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Revue de gnie industriel 2009, 4, 25-39

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26
Revue de
Gnie Industriel
ISSN 1313-8871
http://www.revue-genie-industriel.info
Evaluation de lactivit antioxydant des composs phnoliques par la
ractivit avec le radical libre DPPH
Cristina Popovici
1
, Ilonka Saykova
2*
, Bartek Tylkowski
2

1
Universit technique de Moldova, Kisinew, Moldavie
2
Universit de technologie chimique et de mtallurgie, Sofia, Bulgarie
* Auteur correspondant: Ilona Saykova; Universit de technologie chimique et de mtallurgie, bul.
Kliment Ohridski 8, 1756 Sofia, Bulgarie ; e-mail : i.seikova@uctm.edu
Rvis et accept le 20 novembre 2009 / Disponible sur Internet le 20 dcembre 2009
Rsum
Ce travail sinscrit dans le cadre de la valorisation des extraits des ppins de raisin en
tant quantioxydants. La mthode applique pour mesurer une activit antioxydant est
celle du pigeage des radicaux libres l'aide du DPPH Les facteurs qui influencent
la ractivit au radical libre DPPH et les protocoles publis ont t discuts. des
fins comparatives sont testes des solutions modles de composs appartenant des
familles phnoliques distinctes (solutions dacide gallique, dpicathine, dacide
tannique et de leurs mlanges). Les proprits antioxydantes ont t mesures et
mises en vidence par la concentration efficace CE
50
et par la cintique de rduction.
Les rsultats indiquent une variation de CE
50
de 30.886.6 mg antioxydant/g DPPH


et des temps de raction T
CE50
entre 5 et 30 minutes, corrls avec leur structure
chimique et la teneur en composs phnoliques.
Abstract
This works is inscribed in the frame of valorization of grape seeds extracts as
antioxidants. The method applied to measure the antioxidant activity was the free
radical scavenging by using DPPH. The factors that influence DPPH radical
reduction kinetics and the analytical protocols published are discussed. For
comparison purposes, model solutions of compounds of distinct phenolic families
(single solutions of gallic acid, epicatechin, tannic acid and their mixtures) were
tested. The antioxidant proprieties were measured and evidenced in terms of their
efficient concentration EC
50
, as well as their reduction kinetics. The results indicate a
variation of EC
50
between 30.886.6 mg antioxidant/g DPPH and times of reaction
T
EC50
from 5 to 30 minutes, in correlation with their chemical structure and the
content of phenolic compounds.
Mots-cls: antioxydant, polyphnols, DPPH, activit anti-radicalaire, cintique de
rduction
Keywords: antioxidant, polyphenols, DPPH, radical scavenger, reduction kinetics

