FUNDAMENTO TEORICO

La cromatografa es la tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos
que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (liquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase
estacionaria, la cual puede ser slida o lquida.
Hay que indicar que el nombre de la tcnica es incorrecto, ya que no consiste en escribir con colores. Este nombre proviene de la
primera experiencia cromatogrfica realizada, la cual se utilizo para separar pigmentos coloreados de plantas. La cromatografa fue
descubierta por el botnico ruso de origen italiano Mijail Tswett en 1903. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila)
vertiendo extracto de hojas verde en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una
probeta. No obstante, no existen datos sobre la utilizacin de esta tcnica hasta 1930 cuando khun y Lederer separaron tambin
pigmentos de las plantas usando como adsorbentes almina y carbonato de calcio. Fue a partir de ah cuando se inicio el verdadero
desarrollo de la cromatografia .
Para explicar el fenmeno cromatorgafico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y otro prximo
Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades fsicas o fsico qumicas de los analitos:
solubilidad, adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente divididos), volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o
bioqumica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situacin experimental dinmica donde exhiben dos de estas
propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos lquidos diferentes como ocurre en cromatografa
liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes:
- Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si.
- El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible.
Fundamento prximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo
par de propiedades fsicas o fsico - qumicas frente a un sistema cromatogrfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden
ser muy pequeas, se basa la separacin cromatogrfica.
Si se transforma la idea del equilibrio esttico establecido entra las dos fases en un equilibrio dinmico, se tiene la realidad del
fenmeno cromatogrfico. Como se ha indicado anteriormente, una de las fases, denominada fase mvil, fluye a travs de la otra, a
la que se denomina fase estacionaria, que permanece inmvil, y que, al menos en una extensin esta en equilibrio con la fase mvil.
Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so movilidad entre si y con respecto a la fase mvil. Se eligen las
condiciones experimentales y las fases cromatogrficas para que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La
base de la separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la velocidad de migracin de los mismos.
La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de separacin: es aplicable a cualquier mezcla soluble o voltil.
De hecho las tcnicas de separacin suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatograficas y no cromatograficas. La eleccin de
una tcnica cromatogrfica concreta depender de la naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la separacin y de las
limitaciones del tiempo y equipo asequible
Puede hacerse una primera distincin entra las tcnicas cromatogrficas atendiendo a la integracin continua o no del sistema de
deteccin. As, la cromatografia no conlleva a un sistema de deteccin, mientras que cualquier cromatgrafo de lquidos o gases
lleva incorporado dicho sistema siendo, por tanto, autnticos instrumentos.
Clasificaciones:
Para clasificar globalmente los procesos cromatogrficos es necesario atender a dos criterios bsicos:
Fundamento del proceso cromatogrfico, lo que conduce a los tipos de cromatografias
Forma de realizar el proceso cromatogrfico, es decir, lo que constituye las distintas tcnicas cromatogrficas
Tipos de cromatografias:
Si es un slido, cabe distinguir entre:
Cromatografa de adsorcin: El slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase mvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de
Van der Waals)
Cromatografia de cambio inico: el slido es un cambiador de iones (fuerzas electrostticas)
Cromatografia de exclusin (o de geles), el slido es un gel formado por polmeros no inicos porosos que retienen a las molculas
de soluto segn su tamao.
Cromatografia de afinidad: es un tipo especial de cromatografia de adsorcion, utilizadaespecialmente en bioqumica, en la que un
slido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador enzimtico o un anticuerpo
Si es un liquido que se encuentra soportado en un slido inerte, se trata de la Cromatografia de particin. El soluto se reparte entra la
fase mvil (liquido o gas) y la fase estacionaria.
Segn la naturaleza de la fase mvil, la tcnica cromatogrfica correspondiente recibe el nombre de dicha fase mvil:
Si es un lquido, cromatografa liquida, cabe distinguir:
Cromatografa liquido-liquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y, por tanto, se trata de una cromatografa de
particin.
Cromatografa liquido-slido (CLS) en la que la fase estacionaria es slida (adsorcin, cambio inica, exclusin,
afinidad).
Si es un gas, cromatografa de gases, puede ser:
Cromatografa gas-liquido (CGL), que es una cromatografa de particin.
Cromatografa gas-slido (CGS), que es una cromatografa de adsorcin.
Si es un fluido supercrtico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura critica, pero simultneamente comprimido
a una presin mayor que su presin critica), se trata de la cromatografa de fluidos supercrticos (CFS), que puede ser de particin o
de adsorcin.
Tcnicas cromatogrficas:
Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, es decir, segn el dispositivo utilizado para conseguir entre la fase
mvil y la estacionaria, cabe distinguir dos tipos de tcnicas cromatogrficas: en columna y plana.
