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Green fluorescent protein

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"EGFP" redirects here. EGFP may also refer to the ICAO airport code for Pembrey
Airport.
Green fluorescent protein

Structure of the Aequorea victoria green fluorescent
protein.
[1]

Identifiers
Symbol Reginal
Pfam PF01353
Pfam clan CL0069
InterPro IPR011584
SCOP 1ema
SUPERFAMILY 1ema
[show]Available protein structures:





The green fluorescent protein (GFP) is a protein composed of 238 amino acid residues
(26.9 kDa) that exhibits bright green fluorescence when exposed to light in the blue to
ultraviolet range.
[2][3]
Although many other marine organisms have similar green
fluorescent proteins, GFP traditionally refers to the protein first isolated from the jellyfish
Aequorea victoria. The GFP from A. victoria has a major excitation peak at a wavelength
of 395 nm and a minor one at 475 nm. Its emission peak is at 509 nm, which is in the lower
green portion of the visible spectrum. The fluorescence quantum yield (QY) of GFP is 0.79.
The GFP from the sea pansy (Renilla reniformis) has a single major excitation peak at
498 nm.
In cell and molecular biology, the GFP gene is frequently used as a reporter of
expression.
[4]
In modified forms it has been used to make biosensors, and many animals
have been created that express GFP as a proof-of-concept that a gene can be expressed
throughout a given organism. The GFP gene can be introduced into organisms and
maintained in their genome through breeding, injection with a viral vector, or cell
transformation. To date, the GFP gene has been introduced and expressed in many Bacteria,
Yeast and other Fungi, fish (such as zebrafish), plant, fly, and mammalian cells, including
human. Martin Chalfie, Osamu Shimomura, and Roger Y. Tsien were awarded the 2008
Nobel Prize in Chemistry on 10 October 2008 for their discovery and development of the
green fluorescent protein.
Contents
[hide]
1 History
o 1.1 Wild-type GFP (wtGFP)
o 1.2 GFP derivatives
2 GFP in nature
3 Other fluorescent proteins
4 Structure
5 Applications
o 5.1 Fluorescence Microscopy
o 5.2 Transgenic pets
o 5.3 GFP in fine art
6 See also
7 References
8 Further reading
9 External links
History[edit]


Aequorea victoria
Wild-type GFP (wtGFP)[edit]
In the 1960s and 1970s, GFP, along with the separate luminescent protein aequorin, was
first purified from Aequorea victoria and its properties studied by Osamu Shimomura.
[5]
In
A. victoria, GFP fluorescence occurs when aequorin interacts with Ca
2+
ions, inducing a
blue glow. Some of this luminescent energy is transferred to the GFP, shifting the overall
color towards green.
[6]
However, its utility as a tool for molecular biologists did not begin
to be realized until 1992 when Douglas Prasher reported the cloning and nucleotide
sequence of wtGFP in Gene.
[7]
The funding for this project had run out, so Prasher sent
cDNA samples to several labs. The lab of Martin Chalfie expressed the coding sequence of
wtGFP, with the first few amino acids deleted, in heterologous cells of E. coli and C.
elegans, publishing the results in Science in 1994.
[8]
Frederick Tsuji's lab independently
reported the expression of the recombinant protein one month later.
[9]
Remarkably, the GFP
molecule folded and was fluorescent at room temperature, without the need for exogenous
cofactors specific to the jellyfish. Although this near-wtGFP was fluorescent, it had several
drawbacks, including dual peaked excitation spectra, pH sensitivity, chloride sensitivity,
poor fluorescence quantum yield, poor photostability and poor folding at 37 C.
The first reported crystal structure of a GFP was that of the S65T mutant by the Remington
group in Science in 1996.
[10]
One month later, the Phillips group independently reported the
wild-type GFP structure in Nature Biotech.
[11]
These crystal structures provided vital
background on chromophore formation and neighboring residue interactions. Researchers
have modified these residues by directed and random mutagenesis to produce the wide
variety of GFP derivatives in use today. Martin Chalfie, Osamu Shimomura and Roger Y.
Tsien share the 2008 Nobel Prize in Chemistry for their discovery and development of the
green fluorescent protein.
[12]

GFP derivatives[edit]


The diversity of genetic mutations is illustrated by this San Diego beach scene drawn with
living bacteria expressing 8 different colors of fluorescent proteins (derived from GFP and
dsRed).
Due to the potential for widespread usage and the evolving needs of researchers, many
different mutants of GFP have been engineered.
[13]
The first major improvement was a
single point mutation (S65T) reported in 1995 in Nature by Roger Tsien.
[14]
This mutation
dramatically improved the spectral characteristics of GFP, resulting in increased
fluorescence, photostability, and a shift of the major excitation peak to 488 nm, with the
peak emission kept at 509 nm. This matched the spectral characteristics of commonly
available FITC filter sets, increasing the practicality of use by the general researcher. A
37 C folding efficiency (F64L) point mutant to this scaffold yielding enhanced GFP
(EGFP) was discovered in 1995 by the laboratories of Thastrup
[15]
and Falkow.
[16]
EGFP
allowed the practical use of GFPs in mammalian cells. EGFP has an extinction coefficient
(denoted ) of 55,000 M
1
cm
1
.
[17]
The fluorescence quantum yield (QY) of EGFP is 0.60.
The relative brightness, expressed as QY, is 33,000 M
1
cm
1
. Superfolder GFP, a series
of mutations that allow GFP to rapidly fold and mature even when fused to poorly folding
peptides, was reported in 2006.
[18]

Many other mutations have been made, including color mutants; in particular, blue
fluorescent protein (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), cyan fluorescent protein (ECFP,
Cerulean, CyPet), and yellow fluorescent protein derivatives (YFP, Citrine, Venus, YPet).
BFP derivatives (except mKalama1) contain the Y66H substitution.They exhibit a broad
absorption band in the ultraviolet centered close to 380 nanometers and an emission
maximum at 448 nanometers. A green fluorescent protein mutant (BFPms1) that
preferentially binds Zn(II) and Cu(II) has been developed. BFPms1 have several important
mutations including and the BFP chromophore (Y66H),Y145F for higher quantum yield,
H148G for creating a hole into the beta-barrel and several other mutations that increase
solubility. Zn(II) binding increases fluorescence intensity, while Cu(II) binding quenches
fluorescence and shifts the absorbance maximum from 379 to 444 nm. Therefore they can
be used as Zn biosensor.
[19]