Introduction
Ces dernires annes, lintrt port aux antioxydants naturels, en relation avec leurs
proprits thrapeutiques, a augment considrablement. Des recherches scientifiques
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dans diverses spcialits ont t dveloppes pour lextraction, lidentification et la
quantification de ces composs partir de plusieurs substances naturelles savoir, les
plantes mdicinales et les produits agroalimentaires [1,2,3].
Lactivit antioxydante dun compos correspond sa capacit rsister loxydation.
Les antioxydants les plus connus sont le -carotne (provitamine A), lacide ascorbique
(vitamine C), le tocophrol (vitamine E) ainsi que les composs phnoliques. En effet, la
plupart des antioxydants de synthse ou dorigine naturelle possdent des groupes
hydroxyphnoliques dans leurs structures et les proprits antioxydantes sont attribues
en partie, la capacit de ces composs naturels piger les radicaux libres tels que les
radicaux hydroxyles (OH) et superoxydes (O
2
) [4-7].
Plusieurs mthodes sont utilises pour valuer, in vitro et in vivo, lactivit antioxydante
par pigeage de radicaux diffrents, comme les peroxydes ROO par les mthodes
ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) et TRAP (Total Radical-Trapping
Antioxidant Parameter) [8] ; les ions ferriques par la mthode FRAP (Ferric ion
Reducing Antioxidant Parameter) [9]; ou les radicaux ABTS (sel dammonium de lacide
2,2-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonique) [10], ainsi que la mthode utilisant le
radical libre DPPH (diphnyl-picrylhydrazyle) [11].
Compte tenu de la complexit des processus doxydation et la nature diversifie des
antioxydants, avec des composants la fois hydrophiles et hydrophobes, il ny a pas une
mthode universelle par laquelle lactivit antioxydante peut tre mesure
quantitativement dune faon bien prcise. Le plus souvent il faut combiner les rponses
de tests diffrents et complmentaires pour avoir une indication sur la capacit
antioxydante de lchantillon tester [12,13,14].
De point de vue mthodologique, le test au radical libre DPPH est recommand pour
des composs contenant SH
-
, NH
-
et OH
-
groupes [15]. Il seffectue temprature
ambiante, ceci permettant dliminer tout risque de dgradation thermique des
molcules thermolabiles. Le test est largement utilis au niveau de lvolution des
extraits hydrophiles en provenance de th vert, des jus de fruits et de raisins, ppins et
pulpes, trs riches en composs phnoliques [16-27].
Dans ce cadre, ltude sest intresse lvaluation des activits antioxydantes
dextraits de ppins de raisin en vue de leur valorisation en tant quantioxydants. Une
tude comparative a t ralise partir des protocoles analytiques publis afin
dvaluer leffet des facteurs qui influent sur la mthode de mesure de la capacit anti-
radicalaire laide du DPPH. Comme exemple dillustration les cintiques de rduction
du DPPH ragissant avec lacide gallique, lpicatchine et lacide tannique ont t
tudies afin destimer la diffrence defficacit entre diffrentes familles de composs
phnoliques prsents dans les ppins de raisins.
Lobjectif de ltude est de proposer une technique rapide et reproductible permetant de
comparer les extraits vis--vis de leur action sur les phnomnes du pigage des
radicaux libres. Cette classification permettra de choisir les conditions les plus
adquates lors des diffrentes tapes de la valorisation de la matire premire:
extraction, purification et concentration en fonction dun critre de qualit optimal :
dune part la teneur en composs phnoliques et paralllement, leur activit anti-
radicalaire.
Principe de la methode
Raction entre le radical libre DPPH et lantioxydant
Le compos chimique 2,2-diphnyl-1-picrylhydrazyle (,-diphnyl--picrylhydrazyl) fut
lun des premiers radicaux libres utilis pour tudier la relation structure-activit
antioxydant des composs phnoliques [28,29]. Il possde un lectron non appari sur
un atome du pont dazote (Fig.1). Du fait de cette dlocalisation, les molcules du
radical ne forment pas des dimres, i.e. DPPH reste dans sa forme monomre
relativement stable temprature ordinaire. La dlocalisation provoque aussi la couleur
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bleue bien caractristique de la solution de DPPH. La mesure de lefficacit dun
antioxydant se fait en mesurant la diminution de la coloration bleue, due une
recombinaison des radicaux DPPH, mesurable par spectrophotomtrie 515-518 nm.

