries sur les plaques de verre.

Après avoir effectué les 3 prélèvements, il est intéressant de savoir s’il reste ou non des bactéries
sur la plaque de verre, ou si elles ont toutes été récoltées. A cette fin, un système basé sur des
billes de verre a été mis au point pour extraire les dernières bactéries ().

Graphique 9 : Pourcentage de bactéries subsistant sur le support après 3 prélèvements successifs, pour
chacune des 3 méthodes. E. hirae en conditions propres (0,3 g/L albumine). Les barres d’erreur représentent
2 écart-types, de part et d’autre de la moyenne.

Germes restants P
®
Rodac - Pétrifilm 0,0056
Rodac - Dipslide 0,0037
®
Pétrifilm - Dipslide 0,8374
Tableau 9 : Différences entre méthodes par rapport au nombre de germes qu’elles laissent sur la plaque en
verre après 3 prélèvements successifs. Les différences significatives sont en rouge sur fond jaune. E. hirae en
conditions propres (0,3 g d’albumine/L).

En considérant le nombre d’UFC subsistant sur la plaque en verre après les séries de 3
prélèvements, 2 effets significatifs ont été mis en évidence.

Effet méthode : dans les conditions propres, la méthode Rodac se distingue significativement des
2 autres (voir tableau et graphique ci-dessus) : il apparaît qu’avec les Rodacs, il reste moins de
bactéries sur la plaque en verre après les 3 prélèvements successifs. Les méthodes Pétrifilm® et
Dipslide s’équivalent à nouveau sur ce point.

Effet temps : cette fois-ci, des différences significatives apparaissent entre les jours 2 et 3
(0,0254) du dénombrement des UFC. Ce n’est qu’après le troisième jour que les résultats restent
stables.
- 24 / 34 -

d. Synthèse.

17 0,00 %
16 0,00 %
15 0,00 %
14 0,00 %
Coefficients d'extraction cumulés

13 0,00 %
12 0,00 %
11 0,00 %
10 0,00 %
9 0 ,00% G er m es r estan t
8 0 ,00% su r plaqu e
P r élèvem en t 3
7 0 ,00%
P r élèvem en t 2
6 0 ,00%
P r élèvem en t 1
5 0 ,00%
4 0 ,00%
3 0 ,00%
2 0 ,00%
1 0 ,00%
0 ,00%
R od ac Pétrifilm ® D ipslide
Mé thode s

Graphique 10 : Synthèse des effets observés pour les 3 méthodes d'échantillonnage évaluées, après
ensemencement avec E. hirae en conditions propres (0,3 g d'albumine/L)
En regardant attentivement le Graphique 10, et en additionnant les bactéries récoltées, on arrive à
un total supérieur à 100 %. On aurait donc récolté en tout plus de germes qu’il n’y en avait au
départ. En effet, si on fait la somme des UFC comptées après 5 jours pour chacun des 3
prélèvements et des UFC qui restent sur la plaque, on obtient, en moyenne :

- Pour la méthode « Rodac » : 159 % du nombre de germes, par rapport au nombre de


germes présents au départ sur la plaque, après séchage.
- Pour la méthode « Pétrifilm® » : 171 % du nombre de germes, par rapport au nombre de
germes présents au départ sur la plaque, après séchage.
- Pour la méthode « Dipslide » : 122 % du nombre de germes, par rapport au nombre de
germes présents au départ sur la plaque, après séchage.

Ce phénomène sera discuté au .

2. Conditions sales (2,7 g albumine/L)

La même expérience avec E. hirae est répétée, mais cette fois dans un environnement « sale » ;
le but est de voir si les performances des différentes méthodes utilisées sont ou non affectées par
la présence d’une plus grande quantité de matières organiques. Les chiffres mentionnés entre
parenthèses reprennent à nouveau la valeur de P.
- 25 / 34 -

a. Ensemencement

Cette fois encore, plusieurs effets ont pu être mis en évidence :

Avant séchage Après séchage Rapport après/avant séchage


Nombre d’UFC 70 48 69 %
37 26 70 %
29 29 100 %
58 42 72 %
38 21 55 %
53 37 70 %
Moyennes 48 34 73 %
Médiane 46 33 70 %
Ecarts-type 15 10 15 %
Tableau 10 : Nombre d’UFC présentes dans la suspension d’essai (avant séchage) et sur la plaque témoin
après séchage pour chacune des expériences avec E. hirae en conditions sales (2,7 g albumine/L)

Effet séchage : le nombre d’UFC présentes dans l’inoculum diffère significativement du nombre
d’UFC comptées sur la plaque de verre après séchage (0,0065). La survie des germes sur les
plaques de verre après séchage est comparable à celle obtenue dans les conditions propres ; en
effet, il reste, après séchage, en conditions « sales », 73 % des germes ensemencés au départ.

b. Prélèvements.

