Laboratorio Bioqumica Ped.

En Ciencias con Mencin

2 Semestre 2014 UC del Maule.
EXTRACCIN DE ADN EN CULUAS VEGETALES Y ANIMALES
OBJETIVO
En esta prctica realizaremos la extraccin del ADN de clulas vegetales y animales,
poniendo de manifiesto su estructura fibrilar y el extraordinario grado de arrollamiento, que
permite el empaquetamiento en el ncleo celular de las largusimas cadenas de esta molcula.

INTRODUCCIN
Los cidos nucleicos son molculas orgnicas de gran importancia en la transmisin de los
caracteres hereditarios y en la sntesis de protenas. Los avances cientficos en este campo tienen
aplicaciones mdicas, agrcolas, ganaderas e industriales. Gran parte de las investigaciones en
biologa molecular actual se realizan sobre estas molculas orgnicas
A nivel qumico los cidos nucleicos son polmeros lineales de
nucletidos, quienes a su vez se componen de un azcar de cinco carbonos,
bases nitrogenadas y un grupo fosfato.
Existen dos tipos de cidos nucleicos:
ADN, polmero de desoxirribonucletidos
ARN, polmero de ribonucletidos
Los desoxirribonucletidos monofosfato de adenina, guanina, citosina y timina forman parte
del ADN. Los ribonucletidos monofosfato de adenina, guanina, citosina y uracilo forman parte de
los ARN.
El ADN contiene la informacin gentica que determina el desarrollo del individuo y sus
caractersticas; esto es as en todas las especies, salvo en algunos virus que contienen la
informacin gentica en el ARN.
La estructura del modelo actual de ADN fue descrita por primera vez por los investigadores F.
Crick y J. Watson, en 1953, quienes postularon que dos molculas de ADN, conformadas, cada
una, por una cadena de polinucleotidos, se enrollaban bajo un mismo eje formando una hlice con
capacidad de rotacin.
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En las clulas eucariotas, el ADN se encuentra en el ncleo, y una pequea cantidad en las
mitocondrias y los cloroplastos. En las clulas procariotas, la molcula de ADN es circular, y
adems, estas clulas pueden tener otras molculas ms pequeas de ADN llamadas plsmidos.
El ARN es un polirribonucletido formado fundamentalmente por los ribonucletidos de
adenina, guanina, citosina y uracilo (en vez de la timina del ADN). La pentosa es la ribosa, que
tiene un grupo hidroxilo en el carbono 2'.
La interaccin de los cidos nucleicos en la expresin de la informacin gentica queda
expresada en lo que se conoce como dogma central de la biologa molecular.






FUNDAMENTO
El ADN se encuentra en el interior del ncleo celular, disperso y muy replegado, unido a
protenas para formar la cromatina. Para poder extraerlo es necesario romper las clulas y separar
el ncleo para despus romper ste y liberar el ADN. Una vez liberado se debe separar de las
protenas y precipitarlo para su extraccin.

EXTRACCIN DE ADN DE CLULAS DE LA MUCOSA BUCAL PRESENTES EN LA SALIVA
MATERIALES
- Alcohol de 90 fro.
- Un tubo de ensayo.
- Varilla de vidrio.
- Vaso de precipitados de 50 mL
- Solucin para extraccin (10 mL)

PROCEDIMIENTO
1. Preparar un tubo de ensayo con alcohol etlico de 96.
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2. Poner un poco de agua en un vaso y enjuagarse la boca enrgicamente durante al menos
medio minuto para arrastrar el mayor nmero posible de clulas de descamacin de la mucosa
bucal (antes de hacerlo conviene haber tragado saliva para eliminar la accin de los enzimas
contenidos en ella)
3. Al vaso con la solucin de saliva, adicionar 15 mL de la solucin de extraccin y remover con la
varilla de vidrio suavemente durante varios minutos sin que se forme espuma.
4. Aadir la solucin suavemente al tubo de ensayo que contiene el alcohol dejndola resbalar
por la pared del tubo inclinado. El filtrado, ms denso que el alcohol y algo turbio se deposita en el
fondo del tubo. Dejar reposar durante 2 3 minutos sin moverlo en absoluto. El alcohol formar
un sobrenadante por encima de la fase acuosa en la que se encuentra el ADN en disolucin
provocando que ste precipite.
5. Esperar unos minutos mientras el ADN precipita en la interfase alcohol-agua formando una
masa blanquecina que asciende lentamente formando un frumo de aspecto algodonoso.

EXTRACCIN DE ADN EN CLULAS VEGETALES
MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES:
Para la extraccin de ADN:

- 2 a 3 frutillas congeladas desde al menos una noche antes.
- 20 mL de alcohol etlico (etanol) 90 fro (se recomienda refrigerar desde una noche
previa del experimento).
- 1 bolsa pequea de plstico con cierre (tipo Ziplock)
- 9 tubos de ensayo
- 1 gradilla
- 1 probeta de 50 mL
- 1 vaso de precipitado 100 ml
- 1 embudo pequeo
- 1 pipeta de 5 mL
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- 1 2 crculos de papel filtro
- 2 palillos largos o varillas de vidrio
- Solucin para extraccin (30 mL)
- Cubos de hielo para enfriar los extractos y el alcohol
- Marcador permanente o masking tape para etiquetar los tubos de ensayo
- 1 cronmetro