Figure 1. Structure chimique du radical libre DPPH (2,2 DiPhenyle-1-Picryl-Hydrazyle)
Le pigeage des radicaux libres par des antioxydants est tributaire de deux types de
mcanismes: (i) la libration de latome dhydrogne du groupement hydroxyle
(cintique rapide de certaines acides et drives phnoliques) ; (ii) la libration dun
lectron (cintique lente des drives glycosyles et des anthocyanes) [3,18].
Dans le cas des composs phnoliques (-OH), le mcanisme principal daction est le
pigeage des radicaux libres par le transfert de latome H sur le DPPH alors transform
en une molcule stable DPPHH [30,31] :
DPPH+ OH DPPHH + O
Plusieurs voies ractionnelles sont alors possibles qui forment des structures plus au
moins stables :
O+ O O-O
DPPH+ O O-DPPH
O (semi-quinone)
- H
=O (quinone)
La capacit anti-radicalaire (capacit fixer des radicaux libres, donc arrter la
propagation de la raction en chane) ne peut tre mesure directement, mais par
contrle de leffet de la ractivit. Plusieurs facteurs influent sur le potentiel antioxydant
et la cintique de rduction, notamment les conditions de la raction (temps, rapport
Antioxydant/DPPH, type de solvants, pH) et le profil phnolique en particulier [30].
Evaluation du potentiel anti-radicalaire
Pour lvaluation de lactivit antioxydante, deux approches sont appliques : dune part,
la dtermination de la rduction relative du radical DPPH un temps de rfrence ou la
dtermination de la quantit dantioxydant ncessaire pour rduire 50 % de DPPH et
dautre part, le suivi de la cintique de la rduction [31,32].
Dans la premire approche, lactivit est dfinie par lindice de la rduction de lactivit
anti-radicalaire en pourcentage %RSA (Radical Scavenger Activity), o labsorbance du
mlange ractionnel qui contient le radical libre et lchantillon de lantioxydant est
relie avec labsorbance du mlange sans aucun antioxydant (solution tmoin ou
contrle) un temps t : [%RSA=(Abs
contrle
Abs
t
)/ Abs
contrle
x 100%].
Comme il nexiste pas de mesure absolue de la capacit antioxydante dun compos, les
rsultats sont souvent ports par rapport un antioxydant de rfrence, comme lacide
ascorbique (vitamine C), les antioxydants synthtiques BHT (butyl-hydroxy-tolune) ou
le Trolox

(acide-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylique), dont la
structure molculaire cyclique est similaire celle de la vitamine E [30].
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Lindice relative %RSA montre seulement la capacit de lchantillon, une
concentration fixe, de rduire ou non les radicaux et dans beaucoup de cas,
laugmentation de la concentration de lantioxydant amne laugmentation de ces
indices relatifs [31].
Pour saffranchir de linfluence de la concentration, dans la majorit des tudes, la
ractivit est estime par la concentration effective CE
50
(ou linverse 1/CE
50
) de
lantioxydant, qui correspond une rduction de 50% de lactivit (de labsorbance) du
DPPH dans le milieu ractionnel. La capacit antioxydante d'un compos est d'autant
plus leve que sa CE
50
est petite. Lindice CE
50
montre les concentrations de
lantioxydant qui sont ncessaires pour faire dcrotre la concentration initiale du
DPPH avec 50% (exprime en mol Antioxydant/mol DPPH ou mg Antioxydant/g
DPPH), mais ne prennent pas en considration linfluence de la concentration sur le
temps de la raction [31].
Pour mieux caractriser le pouvoir anti-radicalaire, dans la deuxime approche des
paramtres cintiques sont introduits, tels que le temps T
EC50
ncessaire pour atteindre
lquilibre CE
50
, la constante de vitesse de la raction ou le coefficient directeur de la
courbe cintique [32,33,34]. Lestimation de T
CE50
permet dintroduire la classification
suivante: T
CE50
< 5 min (raction rapide), 530 min (raction intermdiaire) et T
CE50
>
30 min (raction lente) [29,32]. Lindice de lefficacit anti-radicalaire [EAR
=1/(CE
50
.T
CE50
)] relie la concentration du DPPH et le temps T
EC50
dans lessai avec la
concentration effective CE
50
de lchantillon, et rsulte dans un paramtre constant
pour chaque solution ou extrait.
Activits anti-radicalaires dextraits de ppins de raisin (Vitis Vinifera L.)
Une tude comparative des protocoles analytiques publis a t ralise, focalise sur
lvaluation des extraits issus des ppins de raisin (Tableau 1). Il est noter que les
ppins de raisin prsentent de trs fortes teneurs en composs phnoliques, qui peuvent
se regrouper de la sorte: (i) les composs non-flavonodes dont font partie les acides
phnoliques (ex. acide gallique) ; (ii) les flavonodes qui comprennent les flavonols, les
anthocyanes responsables de la couleur et les flavan-3-ols dont les molcules de
catchine et de lpicatchine et leurs drives glycosyles sont trs abondantes ; (iii)
les tannins condenss avec un degr de polymrisation faible, infrieur 3
(procyanidines dimres et trimres et leurs esters galliques) [24].
Bien que lextraction partir des ppins de raisin soit extrmement tudie, il est
relativement difficile de comparer les donnes de la littrature (Tableau 1). En effet, il
existe une diversit des varits, maturit, conditions climatiques et conditions de
stockage des raisin et de leur dchets, dune part et une assez grande variation dans les
procds dextraction dautre part : type de solvants (eau, thanol, mthanol, actone,
thyle actate), temprature (20-60C) et temps dextraction (de 5 minutes 24 heures).
Les tests au DPPH fournis dans la littrature sont bass sur le mme principe que celui
dcrit par Brand-Williams et al. [29], mais les protocoles analytiques diffrent dans
plusieurs paramtres. Dans la mthode originale des solutions de DPPH 50-100 M
(les absorbances 515 nm autour de 1) et un temps de raction de 30 minutes ont t
recommands, et ces conditions sont utilises dans plusieurs travaux rcents
[14,23,25,38,39]. En mme temps, des solutions de DPPH variant de 25 600 M
(faites le plus souvent avec du mthanol ou thanol) et des temps de raction plus courts
(5, 10 et 20 min) ou plus longs (60 min, 100 min et 120 min) sont galement rapports
[24,35-38].
Toutefois il est important de noter que lutilisation de diffrents protocoles de mesure et
de diffrents indices dvaluation de lactivit antioxydante rduit la fiabilit dune
comparaison des valeurs.