180,00%
170,00%
160,00%
150,00%
Coefficient de récupération

140,00%
130,00%
120,00%
110,00%
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
Rodac Pétrifilm® Dipslide

Méthodes

Graphique 11 : Coefficient de récupération moyen, en fonction des 3 méthodes d'échantillonnages évaluées,


sans tenir compte du moment de prélèvement, après ensemencement réalisé avec E. hirae en conditions sales
(2,7 g/ L d’albumine). Les barres d’erreur représentent 2 écarts-types, la ligne bleue horizontale le coefficient
de récupération moyen, toutes méthodes confondues.

Effet méthode : tout comme ce qui a été observé en conditions « propres », les Dipslides et les
Pétrifilms® ne diffèrent toujours pas (0,5495) entre eux. Par contre, cette fois-ci, on observe déjà
une différence à la fois entre les Rodacs et les Pétrifilms ® (0,0007), et entre les Rodacs et les
Dipslides (0,0037). Les Rodacs se distinguent donc des 2 autres méthodes.
- 26 / 34 -

Graphique 12 : Coefficient de récupération moyen, en fonction du moment du prélèvement,


indépendamment de la méthode d'échantillonnage utilisée, après ensemencement avec E. hirae en conditions
sales (2,7 g albumine/L). Les barres d’erreur correspondent à 2 écarts-types, la ligne bleue horizontale à la
moyenne du coefficient de récupération, tous prélèvements confondus.

Effet prélèvement : en se focalisant donc sur les premiers, deuxièmes et troisièmes prélèvements,
indépendamment de la méthode utilisée, le premier prélèvement récolte significativement plus de
germes que les 2 suivants (<0,0001). Tout comme en conditions « propres », les 2 derniers
prélèvements récoltent un nombre comparable de germes (0,0713).

Graphique 13 : Coefficient de récupération pour chacun des prélèvements successifs réalisés, et pour chacune
des trois méthodes, après ensemencement avec E. hirae en conditions sales (2,7 g/L albumine). Les barres
d’erreurreprésentent 2 écarts-types, et la ligne bleue horizontale le coefficient de récupération moyen, toutes
- 27 / 34 -

méthodes et prélèvements confondus. Rodac 1 signifie par exemple qu’il s’agit du premier prélèvement
effectué sur une plaque avec un milieu Rodac.

Prélèvements et milieux P
Dipslide 1 - Dipslide 2 0,0538
Dipslide 1 - Dipslide 3 0,0026
Dipslide 1 - Pétrifilm® 1 0,1906
Dipslide 1 - Rodac 1 <0,0001
Dipslide 2 - Dipslide 3 0,2278
Dipslide 2 - Pétrifilm® 2 0,9631
Dipslide 2 - Rodac 2 0,7458
Dipslide 3 - Pétrifilm® 3 0,7413
Dipslide 3 - Rodac 3 0,8118
Pétrifilm® 1 - Pétrifilm® 2 0,4864
Pétrifilm® 1 - Pétrifilm® 3 0,1294
Pétrifilm® 1 - Rodac 1 <0,0001
Pétrifilm® 2 -Pétrifilm® 3 0,4027
Pétrifilm® 2 - Rodac 2 0,781
Pétrifilm® 3 - Rodac 3 0,5705
Rodac 1 - Rodac 2 <0,0001
Rodac 1 - Rodac 3 <0,0001
Rodac 2 - Rodac 3 0,2619

Tableau 11 : Tableau récapitulatif combinant les différences entre méthodes et prélèvements : Rodac 1
signifie par exemple qu’il s’agit du premier prélèvement effectué sur une plaque avec un milieu Rodac. La
différence est significative quand la valeur statistique est < 0,05 (ici en rouge sur fond jaune) – conditions
sales.

Effet méthode et effet prélèvement combinés : le tableau 10 reprend le détail des valeurs
statistiques. La lecture du Tableau 11 se fait de manière identique à celle du Tableau 7.

Dans les conditions « sales », on retrouve les mêmes effets qu’en conditions propres. Le 1er
prélèvement effectué avec la méthode Rodac se distingue donc des premiers prélèvements
effectués avec les 2 autres méthodes. Les 2ème et 3ème prélèvements s’équivalent quasi toujours,
quelle que soit la méthode utilisée. A nouveau, le premier prélèvement effectué avec la méthode
Rodac se distingue des 2ème et 3ème prélèvements effectuées avec cette même méthode.

A noter qu’un effet supplémentaire apparaît : Les premiers et troisièmes prélèvements effectués
avec les Dipslides diffèrent, cette fois-ci. Ceci sera discuté au point IV.

A nouveau, une quantification de ces différences constatées a été effectuée sous forme de
« coefficients de récupération ». Le graphique 13 reprend ces valeurs, pour chacun des 3
prélèvements, et pour chacune des méthodes. Pour ne rien changer dans la lecture des figures,
Rodac 1, par exemple, signifie toujours : 1er prélèvement effectué sur la plaque avec la méthode
Rodac.