Para observar las propiedades fisicoqumicas de los cidos nucleicos
- 3 tubos con las hebras de ADN obtenidas en la extraccin
- 10 mL de clara de huevo (2 huevos enteros por grupo)
- 10 ml de agua destilada
- 10 ml de HCl 0.1 N
- 10 ml de reactivo biuret
- 3 tubos de ensayo
- 4 pipetas
- Mechero y trpode
- 1 gradilla para tubos de ensayo
- Vaso de precipitado de 500 mL
- Termmetro
- Pinza para tubo de ensayo
- 1 cronmetro
PROCEDIMIENTO:
I.- Extraccin de ADN
1.- Tiempo antes de comenzar la prctica congelar las frutillas y enfriar el alcohol (es mejor
meterlo al refrigerador una noche antes de su uso).
2.- Colocar las frutillas en una bolsa plstica, agregar 20 mL de solucin de extraccin, sacar todo
el aire de la bolsa y cerrar sta.
3.- Machacar las frutillas con los dedos durante 5 minutos.
4.- Coloca la bolsa al hielo por un minuto y repetir el machacado por otros 5 minutos.
5.- Filtrar el machacado usando un embudo y papel filtro de filtrado rpido, recibir el lquido en un
probeta o vaso precipitado.
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6.- Colocar 2 mL de filtrado en un tubo de ensayo cuidadosamente agregar un volumen igual de
alcohol al 90% fro lentamente sin mezclar. Dejar reposar el tubo durante 5 minutos.
Es importante mantener el alcohol fro en la mesa de trabajo, colocando ste en un bao de hielo.
7.- Transcurrido ese tiempo notars que aparece una sustancia viscosa. Introduce el palito de
madera y varilla y scalo a la superficie.
8.- Este es el ADN de las frutillas!
9.- Repetir 3 veces la obtencin de la hebra de ADN y colocar cada uno en un tubo de ensayo (del
punto 5 al 8). Rotular cada tubo con la letra a, estas muestras de ADN se usar para los siguientes
ensayos.
10.- Elimina los restos de alcohol mediante decantacin. Ten cuidado ya que es fcil perder la
muestra.

II.- Ensayos para observar las propiedades fisicoqumicas de los cidos nucleicos.
A continuacin comprobaremos que la muestra obtenida es ADN con base en algunas de
sus propiedades fisicoqumicas. Utilizaremos la muestra de ADN obtenida, as como clara de huevo
como un ejemplo de protena (albmina). Estos dos tipos de muestra usaremos en los prximos
ensayos.
Antes de empezar las pruebas coloca 0,5 mL de clara de huevo en 3 tubos de ensayo
rotulados con la letra b.

II A.- Efecto de la temperatura.
1.- A una muestra de ADN contenida en un tubo de ensayo agregar 2 mL de agua destilada. Hacer
lo mismo con la muestra de 0.5 mL de clara de huevo y agitar levemente ambos tubos.
2.- Colocar los 2 tubos dentro de un vaso de precipitado con agua hirviendo durante 2 minutos,
sacar del bao con ayuda de una pinza y agitar levemente.
3.- Observar cuidadosamente los dos tubos notas alguna diferencia? Como te habrs dado cuenta
se observa que el ADN se ha disuelto (tubo a) y la clara de huevo ha formado un cogulo de color
blanco (tubo b)




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II B.- Efecto de un medio cido.
1.- En un tubo de ensayo conteniendo una muestra de ADN agregar 2ml de HCl 0,1 N y agitar
vigorosamente por 2 minutos. Esta operacin puede efectuarse fcilmente sujetando el tubo por
la parte superior con una mano y golpeando con el dedo ndice de la otra mano.
2.- A una muestra de 0,5 mL de clara de huevo agregar 2 mL de HCl 0,1 N y agitar vigorosamente
durante 2 minutos.
3.- Compara los dos tubos e identifica en qu son diferentes las soluciones que contienen. Se
observa que el ADN se ha disuelto (tubo a) y la clara de huevo en el tubo b a formado varios
agregados blancos en medio de un lquido incoloro (coagulacin de la protena)

III C.- Determinacin cualitativa de protenas
1.- En un tubo de ensayo conteniendo una muestra de ADN agregar 5 gotas de reactivo Biuret y
agitar.
2.- En otro tubo, conteniendo una muestra de 0,5 mL de clara de huevo agregar 5 gotas de
reactivo Biuret y agitar.
3.- Comparar los resultados obtenidos en cada tubo. En el tubo a (muestra de ADN) el color azul
del reactivo Biuret permanece debido a que en la muestra no hay presencia de protenas en
cambio en el tubo b (clara de huevo) el lquido presenta un color violeta debido a la presencia de
protenas. En este caso la albmina de la clara de huevo.


CUESTIONARIO

1.- Por qu es necesario moler o machacar las fresas?

2.- investiga la funcin de cada una de las sustancias en la extraccin del ADN.
SUSTANCIA FUNCIN
Detergente
Sal
Alcohol



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3.- Por qu ser importante realizar el experimento en un bao de hielo?

4.- Qu funcin tiene llevar a cabo la filtracin?

5.- Por qu se utiliza el reactivo Biuret para la identificacin de protenas?