The critical mutation in cyan derivatives is the Y66W substitution, which causes the
chromophore to form with an indole rather than phenol component. Several additional
compensatory mutations in the surrounding barrel are required to restore brightness to this
modified chromophore due to the increased bulk of the indole group. In ECFP and
Cerulean, the N-terminal half of the seventh strand exhibits two conformations. These
conformations both have a complex set of van der Waals interactions with the
chromophore. The Y145A and H148D mutations in Cerulean stabilize these interactions
and allow the chromophore to be more planar, better packed, and less prone to collisional
quenching.
[20]
The red-shifted wavelength of the YFP derivatives is accomplished by the
T203Y mutation and is due to -electron stacking interactions between the substituted
tyrosine residue and the chromophore.
[3]
These two classes of spectral variants are often
employed for Frster resonance energy transfer (FRET) experiments.
[21]
Genetically
encoded FRET reporters sensitive to cell signaling molecules, such as calcium or
glutamate, protein phosphorylation state, protein complementation, receptor dimerization,
and other processes provide highly specific optical readouts of cell activity in real time.

Semirational mutagenesis of a number of residues led to pH-sensitive mutants known as
pHluorins, and later super-ecliptic pHluorins. By exploiting the rapid change in pH upon
synaptic vesicle fusion, pHluorins tagged to synaptobrevin have been used to visualize
synaptic activity in neurons.
[22]

Redox sensitive versions of GFP (roGFP) were engineered by introduction of cysteines into
the beta barrel structure. The redox state of the cysteines determines the fluorescent
properties of roGFP.
[23]

The nomenclature of modified GFPs is often confusing due to overlapping mapping of
several GFP versions onto a single name. For example, mGFP often refers to a GFP with
an N-terminal palmitoylation that causes the GFP to bind to cell membranes. However, the
same term is also used to refer to monomeric GFP, which is often achieved by the dimer
interface breaking A206K mutation.
[24]
Wild-type GFP has a weak dimerization tendency at
concentrations above 5 mg/mL. mGFP also stands for "modified GFP," which has been
optimized through amino acid exchange for stable expression in plant cells.
GFP in nature[edit]
The purpose of both bioluminescence and GFP fluorescence in jellyfish is unknown. GFP
is co-expressed with aequorin in small granules around the rim of the jellyfish bell. The
secondary excitation peak (480 nm) of GFP does absorb some of the blue emission of
aequorin, giving the bioluminescence a more green hue. The serine 65 residue of the GFP
chromophore is responsible for the dual-peaked excitation spectra of wild-type GFP. It is
conserved in all three GFP isoforms originally cloned by Prasher. Nearly all mutations of
this residue consolidate the excitation spectra to a single peak at either 395 nm or 480 nm.
The precise mechanism of this sensitivity is complex, but, it seems, involves donation of a
hydrogen from serine 65 to glutamate 222, which influences chromophore ionization.
[3]

Since a single mutation can dramatically enhance the 480 nm excitation peak, making GFP
a much more efficient partner of aequorin, A. victoria appears to evolutionarily prefer the
less-efficient, dual-peaked excitation spectrum. Roger Tsien has speculated that varying
hydrostatic pressure with depth may affect serine 65's ability to donate a hydrogen to the
chromophore and shift the ratio of the two excitation peaks. Thus, the jellyfish may change
the color of its bioluminescence with depth. However, a collapse in the population of
jellyfish in Friday Harbor, where GFP was originally discovered, has hampered further
study of the role of GFP in the jellyfish's natural environment.
Other fluorescent proteins[edit]
Because of the great variety of engineered GFP derivatives, fluorescent proteins that belong
to a different family, such as the bilirubin-inducible fluorescent protein UnaG, dsRed,
eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP, Dendra, IrisFP and many others, are erroneously
referred to as GFP derivatives. Several of these proteins display unique properties like red-
shifted emission above 600 nm or photoconversion from a green-emitting state to a red-
emitting state. These properties are so far unique to fluorescent proteins other than GFP
derivatives.
Structure[edit]
GFP has a typical beta barrel structure, consisting of eleven -sheets with six alpha helix(s)
containing the covalently bonded chromophore 4-(p-hydroxybenzylidene)imidazolidin-5-
one (HBI) running through the center.
[3][10][11]
The beta barrel structure is a nearly perfect
cylinder,42 long and 24 in diameter,
[10]
creating what is referred to as a -can
formation. HBI is nonfluorescent in the absence of the properly folded GFP scaffold and
exists mainly in the unionized phenol form in wtGFP.
[citation needed]
Inward-facing sidechains
of the barrel induce specific cyclization reactions in the tripeptide Ser65Tyr66Gly67 that
induce ionization of HBI to the phenolate form and chromophore formation. This process
of post-translational modification is referred to as maturation.
[25]
The hydrogen-bonding
network and electron-stacking interactions with these sidechains influence the color,
intensity and photostability of GFP and its numerous derivatives.
[26]
The tightly packed
nature of the barrel excludes solvent molecules, protecting the chromophore fluorescence
from quenching by water.



GFP molecules drawn in cartoon style, one fully and one
with the side of the beta barrel cut away to reveal the
chromophore (highlighted as ball-and-stick). From PDB
1GFL.

