HPLC

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA

VALIDACIN DE LA METODOLOGA ANALTICA DE CUANTIFICACIN DE
CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMOHIDRATO,
FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA EN DOS JARABES
COMERCIALES POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

FRIDA LUCITANIA VALLEJO GARCIA

QUMICA FARMACUTICA

GUATEMALA, ABRIL DE 2009


VALIDACIN DE LA METODOLOGA ANALTICA DE CUANTIFICACIN DE
CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO,
FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA EN DOS JARABES
COMERCIALES POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

INFORME DE TESIS

PRESENTADO POR

FRIDA LUCITANIA VALLEJO GARCIA

PARA OPTAR AL TTULO DE

QUMICA FARMACUTICA

GUATEMALA, ABRIL DE 2009.

JUNTA DIRECTIVA


Lic. Oscar Cbar Pinto, Ph.D. Decano
Lic. Pablo Ernesto Oliva Soto Secretario
Licda. Lillian Raquel Irving Antilln, M.A. Vocal I
Licda. Liliana Vides de Urizar Vocal II
Lic. Luis Antonio Glvez Sanchinelli Vocal III
Br. Andrea Alejandra Alvarado lvarez Vocal IV
Br. Anbal Rodrigo Sevillanos Cambronero Vocal V

A mi amado Seor con gratitud infinita por sus tantas bendiciones y misericordias que me ha
ofrecido. Ha trado muchos cambios a mi vida con paz, bondad y alegra. Y por eso te doy gracias
por tus dones y el milagro de tu amor para iluminar mi camino y llegar al final con perseverancia.
Te quiero con todo mi corazn.

A mis padres Jos Efran Vallejo Rivas Q.E.P.D. y Lucy Garca viuda de Vallejo por brindarme su
amor, apoyo incondicional, exhortacin y por sus esfuerzos para lograr mi formacin profesional y
personal.

A mi hija Dania Eunice Mndez Vallejo por llegar a mi vida a despertar el amor y la ternura e
impulsarme a alcanzar esta meta.

A mis hermanos y familia Eddie Stuardo, Edgar Efran, Hjalmar Elas, Ivan Stuardo,
Q.E.P.D., Gueyry Wotsvel por sus oraciones y apoyo que me alientan y me inspiran, y la
confianza que restablece mi fe y seguridad.

A mis amigos por darle un toque a mi vida con sus consejos, nimo, alegra y hacerla especial.

Y a Usted gracias por compartir conmigo este triunfo, Qu Dios lo bendiga!

D DE ED DI IC CA AT TO OR RI IA A

A la Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad y Escuela de Ciencias Qumicas y
Farmacia, Centro Guatemalteco de Informacin de Medicamentos -CEGIMED-, Centro de
Documentacin/Biblioteca de Farmacia -CEDOBF-
Al cuerpo de catedrticos por transmitirme sus conocimientos y experiencias y al personal
administrativo que en una u otra forma participaron en la formacin profesional y culminacin de
mi carrera.

Al Laboratorio Transnacional de Guatemala
Al personal administrativo, profesional y tcnico por la colaboracin integral y proveer el soporte
instrumental, prstamo de cristalera, reactivos, espacios necesarios e instalaciones para el
desarrollo de este estudio.

A mi asesores
Licenciada Ibe Arriola por brindarme su amistad, su invaluable orientacin, consejos, sugerencias y
por ser la promotora de la realizacin de esta tesis.
Licenciada Lucrecia Martnez, Licenciada Vivian Sandoval y el Licenciado Estuardo Serrano que
con su asesora y apoyo contribuyeron a mejorar y dar forma a esta investigacin.

A AG GR RA AD DE EC CI IM MI IE EN NT TO OS S

CONTENIDO PGINA
1. RESUMEN..
2. INTRODUCCCIN
3. ANTECEDENTES.
4. JUSTIFICACIN
5. OBJETIVOS...........
6. HIPTESIS.
7. MATERIALES Y MTODOS
7.1 UNIVERSO DE TRABAJO.
7.2 MEDIOS..
7.2.1 RECURSOS HUMANOS
7.2.2 MATERIALES
7.2.3 INSTALACIONES.
7.3 RECURSOS MATERIALES.
7.3.1 EQUIPO..
7.3.2 DATOS DE LA CALIBRACIN DEL EQUIPO.
7.3.3 REACTIVOS..
7.3.4 CRISTALERA...
7.4 METODOLOGIA.
7.4.1 CUANTIFICACN DE GUAIFENESINA
7.4.1.1 PREPARACIN DE REACTIVOS
7.4.1.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN.
7.4.1.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA..
7.4.1.4 SISTEMA CROMATOGRFICO
7.4.1.5 PROCEDIMIENTO.
7.4.1.6 CLCULOS...
7.4.2 CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO
7.4.2.1 PREPARACION DE REACTIVOS.
7.4.2.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN
7.4.2.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA..
7.4.2.4 SISTEMA CROMATOGRFICO
N ND DI IC CE E
1 - 2
3 - 4
5 - 24
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27

28
28
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28 - 29
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29
29
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30
30
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31
31
32
32
32
32 - 33

33
34
34
34 - 35

7.4.2.5 PROCEDIMIENTO..
7.4.2.6 CLCULOS..
7.4.3 CUANTIFICACIN DE FENILEFRINA CLORHIDRATO
7.4.3.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN..
7.4.3.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA.
7.4.3.4 SISTEMA CROMATOGRFICO..
7.4.3.6 CLCULOS..
7.4.4 CUANTIFICACIN DE DEXTROMETROFANO BROMHIDRATO
7.4.3.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN.
7.4.3.6 CLCULOS.....
7.4.5 CUANTIFICACIN DE FENILEFRINA, DEXTROMETORFANO Y
CLORFENIRAMINA EN JARABE A
7.4.5.6 CLCULOS.
7.4.6 CUANTIFICACIN DE GUAIFENESINA, DEXTROMETORFANO Y
CLORFENIRAMINA EN JARABE B
7.4.5.5 PROCEDIMIENTO .
7.4.5.6 CLCULOS.
7.4.7 PROCEDIMIENTO DE VALIDACIN DE LA METODOLOGA
ANALTICA
35
35

36
36
36 - 37
37
37
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39
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39

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41
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42
42 - 44

44 - 45
45
45
45
46
46 48

48 - 51

7.4.8 TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS RESULTADOS
8. RESULTADOS..
9. DISCUSIN DE RESULTADOS
10. CONCLUSIONES.
11. RECOMENDACIONES...
12. BIBLIOGRAFA.
13. ANEXOS............

51 - 54
55 - 64
65 - 68
69 - 70
71
72 - 75
76

1
1. RESUMEN

1. RESUMEN
Este trabajo de investigacin consiste en la Validacin de la Metodologa Analtica
empleada en el laboratorio para la Cuantificacin de Clorfeniramina Maleato, Fenilefrina
Clorhidrato, Dextrometorfano Bromohidrato y Guaifenesina en dos Jarabes Comerciales
por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin. Tiene como propsito desarrollar y validar
un mtodo analtico que cumpla con los parmetros establecidos de cromatografa y
requerimientos de la Farmacopea Estadounidense (USP) e ICH (Conferencia Internacional
Tripartita sobre Armonizacin).
El diseo de este nuevo mtodo sirve de gua a la Industria Farmacutica para la
cuantificacin de tres principios activos como materia prima y en un producto terminado;
basndose en la cromatografa lquida de alta resolucin como una tcnica automatizada
que permite analizar de forma rpida y eficiente la separacin, cuantificacin y deteccin
de las muestras por medio de la identificacin de los picos en los cromatogramas.

Para determinar que la metodologa es exacta y precisa se verific el cumplimiento
de ciertos parmetros de validacin que incluyen la exactitud, precisin intermedia,
repetibilidad, linealidad del sistema, linealidad del mtodo y especificidad que fueron
evaluados durante todo el proceso analtico.

Se utilizaron las siguientes condiciones cromatogrficas: cromatgrafo lquido de
alta resolucin Hitachi, columna Whatman Partisil SCX, fase mvil fosfato dicido de
potasio pH 4 y metanol HPLC (40:60), flujo 1 mL/min, longitud de onda de 220 nm y 20
L de volumen de inyeccin. Se prepararon estndares y muestras a las siguientes
concentraciones: Clorfeniramina Maleato 0.08 mg/mL, Dextrometorfano Bromohidrato
0.08 mg/mL, Fenilefrina Clorhidrato 0.04 mg/mL y Guaifenesina 0.4mg/mL.

La metodologa analtica cumple con los parmetros de aptitud del sistema,
linealidad, exactitud, precisin (repetibilidad y precisin intermedia) para la cuantificacin
de los principios activos de Clorfeniramina Maleato, Fenilefrina Clorhidrato y

2
Dextrometorfano Bromohidrato tanto en materia prima como en el Jarabe A y B, pero no
demostr ser exacto en la cuantificacin de Guaifenesina en el Jarabe B.

Para este proceso se emplearon las instalaciones del laboratorio, que por estar
acreditado y cumplir con los requerimientos de las Buenas Prcticas de Manufactura, as
como el equipo e instrumentos validados para desempear estas caractersticas, y muestras
del mismo lote de fabricacin, estndares de referencia y reactivos de alta pureza.

En general, el mtodo analtico desarrollado es efectivo y reproducible, cumple con
las especificaciones necesarias para su aplicacin si se realiza a las mismas condiciones de
laboratorio y con los mismos principios activos, permitiendo que se obtengan resultados
satisfactorios y confiables.

3

2. INTRODUCCIN
El adquirir conocimientos cientfico-tecnolgicos y de medicina contribuye a
satisfacer una de las demandas de la sociedad, proporcionar solucin a problemas de
salud, por medio de medicamentos que en las ltimas dcadas son reemplazados por
frmacos especficos. Dichos medicamentos son elaborados por grandes laboratorios e
industrias farmacuticas; quienes tienen que prestar atencin y cumplir con Buenas
Prcticas de Manufactura y de Laboratorio, as tambin el control de calidad del producto
fabricado es esencial para garantizar al consumidor final un medicamento confiable y
seguro.