Le graphique 13 permet d’arriver aux mêmes conclusions que celles présentées pour la série
d’expériences effectuées dans des conditions « propres ».
- 28 / 34 -

Deux autres effets ont par ailleurs encore été observés :

- Effet temps : le comptage des UFC étant systématiquement ré-effectué toutes les 24
heures pendant 5 jours. Le 1er comptage diffère significativement du deuxième (0,0022)
et des autres, mais plus les autres entre eux. Le phénomène est donc le même que celui
observé en conditions « propres ».

- Effet répétition : tout comme pour les conditions « propres », un effet répétition a été mis
en évidence, sous-entendant que les expériences ou les conditions dans lesquelles sont
réalisées les expériences successives ne sont pas à chaque fois tout à fait identiques. Ceci
sera discuté au point IV.

• Bactéries subsistant sur la plaque de verre.

En ce qui concerne le nombre d’UFC subsistant sur la plaque en verre après série de 3
prélèvements, 1 seul effet significatif persiste : l’effet temps.

50%
40%
% de 30% Rodac
bactéries Petrifilm
restantes 20% Dipslides
10%
0%
1
Méthodes

Pourcentage de bactéries subsistant sur le support suite aux 3 prélèvements successifs effectués pour chacune des 3
méthodes, avec E. hirae en conditions sales (2,7 g/L albumine).

- Effet méthode : dans les conditions « sales », aucune différence significative n’existe
plus entre les différentes méthodes. Cette fois, les 3 prélèvements successifs laissent un
nombre semblable d’UFC sur la plaque, quelle que soit la méthode utilisée. Le graphique
14 illustre cette absence d’effet. C’est la plus grande différence observée par rapport aux
résultats obtenus en conditions propres.

- Effet temps : seuls les jours 3 et 4 diffèrent significativement (0,0202).


- 29 / 34 -

Coefficients de récupération cumulés


1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9 Germes
0,8 restant sur
0,7 plaque
0,6 Prélèvement 3
0,5 Prélèvement 2
0,4 Prélèvement 1
0,3
0,2
0,1
0
Rodac Pétrifilm Dipslide
®
Méthodes
Synthèse des effets observés pour les 3 méthodes d'échantillonnage évaluées, après ensemencement avec E. hirae en
conditions sales (2,7 g d'albumine/L)
Si on regarde attentivement le graphique 15, et qu’on fait la somme des bactéries détectées, on
arrive à un total supérieur à 100 %. On aurait donc détecté en tout plus de germes qu’il n’y en
avait au départ. En effet, si on fait la somme des UFC comptées après 5 jours pour chacun des 3
prélèvements + les UFC qui restent sur la plaque, on obtient, en moyenne :

- Pour la méthode « Rodac » : 171 % du nombre de germes, par rapport au nombre de


germes présents au départ sur la plaque, après séchage.
- Pour la méthode « Pétrifilm® » : 124 % du nombre de germes, par rapport au nombre de
germes présents au départ sur la plaque, après séchage.
- Pour la méthode « Dipslide » : 128 % du nombre de germes, par rapport au nombre de
germes présents au départ sur la plaque, après séchage.

Ce phénomène sera discuté au point IV.

Discussion

Au vu des résultats, la discussion sera scindée en 2 parties : l’une concernant la série


d’expériences effectuées avec E. coli, l’autre concernant E. hirae.
Section 1 : E. coli
- 30 / 34 -

Les résultats obtenus avec la souche d’E. coli utilisée ne sont donc pas interprétables. Cependant,
les 2 repiquages initiaux de la souche n’ont pas posé de problème. La mise en suspension des
germes dans le tryptone-sel n’est par ailleurs pas connue pour avoir des effets délétères sur E.
coli.
Deux éléments peuvent expliquer la très faible récupération de la bactérie sur la plaque de verre
après la phase de séchage :

- L’inoculum utilisé n’est pas suffisamment important.


- La dessiccation peut également avoir une influence non négligeable sur la capacité de
survie de la bactérie.

Certaines études ont démontré que sur un support en ciment, par exemple, le taux de survie d’E.
coli était d’en moyenne 22,9 % (Avery et Buncic, 2003), avec des minima atteignant 1,2 % pour
certaines souches, après dessiccation pendant 24 heures.
Sur le verre, certaines souches d’E. coli survivent plus de 5 heures, mais les prélèvements
effectués dans le cadre de l’expérience visant à étudier ce temps de survie ont été effectués en
plein air, et non en laboratoire (Marshall et al, 1988).
A titre d’exemple, selon les données de l’ICMSF (International Commission on Microbiological
Specifications for food, 1996), l’activité de l’eau minimale (awmin) pour qu’E. coli O157:H7
survive dans des aliments est de 0,95, l’aw idéale pour sa croissance se situe aux alentours de
0,995.
Le degré d’hygrométrie du laboratoire n’a pas constitué un point d’attention particulier du
protocole. Il serait donc intéressant de réitérer cette expérience, mais cette fois dans des
conditions de température, de pH et d’hygrométrie bien contrôlées, avec plusieurs niveaux
d’inoculation. L’influence du degré d’hygrométrie et celle de la taille de l’inoculum doivent en
effet être étudiées plus en profondeur.