GFP ribbon diagram. From
PDB 1EMA.
Applications[edit]
Fluorescence Microscopy[edit]


Superresolution with two fusion proteins (GFP-Snf2H and RFP-H2A), Co-localisation
studies (2CLM) in the nucleus of a bone cancer cell. 120.000 localized molecules in a
widefield area(470 m2)
The availability of GFP and its derivatives has thoroughly redefined fluorescence
microscopy and the way it is used in cell biology and other biological disciplines.
[27]
While
most small fluorescent molecules such as FITC (fluorescein isothiocyanate) are strongly
phototoxic when used in live cells, fluorescent proteins such as GFP are usually much less
harmful when illuminated in living cells. This has triggered the development of highly
automated live-cell fluorescence microscopy systems, which can be used to observe cells
over time expressing one or more proteins tagged with fluorescent proteins. For example,
GFP had been widely used in labelling the spermatozoa of various organisms for
identification purposes as in Drosophila melanogaster, where expression of GFP can be
used as a marker for a particular characteristic. GFP can also be expressed in different
structures enabling morphological distinction. In such cases, the gene for the production of
GFP is spliced into the genome of the organism in the region of the DNA that codes for the
target proteins and that is controlled by the same regulatory sequence; that is, the gene's
regulatory sequence now controls the production of GFP, in addition to the tagged
protein(s). In cells where the gene is expressed, and the tagged proteins are produced, GFP
is produced at the same time. Thus, only those cells in which the tagged gene is expressed,
or the target proteins are produced, will fluoresce when observed under fluorescence
microscopy. Analysis of such time lapse movies has redefined the understanding of many
biological processes including protein folding, protein transport, and RNA dynamics, which
in the past had been studied using fixed (i.e., dead) material. Obtained data are also used to
calibrate mathematical models of intracellular systems and to estimate rates of gene
expression.
[28]

The Vertico SMI microscope using the SPDM Phymod technology uses the so-called
"reversible photobleaching" effect of fluorescent dyes like GFP and its derivatives to
localize them as single molecules in an optical resolution of 10 nm. This can also be
performed as a co-localization of two GFP derivatives (2CLM).
[29]

Another powerful use of GFP is to express the protein in small sets of specific cells. This
allows researchers to optically detect specific types of cells in vitro (in a dish), or even in
vivo (in the living organism).
[30]
Genetically combining several spectral variants of GFP is a
useful trick for the analysis of brain circuitry (Brainbow).
[31]
Other interesting uses of
fluorescent proteins in the literature include using FPs as sensors of neuron membrane
potential,
[32]
tracking of AMPA receptors on cell membranes,
[33]
viral entry and the
infection of individual influenza viruses and lentiviral viruses,
[34][35]
etc.
It has also been found that new lines of transgenic GFP rats can be relevant for gene
therapy as well as regenerative medicine.
[36]
By using "high-expresser" GFP, transgenic rats
display high expression in most tissues, and many cells that have not been characterized or
have been only poorly characterized in previous GFP-transgenic rats. Through its ability to
form internal chromophore without requiring accessory cofactors, enzymes or substrates
other than molecular oxygen, GFP makes for an excellent tool in all forms of biology.
[37]

GFP has been shown to be useful in cryobiology as a viability assay. Correlation of
viability as measured by trypan blue assays were 0.97.
[38]
Another application is the use of
GFP co-transfection as internal control for transfection efficiency in mammalian cells.
[39]

A novel possible use of GFP includes using it as a sensitive monitor of intracellular
processes via an eGFP laser system made out of a human embryonic kidney cell line. The
first engineered living laser is made by an eGFP expressing cell inside a reflective optical
cavity and hitting it with pulses of blue light. At a certain pulse threshold, the eGFPs
optical output becomes brighter and completely uniform in color of pure green with a
wavelength of 516 nm. Before being emitted as laser light, the light bounces back and forth
within the resonator cavity and passes the cell numerous times. By studying the changes in
optical activity, researchers may better understand cellular processes.
[40][41]

GFP is used widely in cancer research to label and track cancer cells. GFP-labelled cancer
cells have been used to model metastasis, the process by which cancer cells spread to
distant organs.
[42]

Transgenic pets[edit]


GloFish, the first pet sold with these
proteins artificially present.


mice expressing GFP under UV light (left &
right), compared to normal mouse (center)
Alba, a green-fluorescent rabbit, was created by a French laboratory commissioned by
Eduardo Kac using GFP for purposes of art and social commentary.
[43]
The US company
Yorktown Technologies markets to aquarium shops green fluorescent zebrafish (GloFish)
that were initially developed to detect pollution in waterways. NeonPets, a US-based
company has marketed green fluorescent mice to the pet industry as NeonMice.
[44]
Green
fluorescent pigs, known as Noels, were bred by a group of researchers led by Wu Shinn-
Chih at the Department of Animal Science and Technology at National Taiwan
University.
[45]
A Japanese-American Team created green-fluorescent cats as proof of
concept to use them potentially as model organisms for diseases, particularly HIV.
[46]
In
2009 a South Korean team from Seoul National University bred the first transgenic beagles
with fibroblast cells from sea anemons. The dogs give off a red fluorescent light, and they
are meant to allow scientists to study the genes that cause human diseases like narcolepsy
and blindness.
[47]

GFP in fine art[edit]


Julian Voss-Andreae's GFP-based sculpture Steel Jellyfish (2006). The image shows the
stainless-steel sculpture at Friday Harbor Laboratories on San Juan Island (Wash., USA),
the place of GFP's discovery.
Julian Voss-Andreae, a German-born artist specializing in "protein sculptures,"
[48]
created
sculptures based on the structure of GFP, including the 1.70 m (5'6") tall "Green
Fluorescent Protein" (2004)
[49]
and the 1.40 m (4'7") tall "Steel Jellyfish" (2006). The latter
sculpture is located at the place of GFP's discovery by Shimomura in 1962, the University
of Washington's Friday Harbor Laboratories.
[50]
























Plsmido
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Dibujo esquemtico de un plsmido en una bacteria: en rojo, el ADN del cromosoma; en azul, los
plsmidos.
Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular o lineal que se replican y
transcriben independientes del ADN cromosmico. Estn presentes normalmente en
bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamao
vara desde 1 a 250 kb. El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo,
desde una sola copia hasta algunos cientos por clula. El trmino plsmido fue presentado
por primera vez por el bilogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952.
1

