Problema 1

Cul de los siguientes tipos de cromatografa ser ms adecuado para

separar los compuestos A y B componentes de cada muestra?
n
Componentes de la muestra
Cromatografa
A B
1)
histona H1 (19,8 kDa,
pI=10,6)
pepsina (35 kDa,
pI=3,9)
...
2)
fenilalanina (M
r
=165,
pI=5,45)
serina (M
r
=105,
pI=5,7)
...
3)
lactato deshidrogenasa
(228 kDa, pI=7,3)
malato
deshidrogenasa (140
kDa, pI=4,8)
...
4)
seroalbmina (69 kDa,
pI=4,8)
inmunoglobulina G
(153 kDa, pI=6,5)
...
5)
seroalbmina
(M
r
=69000, pI=4,8)
glutatin (M
r
=333,
pI=2,25)
...
6)
cierta protena integral
de membrana (55 kDa,
pI=9,5)
hexoquinasa (53 kDa,
pI=10,0)
...
Cromatografa:
a. En capa fina de celulosa con cloroformo/metanol/actico (1:1:0,1)
como fase mvil
b. En columna de Sephadex G-50 con tampn fosfato pH=7 como
fase mvil
c. En columna de DEAE-Sepharosa con un gradiente de NaCl como
fase mvil
d. En papel con tampn fosfato pH=4 como fase mvil
e. En columna de protena A-Sepharosa con un gradiente de pH 7,5 a
1,5 como fase mvil
f. En columna de octil-Sepharosa con tampn fosfato pH=7 como
fase mvil
g. En columna de piruvato ligado a BioGel-P20 con un gradiente de
NaCl como fase mvil
h. En columna de gel de slice con hexano/ter/actico (60:40:1)
como fase mvil
Respuesta al problema 1
Muestra Cromatografa
1 (histona y pepsina) (c) por su distinta carga
2 (Phe y Ser) (a) o (h) por su distinta hidrofobia
3 (LDH y MDH)
(g) afinidad, pues el piruvato es el producto
de la reaccin de la LDH y tendr afinidad
por su centro activo
4 (seroalbmina e IgG) (e), la protena A une inmunoglobulinas G
5 (seroalbmina y
glutatin)
(b), por su diferente tamao
6 (protena integral de
membrana y
hexoquinasa)
(f), por su distinta hidrofobia

Problema 2
Disponemos de microesferas de polietileno con grupos sulfnico unidos
covalentemente. Para qu tipo de cromatografa podremos utilizarlas
(como fase estacionaria)?
(a) de exclusin; (b) de intercambio aninico; (c) de intercambio
catinico; (d) de reparto
Respuesta al problema 2
De intercambio catinico, porque la resina tiene carga negativa




Problema 3
La casa GE Lifesciences vende, para cromatografa de filtracin en gel,
el producto Sephadex G-100 Superfine, con las siguientes
caractersticas:
Material: dextrano entrecruzado con epiclorohidrina
Tamao de partcula: 10-40 m (seco)
Volumen de lecho: 15-20 ml/g (en agua)
Lmite de exclusin para protenas globulares: 100 kDa
Intervalo de fraccionamiento para protenas globulares: 4-100 kDa
Una muestra contiene las protenas indicadas a continuacin. Razonar
cul(es) de los componentes se podr(n) separar en una columna
rellena con Sephadex G-100.
Lactoferrina: 77 kDa, pI=8,8
Protena ligante de retinol (RBP): 21 kDa, pI=4,6
Lisozima: 15 kDa, pI=10,5
Ceruloplasmina: 134 kDa, pI=4,4
Glutatin: 333 Da, pI=2,25
Respuesta al problema 3
G-100 excluye la ceruloplasmina (que saldr al principio, en el volumen
de exclusin).
Se resuelven (separan) la lactoferrina, la protena ligante de retinol y la
lisozima, pues sus tamaos estn en el intervalo de fraccionamiento de
G-100; saldrn en ese orden.
El glutation queda retenido en la columna y saldr al final, pero sin
resolucin respecto a otros componentes pequeos (como los iones del
tampn).