II. E. hirae
C’est sur les résultats obtenus avec Enterococcus que reposent les différents effets mis en
évidence dans ce mémoire. En effet, le taux de survie de la bactérie après séchage sur la surface
est satisfaisant, et l’ensemencement réalisé est donc par conséquent tout à fait valable. Au vu des
résultats, la méthode Rodac présente plusieurs avantages par rapport aux Dipslides et aux
Pétrifilms®.
En effet, lors des prélèvements de surface sur le terrain, dans l’industrie alimentaire,
pharmaceutique, dans les hôpitaux ou dans les cuisines, il est nécessaire de disposer d’une
méthode fiable, reproductible, et qui soit représentative de la contamination microbiologique
réelle de la surface à évaluer, et ce, si possible, dès un premier prélèvement. De fait, toutes les
normes citées au point I.3. ne mentionnent qu’un seul prélèvement par endroit.
Pour rappel, il apparaît ici que la méthode « Rodac » se distingue des 2 autres méthodes sur
plusieurs points, et, dans l’ensemble, le fait que la surface de départ soit propre ou sale ne
modifie pas grand-chose aux conclusions qu’on peut tirer. Les Rodacs extraient donc plus de
germes de la surface que les 2 autres méthodes. De même, c’est le premier prélèvement qui est le
plus fructueux, ce qui est recherché en pratique, sur le terrain.

Plusieurs facteurs pourraient expliquer les meilleures performances obtenues avec la méthode
Rodac :
- 31 / 34 -

- Temps de contact lors du prélèvement : l’intervalle de temps pendant lequel les Rodacs
restent en contact avec la surface à évaluer est moins sujet à variation que pour les
méthodes Dipslides ou Pétrifilms®. En effet, si, pour ces dernières, le temps de contact
est mesuré avec une montre à trotteuse, en ce qui concerne les
Rodacs, c’est l’applicateur qui émet un signal sonore une fois que la durée de contact
nécessaire est atteinte.

- Pression : à nouveau, la pression exercée avec les Rodacs sur les différentes surfaces est
uniformisée grâce à l’applicateur. Pour les Dipslides, la plicature de la membrane,
comme désigné par la flèche rouge sur la figure 3, définit la pression exercée. Cependant,
il faut maintenir le Dipslide sur la plaque de verre en posant son doigt à l’autre extrémité
de celui-ci. Cette manipulation peut faire varier légèrement la pression exercée. Pour les
Pétrifilms®, la pression est uniquement effectuée manuellement, et est donc sujette à de
grande variations d’un échantillonnage à l’autre.

- Composition du milieu : la composition du milieu de culture des trois méthodes diffère


légèrement (cfr annexe I). Cependant, il s’agit dans les trois cas de milieux « germes
totaux », non sélectifs, à pH quasi équivalent. Ce facteur ne devrait normalement
interférer avec les résultats que de manière minime, négligeable.

Néanmoins, ces résultats sont à remettre dans leur contexte, car plusieurs points peuvent être
sujets à débat.

Tout d’abord, l’expérience en elle-même : on ne peut évidemment pas généraliser les différences
constatées. Il s’agit ici d’une expérience que l’on qualifiera de préliminaire, effectuée avec un
germe particulier, à un faible niveau de contamination, avec une température et une durée
d’incubation constantes. La validation des Dipslides (Salo et al, 2000 et Salo et al, 2002), par
exemple, s’est effectuée dans plusieurs laboratoires, avec plusieurs sortes de germes, à des
niveaux de contamination faible, moyen et élevé, avec des températures et des durées
d’incubation différentes.
Par contre, l’expérience effectuée dans le cadre de ce mémoire est une première en ce qui
concerne l’alignement des 3 méthodes Rodac, Dipslide et Pétrifilm ® pour l’analyse des surfaces
de travail. En effet, comme mentionné dans l’introduction, les Rodacs ont souvent été comparées
à d’autres méthodes, dont effectivement les Dipslides et les Pétrifilms ®, mais également les
écouvillons, les ATP-mètres, le papier collant, et d’autres encore. Cependant, jamais les 3
méthodes n’ont été reprises dans une même étude.

