Analytik

U
Real-time-PCR als Alternative
Matthias Kiehne, Cordt Grnewald, Benjamin Junge, Tanja Musiol

Schnellmethoden auf PCR-Basis knnen mikrobiologische Methoden in der Lebensmittelprfung
ersetzen, denn sie sind weniger zeitintensiv und arbeiten hufig spezifischer.
G Fr mikrobiologische Prfungen
von Lebensmitteln drfen Anwen-
der laut EU-Verordnung auch andere
Untersuchungsmethoden als die Re-
ferenzmethoden verwenden, so lan-
ge diese Verfahren gleichwertige Er-
gebnisse liefern.
1)
Eine solche Alter-
native sind Schnellmethoden, die
auf der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) beruhen.
Durch die Entwicklung von qua-
litativ und quantitativ arbeitenden
Systemen auf PCR-Basis, die schnell
und spezifisch lebensmittelrelevante
Parameter wie Salmonella und Liste-
ria monocytogenes oder gentechnisch
vernderte Organismen (GVO)
nachweisen, wendet die Lebensmit-
telindustrie zunehmend diese Me-
thoden an. Das liegt nicht nur an der
Geschwindigkeit und Genauigkeit,
sondern auch an der einfachen
Handhabung.
2,3)

Real-time-PCR
G Mit Real-time-PCR erhlt der
Anwender bereits whrend der
Analyse Informationen ber Kon-
taminationen. Die Methode weist
die DNA eines Erregers oder einer
gentechnisch vernderten Pflanze
nach, und zwar ber Sonden, die
komplementr zu den Einzelstrn-
gen der Zielsequenzen sind und da-
durch wie Primer (kurze DNA-
Strnge) an sie binden. Im Gegen-
satz zu Primern sind an die Sonden
Farbstoffe gekoppelt, die ber eine
Fluoreszenzreaktion die Ableitung
von Lichtemission ermglichen.
Die Emission nimmt das PCR-Gert
auf, die dazugehrige Software wer-
tet sie aus.
4)
Durch die software-
gesttzte Auswertung ist die Ana-
lyse auch ohne grere Vorkennt-
nisse machbar.
5)

In den meisten handelsblichen
Testkits fr die Lebensmittelanalytik
liegen alle bentigten PCR-Kom-
ponenten in einem anwenderfreund-
lichen Format als Reagenzien vor.
Damit lassen sich mehrere Lebens-
mittelproben in wenigen Schritten
parallel untersuchen.
Anreicherung und Extraktion
G Soll eine Probe auf einen Orga-
nismus geprft werden, so ist vor
der PCR eine kulturelle Anreiche-
rung der Probe notwendig. Die An-
reicherung dauert fr die meisten
Testkeime 16 bis 24 Stunden.
6)
Bei
quantitativen Analysen, beispiels-
weise der GVO-Anteile von Soja
oder Mais, ist keine Anreicherung
erforderlich.
7)

Ein Extraktionsschritt der DNA
aus den Zielorganismen schliet
sich an. Dafr existieren eine Viel-
zahl von Probenaufarbeitungsver-
fahren speziell fr die Lebensmittel-
industrie. Sie unterscheiden sich im
Grad der DNA-Reinigung und dem
damit verbundenen Zeit- und Ar-
beitsaufwand. Fr die meisten Le-
bensmittelmatrizes gengen ein-
fache und schnelle Systeme, die
mehrere Proben innerhalb von 30
Minuten aufarbeiten.
8)

