Mg. Sc . Bl go.

LUI S GUZMN MASI AS

I NSTI TUO PERUANO DE BI OLOG A
MOLECULAR

l ui s _guzman@i pbi omol . c om
PCR en Tiempo Real
Uso de PCR en tiempo real en
publicaciones indexadas (Medline)
PCR
1983 1985 : Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Kary Mullis

Ventajas:
Alta sensibilidad
Alta especificidad
Rapidez
Otras ventajas:
Deteccin a partir de cualquier muestra biolgica (sangre,
piel, cabellos, saliva, lquido cefaloraqudeo, etc)
No es necesario que la muestra sea estril
Deteccin de un patgeno en particular an en presencia
de otros patgenos.
RT-PCR : deteccin de mRNA
PCR-RFLP : polimorfismo gentico
RAPDs : amplificacin con random primers - polimorfismo
PCR Nested : amplificacin de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultnea
Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras
Long PCR : amplificacin de fragmentos grandes 10 -20 kb.

VARIANTES DE PCR
APLICACIONES DE PCR
Diagnstico clnico
Monitoreo y Evaluacin de terapia
Deteccin de cepas resistentes a antibiticos
Deteccin de mutaciones puntuales
Polimorfismo gentico
Filiacin humana
Medicina Forense
Pedigr animal
Control de calidad
POR QU PCR EN TIEMPO REAL EST
DESPLAZANDO AL PCR ESTANDAR?

QUE VENTAJAS PRESENTA EL
PCR EN TIEMPO REAL?
PCR Standard vs. PCR Tiempo
Real
Anlisis de punto final
Deteccin del producto por
Electroforesis en gel
Anlisis de la cintica de
la reaccin
Deteccin del producto en
cada ciclo de la reaccin
1. Compuestos fluorescentes:
- compuestos que emiten fluorescencia cuando se
unen a dsDNA
- interaccin inespecfica
- Sybr green, EtBr,YOYO-1, entre otros
- Puede unirse a dimeros
2. Reporteros fluorescentes :
- Sondas Taqman
- Beacons moleculares
- FRET
DETECCION DEL PRODUCTO EN
CADA CICLO DE REACCION
SYBR Green


Absorbe a 480 nm, y
emite a 520 nm.

Desventaja: se une a
cualquier DNA de
doble cadena de
forma inespecfica
(dmeros
de primers y/o
productos
inespecficos).

Beacons moleculares
El Fluorforo emite seal
cuando el agente
bloqueador (Quencher) se
encuentra alejado por
efecto de la hibridacin a
la secuencia target
TaqMan PCR : generacin de seal por hidrlisis
de sonda.
FAM : maxima
emisin a 535 nm
TAMRA : mxima
absorcin a 560nm
FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer
HARDWARE & SOFTWARE
SOFTWARE
Ventajas del PCR en tiempo real
Simple y rpida (semi-automatizada).
No hay manipulacin post-PCR: disminuye el riesgo de
contaminacin por amplicones.
Cuantificacin precisa del DNA o RNA inicial.
Alta sensibilidad y especificidad
Discriminacin de productos inespecficos con la opcin
curva de desnaturalizacin (Melt-Curve).
Deteccin de ms de un producto especfico en una misma
reaccin.
DETECCION DEL PRODUCTO EN CADA CICLO DE REACCION
LO CUAL PERMITE UN ANALISIS DE LA CINETICA DE REACCION
En teora el Producto (P) se incrementa exponencialmente
con el # ciclos (n).
Depende del numero de copias templado iniciales (T)

P (2)
n
T
0
10
0 5 10 15 20
P
C
R

p
r
o
d
u
c
t
Cycle number
4T
2T
T
FASE PLATEAU
Sin embargo, reacciones con diferentes numero de
copias iniciales llegan al mismo nivel de plateau
El producto de PCR no siempre se duplica con cada
ciclo.



E = eficiencia del PCR

Generalmente la eficiencia es de 80-90%
Los productos pequeos se amplifican con mayor
eficiencia que los productos largos
PCR no es 100% eficiente
P T(1 E)
n
EFECTO DE LA EFICIENCIA EN LA CANTIDAD DE PRODUCTO OBTENIDO
Factores limitantes en la eficiencia del PCR:
- cantidad de cebadores disponibles
- actividad de la Taq DNA Polimerasa

Plateau : no hay mayor incremento del producto

PCR Standard: Anlisis de punto final (End point detection)
Deteccin al final del total de ciclos por electroforesis en gel
(en fase plateau)
CANTIDAD DE DNA (escala aritmtica) vs. NUMERO DE CICLOS

Los productos de amplificacin no se detectan en los primeros ciclos
porque estn por debajo de la escala utilizada.
Recin se observa la curva en los ltimos ciclos hasta llegar a la fase de
plateau.
CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE
CICLOS