Deuxièmement, un effet répétition a été constaté, cela aussi bien pour la série d’expériences
effectuées en conditions propres que pour celles effectuées en conditions sales, suggérant que les
conditions d’expérimentation ne sont pas tout à fait identiques d’expérience en expérience. Au
vu des résultats bruts (annexe II), l’explication la plus probable serait la variabilité du nombre de
germes ensemencés au départ. En effet, vu que la turbidité de la solution de Mc Farland (servant
d’échelle pour estimer le nombre de germes mis en suspension après double repiquage) est trop
élevée que pour être mesurable par les turbidimètres dont dispose le laboratoire, la comparaison
entre la solution de Mc Farland et la suspension bactérienne avant dilution se fait à l’œil nu. Ce
qui fait qu’après les dilutions sérielles, le nombre théorique de 30 germes/100µl a rarement été
atteint. Néanmoins, le nombre de germes au départ s’est toujours inscrit dans le même
logarithme, et si une différence significative a été détectée statistiquement, elle n’est pas si
importante aux yeux du microbiologiste.
Bien sûr, il est toujours possible que d’autres paramètres soient en cause.
- 32 / 34 -

L’effet temps d’incubation, mentionné à diverses reprises dans les résultats, n’a pas beaucoup
d’importance en pratique, et n’est là qu’à titre informatif. En effet, en fonction du germe
recherché, les durées et températures d’incubation sont quasi toujours normalisées.

Une différence a été observée au niveau des résultats obtenus dans les conditions sales par
rapport aux conditions propres : dans les conditions sales, le premier prélèvement effectué avec
les Dipslides est significativement plus important que le troisième. Par contre, il n’y a pas de
différence entre les 1er et 2ème, ni entre les 2ème et 3ème prélèvements effectués avec le Dipslide.
Mais si on regarde la première ligne du tableau 10, cette absence de différence se joue de peu
(valeur P = 0,0538, donc très proche de 0,05) ; on peut donc en déduire que le premier
prélèvement effectué avec le Dipslide tend tout de même à être plus fructueux par rapport aux 2
suivants, dans les conditions sales. Mais cette différence est loin d’être aussi marquée qu’avec
les Rodacs.

De plus, on s’aperçoit que si on fait la somme des bactéries prélevées avec celles qui restent sur
la plaque, on a « récolté » plus de germes que l’on en a initialement « semés ». Si on peut
accepter une certaine marge de manœuvre (30 % de différence pouvant constituer une erreur
acceptable) en microbiologie, cette différence dépasse tout de même parfois les 50 % (voir point
III).
Ce phénomène a plusieurs explications possibles : tout d’abord, le nombre de bactéries de départ
(présentes sur la plaque après séchage) a pu être sous-estimé. La technique utilisée et prescrite
par la norme NBN EN 13697 peut en effet être un facteur limitant du protocole (voir point II) :
les billes de verre, dont le rôle est d’extraire les bactéries de leur support par agitation, peuvent
ne pas avoir mis tous les germes en suspension ; une partie de cette suspension subsiste
systématiquement, par capillarité, entre les billes. La suspension qui est donc filtrée peut ne pas
contenir toutes les bactéries initialement présentes sur le support.
De plus, si le facteur temps d’incubation dont on parle ci-dessus (différences entre les comptages
quotidiens) n'a pas beaucoup d'importance en pratique, le temps que prennent toutes les
manipulations, lui, peut influer d’une façon non négligeable le nombre de germes détectés sur
les plaques après séchage, après les prélèvements, etc. En effet, les bactéries ne sont pas des
éléments statiques, et se multiplient dès qu’elles le peuvent, ce qui peut provoquer une différence
entre les niveaux de contamination théorique et réel.
Une autre limitation de ce protocole est le nombre de plaques témoin choisi : une seule plaque
témoin par expérience semble insuffisant a posteriori : même si la suspension de départ est
homogénéisée, il aurait été intéressant de voir s’il y avait une variation dans l’estimation du
nombre de germes au départ.
La contamination est bien sûr une autre explication potentielle de la différence observée entre le
nombre de germes ensemencés et prélevés. Ce phénomène est difficile à évaluer dans cette
étude : seuls des milieux sélectifs ont été choisis pour estimer le nombre d’Enterococcus présents
sur les plaques ou dans l’inoculum. Il aurait été intéressant de coupler ces contrôles avec
d’autres, sur milieu non sélectif.
En effet, la probabilité de contamination croisée au cours de l’expérimentation, malgré toutes les
précautions prises, n’est jamais exclue à 100 %. On pourrait imaginer que, malgré le
renouvellement des filtres stériles, certains Enterococcus subsistent sur la tête de filtration et
contaminent les filtres suivants, provoquant une surestimation du nombre de germes subsistant
sur la plaque.
S’il n’y a ni sous-estimation, ni contamination, peut-être faut-il envisager un facteur de
correction des résultats obtenus, en fonction de la méthode choisie, de façon à rendre un résultat
qui soit représentatif de la flore réellement présente sur la surface prélevée. D’ailleurs, les
résultats obtenus sont dans ce cas-ci en contradiction avec Salo et al (2000), qui ont un taux de
récupération nettement moindre: sur un support en inox, avec une flore aérobie, et par rapport à
- 33 / 34 -

la solution de départ (avant ensemencement), ils n’obtiennent que 16 % (haut niveau de