El constante crecimiento y expansin del mercado exige que las empresas se
preparen y busquen la calidad en sus productos y procesos, para utilizarlo como una
ventaja competitiva. Lo anterior, aumenta la necesidad de obtener certificaciones que
garanticen la calidad del producto, como por ejemplo la certificacin ISO 9001 y dentro de
sus requisitos se encuentra que los productos deben tener metodologas de anlisis
validadas.

Los mtodos de anlisis utilizados en el control de calidad de productos
farmacuticos que no se traten de mtodos oficiales de anlisis (registrados o contemplados
en farmacopea), deben validarse previamente a su uso de rutina y tiene como finalidad
demostrar la idoneidad de dicho mtodo para llevar a cabo un anlisis determinado.
(1)

Con la cromatografa lquida de alta resolucin que presenta ventajas sobre los
mtodos tradicionales se pretende mejorar la eficacia de la tcnica analtica obteniendo
tiempos de anlisis rpidos, separacin de sustancias de mezclas complejas con alta
resolucin, ejecucin de anlisis con facilidad y exactitud, obteniendo errores relativos
menores al 1%. Adems el beneficio de la tecnologa al brindar un sistema automatizado
que inyecta la muestra, realiza la separacin, imprime la identificacin de cada pico y su
concentracin para luego repetir el ciclo con la muestra siguiente.
(2)

4
Este estudio procedi a validar el mtodo para cuantificar Clorfeniramina Maleato,
Dextrometorfano Bromohidrato, y Fenilefrina Clorhidrato (Jarabe A) y tambin
Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromohidrato y Guaifenesina (Jarabe B),
producidos en una industria farmacutica para garantizar que el mtodo de anlisis
utilizado es confiable y preciso.

La formulacin de los jarabes combina estos principios activos por su actividad
teraputica y compatibilidad qumica para actuar en pacientes con trastornos de tos, gripe,
resfriados o alergias. El mtodo de cromatografa de alta resolucin logra el anlisis de
estos principios activos con eficacia al lograr identificarlos y separarlos en una mezcla.

Los resultados fueron examinados con un programa de infrmatica certificado que
integra los criterios de estadstica y aceptacin que especifica cada requisito, que permite
generar resultados verdicos para asegurar y validar un mtodo analtico de medicamentos
que puede ser aprobado y autorizado.

5

3. ANTECEDENTES
3.1 MALEATO DE CLORFENIRAMINA
3.1.1 Usos. El Maleato de Clorfeniramina es un antihistamnico que probablemente
sea eficaz en la rinitis alrgica y vasomotora, en la conjuntivitis alrgica, en la
urticaria y el angioedema leve, en reacciones alrgicas a la sangre y el plasma en
pacientes sensibles, en el dermografismo y como tratamiento auxiliar del shock
anafilctico. Se utiliza como ingrediente de frmulas antitusgenas de marca
registrada.
(3)

3.1.2 Indicaciones. Tratamiento de diversas reacciones de hipersensibilidad, rinitis,
eritema cutneo y prurito.
(4)

3.1.3 Propiedades fsico-qumicas.
o Estado fsico: polvo
o Apariencia: blanco, cristalino
o Olor: inodoro
o pH: 4 - 5 (de una solucin al 1%)
o pKa: 9.1
o Punto de fusin: 130-135
o
C
o Solubilidad: 0.25g/mL(agua), 0.1g/mL(alcohol), 0.1g/mL(cloroformo);
ligeramente soluble en ter o benceno
o Frmula molecular: C
16
H
19
ClN
2
.C
4
H
4
O
4

o Peso molecular: 390.87 g/moL
(5)

3.2 BROMOHIDRATO DE DEXTROMETORFANO
3.2.1 Usos. El Dextrometorfano, el d-ismero del anlogo codenico del levorfanol, se
emplea como antitusgeno. Controla los espasmos de tos al deprimir el centro
de la tos en el bulbo. Posee una potencia supresora de la tos de
aproximadamente la mitad de la potencia antitusgena de la codena. La

6
administracin oral de 30 mg a un adulto proporciona una actividad antitusiva
efectiva en un perodo de 8 a 12 horas.
A diferencia de la codena, no posee propiedades analgsicas y produce poca o
ninguna depresin del sistema nervioso central.
El Dextrometorfano se combina a menudo con expectorantes u otras drogas en
medicaciones de venta libre para la tos y el resfro.
(3)

3.2.2 Indicaciones. Tratamiento para la supresin de la tos no productiva (crnica).
(4)

o Estado fsico: cristales o polvo
o Apariencia: casi blanco o cristalino
o Olor: dbil
o pH: 5.2 - 6.5 (solucin de 1 en 1000)
o Punto de fusin: 126
o
C
o Temperatura de descomposicin: 126
o
C
o Solubilidad: 1g en alrededor de 65 mL de agua; completamente soluble en
alcohol o cloroformo; insoluble en ter.
18
H
25
NO.HBr
(5)

3.3 GUAIFENESINA
3.3.1 Usos. Se usa para el alivio sintomtico de los trastornos respiratorios
caracterizados por una tos seca no productiva, y por la presencia de moco en el
tracto respiratorio. La accin de la Guaifenesina mejora la tos seca no
productiva al disminuir la viscosidad del esputo, la dificultad en la
expectoracin y aumentar el volumen del esputo. Es un componente en muchas
formulaciones expectorantes registradas.
(3)

7
3.3.2 Indicaciones. Es un expectorante. Se usa para aliviar la congestin y la
mucosidad para ayudar a respirar ms fcil. La Guaifenesina diluye la
mucosidad, aumenta la lubricacin de las vas respiratorias (los pulmones, la
nariz, y la garganta), y aumenta la eliminacin de mucosidad.
(6)
o Estado fsico: polvo cristalino
o Apariencia: blanco a levemente gris
o Olor: leve, caracterstico
o Sabor: amargo
o pH: 5 - 7 (solucin de 1 en 100)
o Punto de fusin: con un intervalo de 3
o
entre 78 y 82
o
C
o Temperatura de descomposicin: 126
o
C
o Solubilidad: 1g en 60 a 70 mL de agua; soluble en alcohol, cloroformo,
glicerina o propilenglicol; insoluble en ter de petrleo
10
H
14
O
4

(5)

3.4 FENILEFRINA
3.4.1 Usos. La Fenilefrina es una amina simpaticomimtica que se utiliza por va
intranasal para combatir la congestin nasal y por va oral en combinacin con
otros frmacos en el tratamiento de la gripe, resfriados, etc. Aplicada
tpicamente sobre los ojos, produce midriasis, siendo utilizada con fines de
diagnstico en el examen del fondo de ojo.
(7)
Tambin en combinacin con
broncodilatadores administrados por inhalacin.
(3)
3.4.2 Indicaciones. La Fenilefrina parenteral est indicada para el mantenimiento de
una presin arterial adecuada durante la anestesia general o espinal y para el
tratamiento de una hipotensin grave debida a un shock, frmacos o estados de
hipersensibilidad. Tambin se emplea en casos de taquicardia supraventricular
paroxstica y, en la anestesia regional como vasoconstrictor local.
(7)

8
o Estado fsico: polvo
o Apariencia: blanco
o Punto de congelacin: 143.00 - 145.00
o
C
9
H
13
NO
2
.HCl
(8)

3.5 CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN
3.5.1 Fundamentos de la tcnica
La cromatografa lquida de alta resolucin es actualmente la tcnica de
separacin ms ampliamente utilizada debido a su versatilidad y amplio campo
de aplicacin. Los componentes de la muestra, previamente disueltos en un
disolvente adecuado (fase mvil), son forzados a atravesar la columna
cromatogrfica gracias a la aplicacin de altas presiones. El material interno de la
columna, fase estacionaria, est constituido por un relleno capaz de retener de
forma selectiva los componentes de la mezcla. La resolucin de esta separacin
depende de la interaccin entre la fase estacionaria y la fase mvil, pudiendo ser
manipulada a travs de la eleccin de diferentes mezclas de disolventes y
distintos tipo de relleno. Como resultado final los componentes de la mezcla
salen de la columna separados en funcin de sus tiempos de retencin en lo que
constituye el cromatograma. A travs del cromatograma se puede realizar la
identificacin cualitativa y cuantitativa de las especies separadas.
3.5.2 Aplicaciones
El campo de aplicacin de esta tcnica es muy extenso. Algunas de las
aplicaciones se nombran a continuacin:
Productos farmacuticos: antibiticos, sedantes, esteroides, analgsicos
Bioqumica: aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos
Alimentacin: edulcorantes artificiales, antioxidantes, aditivos

9
Contaminantes: plaguicidas, herbicidas, fenoles, PCBs
Qumica forense: drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrgenos.
3.5.3 Requisitos y limitaciones
Las muestras se proporcionarn debidamente filtradas.
La cantidad mnima para realizar el ensayo es de 0.5 mL.
Con la entrega de la muestra se entregarn los patrones preparados en las
mismas condiciones que esta.
El rango de volumen de inyeccin que cubre el equipo es de 10 a 100 L.
(9)

3.5.4 Instrumentacin
Los componentes bsicos de un sistema para HPLC son:
A) Depsitos para la fase mvil (disolventes)
B) Sistema de bombeo para proporcionar presin a la fase mvil
C) Sistema de inyeccin de muestras
D) Columna cromatogrfica
E) Termostatos para las columnas
F) Detectores
G) Sistema para el tratamiento de datos y registrador

10

Como algunas de las fases mviles usadas en HPLC pueden ser
qumicamente activas como cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que
los componentes del sistema estn fabricados con materiales resistentes, por lo
que la mayora de las partes en contacto con la fase mvil suelen estar
fabricadas con acero inoxidable (Hernndez L. 2002).
Los disolventes ms usados en HPLC son agua, disoluciones tampn acuosas y
disolventes orgnicos como el metanol. Deben ser espectroscpicamente puros,
exentos de partculas slidas y desgasificados, esto se lleva a cabo con un gas
inerte muy poco soluble como el helio.
Como fase estacionaria lo ms comn es usar partculas microporosas esfricas
de slice muy puro, que son permeables al disolvente (Harris, D. 2001).
A. Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase mvil tienen
que ser inertes, es decir, el disolvente no deber extraer especie
alguna del material con el que estn construidos. Suelen ser botellas
de vidrio y tubos de tefln. Estn provistos de unos filtros,
indispensables para eliminar los gases disueltos y partculas que
pueda contener la fase mvil (Loro J. F. 2001).