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Tableau 1. Synthse de ltude bibliographique sur lactivit anti-radicalaire dextraits de ppins de raisin
Conditions du test au DPPH TCP
*

Conditions dextraction
Indice dvaluation de
lactivit anti-radicalaire
Ref.
V
AO
/V
DPPH
(25 M dans MeOH)
=1 ml/2 ml; t=5 min; =517 nm
6.71-7.04
(EtAc:Ac:Eau, 60C, 8h)
% RSA=90.2-92.6%
(des extraits de 25, 50 et
100 g /ml)
[35]
V
AO
/V
DPPH
(60 M dans MeOH)
=0.1ml/4 ml; t=30 min ; =517 nm
7.5-40.4
(70%EtOH, 70%Ac,
MeOH, H
2
O, 45C, 2h)
CE
50
=3.35-11.8 mg/ml [14]
V
AO
/V
DPPH
(120 M dans MeOH)
=0.1ml/3.9 ml; t=T
eq
; =515 nm
50.3-87.1
(70% EtOH acidifie,
T
amb
, 4h)
CE
50
=1.74 -3.49 g
GAE/ml
[24]
V
AO
/V
DPPH
(63 M dans MeOH)
=0.1ml/3.9 ml; t= T
eq
; =515 nm
79.2-154.6
(Ac 70%, 50C, 2h)
CE
50
=2.71-4.62 g/ml [25]
V
AO
/V
DPPH
(500 M dans EtOH)
=0.2ml/3 ml; t=15 min; =517 nm
12-20 (moyen de 9
varits)
(EtOH, 50-90C, 1-12 h)
CE
50
=22.9-32.90 g /ml [36]
V
AO
/V
DPPH
(600 M dans EtOH)
=0.025ml/0.975 ml;
t=120 min; =515 nm
1.43-22.28 (9 varits)
(EtOAc, T
amb
, 5 min)
CE
50
=0.24-0.92 g GAE
/g DPPH
[37]
V
AO
/V
DPPH
(63 M dans MeOH)
=0.025ml/0.975 ml
t=120 min; =515 nm
171.45 (moyen de 24
varits)
(H
2
0, T
amb
, 4 h)
CE
50
=0.66 g /g
DPPH
[38]
V
AO
/V
DPPH
(73 M dans MeOH)
=0.025ml/0.975 ml
t=30 min; =515 nm
79.57-137.56
(EtAc:Ac:H
2
0, T
amb
,
10min + macration)
A
AR
=4.57-8.85 mM
TRE/g MS
[23]
V
AO
/V
DPPH
(60 M dans MeOH)
=0.025ml/0.975 ml;
t=30 min; =515 nm
3.6-54.9 (moyen de 9
varits)
(MeOH acidifie, T
amb
,
12 h)
A
AR
=16.8 -92.2 mM
TRE/g MS
[39]
*Teneur en Composs Phnoliques, (mg Antioxydant/g matire sche)
Partie exprimentale
Matriaux
titre dexemple nous avons valu la capacit antioxydante de produits classiques,
reprsentatifs du profil phnolique des ppins de raisin [40]. Trois composs
phnoliques aux proprits diffrentes sont tests: acide gallique AG (M
w
=170.1 g mol
-
1
), picatchine EC (M
w
=290.3 g mol
-1
) et acide tannique AT (M
w
=1700.1 g mol
-1
).
Lacide gallique est prsent dans les ppins de raisin sous sa forme libre et surtout
faisant partie dune molcule phnolique (Fig.2). Lpicatchine, un stro-isomre de la
catchine, appartient la classe des flavan-3-ols. Ils possdent tous une mme structure
de base quinze atomes de carbone, constitue de deux cycles aromatiques (A et B) en
C6, relis par un htrocycle (C) en C3 (Fig. 2). Le deuxime cycle (B) se lie
lhtrocycle en position 2 ou 3. A ltat naturel, un ou plusieurs de leurs groupements
hydroxyles sont glycosyls. Ainsi, on retrouve les flavanols communs avec une
configuration -cis dans les positions 2,3 : picatchine, pigallocatchine, picatchine
gallate, pigallocatchine gallate, et avec une configuration -trans dans les positions
2,3 : catchine, gallocatchine, gallocatchine gallate.
Lacide tannique est un mlange complexe de gallotanins qui sont des esters de lacide
gallique ou/et de ses dimres dacide digallique et dacide ellagique avec des
monosaccharides, essentiellement la glucose. Il faut noter que la structure de lacide
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tannique nest pas bien tablie et elle peut contenir un nombre diffrent de
groupements gallyol glycosyls. Nanmoins, une structure de base (C
76
H
52
O
46
) similaire
sa masse molaire est prsente sur la Fig.2.