contamination au départ) à 30 % (faible niveau

de contamination de départ) au mieux de germes récupérés, que ce soit avec les Rodacs, les
Dipslides ou les écouvillons (aucune différence n’a d’ailleurs été constatée par les auteurs entre
les 3 méthodes). Dans une seconde étude sur ces mêmes trois méthodes, Salo et al (2002)
avancent cette fois-ci des coefficients de récupération plus proches de ceux que nous avons
trouvé : de 15 % (pour les surfaces en inox fortement contaminées avec des Enterobacteriaceae,
et incubation sur milieu VRBGA) à 100 % (surfaces faiblement contaminées) pour les Rodacs, et
de 15 à 150 % pour les Dipslides. De même Hartemann et al (1980), après avoir effectué,
comme dans le cadre de ce mémoire, plusieurs prélèvements successifs à un même endroit sur
plusieurs types de surfaces à l’aide de la méthode Rodac, étaient également arrivés à la
conclusion qu’il fallait appliquer un coefficient de récupération aux résultats, afin d’estimer la
contamination réelle de la surface : par exemple, un premier prélèvement sur du carrelage
présentait une efficacité de récupération de 39 % ; cependant, ils échantillonnaient des surfaces
naturellement contaminées, non comparables avec le faible inoculum utilisé dans le cadre de ce
mémoire. Le coefficient de récupération à appliquer serait propre à chaque type de matériau.
Whyte et al (1989), quant à eux, font intervenir ce coefficient de récupération dans une équation
reprenant également le nombre d’échantillons effectués, afin de déterminer le niveau de
contamination initial d’un plan de travail.
- 34 / 34 -

Conclusions
Les boîtes de contact (Rodacs) apparaissent plus performantes que les lames de contact
(Dipslides) et les Pétrifilms®, dans les conditions posées lors de cette expérience.
Il s’agit cependant d’une étude préliminaire, et des investigations à plus grande échelle, avec
différents niveaux de contamination et différents germes doivent confirmer ces résultats.
D’autre part, il faudrait réitérer l’expérience avec E. coli, mais en contrôlant mieux les conditions
environnementales de l’expérimentation (notamment l’humidité), et en utilisant différents
niveaux d’inoculation.
IRSD – 119 Div Annexe A
[Titre] - 1 / [Nb1?] -

Bibliographie

1. Livres et Papers
a. Eeeee
b. Eeeee
c. Eeeee
d. Eeeee
e. Eeeee
f. Eeeee
g. Eeeee
h. Eeeddd
i. Dddd
j. Ddddd
k. Ddddd
l. Ddddd
m. Ddddd
n. Dddd
o. Ddddd
2. Articles
a. AVERY S.M., BUNCIC S. Escherichia coli O157 diversity with respect to survival
during drying on concrete. J Food Prot., 2003, 66 (5), 780-6.
b. BUGGY B.P., KENNETH H.W., FEKETY R. Comparison of Methods for Recovery of
Clostridium difficile from an Environmental Surface. J Clin Microbiol, 1983, 18 (2),
348-352
C. BUTTNER M.P., CRUZ-PEREZ P., STETZENBACH L.D. Enhanced Detection of
Surface-Associated Bacteria in Indoor Environments by Quantitative PCR. Appl
Environ Microb, 2001, 67 (6), 2564-2570
D. BYRD J.A., CORRIER D.E., DELOACH, J.R., NISBET D.J. Comparison of drag-swab
environmental protocols for the isolation of Salmonella in poultry houses. Avian dis.,
1997, 41, 709-713
E. COLQUHOUN K.O., TIMMS S., FRICKER C.R. A simple method for the comparaison
of commercially available ATP hygiene-monitoring systems. J. Food protection, 1998,
61 (4), 499-501
f. CORRÉGÉ I., LE ROUX A., BUTIN M. Comparaison de méthodes rapides de contrôle
de l'efficacité du nettoyage-désinfection. Viandes Prod. Carnés, 1995, 16 (4), 123-130.
a. CRAYTHORN J.M., BARBOUR A.G., MATSEN J.M., BRITT M.R., GARIBALDI
R.A. Membrane filter contact technique for bacteriological sampling of moist surfaces. J
Clin Microbiol, 1980, 12 (2), 250-255
b. DAL MASO G., ADAMI S., DAL BON V. Microbiological validation of a film system
for monitoring total aerobic bacteria on surfaces and laboratory garments in controlled
areas Boll Chim Farm., 1993, 132 (1), 23-28
C. DAVIDSON C.A., GRIFFITH C.J., PETERS A.C., FIELDING L.M. Evaluation of two
methods for monitoring surface cleanliness-ATP bioluminescence and traditional
hygiene swabbing. Luminescence, 1999, 14(1), 33-38
d. DECKERS S., Performances et limitations des boîtes RODAC et des PetrifilmTM pour le
contrôle microbiologique de l’hygiène des surfaces, Facultés universitaires des Sciences
Agronomiques de Gembloux, 2008.
A. EGINTON P.J., GIBSON H., HOLAH J., HANDLEY P.S., GILBERT P. Quantification
of the ease of removal of bacteria from surfaces. J Ind Microbiol, 1995, 15 (4), 305-310
IRSD – 119 Div Annexe A
[Titre] - 2 / [Nb1?] -