Las molculas de ADN plasmdico, adoptan una conformacin tipo doble hlice al igual
que el ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se encuentran fuera de los mismos.
Se han encontrado plsmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN
cromosomal, los plsmidos no tienen protenas asociadas.
En general, no contienen informacin esencial, sino que confieren ventajas al hospedador
en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo ms comn es el de los plsmidos
que contienen genes de resistencia a un determinado antibitico, de manera que el plsmido
nicamente supondr una ventaja en presencia de ese antibitico.
Hay algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el
cromosoma bacteriano. Estos rompen momentneamente el cromosoma y se sitan en su
interior, con lo cual, automticamente la maquinaria celular tambin reproduce el plsmido.
Cuando ese plsmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.
Los plsmidos se utilizan como vectores de clonacin en ingeniera gentica por su
capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal as como
tambin porque es relativamente fcil manipularlos e insertar nuevas secuencias genticas.
Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica suelen contener uno o dos genes que les
confieren resistencia a antibiticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay otros
mtodos de seleccin adems de la resistencia a antibiticos, como los basados en
fluorescencia o en protenas que destruyen las clulas sin uso de antibiticos. Estos nuevos
mtodos de seleccin de plsmidos son de uso frecuente en agrobiotecnologa, debido a la
fuerte crtica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibiticos en los
organismos modificados genticamente.
ndice
[ocultar]
1 Resistencia a los antibiticos
2 Epsomas
3 Tipos
4 Aplicaciones
5 Extraccin del ADN plasmdico
6 Conformaciones
7 Referencias
8 Vase tambin
9 Enlaces externos
Resistencia a los antibiticos[editar]
Los plsmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que les confieren una ventaja
selectiva, lo que les da la habilidad de hacer a la bacteria resistente a los antibiticos.
Cada plsmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de
replicacin u ORI (un punto inicial para la replicacin del ADN), lo cual habilita al ADN
para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal. Los plsmidos de la mayora
de las bacterias son circulares, pero tambin se conocen algunos lineales, los cuales
reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayora de eucariotas.
Epsomas[editar]
Un epsoma es un plsmido que puede integrarse por s mismo al ADN cromosomal del
organismo husped. Por esta razn, puede mantenerse en contacto por un largo tiempo, ser
duplicado en cada divisin celular del husped y volverse parte bsica de su mapa gentico.
Este trmino no se usa ms en plsmidos, debido a que ahora est claro que una regin
homologa con el cromosoma elabora un plsmido dentro de un epsoma.
Los plsmidos usados en ingeniera gentica son llamados vectores. Estos son usados
para transferir genes desde un organismo a otro y tpicamente contienen un marcador
gentico confiriendo un fenotipo el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. La
mayora tambin contienen un polivinculador o sitio de clonado mltiple (MCS), el cual es
una pequea regin que contiene los sitios de restriccin ms comnmente usados,
permitiendo una fcil insercin de fragmentos de ADN en ese lugar.
Tipos[editar]
Una forma de agrupar plsmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los
plsmidos conjugativos contienen tra-genes, los cuales ejecutan complejos procesos de
conjugacin, como la transferencia sexual de plsmidos a otra bacteria. Los plsmidos no-
conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugacin, de all que ellos pueden transferirse
nicamente con la asistencia de los plsmidos conjugativos y lo hacen por accidente. Una
clase intermedia de plsmidos son los movilizables los cuales llevan solo un subtipo de
genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden parasitar un plsmido conjugativo,
transfirindose a una alta frecuencia solo en su presencia.
Es posible para plsmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple.
Siete tipos diferentes de plsmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero normalmente
plsmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos sobrevive
en la lnea celular, debido a la regulacin de las funciones vitales de los plsmidos. Por lo
tanto, los plsmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de compatibilidad.
Otra forma de clasificar plsmidos es por funcin. Hay 5 clases principales:
Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son capaces de conjugarse.
Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir resistencia
contra antibiticos o venenos. Histricamente conocidos como Factores R, antes de que se
entendiera la naturaleza de los plsmidos.
Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la produccin de)
colinas y protenas que pueden matar a otra bacteria.
Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias inusuales como
tolueno o cido saliclico.
Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno.
Los plsmidos pueden pertenecer a ms de uno de estos grupos funcionales.
Los plsmidos solo pueden coexistir como una o ms copias en cada bacteria, debido a la
divisin celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.
Algunos plsmidos incluyen un sistema de adicin o Sistema de Muerte
Postsegregacional (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto
un veneno de larga vida y un antdoto de vida corta. Las clulas hija que retienen una copia
del plsmido sobreviven, mientras que una clula hija que falla al integrar el plsmido
muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo de la clula
padre. Este es un ejemplo de plsmidos como el ADN replicante.
Aplicaciones[editar]
Los plsmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios de gentica e
ingeniera bioqumica, donde son comnmente usados para multiplicar (hacer muchas
copias de) o como genes particulares expresos. Muchos plsmidos estn disponibles
comercialmente para dichos usos.
El gen a ser replicado se inserta en copias de un plsmido el cual contiene genes que hacen
clulas resistentes a un antibitico en particular. En el paso siguiente el plsmido es
insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transformacin. Luego, la
bacteria es expuesta a un antibitico particular. Solo la bacteria que toma copias del
plsmido sobrevive al antibitico debido a que el plsmido lo hace resistente. En particular,
los genes protectores son expresados (usados para hacer protena) y la protena expresada
evita la accin del antibitico. De esta forma, los antibiticos actan como un filtro que
seleccionan nicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas
en largas cantidades, cosechadas y el plsmido de inters puede ser aislado.
Otro uso importante de los plsmidos es fabricar grandes cantidades de protenas. En este
se deja crecer la bacteria que contiene el plsmido que encierra al gen de inters. Solo como
la bacteria produce la protena que le confiere si resistencia a los antibiticos, este tambin
puede ser usado para producir protenas en grandes cantidades desde el gen insertado. Esta
es una forma barata y fcil de producir genes o protenas que este codifica de forma masiva,
como por ejemplo insulina, o inclusive antibiticos.
Extraccin del ADN plasmdico[editar]
En el maxiprep se cultivan volmenes mucho ms grandes de bacterias en suspensin.
Esencialmente, este es un escalado de la preparacin mini-prep, el cual es seguido por una
purificacin adicional. Esto resulta en una cantidad relativamente grande (0,5 -1 mg) de
ADN plsmido muy puro.
En los ltimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar la extraccin
plasmdica a varias escalas, purezas y niveles de automatizacin.
Conformaciones[editar]
El ADN plsmido puede aparecer en uno de cinco conformaciones, las cuales (para un
tamao dado) corren a diferentes velocidades en un gel durante electroforesis. Las
conformaciones se muestran abajo en orden de movilidad electrofortica (velocidad para un
voltaje dado), del ms lento al ms rpido:
Mellado abierto circular: el ADN tiene un solo corte filamentario.
Lineal: ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos fueron cortados o porque
el ADN era linear in vivo. Usted puede modelar este como un cordn que no se ha
conectado as mismo.
circular relajado: ADN que interacta completamente con ambos filamentos sin cortar,
pero que ha sido enzimticamente relajado. Usted puede modelar este dejando un
cordn relajado y luego conectndolo a s mismo.
superespiral desnaturalizado: ADN como el ADN superespiral o superenrollado (ver ms
abajo), pero que tiene regiones sin unir que lo hacen ligeramente menos compacto; esto
resulta de una excesiva alcalinidad durante la preparacin del plsmido.
ADN superespiral: Es un ADN totalmente intacto con los filamentos sin cortar, y con forma
de remolino, resultando en una forma compacta.
La tasa de migracin de pequeos fragmentos lineales es directamente proporcional al
voltaje aplicado (en el caso de voltajes bajos). En el caso de altos voltajes, grandes
fragmentos migran continuamente a diferentes tasas. Por lo tanto, la resolucin del gel
decrece con el incremento del voltaje.
A un bajo voltaje determinado, la migracin de un pequeo fragmento lineal de ADN est
en funcin de su longitud. Fragmentos lineales largos (de 20kb) migran a cierta tasa sin
importar la longitud. Esto es debido a que las molculas reptan desde el centro de la
molcula siguiendo el sentido de la matriz de gel.
La digestin restrictiva se usa frecuentemente para analizar fragmentos purificados de
plsmidos. Estas enzimas rompen especficamente el ADN en ciertas secuencias cortas.














