Acide gallique
(3,4,5-trihydroxybenzoique acide)


Epicatchine
(-) cis-3,3',4',5,7-penta-
hydroxyflavane

Acide tannique (acide gallotannique)
Figure 2. Structure chimique des composs phnoliques tests.
Activit anti-radicalaire par le test au DPPH
La solution de DPPH 63.4 M (25 mg dans 100 ml de mthanol 90%) est prpare
lavance (au moins 1-2 heures) car la solubilisation est difficile, et elle ne se conserve
pas plus de 4-5 jours -5C et lobscurit. Chaque compos phnolique a t dissous
dans une solution de 70% thanol-30% eau distille. Des volumes de 0.1 ml de la
solution tester ont t mlangs avec la solution du DPPH (3.9 ml; absorbance de
0.68 0.03 515 nm). Le mlange ractionnel est agit vigoureusement pendant 10
secondes. Le contenu est ensuite transfr dans un micro-tube de 4 ml et puis incub
dans la cavit du spectrophotomtre pendant le temps ncessaire pour atteindre le
plateau avec ce type dchantillon. A des intervalles de temps rguliers, les absorbances
515 nm ont t enregistres (contre le mthanol) sur un spectrophotomtre UV-VIS
Bueco S-22.
Les cart-types ont t calculs partir de trois sries dexpriences. Une erreur
moyenne de 3% sur les concentrations restant lquilibre [DPPH]
eq
a t obtenue.
Par contre, une incertitude de reproductibilit sur le temps atteindre lquilibre T
eq
et
les absorbances dans les premires secondes de la raction a t dtecte (dispersion
suprieure 10%)
Courbe dtalonnage de la solution du DPPH
Dans un premier temps, la stabilit et lintervalle de linarit des solutions du DPPH
ont t valus et les rsultats sont prsents sur la Fig.3. Cinq solutions du DPPH
faites dans du mthanol dans lintervalle 3.37-63.4 M (15-250 g/ml) ont t testes.
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32
0
0,042
0,08
0,159
0,321
0,646
Abs= 0,0108[DPPH] - 0,0004
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 10 20 30 40 50 60 70
Concentration de la solution du DPPH, uM
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
,