b. FUNG D.Y.C. Rapid Methods and Automation in Microbiology, Compr Rev Food Sci
F, 2002, 1, 3-22
c. GREENE A.K., FEW B.K., SERAFINI J.C. A comparison of ozonation and chlorination
for the disinfection of stainless steel surfaces. J Dairy Sci, 1993, 76, 3617-3620
d. HACEK D.M., TRICK W.E., COLLINS S.M., NOSKIN G.A., PETERSON L.R.
Comparison of the Rodac Imprint Method to Selective Enrichment Broth for Recovery
of Vancomycin-Resistant Enterococci and Drug-Resistant Enterobacteriaceae from
Environmental Surfaces. J Clin Microbiol, 2000, 38 (12), 4646–4648
e. HARTEMANN P., DEMANGE C., BLECH M.F., THOFEM E. Evaluation de la
Biocontamination des surfaces par impression sur gélose en boîte RODAC. VDI-
Berichte, 1980, 386, 151-156
f. HORBORN J. Bacterial counts on fabrics : a comparative study of three methods.
Journal Hyg Camb., 1985, 95, 403-407
g. KIRSCHNER L.E., PULEO J.R. Wipe-rinse technique for quantitating microbial
contamination on large surfaces. Appl Environ Microbiol, 1979, 38 (3), 466-470
H. LEE J.Y., FUNG D.Y.C. Surface sampling technique for bacteriology. J Environ
Health, 1986, 48, 200-205
i. LEMMEN S. W., HÄFNER H., ZOLLDANN D., AMEDICK G., LÜTTICKEN R.
Comparison of two sampling methods for the detection of gram-positive and gram-
negative bacteria in the environment : moistened swabs versus Rodac plates. Int. J. Hyg.
Environ. Health, 2001, 203, 245-248
j. LICHTENWALNER P.C. Evaluation of wipe sampling procedures and elemental
surface contamination. Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 1992, 53 (10), 657-659.
K. LOMBARDO S. Development of Surface Swabbing Procedures for a Cleaning
Validation Program In a Biopharmaceutical Manufacturing Facility. Biotechnol Bioeng,
1995, 48:513-519
l. MARSHALL B., FLYNN P., KAMELY D., LEVY S.B. Survival of Escherichia coli
with and without ColEl::Tn5 after Aerosol Dispersal in a Laboratory and a Farm
Environment. Appl Environ Microbiol., 1988, 54 (7), 1776–1783
m. MINVIELLE B., RUGRAFF Y. Intérêt de l’ATP-métrie pour la validation et
l’optimisation du nettoyage-désinfection dans le secteur abattage-découpe. Techni Porc,
1999, 22 (5), 5-9
n. MOORE G., GRIFFITH C. A comparison of traditional and recently developed methods
for monitoring surface hygiene within the food industry : an industry trial. Int. J.
Environ. Health Res., 2002, 12, 317-329
a. MOORE G., GRIFFITH C. Problems associated with traditional hygiene swabbing: the
need for in-house standardization. Journal of Applied Microbiology, 2007.
B. NISKANEN A., POHJA M.S., Comparative studies on the sampling and investigation
of microbial contamination of surfaces by the contact plate and swab methods. J. Appl.
Bacteriol., 1977, 42, 53-63
C. PARK C.-M., BEUCHAT L.R. Survival of Escherichia coli O157:H7 in potato starch as
affected by water activity, pH and temperature. Appl Microbiol, 2000, 31, 364-367
D. POLETTI L., PASQUARELLA C., PITZURRA M., SAVINO A. Comparative
efficiency of nitrocellulose membranes versus RODAC plates in microbial sampling on
surfaces. J Hosp Infect, 1999, 41 (3), 195-201.
e. RUSSELL S., COX N., BAILEY J. Microbiological Methods For Sampling Poultry
Processing Plant Equipment. Applied Poultry Science,1997, 229-233.
a. SALO S., LAINE A., ALANKO T., SJÖBERG A-M., WIRTANEN G. Validation of the
microbiological methods hygicult Dipslides, contact plate, and swabbing in surface
hygiene control : a nordic collaborative study. J. AOAC Int., 2000, 83 (6), 1357-1365.
IRSD – 119 Div Annexe A
[Titre] - 3 / [Nb1?] -