Agonista
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En bioqumica, un agonista es aquella sustancia que es capaz de unirse a un receptor
celular y provocar una accin determinada en la clula generalmente similar a la producida
por una sustancia fisiologica. Un agonista es lo opuesto a un antagonista en el sentido de
que mientras un antagonista tambin se une a un receptor, no solamente no lo activa, sino
que en realidad bloquea su activacin por los agonistas; Un agonista parcial activa al
receptor pero no causa tanto efecto fisiolgico como un agonista completo. Los receptores
en el cuerpo humano funcionan al ser estimulados o inhibidos por agonistas o antagonistas
naturales (como las hormonas o neurotransmisores) o artificiales (como algunos farmacos).
Recientemente ha sido lanzada una novedosa teora denominada selectividad funcional, la
cual ampla la definicin convencional de la farmacologa.
En anatoma, los msculos agonistas son los capaces de realizar el mismo tipo de
movimiento.






















Agonista | Antagonista
Escrito por elena (sguele en Google+)
Diferencia entre agonistas y antagonistas con vdeo en De Medicina.com
El uso de los trminos agonista y antagonista se usa en bioqumica lo vemos escrito en la
posologa del prospecto de los medicamentos.
Qu es un antagonista y un agonista? Un agonistas y un antagonistas son los opuestos
si se produce una accin o agonista, el antagonista reaccionara y se opondr a esa accin.

Agonista
Se llama agonista a un compuesto qumico capaz de simular el efecto de una sustancia
producida por nuestro propio cuerpo. El agonista no es la sustancia original de nuestro
cuerpo pero acta de forma parecida, la imita.
Las sustancias que produce nuestro cuerpo actan sobre los receptores. Si un agonista
imita a la sustancia producida de forma natural , estimula al receptor y se logran los
efectos que esa sustancia natural produce en las clulas.
Ejemplo. La Dopamina, una sustancia producida por nuestro cuerpo presente en muchos
medicamentos como los antidepresivos.
Sustancias qumicas producidas de forma artificial como la apomorfina, el pramipexole ,
las anfetaminas, las bromocriptinas imitan esta composicin natural de la dopamina,
engaan al receptor y lo estimulan, luego producen efectos similares a la dopamina en
el cuerpo humano.

El uso de agonistas o sustancias qumicas fabricadas de forma artificial para imitar a otras
que tenemos en nuestro cuerpo es bsica para la fabricacin de medicinas.
Una sustancia puede ser agonista pleno, si logra una respuesta plena tal como se
obtendra con la sustancia producida por nuestro cuerpo.
O puede ser Agonista de forma parcial. Cuando logra una respuesta apreciable pero no
completa tal como la propia sustancia producida de forma natural.

Antagonista
Sustancia que imita a la sustancia natural para poder ocupar su lugar en el receptor
bloquendolo sin producir efecto. El antagonista engaa al receptor simulando ser la
sustancia natural sin serlo. De esta forma la sustancia original no podr actuar ya que su
sitioest ocupado por ese antagonista.
En el ejemplo de la Dopamina, son antagonistas de la dopamina sustancias como los
neurolpticos, los tiaxantenos, butiferononas.
Una forma divertida de ver cmo actan los agonistas y antagonistas
Agonistas se combinan con otras sustancias qumicas para promover
alguna accin, mientras que los antagonistas se combinan con
sustancias qumicas para bloquear esa accin.
De forma coloquial mientras las sustancia agonista trabaja, la sustancia
antagonista, ocupa un lugar y se cruza de brazos sin hacer nada y sin
dejar que la sustancia natural ocupe ese sitio.
En Demedicina nos importa tu opinin, si tienes ideas o sugerencias puedes dejar tu
comentario. Gracias por leer De Medicina.com
AGONISTAS Y ANTAGONISTAS ADRENERGICOS

MEDICAMENTOS P
Un medicamento p es aquel por el cual el mdico se siente identificado en su
potencia y efecto farmacolgico para tratar la patologa que est afectando a su
paciente.
Por lo tanto nos podemos dar cuenta que esta decisin es subjetiva, sea de cada
profesional de la salud.