Problema 4
Resuelve el problema anterior empleando como medio cromatogrfico
Sephadex G-75.
Los datos necesarios pueden encontrarse en el catlogo de GE Life
Sciences o en http://www.gelifesciences.com/
Respuesta al problema 4
El Sephadex G-75 tiene un intervalo de fraccionamiento para protenas
globulares de entre 3 y 70 kDa.
En consecuencia:
La ceruloplasmina y la lactoferrina saldrn en el volumen de exclusin.
Se resuelven la protena ligante de retinol y la lisozima, pues sus
tamaos estn en el intervalo de fraccionamiento de G-75; saldrn en
ese orden.
El glutation queda retenido en la columna y saldr al final, pero sin
resolucin respecto a otros componentes pequeos (como los iones del
tampn).
Problema 5
A partir de un antisuero se pretende purificar un anticuerpo anti-
insulina, empleando cromatografa de afinidad en una columna rellena
con Biogel-A al que se ha unido insulina de forma covalente a travs de
un grupo espaciador de 6 carbonos.Elegir de entre las fases mviles
siguientes las ms adecuadas para la etapa de lavado tras la muestra y
para la elucin de lo retenido en la columna.
a. Mezcla cloroformo/metanol 2:1
b. Alcohol isoproplico
c. NaCl 0.9%
d. Tampn bicarbonato sdico pH=10
e. 0.5 mg/ml de [
125
I]-insulina en tampn fosfato pH=7.4
f. 2 mg/ml de glucagn en NaCl 0.9%
g. 2 mg/ml de IgG anti-insulina en tampn fosfato pH=7
Respuesta al problema 5
Para lavar (c) (sin ningn efecto en especial pero compatible con la
unin en condiciones fisolgicas).
Para eluir (e), pues la insulina aadida competir con la insulina
inmovilizada en la columna y as desplazar el anticuerpo retenido; el
marcaje con yodo es irrelevante

Problema 6
Una de las aplicaciones frecuentes de la cromatografa de exclusin
molecular es la determinacin de la masa molecular de protenas
globulares. Para ello, es preciso disponer de protenas patrn de masa
conocida.
Tras un proceso de purificacin que parti de un extracto celular, el
cromatograma de exclusin obtenido con la muestra resultante indic la
presencia de 2 protenas diferentes. Calcule cul es su masa molecular,
a partir de los datos de volumen de elucin obtenidos con la mezcla de
protenas patrn cromatografiada bajo las mismas condiciones.
Cromatograma de la muestra:

Cromatograma y datos de la
mezcla de protenas patrn:

protena
masa
molecular
Ve
aldolasa 39.2 kDa 24.0
mL
seroalbmina 66.2 kDa 21.3
mL
fosforilasa b 97.0 kDa 18.0
mL
-
galactosidasa
116.0 kDa 16.5
mL
miosina 212.0 kDa 14.0
mL

Respuesta al problema 6
Leemos en el
cromatograma de la muestra los V
e
de sus dos componentes: 15.5 y 20
mL.
Construimos una tabla con los datos de los patrones y con ellos una
curva de calibrado (dada la gran dispersin de valores de masa
molecular, es habitual representar stos en una escala logartmica, para
conseguir agruparlos y adems normalmente as se ajustan mejor a una
recta).
Puesto que la distribucin de puntos patrn es bastante lineal,
ajustamos a una recta (lo ideal sera un ajuste por regresin no lineal a
una curva logartmica). La ecuacin resultante es:
log(M
r
/1000) = 3.25 0.069 V
e

M
r
es masa molecular relativa, es decir, sin unidades; si ponemos
Da o kDa ya hay unidades y es masa molecular, mejor que peso
molecular. El ajuste se hizo con los valores numricos de kDa, por lo
cual la variable Y es M
r
/1000
Ntese la escala logartmica en el eje de ordenadas.
Interpolando el volumen al que han eluido las dos protenas
componentes de la muestra (picos a 15.5 y 20 mL) obtenemos: 151 y
75 kDa.