11
B. Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeo tamao de
las partculas de la fase estacionaria, se utiliza una bomba que es la
encargada de introducir la fase mvil o disolvente a travs de la
columna.
Los sistemas de bombeo debern reunir las siguientes caractersticas:
Generar presiones superiores a 6000 psi.
Capaces de cubrir un amplio rango de flujo entre 0,1 y 10
mL/min con una precisin del 0,5% y que est libre de
pulsaciones.
Construidos con materiales inertes respecto a los disolventes
empleados.

Las bombas empleadas en HPLC son de tres tipos:
Bombas recprocas o de vaivn, son las ms utilizadas. Estn
formadas por una pequea cmara cilndrica que se llena y
luego se vaca por oscilacin de un pistn de zafiro. El
bombeo produce un flujo pulsado que despus debe
amortiguarse. Sus principales ventajas son que se consiguen
presiones elevadas y se suministra un caudal constante,
consiguindose adaptar a la tcnica de elucin con gradiente,
debido a su pequeo volumen interno (Skoog, D. A. et al.
2001).
Bombas neumticas o de presin constante, hacen uso de la
presin de un gas aplicado al recipiente conteniendo la fase
mvil. Son sencillas, no provocan pulsaciones pero estn
limitadas a presiones relativamente bajas. (Hernndez, L.
2002).
Bombas de desplazamiento o tipo jeringa, consisten en una
cmara equipada con un mecanismo de tornillo. Suministran

12
un flujo libre de pulsaciones pero con una capacidad limitada
a unos 250 mL. (Loro J. F. 2001)

C. Los volmenes que se inyectan de muestra debern ser pequeos
para evitar la sobrecarga de la columna. Hay varios tipos:
El mtodo ms simple es la utilizacin de una jeringa de alta presin
con un diafragma (septum) a la entrada de la columna. Est
limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi.
Las vlvulas de inyeccin con bucles de volumen conocido, es el
mtodo ms utilizado.

D. En las columnas cromatogrficas es donde se produce la velocidad
diferencial de los solutos que permite su separacin (Loro J. F. 2001).
El material de las columnas cromatogrficas suele ser de acero
inoxidable cuya longitud vara de 5 a 30 cm y un dimetro de 1 a 5
mm. La eficacia de las columnas aumenta al disminuir el tamao de
las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las
partculas es de 3-10 um.

Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se
protege la entrada de la columna con otra ms corta, la precolumna,
que retiene por adsorcin las impurezas de forma irreversible (Harris,
D. 2001).

E. No es necesario el control estricto de la temperatura de la columna,
pero las separaciones resultan ms reproducibles cuando la
temperatura se mantiene constante. Los instrumentos comerciales
modernos estn equipados con calentadores que regulan la
temperatura de la columna.

13
F. El papel del detector es indicar los momentos de aparicin de los
componentes, y proporcionar indicacin cuantitativa y cualitativa de
los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la
muestra y deber reunir una serie de caractersticas como son, tener
una sensibilidad elevada, buena estabilidad y reproducibilidad.
Amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la
presin y la temperatura. (Hernndez, L. 2002)
El detector se coloca al final de las columnas, responde a la
concentracin del soluto y se registra en funcin del tiempo y
obtenindose una serie de picos, generndose un grfico que se
denomina cromatograma. La posicin de los picos en el eje del
tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra.

Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele
presentar la fase mvil. Suelen ser muy selectivos y sensibles, los
cuales son:

Detectores de absorbancia ultravioleta, son los ms utilizados.
Su fundamento es la espectrofotometra de absorcin de luz
visible y ultravioleta de un componente a una determinada
longitud de onda. Los ms potentes son los que utilizan un
montaje de fotodiodos para registrar el espectro completo de
cada soluto que pasa por el detector. Los datos de absorbancia
se representan en funcin de la longitud de onda y del tiempo.

Detectores de fluorescencia, son muy sensibles y selectivos,
el principio de operacin se basa en la irradiacin con la luz
UV al componente de inters y la posterior medida de la luz
fluorescente emitida por ste.(Loro J. F. 2001)

14
Detectores electroqumicos, ofrece ventajas debido a su
especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad,
especialmente para compuestos orgnicos. Responde a
analitos que puedan oxidarse o reducirse. Es el ejemplo de
fenoles, aminas, perxidos (pueden detectarse por oxidacin)
y cetonas, aldehdos (detectados por reduccin). Las tcnicas
electroqumicas ms utilizadas con esta finalidad son la
amperometra, voltamperometra y culombimetra.

Los detectores basados en una propiedad de la disolucin, responden
a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles:

Detectores de ndice de refraccin, est formado por una celda
con dos compartimentos, en uno se introduce el disolvente
puro y en el otro la muestra, se hace pasar luz visible paralela.
Cuando entra en la celda soluto de distinto ndice de
refraccin al disolvente el has se desva y vara la seal dada
por la fotoclula (Harris, D. C. 2001). El principal
inconveniente es que son muy sensibles a los cambios de
temperatura y no resultan apropiados para trabajar con la
modalidad de elusin con gradiente.

Detectores de conductividad, son los ms utilizados cuando
los solutos eluidos son inicos, como cidos y bases, as como
cationes y aniones inorgnicos despus de su separacin por
cromatografa de cambio inico. Tienen elevada sensibilidad,
baratos y de larga duracin.
(9)

15
VENTAJA:
Sensibilidad de la tcnica.
Fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas.
Idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles.
Gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la
industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en
general.
(10)

DESVENTAJA:
Por las presiones altas que se manejan en HPLC, el equipo necesario
tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de
cromatografa.
El solvente se debe filtrar a travs de una membrana o microport
antes de utilizar.
Utilizar solventes de grados HPLC o de alta pureza lo que eleva los
costos.
El detector de fluorescencia es limitado por ciertas sustancias ya
que no todas las sustancias fluorescen.

3.6 VALIDACIN
La validacin de un mtodo analtico es el proceso que establece mediante
estudios en laboratorio, que las caractersticas de desempeo del mtodo cumplen
los requisitos adecuados de exactitud y confiabilidad para las aplicaciones
analticas previstas. Las caractersticas de desempeo analtico habituales que
deben considerarse en la validacin de los tipos de mtodos descritos son
exactitud, precisin, especificidad, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin,
linealidad e intervalo.

16
En el caso de mtodos farmacopeicos, puede resultar necesaria una nueva
validacin en las siguientes circunstancias: presentacin a la USP de un mtodo
analtico revisado o utilizacin de un mtodo general establecido con un nuevo
producto o materia prima.
Los documentos de la Conferencia Internacional Tripartita sobre Armonizacin
(ICH) aconsejan sobre la necesidad de realizar una nueva validacin en las
siguientes circunstancias: cambios en la sntesis del frmaco, cambios en la
composicin del producto farmacutico y cambios en el procedimiento analtico.
(11)
Cualquier mtodo de anlisis requiere su validacin. El mtodo descrito
debe incluir los principios en los que se basa y las referencias bibliogrficas
correspondientes, las especificaciones de los instrumentos y del equipo, los
requisitos del material a analizar, incluidas las condiciones de almacenamiento,
los diferentes reactivos, su procedencia comercial y el grado de pureza, su
preparacin y sus concentraciones expresadas en las unidades adecuadas, la
descripcin detallada de todos los pasos (especialmente de los crticos), cualquier
precaucin acerca de la seguridad en la manipulacin de las muestras, la
eliminacin de los residuos, el procedimiento de calibracin de los instrumentos,
el clculo de los resultados, las descripciones de los compuestos de referencia
(estndar) y el intervalo analtico (intervalo de concentraciones de los compuestos
en la muestra para el que puede aplicarse el mtodo sin modificacin).

En la eleccin de mtodos de anlisis, los estudios de estabilidad requieren
detectar pequeos cambios que pueden ser significativos a lo largo del tiempo de
almacenamiento. La cromatografa de gases (CG) y la cromatografa lquida de
alta resolucin (HPLC), los mtodos espectromtricos, las valoraciones
gravimtricas, volumtricas y electroqumicas, son capaces de tal precisin.

El control de calidad del producto final (para su comercializacin) requiere
la especificacin muy estrecha de los lmites de pureza y concentracin, para lo

17
que se usan la cromatografa lquida de alta resolucin HPLC o la cromatografa
de gases CG, por su sencillez, velocidad, buena especificidad y excelente
precisin.
(12)

3.7 CARACTERSTICAS DE DESEMPEO ANALTICO
Para asegurar la calidad de los resultados en un proceso de validacin se requiere
del cumplimiento de ciertas caractersticas de labarotario que satisfacen los
requerimientos de la aplicacin deseada.

3.7.1 EXACTITUD
La exactitud de un mtodo analtico es la proximidad entre los
resultados de la prueba obtenidos mediante ese mtodo, y el valor verdadero.
La exactitud de un mtodo analtico debe establecerse en todo su intervalo.
En la valoracin de un frmaco, la exactitud puede determinarse mediante la
aplicacin del mtodo analtico con respecto a un analito de pureza conocida
(por ejemplo, un estndar de referencia), o comparando los resultados del
mtodo con los de un segundo mtodo bien caracterizado, cuya exactitud se
haya comprobado o definido.
En la valoracin de un frmaco en un producto formulado, la exactitud
puede determinarse mediante la aplicacin del mtodo analtico a mezclas
sintticas de los componentes del producto farmacutico al que se hayan
aadido cantidades conocidas de analito dentro del intervalo del mtodo.

