Deteccin de Trypanosoma cruzi en heces del vector Rhodnius

proxilus mediante el mtodo de hemaglutinacin directa

Para determinar la presencia de Trypanosoma cruzi en los 15 vectores
capturados de la zona problema, es necesario realizar el siguiente
procedimiento:
1.1. Obtencin de las heces fecales, por medio de las cuales el pito
infecta al humano, se deben obtener las 15 heces por separado,
debido a que con cada una de estas se debe realizar la obtencin de
los antgenos ! de los anticuerpos para determinar, si son positivas !
no.
1.". #e debe hacer un procedimiento de procesamiento de cada una de las
muestras ! posterior extraccin de protenas encontradas en las
muestras, por e$emplo, por medio de un #%#, para de esta forma
obtener los epitopes con los cuales se va a traba$ar.
1.&. Anticuerpos monoclonales contra los epitopes: 'os epitopes de
inter(s obtenidos, cada uno por aparte, se inoculan en un ratn
diferente, la norma es que un antgeno contiene m)s de una epitope,
el sistema inmune del animal va a hacer que un clon de c(lula
responda al epitope 1, otro clon de c(lula responda al epitope ", etc.
Por esto se tendran plasmocitos cu!os anticuerpos reconocen el
epitope 1, " ! as sucesivamente, es decir lo que se esperara
encontrar es una mezcla de anticuerpos contra todos los epitopes que
ha!a reconocido el sistema inmune. Para conseguir anticuerpos
monoclonales se desea no tener una mezcla, despu(s de la inoculacin
se debe asegurar que el ratn est( produciendo anticuerpos, se
sacri*ca el animal ! se toman del bazo c(lulas inmunes. #e llevan a un
medio ! se fusionan con c(lula inmortales, c(lulas de mieloma, !
mediante un agente se promueve la fusin de las membranas de esas
c(lulas. #e obtienen c(lulas hibridas que idealmente tiene constitucin
gen(tica del plasmocito + pero as mismo tiene constitucin gen(tica
de las c(lulas de mieloma, se logran c(lulas con " caractersticas
importantes, especi*cidad en la produccin de un anticuerpo ! se
logra que la c(lula sea inmortal gracias a la fusin con las c(lulas de
mieloma. 'os hbridos est)n mezclados ! todava siguen siendo
policlonales, se siembra lo que haba en el tubo en un recipiente
pl)stico con ori*cios o cavidades. #e coloca un cierto volumen en cada
cavidad con un micropipeta, se pone a incubar en condiciones de
esterilidad, al otro da se revisan los pozos ! el que nos interesa sea
donde ha!a un racimo de c(lulas o un clon. #e observa con un
microscopio invertido.
1.,. -+isten t(cnicas que permiten saber cuando un antgeno se uni a un
anticuerpo, en una super*cie .pozos/ se pone lo que se quiera probar
.epitope/, se coloca el sobrenadante ! en aquellos que ha!a se0al
positiva se a*rma que ese clon esta secretando anticuerpos que
reconocen el epitope que queremos.
1.5. 1na vez obtenidos estos anticuerpos, es necesario almacenarlos
adecuadamente ! con estos es que se realiza la hemaglutinacin
directa.
1.2. -s necesario tener controles positivos .Trypanosoma cruzi que
efectivamente se ha comprobado la presencia de este parasito, por
e$emplo epitopes obtenidos de la e+traccin de protenas de los
tripomastigotes metacclicos/ ! controles negativos .no presencia de
Trypanosoma cruzi) para que de esta forma la prueba tenga validez.
1.3. Para cada una de las 15 muestras ! el control positivo ! negativo se
debe hacer el siguiente procedimiento en lineas diferentes:
1.3.1. 4arcar los pozos con cada una de las diluciones a traba$ar en las
diferentes muestras, de la #1 a la #15, de la misma forma que se
ve en la Imagen 1:
Imagen 1. 5emaglutinacin directa de Trypanosoma cruzi.
1.3.". #e agrega el dilu!ende de la muestra a cada uno de los pozos.
1.3.&. #e agrega cada una de las muestras problema incluidos los
controles en todos los pozos de la dilucin 16".
1.3.,. #e realizan las diluciones seriadas, de la ultima dilucin se elimina
la misma cantidad agregada de la dilucin anterior.
1.3.5. #e agrega la solucin de globulos ro$os no sensibilizados en las
diluciones 16" ! 16,.
1.3.2. 7gregar "5 8l de la solucin de 9lbulos :o$os #ensibilizados a
partir de la dilucin 16;, estos globulos ro$os fueron sensibilizados
mediante tanizacin con )cido t)nico diluido, posteriormente se le
agregan en este caso los anticuerpos .para la hemaglutinacin
directa/.
1.3.3. #e de$a reposar durante <= min en lugar sin vibraciones.
1.3.;. > por ultimo se leen los resultado:
eactiva: #e detecta la presencia de anticuerpos contra
Trypanosoma cruzi .4alla/. !tulo: seg?n lectura.
"o reactiva: 7usencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi
.botn/.