Cromatografa en columna: Se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su travs se hace pasar la
fase mvil. El flujo de la fase mvil (liquido o gas) a travs de la estacionaria se consigue: 1)por presin, 2)por capilaridad, 3) por
gravedad.
Es de destacar que en la actualidad, aunque incorrectamente, el trmino de cromatografia en columna suele aplicarse a la
cromatografia liquida para distinguirla de la cromatografia plana ya que, obviamente la cromatografia de gases solo puede realizarse
en columna.
Cromatografia plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es tridimensional, aunque una de sus
dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse bidimendional. Se divide en dos tipos generales:
Cromatografia en papel: en la que el papel acta como soporte de la fase estacionaria (cromatografia de particin).
Cromatografia en capa fina: en la que un slido acta como fase estacionaria (cromatografia de particin), se extiende
en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio.
El flujo de la fase mvil puede conseguirse de dos formas: 1) por capilaridad (cromatografia horizontal y ascendente) y 2) por
capilaridad y gravedad (cromatografia descendente). En la cromatografia plana queda excluido el uso de un gas como fase mvil,
por lo que sta siempre es lquida.
Cromatografia plana:
La cromatografia plana es un tipo de cromatografia liquida en la que la fase estacionaria esta extendida sobre la superficie de un
plano y la fase mvil fluye a travs de ella. La fase mvil siempre es un liquido, mientras que la fase estacionaria puede ser un
liquidosoportedo en un slido (cromatografia de particion) o un slido sorbente (cromatografia de adsorcin, cambio ionico o
exclusin). El flujo de la fase mvil se produce:
Por capilaridad (cromatografia horizontal y ascendente)
Por capilaridad y gravedad (cromatografia descendente)
Esta clase de cromatografia es considerada la ms simple de todas las tcnicas cromatograficas. La diferencia principal con la
cromatografia en columna es de tipo tcnico, es decir, difieren en la forma de soportar la fase estacionaria. En lo que se refiere al
fenmeno en que se fundamenta la separacin, es el mismo para ambas tcnicas
En la cromatografa plana, la disolucin de la muestra a separar se sita sobre el plano que contiene la fase estacionaria en forma de
mancha, o a veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano. Una vez seca la mancha o banda, el extremo
del plano prximo a la misma se pone en contacto con la fase mvil, manteniendo todo el sistema cromatogrfico en una cmara
cerrada. La separacin se produce por migracin diferencial de los componentes de la muestra en la direccin en que se mueve la
fase mvil.
Generalmente, a diferencia de la cromatografa en columna, en cromatografa plana el analito no abandona el lecho cromatogrfico,
de forma que el proceso se detiene cuando la fase movil ha alcanzado una determinada zona del plano.
Cabe distinguir dos tipos de cromatografia plana: En papel (CP) y en capa fina (CCF).
La cromatografa en papel tuvo su mximo desarrollo en, os aos cincuenta per en la actualidad se encuentra practicamante
eclipsada debido a la mayor rapidez, eficacia y versatilidad de la cromatografa en capa fina. Aproximadamente solo el 4% de las
publicaciones sobre las distintas tcnicas cromatogrficas se dedican a la cromatografa en papel. En esta tcnica, la celulosa acta
como soporte de la fase estacionaria que suele ser agua (cromatografia de particin). No obstante, tambin existen en el comercio
papeles impregnados (v.i. como gel de slice o almina, con silicona para separaciones en fase invertida, con cambiadores ionicos) o
tratadas qumicamente (v.i. grupos cambiadores incorporados al esqueleto polimrico de la celulosa), que amplan la aplicabilidad
de esta tcnica.
En cromatografa en capa fina, un slido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se extiende en forma de capa sobre el plano de
una superficie rgida, normalmente una capa de vidrio o polietileno, de forma que la fase mvil fluye a travs del mismo.
Dependiendo de las caractersticas del slido utilizado, la cromatografa ser de particin, adsorcin, cambio ionico o exclusin.
Hasta hace relativamente poco tiempo, la (CCF) era considerada una tcnica cualitativa simple y rpida, para separar mezclas no
demasiado complejas, pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa frente a otras tcnicas cromatogrficas como
la CLAR. Sin embargo, actualmente, debido a los cambios introducidos en esta tcnica, en lo que se refiere a la calidad de los
sorbentes, equipos para aplicar y la muestra y sistemas de deteccin, el inters por la CCF ha vuelto a renacer, siendo considerada
una tcnica til para separar y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas a nivel de trazas. Estos cambios han
llevado a modificar el nombre de la tcnica, denominada cromatografia en capa fina de alta resolucin (CCFAR o HPTLC en la
bibliografa inglesa), al igual que ocurri cuando se mejoro la capacidad de resolucin de la cromatografia liquida en columna,
pasando a denominarla cromatografia liquida de alta resolucin (CLAR o HPLC)