Por lo tanto aqu estn mencionados "algunos" de mis medicamentos P:
*ACETAMINOFEN
*ACIDO ACETIL SALICLICO
*METFORMINA
*SALBUTAMOL
*ENALAPRIL
*ATROPINA
*METOPROLOL
ENTRE OTROS MS...

AGONISTAS ADRENERGICOS
Son medicamentos o sustancias que ejercen efectos similares o idnticos a los de
la epinefrina (adrenalina). Por ello, son un tipo de agentes simpaticomimticos.
Sus acciones son opuestas a las de los antagonistas adrenrgicos, es decir, los
beta bloqueantes y los alfa bloqueantes.
Su clasificacin es la siguiente:
Los agonistas de los receptores alfa y de los receptores beta. En total, son cinco
los receptores adrenrgicos: 1, 2, 1, 2, y 3. Estos agonistas varan en su
especificidad entre los receptores. Sin embargo, tambin existen otros
mecanismos de lograr agonismo adrenrgico. Debido a que la epinefrina y la
norepinefrina son sustancias de amplio espectro, los agonistas adrenrgicos
tienden a ser ms selectivos y, por ende, tiles en la farmacologa.
A continuacin describir cada agonista, su funcin y algunos de los frmacos
ms utilizados para realizar este efecto.
1. AGONISTA 1: estimulan la actividad de la fosfolipasa C y producen
vasoconstriccin y midriasis. Son usados como descongestionantes y en ciertos
exmenes del ojo. Algunos ejemplos incluyen:
*Metoxamina
*Metilnorepinefrina
*Oximetazolina
*Fenilefrina

2. AGONISTAS 2: inhiben la actividad de la enzima adenilil ciclasa, reduciendo
la activacin del sistema nervioso simptico mediada por el centro vasomotor de
la mdula espinal. Son usados como antihipertensivos, sedativos y en el
tratamiento de los sntomas por la abstinencia del licor y opios. Algunos
receptores 2 incluyen:
Clonidina (agonista mixto del receptor alfa2-adrenrgico e imidazolina-I1)
Guanfacina (preferencia por el adrenoreceptor del subtipo alfa2A)
Guanabenz (el agonista ms selectivo por el alfa2-adrenrgico, a diferencia de la
imidazolina-I1)
Guanoxabenz (metabolito del guanabenz)
Guanetidina (agonista del receptor alfa2-perifrico)

3. AGONISTAS 1: estimulan la actividad de la adenilil ciclasa, abriendo los
canales de calcio, produciendo estimulacin cardaca. Son usados en el
tratamiento del shock cardiognico, insuficiencia cardaca aguda y
bradiarritmias. Algunos ejemplos incluyen:

Dobutamina
Isoproterenol (tanto 1 como 2)

4. AGONISTAS 2 : estimulan la actividad de la adenilil ciclasa, cerrando los
canales de calcio, produciendo relajacin del msculo liso. Son usados en el
tratamiento del asma y la EPOC. Algunos ejemplos incluyen:
Salbutamol (albuterol en los Estados Unidos)
Fenoterol
Formoterol
Isoproterenol (1 y 2)
Metaproterenol
Salmeterol
Terbutalina
Clenbuterol
5. Existen otras acciones realizadas por sustancias naturales como la:
EFEDRINA: es un agonista adrenrgico (directo e indirecto), muy activo sobre los
receptores del sistema nervioso simptico, pero relativamente poco potente
como estimulante del sistema nervioso central. Esto se debe a la limitada
destreza de la molcula para atravesar la barrera hematoenceflica, en relacin
con otros compuestos similares como la anfetamina. Su accin teraputica se
encarga de broncodilatador adrenrgico, vasopresor. Estimula los receptores beta-
2 adrenrgicos en los pulmones para relajar el msculo liso bronquial; alivia el
broncoespasmo, aumenta la capacidad respiratoria, disminuye el volumen residual
y reduce la resistencia de las vas areas. Puede tambin inhibir la liberacin de
histamina inducida por antgenos. Como vasopresor acta en los receptores beta-
1 adrenrgicos en el corazn y aumenta la fuerza de contraccin mediante un
efecto inotrpico positivo en el miocardio. Esta accin aumenta el gasto cardaco y
eleva la presin arterial sistlica y, habitualmente, la diastlica. Acta sobre los
receptores alfa adrenrgicos de los vasos sanguneos de la mucosa nasal;
produce vasoconstriccin, lo que origina descongestin nasal. Estimula la corteza
cerebral y los centros subcorticales, y muestra sus efectos en la narcolepsia y
estados depresivos, aunque estos usos estn acotados por la excesiva activacin
simpaticomimtica perifrica que produce la efedrina, respecto de otros
estimulantes ms selectivos sobre el sistema nervioso central.


ANTAGONISTAS ADRENERGICOS

Las drogas que antagonizan las acciones directas de los simpaticomimticos se
pueden clasificar en dos grupos, segn el tipo de receptor sobre el que acten, en
drogas bloqueantes de los receptores y drogas bloqueantes de los receptores .
BLOQUEANTES : Los ms clsicos son los bloqueantes naturales derivados de
los alcaloides del cornezuelo de centeno (ergotamina)
Existen bloqueantes sintticos no selectivos, reversibles (fentolamina) e
irreversibles (la betahaloalquilamina fenoxibenzamina)
Los bloqueantes selectivos de los receptores alfa1 estn representados por el
prazosn, terazosn, doxazosn y trimazosn, y los alfa2 por la yohimbina.

Estos actan de la siguiente manera:
Bloqueo competitivo de receptores alfa adrenrgicos
Bloqueo no competitivo de receptores alfa adrenrgicos: el caso de la
fenoxibenzamina.
Sus acciones cardiovasculares estn centradas en los siguientes mecanismos:
Dependen del tono simptico basal
Inhibicin de las respuestas presoras inducidas por aminas simpaticomimtica
selectivas y no selectivas: el fenmeno de reversin de la respuesta presora a la
adrenalina (Henry Dale).
El problema de la vasodilatacin, la hipotensin y la taquicardia refleja
(baroreceptores) con: Bloqueantes alfa no selectivos Bloqueante alfa1 selectivos.
El tema de los receptores presinpticos alfa2 (clonidina, yohimbina).

