CURSO : Microbiologa Animal

PROFESOR : TAFUR ZEVALLOS, Lizandro

ALUMNA : BONIFACIO ESPINOZA, Jherson
CICLO : 2014 - I


TINGO MARIA 2014
I. INTRODUCCION
El imperceptible tamao de las bacterias y otros microorganismos as como la
dificultad para observarlas en detalle con el microscopio ptico por causa de la
falta de contraste que existe entre estos, debido a que son usualmente
transparente en el medio que les rodea; hizo que se crearan mtodos para
poder apreciarlas, siendo los mtodos ms sencillos el de fijacin y tincin,
iniciados por Paul Ehrlich y Robert Koch, los que permitieron a los
microbilogos distinguir muchas caractersticas estructurales normalmente
vistas as el uso de colorantes, es el medio ms simple de aumentar el
contraste. Estos pueden utilizarse para distinguir entre distintos tipos de clulas
o para apreciar la presencia de algunos elementos celulares, como flagelos,
esporas, cpsulas, paredes celulares, mitocondrias, ncleos, membranas
celulares, etc.
Existen numerosos colorantes, y en su mayora son compuestos orgnicos
naturales que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares.
Los colorantes que se utilizan usualmente son molculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los componentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos (azul de metileno, el cristal violeta y la safranina); otros colorantes
son molculas cargadas negativamente (aniones) los que se combinan con los
elementos celulares cargados positivamente, como son las protenas (Eosina,
la fucsina cida y el rojo Congo). Existe otro grupo de colorantes conformado
por sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipdicos de la clula, usndose generalmente para revelar la
localizacin de los depsitos de grasa (negro de Sudn).
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el
laboratorio de microbiologa. Su aplicacin prctica es innegable sobre todo en
el trabajo microscpico de rutina; las referencias a la morfologa celular
bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, negativos y positivos fig1) se basan
precisamente en la tincin de GRAM.
OBJETIVOS:
Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o
Gram negativas de acuerdo a esta tincin.
II. REVISION BIBLIOGRAFICA.
2.1. TINCIN
Es el proceso por el cual las molculas de un color ante se adsorben a
una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los
microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio ptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observar se
claramente sin algn tratamiento previo.
De acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:
2.1. Tincin simple
El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa
celular.
2.1. Tincin diferencial
El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre
clulas bacterianas o entre partes de una misma clula. Estas
tcnicas utilizan ms de un colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tincin.
Ejemplos: Tincin de Gram, Tincin de Ziehl-Neelsen , etc.
2.2. TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian
Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la
tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos,
grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y
negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente
designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).
2.3. CULTIVO.
En biologa, y especficamente en microbiologa, un cultivo es un mtodo
para la multiplicacin de clulas o microorganismos, o para el
crecimiento de tejidos en el que se prepara un medio ptimo para
favorecer el proceso deseado; es empleado como un mtodo
fundamental para el estudio de las bacterias.
Esto se lleva a cabo al cultivarlas en un medio lquido o en la superficie
de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos
nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas
como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar
una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos
tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las
clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos
ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria
una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de
clulas similares a la original.
2.4. COLORACION GRAM

Dado que las bacterias no tienen color y por lo general invisible para la
microscopa de luz, diferentes tcnicas de tincin se han desarrollado
para visualizarlas. La ms til es la tincin de Gram, que separa los
organismos en 2 grandes grupos: gram-positivos y gram-negativas.
Esta tincin tambin permite que el clnico pueda determinar si el
organismo es redondo o
en forma de varilla, etc.







Las cadenas de amino-cidos del peptidoglicano se unen covalentemente a
otros aminocidos de las cadenas vecinas. Esto resulta en una estable
estructura reticulada. La enzima que cataliza la formacin de esta unin Se
llama transpeptidasa y est situado en el interior citoplsmica
membrana. El antibitico se une a la penicilina inhibe esta enzima. Por esta
razn, la enzima es
tambin llamada protena de unin a la penicilina.
La tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examen microscpico
de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clnica pueden
detectarse con este mtodo. Las nicas excepciones son:
Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las
clulas husped (p. ej., clamidias).
Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).
Los que tienen un tamao insuficiente para ser observados por el
microscopio ptico (p. ej., espiroquetas).
Los que tienen una diferente composicin en su pared y no captan los
colorantes (p. ej., mycobacterias).











2.5. FACTORES QUE CONSIDERAR EN LA TINCIN DE GRAM

No se debe sobrepasar los tiempos de tincin y decoloracin.
Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tian parcial o
totalmente de color rosa.
Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el
rango de Ph 7-7.8 ya que:
Los Gram positivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
Los gramnegativos pueden hacerse Gram positivos al aumentar la alcalinidad.