3.7.2 PRECISIN
La precisin de un mtodo analtico es el grado de concordancia entre
los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el mtodo
repetidamente a mltiples muestreos de una muestra homognea. La
precisin de un mtodo analtico habitualmente se expresa como la
desviacin estndar o la desviacin estndar relativa (coeficiente de
variacin) de una serie de mediciones. La precisin es una medida del grado

18
de reproducibilidad o de repetibilidad del mtodo analtico en condiciones
normales de operacin. La repetibilidad se refiere a la utilizacin del
procedimiento analtico en un laboratorio durante un perodo de tiempo
corto realizado por el mismo analista con el mismo equipo.
La precisin de un mtodo analtico se determina mediante el anlisis de un
nmero suficiente de alcuotas de una muestra homognea que permita
calcular estadsticamente estimaciones vlidas de la desviacin estndar o de
la desviacin estndar relativa (coeficiente de variacin).

3.7.3 ESPECIFICIDAD
Capacidad de evaluar de manera inequvoca el analito en presencia
de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, como
impurezas, productos de degradacin y componentes de la matriz. La falta
de especificidad de un procedimiento analtico individual puede
compensarse usando otros procedimientos analticos complementarios.
En anlisis cualitativos (pruebas de identificacin), debe demostrarse la
capacidad de distinguir compuestos de estructura estrechamente relacionada
cuya presencia resulta probable. Esta capacidad debera confirmarse
mediante la obtencin de resultados positivos a partir de muestras que
contengan el analito (quizs mediante comparacin con un material de
referencia conocido), junto con resultados negativos de muestras que no
contengan dicho analito, y mediante la confirmacin de que no se obtiene
una respuesta positiva de materiales con estructura similar o estrechamente
relacionada a la del analito.

3.7.4 LMITE DE DETECCIN
El lmite de deteccin es una caracterstica de las pruebas de lmite.
Es la cantidad mnima de analito en una muestra que puede detectarse,
aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales
indicadas. Las pruebas de lmite simplemente comprueban que la cantidad

19
de analito se encuentra por encima o por debajo de un nivel determinado. El
lmite de deteccin se expresa habitualmente en forma de concentracin de
analito (por ejemplo, porcentaje, partes por milln) en la muestra.
Para mtodos no instrumentales, el lmite de deteccin se determina
generalmente mediante el anlisis de muestras con concentraciones
conocidas de analito, estableciendo el nivel mnimo del analito que puede
detectarse confiablemente. Para procedimientos instrumentales, se puede
utilizar el mismo mtodo que para los no instrumentales.

3.7.5 LMITE DE CUANTIFICACIN
El lmite de cuantificacin es una caracterstica de las valoraciones
cuantitativas de compuestos que se encuentran en baja concentracin en la
matriz de una muestra, como por ejemplo: impurezas en frmacos a granel y
productos de degradacin en productos farmacuticos terminados. Es la
misma cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con
precisin y exactitud aceptables en las condiciones experimentales
indicadas. El lmite de cuantificacin se expresa habitualmente en forma de
concentracin de analito (por ejemplo, porcentaje, partes por milln) en la
muestra.
Para mtodos no instrumentales, el lmite cuantitativo se determina
habitualmente mediante el anlisis de muestras con concentraciones
conocidas de analito, estableciendo el nivel mnimo del analito que se puede
determinar con exactitud y precisin aceptables.
Para procedimientos instrumentales, se puede utilizar el mismo mtodo que
para los no instrumentales.

3.7.6 LINEALIDAD E INTERVALO
La linealidad de un mtodo analtico es su capacidad para obtener
resultados de prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por

20
medio de una transformacin matemtica bien definida, a la concentracin
del analito en muestras en un intervalo dado.
El intervalo de un mtodo analtico es la amplitud entre la concentracin
inferior y superior de analito (incluyendo esos niveles) en la cual se puede
determinar al analito con un nivel adecuado de precisin, exactitud y
linealidad utilizando el mtodo segn se describe por escrito. El intervalo se
expresa normalmente en las mismas unidades que los resultados de la prueba
(por ejemplo, porcentaje, partes por milln) obtenidos mediante el mtodo
analtico.
La linealidad debe establecerse en el intervalo completo del procedimiento
analtico. Debera establecerse inicialmente mediante examen visual de un
grfico de seales como funcin de concentracin de analito del contenido.
Si aparece existir una relacin lineal, los resultados de la prueba deberan
establecerse mediante mtodos estadsticos adecuados (por ejemplo,
mediante el clculo de una lnea de regresin por el mtodo de los cuadrados
mnimos).

3.7.7 TOLERANCIA, TAMBIN CONOCIDA COMO FORTALEZA O
RESISTENCIA
La tolerancia de un mtodo analtico es el grado de reproducibilidad
de los resultados de las pruebas obtenidos mediante el anlisis de las mismas
muestras en diversas condiciones, como por ejemplo en diferentes
laboratorios, con diferentes analistas, instrumentos, lotes de reactivos,
tiempo transcurrido durante la valoracin, temperaturas de valoracin o das.
La tolerancia se expresa normalmente como la carencia de influencia de las
variables operativas y ambientales del mtodo analtico sobre los resultados
de las pruebas. La tolerancia es una medida de la reproducibilidad de los
resultados de las pruebas sometidas a la variacin de condiciones que se
esperaran normalmente entre distintos laboratorios o distintos analistas.

21
La tolerancia de un mtodo analtico se determina mediante el anlisis de
alcuotas de lotes homogneos en diferentes laboratorios, por diferentes
analistas, utilizando condiciones operativas y ambientales que pueden ser
diferentes pero que continan encontrndose dentro de los parmetros
especificados del anlisis.

3.7.8 ROBUSTEZ
La robustez de un mtodo analtico es una medida de su capacidad
para no resultar afectado por pequeas pero deliberadas variaciones en los
parmetros del mtodo; adems proporciona una indicacin de su
confiabilidad durante su uso normal.

3.7.9 APTITUD DEL SISTEMA
Si las mediciones son susceptibles a variaciones en condiciones
analticas, stas deben controlarse adecuadamente o incluirse en el mtodo
una declaracin preventiva. Una consecuencia de la evaluacin de la
tolerancia y la robustez sera el establecimiento de una serie de parmetros
de aptitud del sistema que garantizan que se mantenga la validez del mtodo
analtico siempre que se utilice. Las variaciones tpicas son la estabilidad de
las soluciones y equipo analtico, y de los analistas. En la cromatografa
lquida, las variaciones habituales son el pH de la fase mvil, la composicin
de la fase mvil, diferentes lotes o proveedores de columnas, la temperatura
y la velocidad de flujo.
(12,13)

Las pruebas de aptitud del sistema se basan en el concepto de que el equipo,
el sistema electrnico, las operaciones analticas y las muestras a analizar
constituyen un sistema integral que puede evaluarse como tal. Los
parmetros de prueba de la aptitud del sistema que deben establecerse para
un mtodo especfico dependen del tipo de mtodo que se est evaluando.
(11)

22
Las farmacopeas no describen un mtodo analtico que pueda
cuantificar en un slo ensayo los cuatro principios activos contenidos en los
jarabes a ensayar y por eso se presenta este mtodo como una alternativa al
anlisis descrito en las farmacopeas. En la farmacopea Britnica se
encuentran las monografas de la materia prima Dextrometorfano
Bromohidrato y de Guaifenesina, siendo el mtodo de cuantificacin por
titulacin. En la farmacopea Mexicana estn las monografas de
Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromohidrato y Fenilefrina
Clorhidrato pero los ensayos tambin son por titulacin. La farmacopea
Estadounidense reporta las monografas de las materias primas de
Clorfeniramina Maleato y Fenilefrina Clorhidrato por titulacin, el
Dextrometorfano Bromohidrato y Guaifenesina se ensayan por mtodos
diferentes en cromatografa lquida de alta resolucin. nicamente en la
farmacopea Estadounidense se encontr una monografa para la
cuantificacin de Guaifenesina, Pseudoefedrina, Acetaminofn y
Dextrometorfano Bromohidrato en soluciones orales, pero el ensayo se
realiza por diferentes metodologas de anlisis en HPLC.

En la actualidad se efectu una revisin bibliogrfica sobre los
trabajos de tesis para optar la licenciatura de Qumico Farmacutico de la
Universidad de San Carlos de Guatemala y de la Universidad del Valle de
Guatemala, para verificar si exista alguna especfica en la validacin de la
metodologa analtica de estos principios activos en la forma farmacutica
analizada.

En junio 2006, Herberth Ral Arvalo Alvarado trabaj una
validacin retrospectiva de proceso de manufactura y mtodo de anlisis de
cpsulas de Diclofenaco Sdico 50 mg.
(14)
Con esto se estableci que la
validacin retrospectiva es aplicable para mtodos o procesos repetidamente
utilizados, que no han sido validados anteriormente y de los que se tiene

23
documentacin suficiente para probar el funcionamiento, tanto del proceso
de manufactura como del mtodo de anlisis. Adems de esto, es utilizado
para cualquier forma farmacutica slida, media vez se tenga los datos
suficientes para que dicha validacin tenga significancia estadstica.

En julio 2003, Mario Ren Pinzn Meza llev a cabo un estudio de
implementacin de metodologa para Acido Valproico por cromatografa
lquida de alta resolucin y validacin por cromatografa de gases con
detector selectivo de masas en muestras sricas.
(15)
El mtodo validado para
la determinacin de Acido Valproico por cromatografa de gases con
detector selectivo de masas es eficaz, rpido y confiable, permite resultados
rpidos, los que por su carcter de validacin son de completa confianza al
cumplir con los parmetros de establecidos por la USP XXIV aplicables a
muestras biolgicas.

En mayo de 2002, Rossana Anleu Lainfiesta realiz una
investigacin para validar un mtodo por cromatografa lquida de alta
resolucin para la cuantificacin de Ibuprofeno en suspensin.
(1)
El mtodo
demostr ser selectivo para Ibuprofeno ya que separa esta sustancia del resto
de ingredientes en la formulacin; y es vlido porque puede utilizarse como
un mtodo analtico, es decir, que cumple con las caractersticas necesarias
para poder cuantificar Ibuprofeno en la forma farmacutica de suspensin.