Se observa diferencias ya desde los ciclos iniciales. Relacin como
lnea recta al utilizar logaritmos, porque la amplificacin por PCR
es una reaccin logartmica.
Escala aritmtica
La misma reaccin de PCR en escala logaritmica - se aproxima a
la grfica terica.
Segn las curvas tericas, se debe obtener una lnea recta en la parte
lineal de la reaccin de PCR. En este caso entre ~20 a ~1500
unidades de fluorescencia arbitraria.
Analizando la misma regin en una escala regular (aritmtica),
veremos que la parte lineal es la primera parte de la curva.
IMPORTANTE: se debe examinar la reaccin de PCR mientras se
encuentra en la fase lineal.
Para cada muestra, el software determina en qu ciclo, el valor de la
fluorescencia emitida cruza la linea arbitraria (Threshold).
Este punto se denomina C
T
(Ciclo crtico / Threshold cycle). Este valor es
inversamente proporcional a la cantidad inicial de molculas especficas en la
muestra original.
Valores de Threshold & C
T
NTC:
tubo control
sin DNA
templado
RUIDO
CONTROLES DE REACCION : ELIMINACION DE RUIDO
Es importante que el threshold este en la parte lineal de la reaccin.
Esto se ve mas facilmente en la grafica logaritmica.
An cuando el threshold estar cerca al fondo de la curva regular, deber
ser lo suficientemente alto para que los valores de fluorescencia sean
debido a la amplificacin y no al ruido.
Grafica regular
Grafica semi-
logaritmica
Cuantificacin de DNA o cDNA
(colocando diluciones de la misma muestra)
A menor concentracin de la secuencia target en la muestra inicial, se
necesitar mas ciclos para ser detectada, por lo tanto se obtienen valores de
C
T
mayores para muestras mas diluidas
.
El Plot de valores Ct de las diluciones vs. concentracin resulta en una
grfica lineal, y debe presentar un alto coeficiente de correlacin (>0.990).
Unin inespecfica de primers (mispriming): por unin de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes
en el DNA o cDNAs de la muestra

Dmeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeos
PROBLEMAS

PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que
pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reaccin. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.
CURVA DE DENATURACION
Muesta el perfil de denaturacin de los productos amplificados.
(no se observan productos inespecficos)
Una temperatura de denaturacin diferente significa un
producto diferente. Dmeros: menor temperatura de fusin.
dmeros
PCR en tiempo real
Deteccin y cuantificacin utilizando reporteros
fluorescentes.

Fluorescencia emitida es proporcional a la
cantidad de producto del PCR.

Se puede realizar el anlisis de varios targets a la
vez (Multiplex) utilizando sondas marcadas con
diferentes fluorforos
Controles
Problemas de Inhibicin - falsos negativos
Estndares internos (genes de referencia,
control interno, control de carga, triplicados)
Optimizacin
Reproducibilidad
Validacin
Personal
Costos
Otras consideraciones
APLICACIONES EN
INVESTIGACION
DNA : - Identificacin de genes de virulencia o de
resistencia a drogas
- Genotipificacin de cepas o subespecies
- Deteccin de mutaciones puntuales
- Estudio de de polimorfismos de un solo
nucletido (SNPs)
- Cuantificacin del nmero de copias por
clula, o determinacin de clulas iniciales en
una muestra.
RNA : - Deteccin de la expresin de genes
- Efecto de mutaciones sobre la expresin
- Anlisis de mRNAs variantes producidos por
procesamiento diferencial
- Cuantificacin de la expresin
Deteccin de la expresin de genes (deteccin de
mRNA)
Perfl de expresin gnica en diferentes tipos celulares en
adultos o durante el desarrollo /diferenciacin

Cambios en la expresin gnica en condiciones
patolgicas

Expresin gnica en respuesta a estmulos: hormonas,
citoquinas, etc

Expresin gnica en respuesta a la presencia de antgenos
de patgenos

Efecto de drogas sobre el perfl de expresin
APLICACIONES AL
DIAGNOSTICO CLINICO
Deteccin /Cuantificacin / Genotipificacin de patgenos:
Virales (carga viral, carga pro-viral)
Bacterianos
Protozoarios
Hongos
Diagnstico temprano (pacientes asintomticos)
Deteccin de genes de resistencia mejor eleccin de terapia
Monitoreo de terapia (enfermedad residual - recada)
Deteccin de marcadores tumorales
Estado del desarrollo / progresin de la enfermedad
DETECCION DE SNPs o
DE MUTACIONES PUNTUALES
Clulas Madre y su
diferenciacin a Linaje
Neuronal:


Ejemplo de Cuantificacin Relativa
Modificaciones covalentes
de las histonas nucleosmicas
ATP ADP
NUCLEOSOMA
La herencia epigentica es regula procesos como proliferacin
y diferenciacin celular manteniendo estados transcripcionales
(Modificada de Mohrmann y Verrijzer 2005)
(Turner 2002)
Modificacin de la cromatina por
complejos multi-ptotecos que
hidrolizan ATP
RNA interferencia
30 min en hielo y
cultivo
Anlisis de Melt
ACTINA OSA1
End-Point
Colonia Ct osa C
t
Actina C
t
C
t
Fold
C2 27,58 22,99 4,59 0,83 0,5625292
F1g 28,7 23,32 5,38 1,62 0,3253354
D3 27,1 22,3 4,8 1,04 0,4863274
WT 23,58 19,82 3,76 1
Curva patrn BCR-ABL
Segunda Derivada
CUANTIFICACION ABSOLUTA
Translocacin (9,22)
Real Time PCR
ejemplo de deteccin en embarazadas a partir
de la sexta semana