III. MATERIALES Y METODOS

3.1. Lugar y Fecha.

La presente prctica se desarroll en el laboratorio de SANIDAD
ANIMAL de la Facultad de Zootecnia, de La Universidad Nacional
Agraria de la Selva el da jueves 05 de Junio del presente ao a horas
de 10 a 12 A.M., en la ciudad de Tingo Mara, Provincia de Leoncio
Prado, Departamento de Hunuco a coordenadas geogrficas: Latitud
Sur: 91708, Longitud Oeste: 755952, a 660 m.s.n.m, con un
temperatura promedia de 27 C aproximadamente.

3.2. Materiales y Mtodos
3.2.1. Materiales.
Lamina porta y cubre objeto.
Estufa. Para el secado de las muestras.
Mechero Bunsen o de Alcohol
Asa de Siembra o aguja enmangada
Pinzas
Muestras bacterianas de origen natural, Sarro Dental, etc.
Palillos
Microscopios
Soporte de Tinciones
Goteros
Gasas

3.2.2. Reactivos
Cristal violeta
Solucin de lugol
Alcohol acetona
Safranina
Aceite de inmersin

3.2.3. Mtodos
Desarrollar la prctica teniendo en cuenta el siguiente procedimiento:
Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero.
Colocar una gota de agua destilada o solucin salina sobre el
porta objetos y luego esterilizar el asa bacteriolgica.
Tomar una pequea muestra de la cepa y diluirla en el porta
objetos y posteriormente esterilizar el asa.
Fijar la muestra al calor flamendola en el mechero, cuidando
no quemar la muestra. Colocar el portaobjetos sobre un
soporte.
Cubrir la muestra con cristal violeta. Esperar que transcurra 1
minuto escurrir y enjuagar.
Cubrir la muestra con solucin de lugol y esperar que
transcurra 1 minuto . Escurrir y enjuagar.
Despus hecharle alcohol acetona dejarlo reposar 30
segundos y enjuagar
Cubrir la muestra con safranina y esperar que transcurra 1
minuto. Escurrir y enjuagar.
Dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de
inmersin y observar en el microscopio a 10X, 100x, etc.









IV. RESULTADOS
















V. DISCUSION

los resultados sobre un estudio de Gram positiva o negativa es realmente
importante para el diagnstico y buen tratamiento de la patologa relacionada
microorganismos es necesario saber cmo influyen en las manifestaciones
clnicas las diferencias existentes entre la pared celular de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas en su deteccin y en el tratamiento.
Porque existen componentes de la pared celular que contribuyen a la virulencia
de las bacterias protegindolas de las respuestas inmunitarias.
En el laboratorio se deseara eliminar de forma selectiva las bacterias Gram
positivas de una mezcla de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

La tincin de Gram no es una prueba fiable de tincin de bacterias en medios
de cultivo con escasos nutrientes (p. ej., cultivos viejos o en fase estacionaria)
o tratados con antibiticos debido a la degradacin del peptidoglicano por parte
de estos frmacos.


VI. CONCLUSION

La tincin de Gram es una herramienta muy til en el laboratorio de
microbiologa as como en los anlisis clnicos y diagnostico medico siendo
ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder tener una
correcta interpretacin de los datos que nos otorga la diferenciacin de Gram
positiva y negativa concluyendo que debido a la estructura de sus paredes
celulares tendrn o no propiedades patolgicas diferentes.
Se pudo utilizar y conocer la funcin de la safranina y el cristal de violeta.









VII. RECOMENDACIN

Se necesita saber con mucha anticipacin que materiales
vamos a usar para no tener que acoplarnos o reemplazar
aquellos que no tenemos como el caso del aceite de
inmersin.
Se necesitaba ms orden en laboratorio al momento de usar
los reactivos, ya que por tener limitados uno se atrasaba ms
que el otro. Provocando as errores en la muestra.

VIII. BIBLIOGRAFIA
Benson, Harold. 1979. Microbiological Applications. A Laboratory
Manual in General Microbiology. Third edition. Wm. C. Brown
Company Publishers. Dubuque, lowa
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual
de Mtodos Generales (segunda edicin). Facultad de Farmacia.
Universidad Central de Venezuela.
Pelczar and Chan. 1977. Laboratory Exercises in Microbiology.
Fourth edition. Mc Graw-Hill Book Company.
Seely. H; Van Demark, P. 1962. Microbios en accin. Manual de
Laboratorio para Microbiologa. Editorial Blume. Madrid-Espaa.
Tortora, Funke and Case. Introduccin a la Microbiologa. 9na
Edicin 2007. Editorial Mdica Panamericana.