En noviembre de 2002, Anabelly Carolina Franco Flores elabor una
gua para validar mtodos analticos nuevos o modificados para productos
farmacuticos.
(16)
Se determin que para validar un mtodo analtico, es
indispensable disponer de un diseo experimental apropiado, establecer
lmites expresados en trminos cuantificables, y un tratamiento estadstico
adecuado de los datos obtenidos experimentalmente. As mismo, se debe
tener en claro las caractersticas y requerimientos que debe satisfacer el

24
mtodo analtico a validar, que garantiza el buen funcionamiento del sistema
en el momento del anlisis para su aplicacin rutinaria y la seguridad en
obtener un rendimiento aceptable.

En enero 1998, Sandra Patricia de Len Barrientos efectu un
estudio sobre validacin del mtodo de cromatografa lquida de alta
resolucin para cuantificacin de vitamina A en tabletas masticables.
(17)
Se
comprob que el mtodo propuesto es capaz de diferenciar Vitamina A de
cualquier otra sustancia, ya sea activo o placebo, presente en la formulacin
utilizada de dicho trabajo de tesis. En s, el sistema es capaz de detectar
niveles de Vitamina A en tabletas multivitamnicas masticables que van
desde 912.5 UI hasta 5475.0 UI.

25

4. JUSTIFICACIN
El tiempo del proceso de fabricacin de un producto farmacutico es notablemente
afectado por el tiempo utilizado en la elaboracin de sus respectivos anlisis fsicos,
qumicos y microbiolgicos, mismos que deben realizarse para garantizar la calidad del
producto. Por lo que es importante contar con metodologas de anlisis rpidos, precisos y
confiables.

La precisin y exactitud de un mtodo es determinado mediante el cumplimiento de
los parmetros de validacin (linealidad, exactitud, precisin intermedia, especificidad,
etc.). Es por ello que surge la necesidad de brindar una metodologa validada y rpida para
la cuantificacin de maleato de clorfeniramina, bromohidrato de dextrometorfano,
guaifenesina y fenilefrina clorhidrato, realizndose sta por cromatografa lquida de alta
resolucin ya que esta tcnica brinda una mejor separacin de los activos de posibles
componentes interferentes (excipientes).

Estos medicamentos por su actividad antitusgena son combinados para potenciar la
accin teraputica que beneficiar adultos y nios; as mismo, sus propiedades
fisicoqumicas permiten elaborar un producto farmacolgico, homogneo y de fcil
adquisicin.

Los estudios recientes muestran que no hay un mtodo analtico que involucre la
asociacin de cuatro principios activos. Debido a esto surgi la necesidad de realizar un
estudio de validacin para la cuantificacin de maleato de clorfeniramina, bromohidrato de
dextrometorfano, guaifenesina y fenilefrina clorhidrato, dos jarabes en un slo mtodo
analtico.

26

5. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Desarrollar y validar un mtodo analtico por cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC), que cumpla con los requerimientos y normas ICH y Farmacopea
Estadounidense (USP 2006) para la cuantificacin de cuatro principios activos
contenidos en dos medicamentos.

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
4.2.1 Disear un mtodo de anlisis selectivo para la cuantificacin de Maleato de
Clorfeniramina, Bromohidrato de Dextrometorfano, Guaifenesina y
Fenilefrina Clorhidrato utilizando cromatografa lquida de alta resolucin.

4.2.2 Determinar y demostrar que la metodologa propuesta cumple con los
parmetros de linealidad, exactitud, repetibilidad, precisin intermedia y
especificidad segn lo establece la Farmacopea Estadounidense (USP) y
normas de Validation of Analitical procedures ICH.

4.2.4 Proveer una metodologa validada que sirva como gua a la industria
farmacutica para la cuantificacin de estos principios activos, tomando en
cuenta que si es utilizada en otros productos debe de ser ensayada y validada
nuevamente.

27

6. HIPTESIS
El mtodo analtico por cromatografa lquida de alta resolucin para la cuantificacin
de clorfeniramina maleato, dextrometorfano bromohidrato, guaifenesina y fenilefrina
clorhidrato en los jarabes sometidos al anlisis, cumple con los parmetros de validacin
establecidos en la Farmacopea de los Estados Unidos versin en espaol USP 30 y normas
ICH Q2B (Internacional Conference on Harmonised), por lo que proporciona datos
precisos, reproducibles y confiables.

28

7. MATERIALES Y MTODOS
7.1 UNIVERSO DE TRABAJO
Muestras de dos jarabes comerciales.
Jarabe A composicin terica.
Clorfeniramina Maleato 1 mg/5mL
Dextrometorfano Bromohidrato..5 mg/5mL
Fenilefrina Clorhidrato2.5 mg/mL

Jarabe B composicin terica
Guaifenesina100 mg/5mL
Clorfeniramina Maleato 2 mg/5mL
Dextrometorfano Bromohidrato10 mg/5mL

7.2 MEDIOS
7.2.1 Recursos Humanos
Autora: Frida Lucitania Vallejo Garca
Asesora: Lcda. Ibe Arleth Arriola Daz
Co-Asesor: Lic. Francisco Estuardo Serrano Vives
Revisora: Lcda. Alma Lucrecia Martnez Cano
Colaboradora: Lcda.Viviana Lisbeth Sandoval Lutn
Personal profesional y tcnico del Laboratorio Transnacional del
Departamento de Investigacin y Desarrollo

7.2.2 Materiales
Libros
Folletos
Informacin por Internet
Cmara digital
Memoria USB

29
Papel bond para impresora
Papel pH
Filtros Wathman

7.2.3 Instalaciones
Laboratorio transnacional
Biblioteca de la Universidad del Valle de Guatemala
Biblioteca Central de la Universidad de San Carlos de Guatemala
Centro Guatemalteco de Informacin de Medicamentos CEGIMED-
Centro de Documentacin/Biblioteca de Farmacia CEDOBF-

7.3 RECURSOS MATERIALES
7.3.1 Equipo
Cromatgrafo lquido de alta resolucin
Jeringa de 50 L
Columna Whatman Partisil SCX
Balanza analtica
Esptula
Bomba al vaco
Estufa con calentador y agitador
Magnetos
Bao de Mara
Bao de ultrasonido
Potencimetro
Computadora
Impresora

30
7.3.2 Datos de la calibracin de equipos
Descripcin del equipo: Cromatgrafo lquido de alta resolucin, marca
Merck Hitachi Serie d-7000 con detector UV-VIS y automuestreador,
cdigo ID-EE-056.
Fecha de calibracin: 22 de septiembre del 2006.
Frecuencia de calibracin: Cada 4 meses.
Empresa y persona que lo calibr: Ing. Daniel Prez de MERCK.
*

Descripcin del equipo: Balanza analtica marca Mettler Toledo AG 204,
cdigo ID-EE-052.
Fecha de calibracin: 20 de junio del 2006.
Empresa y persona que lo calibr: Sr. Jacobo Chum de PRESICIN.
Frecuencia de calibracin: Cada 6 meses. *
* (Ver copia de los certificados de calibracin en Anexos)

7.3.3 Reactivos
Agua HPLC
Metanol HPLC
Fosfato Monobsico de Potasio
cido fosfrico al 50%

7.3.4 Cristalera
Balones volumtricos de 25, 50, 100, 1,000 y 2,000 mL
Pipeta volumtrica de 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7 y 10 mL
Beackers de 50, 100, 1,000 y 2,000 mL
Embudos
Kitazato y equipo de filtracin
Varilla de vidrio
Probetas de 100 mL
Viales
Micropipetas

31
7.4 METODOLOGA
7.4.1 CUANTIFICACIN DE GUAIFENESINA
La cuantificacin de Guaifenesina se llev a cabo mediante el Mtodo de
Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual posee los siguientes
procedimientos:

7.4.1.1 PREPARACIN DE REACTIVOS:
Fase Mvil: En un recipiente adecuado se coloc 600 mL de
metanol HPLC agregando 400 mL de buffer de fosfatos pH 4
para mezclar y filtrar a travs de una membrana de nylon 0.45
m que permiti desgasificar.
cido Fosfrico al 20%: Se midi 25 mL de cido fosfrico al
85% y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL que
contena 50 mL de agua desmineralizada que se llev a volumen
con el mismo solvente.
Buffer de Fosfatos: Se pes 3.4 g de fosfato monobsico de
potasio, disolvindolos en 450 mL de agua para ajustar a pH 4
con cido fosfrico al 20% (1 a 5 gotas) llevando a volumen de
500 mL.
Solucin de Dilucin: Se prepar una solucin con 40% de agua
y 60% de metanol HPLC que se filtr a travs de una membrana
de nylon de 0.45 m para desgasificar.

7.4.1.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN:
Se pesaron 200 mg de Guaifenesina que se transfirieron a un baln
volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin,
sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar.
Posteriormente se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln
volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin de
dilucin.

32
La concentracin final aproximada es de: Guaifenesina 0.4 mg/mL.

7.4.1.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA:
Para preparar la muestra se pes 200 mg de materia prima y se
transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con
solucin de dilucin, despus sonificar llevando a volumen con la
misma solucin y finalmente mezclar. En seguida se transfirieron 5
mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL llevando a
volumen con la solucin de dilucin.
La concentracin final aproximada es de: Guaifenesina 0.4 mg/mL.