Beispiele Salmonellen,
Listerien und E. coli
G Die neuen TqM-real-time-PCR-
Kits von Biotecon Diagnostics lie-
fern schnelle und sichere Nachweise
der wichtigsten Lebensmittelpatho-
gene. In der vorliegenden Unter-
suchung wurde die Einsatzfhigkeit
Abb. 1. Mastercycler fr die Real-time-PCR. (Foto: Eppendorf)
1161
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der Kits zum Nachweis von Salmo-
nellen, E. coli O157, Listeria mono-
cytogenes und der Gattung Listeria
auf dem Mastercycler ep realplex
von Eppendorf (Abbildung 1,
S. 1161) getestet.
Die Platte des Gerts leuchtet ein
96-LED-Array gleichmig aus.
Vorteil dieser Lichtquelle ist, dass
sie uerst langlebig ist und sich so
die Lichtintensitt ber die gesamte
Lebenszeit des Gerts nicht mess-
bar verndert. Ergebnisse wie am
Tag der Inbetriebnahme erreicht
der Mastercycler auch noch nach
mehreren Jahren. Seine Geschwin-
digkeit ermglicht darber hinaus
eine Analyse in circa eineinhalb
Stunden.
Mit allen getesteten Kits lsst sich
die DNA der pathogenen Keime
nachweisen, wenn das Anreiche-
rungsmedium 10
3
bis 10
4
Zellen pro
mL enthlt. Die Inhaltsstoffe aus den
meisten Lebensmittelmatrizes inhi-
bierten die PCR nicht, nur bei ein-
zelnen Produkten, z. B. bestimmten
Gewrzsorten, ist eine Reinigung er-
forderlich.
Abbildung 2 zeigt als Beispiel
den Nachweis von Salmonellen
(circa 4 10
4
mL
1
) in Anreicherun-
gen der Lebensmittelmatrizes
Fisch, Geflgel, Pilze, Kuchen, Nu-
deln, Kse, Eiscreme, Mungoboh-
nenkeime und Instantprodukte. Die
Proben wurden hierzu mit dem
Starprep-One-Kit von Biotecon Di-
agnostics prpariert. Dieses Kit iso-
liert PCR-fhige DNA in wenigen
Arbeitsschritten.

Matthias Kiehne, Cordt Grnewald, Benjamin
Junge sind Wissenschaftler bei Biotecon Diag-
nostics, Potsdam; www.bc-diagnostics.com.
Tanja Musiol ist Produktspezialistin Automati-
on & (real-time) PCR bei Eppendorf, Hamburg;
www.eppendorf.de; Eppendorf Vertrieb
Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf; ver
trieb @eppendorf.de

1) Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 der Kom-
mission vom 15. November 2005 ber
mikrobiologische Kriterien fr Lebensmit-
tel.
2) K. Berghof, F. Wilborn, P. A. Bertram-
Drogatz, transkript, 1999, 5(1), 12.
3) P. Scheu, K. Berghof, U. Stahl, Food
Microbiology, 1998, 15, 13.
4) A. Gru, B. Schnenbcher, Validation of
a Real Time PCR system For Detection of
Escherichia coli O157 in Food, Food
Marketing and Technology, 2005, 19, 19.
5) J. Baumgart, Mikrobiologische Unter-
suchung von Lebensmitteln, Behr's
Verlag, Hamburg 1994.
6). H.-H. Drries, M. Kiehne, B. Kurth, C.
Grnewald, K. Berghof-Jger, Biochemica
3/2004.
7) M. Fandke, A. Schneider, C. Grnewald, K.
Berghof-Jger, Biochemica 2/2002, 19.
8) C. Grnewald, M. Kiehne, K. Berghof-
Jger, Hygiene Report 1/2006, 22.
Abb. 2. Nachweis von Salomonellen in Lebensmitteln ber PCR mit Fluoreszenzdetektion.
BlickpunktU Analytik|PCR 1162
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Kurz notiert
Biotechnica 2008
G 535 Aussteller prsentierten sich
zur Biotechnica Anfang Oktober in
Halle 9 auf dem Messegelnde Han-
nover. Neben Gerteherstellern und
Dienstleistern fr die biotechnologi-
sche Forschung nahmen Lnderver-
tretungen und Forschungsinstitutio-
nen wie die Fraunhofer-Gesellschaft
und das Bundesministerium fr Bil-
dung und Forschung einen Groteil
der knapp 8400 Quadratmeter Aus-
stellungsflche ein. Bei der letzten
Biotechnica vor einem Jahr, der letz-
ten, die noch im zweijhrigen Turnus
stattfand, waren noch 13 000 Qua-
dratmeter belegt. Zuknftig soll die
Messe jedes Jahr stattfinden.
11 000 Messebesucher (2007:
13 000) registrierte der Veranstalter
der Biotechnica, die Deutsche Messe
AG, und zeigte sich damit sehr zufrie-
den. Fast ein Viertel der Besucher
kam aus dem Ausland, von den Aus-
stellern war es etwa ein Drittel, die
meisten davon aus Grobritannien,
der Schweiz, den USA und aus Korea.
Rund 2800 Teilnehmer zhlten die
Tagung Bioperspectives und etwa 20
weitere, kleinere Symposien, Work-
shops und Foren, die parallel zur
Messe stattfanden und die die Ver-
anstalter in Bioscience, Biopolitics
und Biobusiness unterteilt hatten.
Die Bioperspectives, ausgerichtet von
der Dechema und 21 weiteren Fach-
gesellschaften, darunter die GDCh,
war zum ersten Mal an die Biotechni-
ca gekoppelt.
Die nchste Biotechnica in Han-
nover findet vom 6. bis zum 8. Okto-
ber 2009 statt. Bis dahin gibt es die
Biotechnica America in New York
(17. bis 19. Mrz 2009) und die Bio-
tech China in Schanghai (1. bis 3.
Juni 2009).
www.biotechnica.de
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Analytik BlickpunktU 1163
Neue Richtlinien fr die
Methanmessung
G Zwei neue Richlininen zur Be-
stimmung von Methan in der Luft
haben der Verein Deutscher Inge-
nieure (VDI) und das Deutsche In-
stitut fr Normung DIN herausgege-
ben. Ein manuelles gaschromatogra-
phisches Verfahren beschreibt die
Richtlinie VDI 2466 Blatt 1. Dieses
Verfahren dient zur diskontinuierli-
chen Bestimmung von CH
4
-Emissio-
nen und zur Kalibrierung von auto-
matischen CH
4
-Messgerten durch
Vergleichsmessungen nach DIN EN
14181. Das Messen von Methan mit
dem Flammenionisationsdetektor
(FID) beschreibt das ebenfalls neue
Blatt 2. Das automatische Verfahren
bestimmt Methanemissionen im sta-
tionren Einsatz kontinuierlich oder
bei Einzelmessungen Methan in tro-
ckenen und feuchten Abgasen. Der
Messbereich reicht von wenigen ppm
bis in den Prozentbereich.
www.vdi.de/richtlinien
Mikrochips fr die
Lebensmittelsicherheit
G Einen Mikrochip als Sensor fr die
Lebensmittelberwachung ent-
wickelt ein internationales Konsorti-
on unter Leitung des ttz Bremerha-
ven. Der Chip arbeitet mit ELISA
(Enyme Linked Immunosorbent As-
say) mit Fluoreszenzdetektion und
soll zunchst Listerien, Aflatoxin M1
und Sulfonamide in Milch sowie Ver-
flschungen wie Kuhmilchproteine
in Ziegenmilch nachweisen. Das mi-
krofluidische System soll zunchst
offline messen und in einem zweiten
Schritt zu einer Online-Methode wei-
terentwickelt werden, die Milch ber-
prft, noch bevor sie in die Molkerei
gelangt.
Die EU frdert dieses Projekt Na-
nodetect im 7. Forschungsrahmen-
programm mit 2,6 Mio. Euro ber
drei Jahre. Neun Unternehmen und
Institutionen sind daran beteiligt, da-
runter die Universitt Bremen.
www.ttz-bremerhaven.de
Analytica China wchst
G Auf der Analytica China belegten
im September die Aussteller fast 50
Prozent mehr Flche als bei der Vor-
gngerveranstaltung im Jahr 2006.
Von den 342 Unternehmen und In-
stitutionen aus Analytik, Labortech-
nik, Diagnostik und Biotechnologie
auf 17 000 Quadratmetern Ausstel-
lungsflche waren 44 Prozent aus
dem Ausland. 13 145 Besucher ka-
men zur Analytica China und zur
Umweltschutzmesse IFAT China, die
parallel im Schanghaier New Inter-
national Expo Centre in Pudong
stattfanden. Auf der Analytica China
Conference im Messe-Rahmenpro-
gramm berichteten 56 Wissenschaft-
ler, davon 33 aus China ber analyti-
sche Qualittssicherung, Labororga-
nisation, Proteomik, Umweltana-
lyse, Massenspektrometrie und Sen-
sorik, Lebensmittelanalytik sowie
die Analytik traditioneller chinesi-
scher Medizin. Auf dem Sino-Ger-
man Symposium on Chromatogra-
phy trugen 21 Redner vor. Die Pro-
teinforschung in China war Thema
des Symposiums Proteomics: From
Basic to Application, organisiert vom
Pekinger Proteom-Forschungszen-
trum. Die britische Royal Society of
Chemistry veranstaltete die Chemis-
try World China Lecture, die Part-
nerschaften zwischen Hochschulen
und Industrie ein Forum bot.
Die nchste Analytica China wird
im Herbst 2010 in Schanghai statt-
finden.
www.analyticachina.com
Glaschip mit Mikrokanlen; um verschiede-
ne Biomolekle gleichzeitig zu bestimmen,
lassen sich die Sensoren durch Parallelschal-
tung miteinander kombinieren.