Tambin podemos encontrar acciones no cardiovasculares como las siguientes:
Relajacin de los msculos del trgono y esfnter vesicales, con disminucin de la
resistencia al flujo urinario (hipertrofia benigna de prstata).
Inyeccin intracavernosa de fentolamina (y administracin oral) para la disfuncin
erctil.
Efectos metablicos escasos. Seguridad a largo plazo de los alfa1-bloqueantes.

En la farmacocintica de estos frmacos podemos encontrar La absorcin errtica
y escasa por va oral de algunos. Otros, como los alfa1 selectivos y la fentolamina,
se absorben mejor por va oral.
Diferencias cinticas entre prazosn (biodisponibilidad del 50-70%, t1/2 de 2-3 h) y
terazosn (biodisponibilidad mayor del 90%, mayor solubilidad acuosa y t1/2 de 12
horas, con duracin de accin mayor de 18 h). El doxazosn puede durar hasta 36
h.
Como todo frmaco estos tienen efectos adversos como los que menciono a
continuacin:
Hipotensin postural: efecto primera dosis del prazosin.
Ergotismo: vasoconstriccin directa de la fibra lisa vascular.

INDICACIONES
Hipertensin arterial (prazosn)
Feocromocitoma (fentolamina, fenoxibenzamina)
Shock
Migraa (ergotamina)
Enfermedades vasoespsticas perifricas
Hipertrofia benigna de prstata (prazosn, terazosn, alfuzosn)
(Receptores alfa1A de la prstata)

BLOQUEANTES

No selectivos (propranolol, alprenolol, pindolol, sotalol, nadolol el cual es ms
potente que el propranolol).
Cardioselectivos beta1 (atenolol, metoprolol)
Bloqueantes alfa y beta: labetalol
ASI (actividad simpatimomimtica intrnseca: acebutolol, oxprenolol)
Beta-bloqueantes vasodilatadores (carvedilol)

En general los bloqueantes beta adrenrgicos son utilizados en el tratamiento de
trastornos cardiovasculares que incluye hipertensin, angina de pecho y arritmias
cardiacas. El propranolol fue el primer antagonista beta adrenrgico que se utiliz
en la clnica. Es un agente bloqueador beta de actividad no selectiva y es capaz
de bloquear los receptores beta en el msculo liso bronquial y esqueltico,
interfiriendo as en la broncodilatacin producida por la epinefrina y otras aminas
simpaticomimticas, de este modo el propranolol no debe ser utilizado en
pacientes con asma y tampoco en diabticos por la gluclisis que produce.
A continuacin explico la funcin de cada uno de los beta bloqueadores
adrenrgicos y su respectiva farmacocintica:

PROPRANOLOL:
Es un frmaco beta bloqueador no selectivo utilizado muy ampliamente en el
tratamiento de la hipertensin arterial, la profilaxis de la angina de pecho y en el
control de ciertas arritmias cardiacas. Acta bloqueando competitivamente los
receptores beta 1 y beta 2 adrenrgicos y no presenta accin agonista intrnseca.
En el sistema cardiovascular: disminuye la frecuencia y el gasto cardiaco,
disminuye la presin arterial ligeramente en los sujetos en reposo. La resistencia
perifrica aumenta a consecuencia de los reflejos simpticos compensadores.
Otros efectos del propranolol es aumentar la resistencia de las vas areas ya que
inhiben la respuesta adrenrgica beta 2 de la norepinefrina en los bronquios,
tambin antagonizan la relajacin uterina producida por las catecolaminas, de
igual manera bloquea el efecto antianafilactico de las catecolaminas sobre la
liberacin de histamina en el pulmn sensibilizado, inducida por un antgeno.
Toxicidad, efectos secundarios y precauciones: una depresin cardiaca seria con
el tratamiento con propranolol no es comn, pero la insuficiencia cardiaca puede
desarrollarse en forma sbita o lenta en corazones seriamente comprometidos por
enfermedad o por otras drogas (anestsicos). Debe darse con cuidado en
pacientes con funcin cardiaca inadecuada, y si estn tratados con digital Los
pacientes hipertensos que dejan de tomar bruscamente propranolol pueden
presentar un rebote de riesgo mortal con presiones arteriales que pueden llegar
algunas veces a sobrepasar los valores previos al tratamiento, por lo tanto, si se
va a cesar un tratamiento con propranolol se recomienda hacerlo en forma
gradual. El asma es una contraindicacin del uso del propranolol, de la misma
manera los pacientes diabticos tratados con insulina o hipoglucemiantes orales.
Los efectos secundarios que se presentan en el uso del propranolol son las
nuseas, vmitos, diarreas leves y estreimiento, otras veces se presentan,
pesadillas, insomnio, alucinaciones y depresin. Usos teraputicos: El propranolol
tiene una indicacin teraputica en los cuadros de hipertensin arterial, arritmias
supraventriculares y ventriculares, y en las intoxicaciones con digital, adems se lo
utiliza cuando se quiere reducir las probabilidades de un nuevo infarto de
miocardio, en el hipertiroidismo, para inhibir las crisis de tirotoxicosis, en la
ansiedad crnica y como profilaxis de la jaqueca.

NALODOL:
Tambin es un agente bloqueador de los receptores beta no selectivo, no se
metaboliza y es excretado sin cambios en la orina, su vida media es de 16 a 20
horas, puede administrarse una vez por da en el tratamiento de la hipertensin,
no estabiliza las membranas como el propranolol ni tiene actividad agonista
parcial, no atraviesa la barrera hematoenceflica y por lo dems presenta las
mismas propiedades del propranolol. El nalodol (Corgard) se presenta en forma de
tabletas para la va oral de 40 a 160 mg y la dosis es de 40 mg una vez por da,
ajustndose entre incrementos de 40 y 80 mg hasta obtener los efectos deseados,
pudiendo llega hasta 320 a 640 mg por da en casos graves de hipertensin
arterial o en angina de pecho.