7.4.1.4 SISTEMA CROMATOGRFICO:
Aparato: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin
Columna: Whatman 10 SCX (Con grupos arilsulfnicos)
Longitud de onda: 220 nm
Volumen de inyeccin: 20 L
Flujo de la fase mvil: 1.0 mL/min.
Fase Mvil: Metanol HPLC: Buffer de fosfatos pH 4 (600:400)

7.4.1.5 PROCEDIMIENTO:
Se inyect la solucin patrn y por duplicado la muestra de
Guaifenesina segn el procedimiento del punto 7.4.1.3

7.4.1.6 CLCULOS:
Para encontrar la concentracin de Guaifenesina se calcul la
cantidad en % de Guaifenesina por cada 5 mL, mediante la
siguiente frmula:

100 % x
Pm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
=

33
Donde:
Am = rea obtenida en la solucin muestra
Ap = rea obtenida en la solucin patrn
Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Guaifenesina
P = Pureza del patrn (%100)
Dil = Diluciones de la muestra
Pm = Peso de la muestra
100 = Factor para reportar en %

7.4.2 CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO
La cuantificacin de Clorfeniramina Maleato se llev a cabo mediante el
Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual posee
los siguientes procedimientos:

contenan 50 mL de agua desmineralizada que se llev a
volumen con el mismo solvente.
potasio, disolvindolos en 450 mL de agua y ajustar a pH 4
con cido fosfrico al 20% (1 a 5 gotas) llevando a volumen
de 500 mL.

34
Solucin de Dilucin: Se prepar una solucin que contenga
40% agua y 60% de metanol HPLC que se filtr a travs de una
membrana de nylon de 0.45 m para desgasificar.

Se pesaron 8 mg de Clorfeniramina Maleato que se transfirieron a
un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de
dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego
mezclar. Posteriormente se transfirieron 5 mL de esta solucin a un
baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin de
dilucin.
La concentracin final aproximada es de: Clorfeniramina Maleato
0.08 mg/mL.

7.4.2.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA
solucin de dilucin, despus sonificar llevando a volumen con la
misma solucin y finalmente mezclar. En seguida se transfirieron 5
mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL llevando a
volumen con la solucin de dilucin.
La concentracin final aproximada es de: Clorfeniramina Maleato
0.08 mg/mL

Columna: Whatman 10 SCX
(Con grupos arilsulfnicos)

35
Fase Mvil: Metanol HPLC: buffer de fosfatos pH 4 (600:400)

Clorfeniramina Maleato segn procedimiento del punto 7.4.2.3

7.4.2.6 CLCULOS:
Para encontrar la concentracin de Clorfeniramina Maleato se
calcul la cantidad en % de Clorfeniramina Maleato, mediante la
siguiente frmula:

100 % x
Pm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
=

Donde:
Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Clorfeniramina
Maleato

7.4.3 CUANTIFICACIN DE FENILEFRINA CLORHIDRATO
La cuantificacin de Fenilefrina Clorhidrato se llev a cabo mediante el
Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual posee
los siguientes procedimientos:

36
7.4.3.1 PREPARACN DE REACTIVOS:
potasio, disolvindolos en 450 mL de agua y ajustar a pH 4 con
cido fosfrico al 20% (1 a 5 gotas) llevando a volumen de 500
mL.

Se pesaron 20 mg de Fenilefrina Clorhidrato que se transfirieron a
un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de
baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin de
dilucin.
La concentracin final aproximada es de: Fenilefrina Clorhidrato
0.04 mg/mL


37
solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma
solucin y finalmente mezclar. Enseguida se transfirieron 5 mL de
esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL llevando a volumen
con la solucin de dilucin.
0.04 mg/mL

Columna: Whatman 10 SCX (Con grupos arilsulfnicos)

Fenilefrina Clorhidrato segn procedimiento del punto 7.4.3.3

7.4.3.6 CLCULOS:
Para encontrar la concentracin de Fenilefrina Clorhidrato se calcul
la cantidad en % de Fenilefrina Clorhidrato, mediante la siguiente
frmula:

5 % x
Pm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
=

Donde:

38
Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Fenilefrina
Clorhidrato

7.4.4 CUANTIFICACIN DE DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO
La cuantificacin de Dextrometorfano Bromhidrato se llev a cabo mediante
el Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual
posee los siguientes procedimientos:

mL.
Solucin de Dilucin: Se prepar una solucin que contenga 40%
agua y 60% de metanol HPLC que se filtr a travs de una

39
Se pesaron 40 mg de Dextrometorfano Bromhidrato que se
solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma
solucin y luego mezclar. Posteriormente se transfirieron 5 mL de
esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen
La concentracin final aproximada es de: Dextrometorfano
Bromhidrato 0.08 mg/mL.

Para preparar la muestra se pes 40 mg de Dextrometorfano
Bromhidrato, y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL,
disolviendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen
con la misma solucin y finalmente mezclar. Enseguida se
transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL
llevando a volumen con la solucin de dilucin.
La concentracin final aproximada es de: Dextrometorfano
Bromhidrato 0.08 mg/mL.

Columna: Whatman 10 SCX (Con grupos
arilsulfnicos)

40
Dextrometorfano Bromhidrato segn procedimiento del punto 7.4.4.3

7.4.4.6 CLCULOS:
Para encontrar la concentracin de Dextrometorfano Bromhidrato se
calcul la cantidad en % de Dextrometorfano Bromhidrato,
mediante la siguiente frmula:

100 % x
Pm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
=

Donde:
Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Dextrometorfano
Bromhidrato

7.4.5 CUANTIFICACIN DE FENILEFRINA, DEXTROMETORFANO Y
CLORFENIRAMINA EN JARABE A
La cuantificacin de Fenilefrina, Dextrometorfano y Clorfeniramina en Jarabe
A se llev a cabo mediante el Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin (HPLC), el cual posee los siguientes procedimientos:

41
mL.

Se pesaron 20 mg de Fenilefrina Clorhidrato, 40 mg de
Dextrometorfano Bromhidrato y 8 mg de Clorfeniramina Maleato
que se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo
con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma
solucin y luego mezclar. Posteriormente se transfirieron 5 mL de
esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen
0.04 mg/mL, Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL,
Clorfeniramina Maleato 0.016 mg/mL.

42
Para preparar la muestra se transfirieron 2 mL de Jarabe A a un baln
volumtrico de 25 mL diluyendo con solucin de dilucin, sonificar
y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar.
Enseguida se filtr a travs de un filtro Whatman No1.
0.04 mg/mL, Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL y
Clorfeniramina Maleato 0.016 mg/mL.

arilsulfnicos)

Jarabe A segn procedimiento del punto 7.4.5.3

7.4.5.6 CLCULOS:
Para encontrar la concentracin de Dextrometorfano Bromhidrato se
calcul la cantidad en mg de Dextrometorfano por cada 5 mL,

5
5
x
Vm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
mL
rfano Dextrometo de mg
=

43
Donde:
Bromhidrato
Vm = Volumen medido de la muestra en mL.
5 = Factor para reportar en mg/5mL.

Para encontrar la concentracin de Clorfeniramina Maleato se
calcul la cantidad en mg de Clorfeniramina Maleato por cada 5
mL, mediante la siguiente frmula:

5
5
min
x
Vm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
mL
a Clorfenira de mg
=

Donde:
Maleato.
Vm = Volumen medido de la muestra
5 = Factor para reportar en mg/5mL

Para encontrar la concentracin de Fenilefrina se calcul la cantidad
en mg de Fenilefrina por cada 5 mL, mediante la siguiente frmula:

44

5
5
x
Vm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
mL
a Fenilefrin de mg
=

Donde:
Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Fenilefrina.
P = Pureza del patrn

7.4.6 CUANTIFICACIN DE GUAIFENESINA, DEXTROMETORFANO Y
CLORFENIRAMINA EN JARABE B
La cuantificacin de Guaifenesina, Dextrometorfano y Clorfeniramina en
Jarabe B se llev a cabo mediante el Mtodo de Cromatografa Lquida de
Alta Resolucin (HPLC), el cual posee los siguientes procedimientos:


45
mL.

Se pesaron 200 mg de Guaifenesina, 40 mg de Dextrometorfano
Bromhidrato y 8 mg de Clorfeniramina Maleato que se transfirieron
a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de
baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin
de dilucin.
La concentracin final aproximada es de: Guaifenesina 0.4 mg/mL,
Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL, Clorfeniramina Maleato
0.016 mg/mL.

7.4.6.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA
Para preparar la muestra se transfirieron 2 mL de Jarabe B a un baln
volumtrico de 25 mL diluyendo con solucin de dilucin, sonificar
y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar.
Enseguida se filtr a travs de un filtro Whatman No1.
La concentracin final aproximada es de: Guaifenesina 0.4 mg/ mL,
Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL y Clorfeniramina
Maleato 0.016 mg/mL.

46
arilsulfnicos)
Flujo de la fase mvil: 1.0 ml/min.

Jarabe B segn procedimiento del punto 7.4.6.3

7.4.6.6 CLCULOS:
Para encontrar la concentracin de Dextrometorfano se calcul la
cantidad en mg de Dextrometorfano por cada 5 mL, mediante la
siguiente frmula:

5
5
x
Vm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
mL
rfano Dextrometo de mg
=

Donde:
Bromhidrato
Vm = Volumen medido de la muestra en mL

47
Para encontrar la concentracin de Clorfeniramina se calcul la
cantidad en mg de Clorfeniramina Maleato por cada 5 mL,

5
5
min
x
Vm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
mL
a Clorfenira de mg
=

Donde:
Maleato.
Vm = Volumen medido de la muestra

Para encontrar la concentracin de Fenilefrina se calcul la cantidad
en mg de Fenilefrina por cada 5 mL, mediante la siguiente frmula:

5
5
x
Vm
Dil
x P x Cp x
Ap
Am
mL
a Fenilefrin de mg
=

Donde:
Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Fenilefrina
P = Pureza del patrn

48

7.4.7 PROCEDIMIENTO DE VALIDACIN DE LA METODOLOGA
ANALTICA
Un mtodo de anlisis para ser validado debi demostrar informacin
documentada del procedimiento seguido, lo cual debi corresponder a un
diseo experimental junto con un procedimiento estadstico apropiado y con
evidencias de aceptacin de la funcionalidad del mtodo para las aplicaciones
analticas propuestas.

EVALUACIN DE LOS PARAMETROS DE DESEMPEO
Para validar una metodologa de anlisis se evaluaron los siguientes
parmetros de desempeo analtico.

EXACTITUD
La exactitud se determin mediante la aplicacin del mtodo analtico a una
de las siguientes pruebas:

Valoracin de un principio activo
Se analizaron tres diferentes concentraciones del analito de pureza conocida
cada una por triplicado (en base a un estndar de referencia).