n
m

Figure 3. La courbe de calibration du DPPH.
Il ny a pas de diffrence significative dans labsorbance entre 0 et 90 min pour les
concentrations testes et une bonne linarit concentration - absorbance a t observe.
Ce rsultat est confirm dans des tudes prcdentes qui ont rapport que labsorbance
du DPPH 515 nm dans du mthanol a diminu avec 20% pour 120 min 25C et sous
laction de la lumire, pourtant, lobscurit, il na pas t observ un changement
significatif pendant 150 min [41].
Rsultats et discussion
Activit anti-radicalaire des composs phnoliques tests
La cintique de rduction du DPPH diffrentes concentrations en antioxydant test
est suivie au cours du temps jusqu lobtention dun plateau au temps final (T
eq
). La
rduction des radicaux libres est value par le rapport relatif de la concentration
rsiduelle [DPPH]
t=Teq
restant en fin de cintique par rapport sa concentration
initiale :
100
] [
] [
) %(
0
x
DPPH
DPPH
DPPH
t
eq
T t
R
=

=

(1)
Lindice %(DPPH)
R
diminue jusqu atteindre un plateau, cette cintique variant selon
lantioxydant utilis (Tableau 2).
Tableau 2. Test dactivit anti-radicalaire au DPPH
Concentration
mg /ml
mg Antioxydant/
g DPPH
mol Antioxydant/
mol DPPH
T
eq

min
%(DPPH)
R

lquilibre
Acide
gallique
(AG)
0.01875
0.0375
0.0750
0.150
20.44
40.93
81.83
158.53
0.0474
0.0949
0.1897
0.3675
20
30
30
3
75.10
53.56
10.63
2.93
Epi-
catchine
(EC)
0.03
0.06
0.1
0.5
20.32
40.63
108.37
541.99
0.0276
0.0552
0.1472
0.7362
60
60
25
5
85.17
69.99
39.59
8.11
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Acide
tannique
(AT)
0.07
0.13
0.19
0.5
75.88
140.55
205.22
538.9
0.0176
0.0326
0.0476
0.125
30
30
20
5
76.09
37.76
36.78
3.91
Les profils cintiques obtenus rvlent une activit anti-radicalaire fortement
dpendante des rapports molaires R
m
=[Antioxydant]/[DPPH]. Plus le compos
antioxydant est concentr, plus la baisse de labsorbance est importante. Les Figures 4
et 5 illustrent cet effet dans le cas de lacide gallique pour la variation de la
concentration entre 0.018750.15 mg/ml (rapports molaires R
m
=0.04740.3675 mol
AG/mol DPPH).
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60
temps, min
%
D
P
P
H
0.3675 0.1897 0.0949 0.0474 mol AG/mol DPPH

Figure 4. Effet des rapports molaires R
m
=[acide gallique]/[DPPH] sur la cintique de rduction.
Pour un R
m
=0.3675 mol AG/mol DPPH dans le mlange ractionnel, le radical est
presque totalement consomm. Le temps ncessaire pour atteindre lquilibre T
eq
varie
en fonction des concentrations entre 3 minutes (raction trs rapide) et 10-30 minutes
(ractions intermdiaires). A partir de la courbe traant la relation entre le pourcentage
de rduction %(DPPH)
R
et la teneur en compos phnolique on en dduit par
interpolation graphique la concentration CE
50
et le temps T
CE50
. La courbe est linaire
faibles concentrations et logarithmique concentrations leves (Fig.5). La
concentration efficace CE
50
dans le cas de lacide gallique est atteinte pour R
m
=0.1 mol
AG/mol DPPH (43.8 mg AG/g DPPH).
En considrant le pouvoir anti-radicalaire (1/CE
50
) et le temps de la raction T
CE50
pour
atteindre 50% rduction, lindice de lefficacit anti-radicalaire EAR a t calcul [32] :
50
1
50
) (
1
CE
T DPPH g AO mg CE
EAR