IMOLOL: es otro antagonista beta no selectivo, cinco a diez veces m s potente que
el propranolol, se absorbe bien por va oral y su vida media es de unas 4 horas, es
muy efectivo en el tratamiento de la hipertensin, angina de pecho y como
preventivo de un nuevo infarto. El maleato de timolol (Blocadren) se vende en
forma de tabletas de 5, 10, y 20 mg y su dosis es de 10 mg dos veces por da,
pudiendo llegar hasta 40 mg por da como dosis de mantenimiento habitual.
Tambin se presenta en forma de gotas oftlmicas (Timoptic) para el tratamiento
del glaucoma crnico de Angulo abierto, ya que se ha demostrado que los
betabloqueadores disminuyen la presin intraocular por disminucin de la
produccin del humor acuoso.

PINDOLOL: beta adrenrgico no selectivo con actividad agonista parcial, sin
actividad estabilizadora de las membranas en dosis habituales, se absorbe bien
por va oral, tiene una vida media de 3 a 4 horas y es utilizado como agente
antihipertensivo con una potencia muy similar a los dems betabloqueadores no
selectivos. El pindolol (Visken) se presenta en forma de tabletas de 5 a 10 mg y la
dosis recomendada es de 10 mg dos veces por da o de 5 mg tres veces al da. La
dosis mxima recomendad es de 60 mg por da.

Bloqueantes adrenrgicos beta selectivos: Estos agentes se caracterizan por
presentar una selectividad por los receptores beta 1, es decir que son
Cardioselectivos:

METOPROLOL: es un antagonista adrenrgico beta 1 selectivo, desprovista de
actividad agonista. Inhibe las respuestas inotrpicas y cronotrpicas del
isoproterenol, reduce la actividad de la renina plasmtica en pacientes hipertensos
y en sujetos normales, observacin que forma parte de la evidencia de que las
clulas yuxtaglomerulares del rin presentan receptores adrenrgicos tipo beta 1.
El metoprolol se absorbe bien por en el tracto gastrointestinal y est sometido
igual que el propranolol al metabolismo de primer paso en el hgado. tiene una
vida media de 3 horas, se metaboliza ampliamente en el organismo y slo se
excreta un 10% sin cambios. Toxicidad, efectos secundarios y precauciones:
Puede causar una cierta disminucin del volumen espiratorio forzado en pacientes
asmticos, pero su efecto es menor que el producido por el propranolol. No inhibe
mayormente la broncodilatacin inducida por el isoproterenol. Entre los efectos
secundarios se presenta la fatiga, cefaleas, mareos e insomnio, no debe usarse si
existe insuficiencia cardiaca congestiva. El tartrato de metoprolol (Lopresor) se
vende en tabletas orales de 50 a 100 mg y la dosis es de 100 mg por da pudiendo
llegar hasta un mximo de 450 mg por da. En forma inyectable se presenta para
el tratamiento del infarto de miocardio, tres inyecciones de 5 mg en bolo cada 2
minutos cuando el estado hemodin mico del paciente ha sido estabilizado. El
paciente debe estar siempre monitorizado.
Atenolol: es un agente bloqueador selectivo de los receptores adrenrgicos beta 1,
con poco efecto agonista y casi nada estabilizador de membranas, no se absorbe
totalmente por va oral, se excreta en gran parte modificado en la orina y su vida
plasmtica media es de 6 a 8 horas, pero su efecto antihipertensivo dura m s
tiempo. Sus caractersticas son muy parecidas al metoprolol y el atenolol se
presenta en tabletas de 50 a 100 mg, se administra por va oral y la dosis es de 50
mg una vez por da pudiendo llegar hasta una dosis de 100 mg por da.

CELIPROLOL: nuevo bloqueador cardioselectivo de los receptores beta y
vasodilatador para el tratamiento de los casos leves a moderados de hipertensin
arterial tan solo con una dosis diaria. el celiprolol bloquea los receptores B1
cardiacos con un efecto menor sobre los receptores B2 bronquiales. El bloqueo
dura unas 24 hs. despus de una dosis oral de 400 mg y a igual que el pindolol y
el acebutol el celiprolol ejerce un efecto agonista parcial en la actividad de los
receptores beta que limita la bradicardia en reposo, de la misma manera reduce la
resistencia vascular perifrica al estimular los receptores B2 aunque tambin
podra actuar relajando directamente los msculos lisos vasculares. El celiprolol es
bastante hidrosoluble por lo que su penetracin en el SNC es mnima, se absorbe
muy rpidamente, su periodo de semidesintegracin es de 4 a 5 hs. y se excreta
por igual en la orina y con las heces. Efectos cardiovasculares: en una sola dosis
diaria de 400 mg. baja la presin arterial de los pacientes hipertensos ppor su
accin vasodilatadora y no por una disminucin del gasto cardiaco, desacelera
menos al corazn. Los efectos indeseables del celiprolol se presentan con menos
frecuencia que con el resto de los beta bloqueadores y entre ellos figuran: fatiga,
mareos y cefaleas.

3.- Bloqueantes de los receptores alfa y beta adrenrgicos:

LABETALOL: es un frmaco antihipertensivo de propiedades farmacolgicas
exclusivas y complejas con actividad bloqueadora beta no selectiva y bolqueadora
alfa 1 selectiva, inhibe la recaptacin de norepinefrina en las terminaciones
nerviosas, el labetalol es unas 10 veces menos potente que la fentolamina para
bloquear los alfareceptores y unas tres veces menos potente que el propranolol
para bloquear los betareceptores. El labetalol se absorbe bien por la va oral y su
vida media en el plasma es de unas 5 horas, el 5% de la droga es excreta por la
orina sin modificaciones. Es una potente droga antihipertensiva por lo que ha sido
utilizado en el tratamiento de la hipertensin esencial y ultimanete en el
tratamiento de la hipertensin del embarazo. Se presenta en forma de tabletas de
clorhidrato de labetalol (Normodine, Trandete) de 200 y 300 mg y la dosis usual es
de 100 mg dos veces por da.


Por eso es muy importante saber manejar estos farmacos debido a que si
cometemos un error nos podemos meter en graves problemas solo por no haber
aprendido bien las cosas....

hagomos bien todo y estoy segura que la gente nos querra.

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