b. SALO S., ALANKO T., SJÖBERG A-M., WIRTANEN G. Validation of the hygicult®
E Dipslides method in surface hygiene control : a nordic collaborative study. J. AOAC
Int., 2002, 85 (2), 388-394
c. SANDERSON W.T., HEIN M.J., TAYLOR L., CURWIN B.D., KINNES G.M., SEITZ
T.A., POPOVIC T., HOLMES H.T., KELLUM M.E., MCALLISTER S.K., WHALEY
D.N., TUPIN E.A., WALKER T., FREED J.A., SMALL D.S., KLUSARITZ B.,
BRIDGES J.H. Surface sampling methods for Bacillus anthracis spore contamination.
Emerg Infect Dis. 2002, 8 (10), 1145-51.
d. SCOTT E., BLOOMFIELD S. F., BARLOW C. G. A comparison of contact plate and
calcium alginate swab techniques for quantitative assessment of bacteriological
contamination of environmental surfaces. J. Appl. Bacteriol., 1984, 56, 317-320
E. SPERBER W. Influence of water activity on foodborne bacteria. A review. J. Food Prot.
1983, 46, 142-150.
f. TAMMINGA S.K, KAMPELMACHER E.H. Comparison of agar sausage, alginate
swab and adhesive tape methods for sampling flat surfaces contaminated with bacteria
Zbl. Bakt. Hyg, I. Abt. Orig., 1977, B 165, 423-434
g. TEBBUTT G. M. An assessment of cleaning and sampling methods for food-contact
surfaces in premises preparing and selling high-risk foods. Epidemiol. Infect., 1991, 106,
319-327
h. TEBBUTT, G., BELL V., AISLABIE J. Verification of cleaning efficiency and its
possible role in programmed hygiene inspections of food businesses undertaken by local
authority officers. Journal of Applied Microbiology, 2006, 102, 1010-1017
A. VERRAN J., BOYD R. D., HALL K., WEST R. H. Microbiological and chemical
analyses of stainless steel and ceramics subjected to repeated soiling and cleaning
treatments. J. Food Prot., 2001, 64 (9), 1377-1387
B. WERLEIN H-D., FRICKE R. Applicability of the swab sampling technique in order to
determine the microbial quality of poultry by means of ATP bioluminescence. Archiv
für lebbensmittelhygiene, 1997, 48, 1-24
c. WHYTE W., CARSON W., HAMBRAEUS A. Methods for calculating the efficiency of
bacterial surface sampling techniques. J. Hosp. Infect., 1989, 13, 33-41
d. YAMAGUSHI N., ISHIDOSHIRO A., YOSHIDA Y., SAIKA T., SENDA S., NASU
M. Development of an adhesive sheet for direct counting of bacteria on solid surfaces. J.
Microbiol. Methods, 2003, 53, 405-410
e. YAMAYOSHI T., DOI H., TATSUMI N. Surface sampling using a single swab
method. J. Hosp. Infect., 1984, 5, 386-390
Annexe [B?]
IRSD – 119 Div
Appendice [1?]
[Titre]
- 1 / [Nb2?]-

Abréviations

Dddddddddddddddddddddddd
abcd…
1. efgh…
b. zz
c. zzz
o zzz
o zzz
d. gggg
e. klmn…
3. vvv
4. opqr
Annexe [B?]
IRSD – 119 Div
Appendice [1?]
[Titre]
- 1 / [Nb3?]-

Législation et normes

zzzz
Annexe [B?]
IRSD – 119 Div
Appendice [1?]
[Titre]
- 2 / [Nb3?]-

5. NF EN ISO 14698-1 (2003) : Salles propres et environnements maîtrisés


apparentés – Maîtrise de la biocontamination – Partie 1 : Principe
généraux.
6. NF EN ISO 14698-2 (2004) : Salles propres et environnements maîtrisés
apparentés – Maîtrise de la biocontamination – Partie 2 : Evaluation et
interprétation des données de biocontamination.
7. NF EN ISO 14698-3 (2003) : Salles propres et environnements maîtrisés
apparentés – Maîtrise de la biocontamination – Partie 3 : Méthodologie
de mesurage de l’efficacité de procédés de nettoyage et/ou de
désinfection de surfaces inertes portant des souillures humides
biocontaminées ou des biofilms.

8. NF EN 1631-1 : Contamination de matériaux, appareils, personnel,


surfaces, par des fluides, gaz ou par des particules viables

2. EN 1632-1 : Technologie des salles propres - Maîtrise de la biocontamination. Méthodes


d’analyse et de mesurage de la biocontamination des surfaces dans les zones à risque

D’autres normes sont encore à l’état de projet, notamment :

9. ISO 14698-6 : Salles propres et environnements maîtrisés apparentés –


Maîtrise de la biocontamination – Partie 6 : Evaluation et interprétation
de la mesure des données de suivi de contamination microbienne des
zones à risque.

10. ISO 14698-7 : Salles propres et environnements maîtrisés apparentés –


Maîtrise de la biocontamination – Partie 7 : Principes de validation de
procédés de nettoyage et de désinfection des surfaces.
mmmmm