=
(2)
Les solutions testes ont t classes suivant la classification propose par Sanchez-
Moreno et all. [32] : lactivit anti-radicalaire est faible pour EAR<1.10
-3
, intermdiaire
entre 1.10
-3
5.10
-3
, leve entre 5.10
-3
10.10
-3
, et trs leve pour EAR>10.10
-3
.
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Figure 5. Dtermination de la concentration efficace CE
50
en cas de lacide gallique.
Les paramtres caractristiques de la cintique de rduction du DPPH pour les trois
composs tests sont prsents dans le Tableau 3. Parmi les trois composs, lacide
gallique reprsente le compos le plus actif, le pouvoir antioxydant de lpicatchine
nest pas significativement diffrent et lacide tannique a donn les valeurs environ 5
fois plus faibles. On obtient ainsi lordre dcroissant de lactivit antioxydante suivant
lindice EAR : acide gallique > picatchine > acide tannique.
Tableau 3. Paramtres caractristiques de la cintique de rduction du DPPH
CE
50

mg AO /ml
CE
50

mg AO/g DPPH
T
CE50

min
EAR (eq.2)
x 10
-3

Classification
AG 0.03 43.81.31 10 2.279 intermdiaire
EC 0.05 54.181.62 10 1.845 intermdiaire
AT 0.08 74.332.22 30 0.448 faible
Les rsultats obtenus sont similaires ceux obtenus par Sanchez-Moreno et son quipe
[32] : lacide gallique sest rlev avoir une activit anti-radicalaire intermdiaire
(CE
50
=26 mg AO/g DPPH, T
CE50
=14.69 min et EAR=2.62 x 10
-3
) et lacide tannique -
une activit faible (CE
50
=59 mg AO/g DPPH, T
CE50
=29.55 min et EAR=0.57 x 10
-3
)
[32].Dans ltude cite, cest lacide ascorbique qui a affich une activit anti-radiculaire
trs leve du fait du temps de raction trs court (CE
50
=76 mg AO/g DPPH,
T
CE50
=1.15 min et EAR=11.44 x 10
-3
) [32].
Ltude confirme galement une certaine corrlation entre la teneur en composs
phnoliques et lactivit anti-radicalaire, mise en vidence dans un grand nombre des
travaux [14,22,23,25,35,36]. Des tudes sur la relation entre la structure chimique des
composs phnoliques et leur pouvoir pigeur des radicaux libres ont montr que
lactivit anti-radicalaire est dpendante du nombre, de la position et de la nature des
substituants sur les cycles B et C (groupements hydroxyles, metaxyls, glycosyls) et le
degr de polymrisation [12,18,42,43].
Ces mmes paramtres sont lis galement la polarit des composs. Lactivit plus
leve de lacide gallique (groupement 3,4,5-tri-OH sur le cycle aromatique) peut tre
attribue sa plus forte polarit (log P=0.06) par rapport aux flavalodes (log P=0.8)
[27,42].
Lpicatchine, caractrise par la prsence du groupe 3-OH en combinaison avec la
double liaison C2-C3, est considre galement comme un antioxydant fort [43,44]. En
comparant la capacit piger les radicaux libres du DPPH par les catchines, Nanjo
et collaborateurs ont montr que la capacit de pigeage des catchines ne dpend pas
0
20
40
60
80
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4
rapport molaire, mol acide gallique/mol DPPH
%

(
D
P
P
H
)

r
e
s
i
d
u
e
l
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de leur stro-isomrie, mais les drivs galloyls de catchines sont des pigeurs plus
puissants que les non-galloyls dans lordre : gallocatchine gallate > pigallocatchine
gallate > picatchine gallate > picatchine = catchine [12,18]. Il y a une information
contradictoire propos du degr jusquau quel la polymrisation a un effet positif sur
lactivit anti-radicalaire. Des rsultats comparatifs montrent que lactivit antioxydante
crot un degr de polymrisation faible, infrieur 3 (Oligomeric Polyphenols
Compounds OPC) [24].
Interaction entre les antioxydants des solutions modles
Une srie de tests a t effectue pour valuer les interactions possibles entre les
antioxydants. Diffrentes combinaisons de composs phnoliques AG:EC, AG:AT et
AG:EC:AT des concentrations diffrentes ont t testes afin de couvrir la plage de la
rduction de DHHP. Chacun de ces composs , en fonction de ses diffrentes
proprits, contribue lactivit antioxydante des extraits suite des interactions plus
au moins complexes.
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60
temps, min
%
D
P
P
H
AG EC AT AG+EC AG+AT AG+EC+AT