VALORACIN DE UN PRINCIPIO ACTIVO EN UN PRODUCTO
TERMINADO
Mtodo de acumulacin
Se obtuvieron muestras de todos los componentes del producto farmacutico,
agregando tres cantidades diferentes y conocidas del analito al producto
farmacutico que corresponden a un lote de fabricacin determinado.

49
Antes de agregar el analito a la muestra fue necesario determinar el contenido
promedio del analito en la muestra con el mtodo a validar y luego se procedi
a enriquecer las muestras con el estndar.
Los valores del analito sugeridos que se agregaron son del 100, 120 y 140% de
la concentracin normal de trabajo del mtodo, pero variaban segn la prueba
de validacin que se ensayaba; as mismo el nmero de datos que se
empleaban en cada prueba.
Para realizar los clculos del porcentaje de recuperacin del analito fue
necesario restar el promedio de las concentraciones del analito contenidas en
las muestras determinadas inicialmente para determinar el valor real utilizado.

PRECISIN
La precisin es una medida del grado de repetibilidad o de la reproducibilidad
del mtodo analtico en condiciones normales de operacin.

Repetibilidad
Esta prueba se realiz analizando la muestra en un mismo laboratorio, bajo las
mismas condiciones de operacin, por el mismo analista, con los mismos
aparatos y reactivos y en el curso de la misma serie de anlisis efectuados. Se
realiz el siguiente ensayo:
Se analiz la muestra (materia prima y producto terminado) que en el
ensayo fue tomada como el cien por ciento (concentracin normal de
trabajo del mtodo sometido a validacin) un mnimo de seis veces.

Precisin intermedia
Para la realizacin de esta prueba se analiz la muestra a la concentracin
tomada como el cien por ciento y se obtuvieron variaciones en las condiciones
de anlisis de la siguiente manera:
Un mismo analista, dos das diferentes de anlisis, el mismo aparato o
instrumento.

50
Dos analistas diferentes, en el mismo da de anlisis, el mismo aparato
o instrumento.
Se evaluaron dos variaciones en las condiciones de anlisis y la muestra se
analiz un mnimo de seis veces con cada variacin.

LINEALIDAD E INTERVALO DE LINEALIDAD
Para este ensayo se realizaron las pruebas de Linealidad del Sistema y
Linealidad del Mtodo.

Linealidad del Sistema
Para la linealidad del sistema se prepar una solucin patrn (solucin madre)
y a partir de sta se realizaron las diluciones necesarias obtenindose como
mnimo cinco diferentes concentraciones (soluciones hijas). La curva de
calibracin se obtuvo con los resultados de las soluciones hijas, las cuales se
analizaron con el mismo mtodo analtico, bajo las mismas condiciones, el
mismo aparato o instrumento, el mismo da y el mismo analista. Para la
validacin de un principio activo (materia prima) o producto terminado se
incluyeron las concentraciones del 60% al 140%. Este procedimiento se
repiti tres veces.

Linealidad del mtodo
Para la linealidad del mtodo se analizaron las muestras a tres diferentes
concentraciones por triplicado, bajo las mismas condiciones de operacin, por
el mismo analista y en el mismo da.

Intervalo de linealidad
El intervalo de linealidad lo constituy el rango en el cual se examin la
linealidad.

51
ESPECIFICIDAD
Para realizar la prueba de especificidad se sometieron la muestra y la solucin
de mezcla de estndares a diferentes condiciones que dieron origen a la
formacin de productos de degradacin.

La degradacin se obtuvo con los siguientes mtodos.
Degradacin cida: a la muestra se le agregaron 10 mL de cido
clorhdrico 1.2N, se calentaron durante 30 minutos, neutralizndose
con una solucin de NaOH diluido que enseguida se afor.
Degradacin bsica: a la muestra se le agregaron 10 mL de hidrxido
de sodio 0.1N, se calentaron durante 30 minutos, se neutraliz con una
solucin de HCl diluido que enseguida se afor.
Degradacin con agua oxigenada: a la muestra se le agregaron 10 mL
de agua oxigenada de 10 volmenes, se calentaron durante 30 minutos
que despus se afor.
Degradacin con sulfito de sodio: a la muestra se le agregaron 10 mL
de sulfito de sodio al 10%, se calentaron durante 30 minutos que
despus se afor.

7.4.8 TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS RESULTADOS
Los resultados obtenidos fueron ingresados en un programa estadstico para
las pruebas de validacin llamado Validacin de Tcnicas Analticas,
establecido y recomendado por ICH, FDA, USP 25, que permite analizarlos
con base en los criterios de aceptacin de cada parmetro.
(22)

EXACTITUD
La exactitud se calcul como el porcentaje de recuperacin de la cantidad
valorada con respecto a la cantidad conocida de analito aadida a la muestra o
como la diferencia entre la medida de la valoracin y el valor verdadero
aceptado, considerando los intervalos de confianza.

52
Se registraron los resultados obtenidos y se calcul lo siguiente:
a) Porcentaje de recuperacin
b) Coeficiente de variacin

Los resultados se compararon con los siguientes criterios de aceptacin:
a) Porcentaje de recuperacin: %R: 98.00% - 102.00%
b) Coeficiente de variacin: %CV menor o igual a 2.0%

PRECISIN
Precisin Intermedia
Se calcul el % de coeficiente de variacin, el cual tiene un criterio de
aceptacin menor o igual al 2%.

Repetibilidad
Se calcul:
- El porcentaje de coeficiente de variacin, el cual tiene un criterio de
aceptacin no mayor al 2%.
- El porcentaje de recuperacin, el cual tiene un criterio de aceptacin
del 98 al 102%.

ESPECIFICIDAD
Se compararon las respuestas obtenidas del producto sin degradar con las
respuestas obtenidas con el producto degradado por los diferentes mtodos.
Los agentes de degradacin presentaron otra respuesta obtenida con las
muestras no degradadas.
El mtodo de anlisis es especfico porque los productos de degradacin
aparecieron en diferentes tiempos de retencin en que eluyeron los analitos de
inters para la materia prima y el Jarabe A; sin embargo para la Guaifenesina
en el Jarabe B no era especfico este mtodo.

53
LINEALIDAD
Linealidad del sistema
Se determin la ecuacin de la regresin lineal (y = a + bx) calculada por el
mtodo de mnimos cuadrados basada en lecturas (y) versus concentracin (x).
Se evalu con p = 0.05.

Se demostraron los resultados de:
a) Ecuacin de la recta
b) Coeficiente de correlacin r
c) Coeficiente de determinacin r
2

d) Grfica de linealidad
e) Intervalo de confianza
f) Intervalo de confianza

Se presentaron los resultados de los criterios de aceptacin:
a) Coeficiente de correlacin r mayor o igual a 0.990
b) Coeficiente de determinacin r
2
mayor o igual a 0.980
c) El intervalo de confianza de la pendiente () no debe de incluir el cero

Linealidad del mtodo
Se determin la ecuacin de la regresin lineal (y = a + bx) la cual debe ser
calculada por el mtodo de mnimos cuadrados basado en lectura (y) versus
concentracin (x). La evaluacin se realiz con p = 0.05.

Se demostraron los resultados de:
a) Ecuacin de la recta
b) Coeficiente de correlacin r
c) Coeficiente de determinacin r
2

d) Grfica de linealidad
e) Intervalo de confianza
f) Intervalo de confianza

54
Se presentaron los resultados de los criterios de aceptacin:
a) Coeficiente de correlacin r mayor o igual a 0.990
b) Coeficiente de determinacin r
2
mayor o igual a 0.980
c) El intervalo de confianza del intercepto () debe de incluir el cero

Despus de realizadas todas las pruebas se emiti la conclusin de cada
caracterstica de validacin.

55

8.1 PARMETRO DE EXACTITUD
Los resultados que se obtuvieron en la exactitud de la materia prima se resumen en la
siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No.1, 6, 11 y 16.

TABLA No.1

EXACTITUD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE
FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA

Materia prima
Parmetro
estadstico

Concentracin 01

Concentracin 02

Concentracin 03
Nominal 80.00 % 100.00 % 120.00 %
Valor medio 81.026200 100.495333 120.192000
Coeficiente
de variacin

0.105581

0.080164

0.143847

Clorfeniramina
Maleato

% Recupe. 101.28% 100.49% 100.16%
Valor medio 80.074400 99.565133 119.731667
Coeficiente
de variacin

0.050058

0.021945

0.688070

Dextrometorfano
Bromhidrato
% Recupe. 100.01% 99.56% 99.78%
Valor medio 80.055033 98.631700 119.497000
Coeficiente
de variacin

0.161277

0.081733

0.637414

Fenilefrina
Clorhidrato
% Recupe. 100.068% 98.63% 99.58%
Valor medio 80.659167 99.848600 119.690667
Coeficiente
de variacin

0.078580

0.117413

0.695644

Guifenesina

% Recupe. 100.82% 99.84% 99.74%
8. RESULTADOS

Los resultados que se obtuvieron en la exactitud de las materias primas que componen
los Jarabes A y B se resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de
los cuadros No. 21, 22, 23, 36, 37 y 38.