Figure 6. Cintique de rduction de [DPPH] 63.4 M avec lacide gallique, lpicathine, lacide tannique et
leurs mlanges.
AG (0.1 mg/ml) ; EC (0.5 mg/ml) ; TA (0.5 mg/ml) ; AG:EC (0.1:0.5 mg/ml); AG:AT (0.1 : 0.5 mg/ml);
AG:EC:AT (0.1:0.5 :0.5 mg/ml).
Des profils trs identiques sont observs des concentrations leves, quel que soit le
type de composs tudi : plateau atteint vers 6-8 %DPPH pour 10 min maximum (Fig.
6). On peut conclure que lactivit antioxydante augmentera avec la teneur en composs
phnoliques, jusqu' atteindre un plateau.
Par contre, il y a des diffrences significatives dans les cintiques de rduction dans le
cas des solutions plus faibles concentrations provoquant une rduction partielle de
DPPH (Fig.7).
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0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60
temps, min
%
D
P
P
H
AG EC AT AG+EC AG+AT AG+EC+AT

Figure 7. Effet de mlange des composs purs : acide gallique, picatchine et acide tannique
AG (0.05 mg/ml); EC (0.25 mg/ml), AT (0.05 mg/ml); AG:EC (0.05:0.25 mg/ml); AG:AT (0.05:0.05 mg/ml);
AG:EC:AT (0.05:0.25:0.05 mg/ml).
Les mlanges prsentent une activit anti-oxydante nettement suprieure celle des
composs purs EC ou AT, mais infrieure lAG. De mme, linstabilit de lacide
tannique aprs 15 minutes est tablie par une augmentation de labsorbance, trs
marque en cas du mlange ternaire AG:EC:AT. Il existe donc des diffrences
qualitatives dans la nature de ces composs phnoliques, dune part, et probablement,
des ractions de dcomposion et dinteraction induisant un effet pro-oxydant
(antagoniste) celui du pigeage des radicaux libres dautre part.
Conclusions
Bien que le test au DPPH soit considr comme une mthode simple, rapide et facile
mettre en uvre, les expriences ont montr certaines difficults de la mesure de ltat
de rduction: un phnomne dynamique fable concentration (traces dantioxydant en
ppm) et accompagn de nombreux composs forms, dans certains cas instables.
De plus, il existe une htrognit structurale au sein des composs phnoliques,
htrognit qui se traduit par des proprits diffrentes. Cest pourquoi, en effectuant
des tests de mesure de la cintique de lactivit anti-radicalaire, on peut gnrer une
valuation plus globale des proprits des chantillons tudis. Lestimation simultane
du pouvoir anti-radicalaire 1/CE
50
et du temps de raction T
CE50
permettent destimer
dune meilleure faon lactivit antioxydante par lindice de lefficacit anti-radicalaire.
Le test au DPPH nest pas quantitatif, il permet de comparer diffrents extraits entre
eux selon leur capacit piger le DPPH et ainsi, dapprcier les variations qualitatives
des composs phnoliques. . Lvaluation de lactivit anti-radicalaire doit tre
interprte avec prcaution du fait que labsorbance du DPPH 515-520 nm diminue
sous laction de la lumire, de loxygne, en fonction du pH et le type du solvant
additionn lantioxydant.
La structure chimique et la polarit de lantioxydant sont dterminantes pour sa
capacit piger les radicaux libres. Des effets synergiques mais aussi antagonistes ont
t observs dans des solutions modles qui contiennent plusieurs composs
fonctionnels activit anti-radicalaire. Nanmoins, ces observations sont bases sur une
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simple estimation des activits des composs purs, et des tudes plus pousses seraient
mener avec des extraits rels.
Remerciements
Ce travail a t effectu grce lappui financier de lAUF dans le cadre du projet Ple
dexcellence rgional: Centre Interdisciplinaire de Formation et de Recherche "Sciences
et Techniques" (CIFR SciTech) et en coopration avec le Fonds Science UTCM-
Sofia, dans le cadre du contrat 10163/09.
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