56
TABLA No. 2

EXACTITUD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE
CLORFENIRAMINA MALEATO Y DEXTROMETORFANO CLORHIDRATO EN
JARABE A Y B

Concentracin 01 Concentracin 02 Concentracin 03
Jarabe
Parmetro
estadstico Dextro. Clorfe. Dextro. Clorfe. Dextro. Clorfe.
Nominal 100.00% 100.00% 120.00% 120.00% 150.00% 150.00%
Valor medio 97.822867 93.876100 121.235667 120.238000 149.101333 148.531667
Coeficiente
de variacin

0.746033

0.745059

2.269117

2.007170

0.470224

0.210020

A
% Recupe. 97.82% 93.88% 101.03% 100.20% 99.40% 99.02%
Nominal 80.00% 80.00% 100.00% 100.00% 120.00% 120.00%
Valor medio 80.845767 80.926000 100.458133 99.948067 121.003000 121.120667
Coeficiente
de variacin

0.548386

0.199305

1.021266

1.523579

0.651161

0.688135

B
% Recupe. 101.06% 101.16% 100.46% 99.95% 100.84% 100.93%

TABLA No. 3

EXACTITUD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN EN
FENILEFRINA CLORHIDRATO EN JARABE A Y GUAIFENESINA EN
JARABE B

Jarabe
Parmetro
estadstico

Concentracin 01

Concentracin 02

Concentracin 03

Nominal 100.00 % 120.00 % 150.00 %
Valor medio 99.087600 121.275667 149.324667

A
Fenilefrina
Clorhidrato
Coeficiente
de variacin

0.482636

2.350996

0.952139
% Recupe. 99.09% 101.06% 99.55%
Nominal 80.00 % 100.00 % 120.00 %
Valor medio 93.031700 113.751333 109.107667 B
Guaifenesina
Coeficiente
de variacin

0.243840

1.114107

17.24
% Recupe. 116.29% 113.75% 90.93%

57
8.2 PARMETRO DE PRECISIN
8.2.1 REPETIBILIDAD
Los resultados que se obtuvieron en la repetibilidad de las materias primas se resumen
en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No. 3, 8, 13 y 18.

TABLA No. 4

REPETIBILIDAD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE

Parmetro
estadstico
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato
Fenilefrina
Clorhidrato

Guaifenesina
Nmero de datos 6 6 6 6
Valor medio 102.593 102.297 99.912 102.169
Desviacin
estndar 1.959 1.948 1.650 1.889
Coeficiente de
variacin (%) 1.910% 1.904% 1.651%

1.849%
Intervalo de
confianza

0.54 %

0.54% 0.45% 0.52%

58
Los resultados que obtuvieron en la repetibilidad de las materias primas que
componen los jarabes A y B se resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en
anexos de los cuadros No. 27, 28, 29, 42, 43 y 44.

TABLA No.5

CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, Y
FENILEFRINA CLORHIDRATO EN JARABE A

Parmetro
estadstico
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato
Fenilefrina
Clorhidrato
Nmero de datos 6

6 6
Valor medio 97.482 99.405 99.912
Desviacin
estndar 0.461

0.554 1.650
Coeficiente de
variacin (%) 0.473% 0.558% 1.651%
Intervalo de
confianza 0.13% 0.15% 0.45%

TABLA No.6

CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, Y
GUAIFENESINA EN JARABE B

Parmetro
estadstico
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato

Guaifenesina
Nmero de Datos 6 6 6
Valor medio 103.398 106.257 112.802
Desviacin
estndar 1.361

1.509 1.444
Coeficiente de
variacin (%) 1.316%

1.42% 1.280%
Intervalo de
confianza 0.37% 0.42% 0.40%

59
8.2.2 PRECISIN INTERMEDIA

Los resultados que se obtuvieron en la precisin intermedia de la materia prima se
resumen en la siguiente tabla y se pueden apreciar en anexos de los cuadros No. 2, 7,
12 y 17.

TABLA No. 7

PRECISIN INTERMEDIA PARA EL MTODO DE ANLISIS DE
CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO
BROMHIDRATO, FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA

Condiciones: 2 analistas, 1 instrumento, 2 das

Parmetro
estadstico
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato
Fenilefrina
Clorhidrato

Guaifenesina
Valor medio 101.2958 101.1500 99.4384 101.1584
Desviacin
estndard

0.0147

0.0188

0.01209 0.0147
Coeficiente
de variacin
(%):

1.4520

1.8607

1.2162

1.4511
Nmero de
datos

14

14

14 14

60
Los resultados que se determinaron en la precisin intermedia de las materias primas
que componen los Jarabes A y B se resumen en la siguiente tabla y se pueden apreciar
en anexos de los cuadros No. 24, 25, 26, 39, 40 y 41.

TABLA No. 8

BROMHIDRATO Y FENILEFRINA CLORHIDRATO EN JARABE A


Parmetro
estadstico
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato
Fenilefrina
Clorhidrato
Valor medio 97.0278

102.4180 106.3059
Desviacin
estndard

0.0316 0.0191 0.0146
Coeficiente
de variacin
(%):

2.00 1.8638 1.3774
Nmero de
datos

12 12 14

TABLA No. 9

BROMHIDRATO, Y GUAIFENESINA EN JARABE B


Parmetro
estadstico
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato

Guaifenesina
Valor medio 100.7985 99.3392 100.1422
Desviacin
estndard

1.8911 2.0885 1.2948
Coeficiente de
variacin (%):

1.8761 2.000 1.2929
Nmero de
datos

12 11 14

61
8.3 PARMETRO DE LINEALIDAD
8.3.1 LINEALIDAD DEL SISTEMA
Los resultados que se determinaron en la linealidad del sistema de la materia prima se
resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No. 4, 9,
14 y 19.

TABLA No. 10

RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LINEALIDAD DEL SISTEMA PARA

Resultados
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato
Fenilefrina
Clorhidrato

Guifenesina
Ecuacin de la
recta
Y= 26034882.26 X
+ -1551.90
Y= 19120775.44 X
+ 29244.89
Y= 24036572.52 X
+ 20429.01
Y= 32252697.33 X
+ 560546.31
Coeficiente de
correlacin r

0.999

0.999

0.999

0.999
Coeficiente de
determinacin
r
2

0.998

0.998

0.998

0.998

62
8.3.2 LINEALIDAD DEL MTODO
Los resultados que se obtuvieron en la linealidad del mtodo de las materias primas se
resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No. 5,
10, 15 y 20.

TABLA No. 11

RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LINEALIDAD DEL MTODO PARA

Resultados
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato
Fenilefrina
Clorhidrato

Guaifenesina
Ecuacin de la
recta
Y= 27845729.04X
+ 26.32
Y=34782588.49 X
-2020.49
Y= 25237131.95 X
-19.56
Y= 34782588.49 X
-2020.49
Coeficiente de
correlacin r

1.000

1.000

1.000

1.000
Coeficiente de
determinacin
r
2

1.000

1.000

1.000

1.000

63
Los resultados que se obtuvieron en la linealidad del mtodo de las materias primas
que constituyen los Jarabes A y B se resumen en la siguiente tabla y se pueden
observar en anexos de los cuadros No. 33, 34, 35, 48, 49 y 50.

TABLA No. 12

RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LINEALIDAD DEL METODO PARA
FENILEFRINA CLORHIDRATO EN JARABE A

Resultados
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato
Fenilefrina
Clorhidrato
Ecuacin de la
recta
Y= 27845729.04 X
+ 26.32
Y= 34782588.49 X
-2020.49
Y= 25236571.88 X
+ 11.09
Coeficiente de
correlacin r

1.000

1.000

1.000
Coeficiente de
determinacin
r
2

1.000

1.000

1.000

TABLA No. 13

RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LINEALIDAD DEL MTODO PARA
CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO Y
GUAIFENESINA EN JARABE B

Resultados
Clorfeniramina
Maleato
Dextrometorfano
Bromhidrato

Guaifenesina
Ecuacin de la
recta
Y= 27845729.04 X
+ 26.32
Y= 34782588.49 X
-2020.49
Y= 34782588.49 X
-2020.49
Coeficiente de
correlacin r

1.000

1.000

1.000
Coeficiente de
determinacin
r
2

1.000

1.000

1.000

64
8.4 PARMETRO DE ESPECIFICIDAD
Se determin la especificidad trabajando con muestras de materia prima de los
principios activos Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromhidrato, Fenilefrina
Clorhidrato y Guaifenesina y tambin con muestras de producto terminado de los
Jarabes A y B. Se sometieron a temperaturas y reacciones cidas (cido clorhdrico),
bsicas (hidrxido de sodio), oxidacin (agua oxigenada) y reduccin (bisulfito de
sodio). Se enfriaron las muestras y se ajust el pH a neutro de todas las muestras y
luego se inyectaron en el equipo.
En el mtodo analtico aplicado puede distinguirse la respuesta de las sustancias de
inters del resto de los dems componentes de una muestra al comparar los resultados
de muestras que contengan el analito junto con resultados de muestras que no
contengan dicho analito.
Ningn producto de degradacin eluye en el mismo tiempo de retencin de los picos de
los analitos de inters.

65

9. DISCUSIN DE RESULTADOS
PARMETRO DE EXACTITUD
En los resultados de la exactitud para la materia prima en la tabla No. 1, la Clorfeniramina
Maleato, Fenilefrina Clorhidrato, Dextrometorfano Bromhidrato y Guaifenesina,
demuestran una recuperacin de la adicin de estndar a la matriz de los jarabes alrededor
del 100% en la mayora de los resultados obtenidos esto es debido a que estn dentro del
rango de aceptacin de 98 102%, por lo que hay concordancia entre el valor experimental
y el valor verdadero adicionado. El coeficiente de variacin obtenido en la evaluacin de
este parmetro para cada uno de los principios activos es menor al 2%, tal como lo
establece el lmite de aceptacin.
Con relacin al Jarabe A en la tabla No.2, en las tres concentraciones que fueron
analizadas el Dextrometorfano Bromhidrato y Clorfeniramina Maleato muestran un
porcentaje de recuperacin dentro del criterio de aceptacin y en la concentracin de 120%
el coeficiente de variacin est un poco arriba del criterio de aceptacin se puede considerar
dentro del rango de aceptacin.
En la tabla No.3, la Guaifenesina correspondiente al Jarabe B, indica que no cumple con
este parmetro porque se obtuvo un porcentaje de recuperacin mayor al lmite permitido
(102%) en las tres concentraciones en que se evalu este principio activo. Esto demuestra
una posible interferencia de la matriz de excipientes del Jarabe B, la cual eluye en el mismo
tiempo de retencin que el pico de Guaifenesina.

PARMETRO DE PRECISION
Este parmetro se evalo con dos pruebas: la repetibilidad y la precisin intermedia. Para
la repetibilidad en la materia prima en la tabla No. 4 se observ que se obtuvo el valor
medio o porcentaje de recuperacin en el lmite permitido (102%) para los principios
activos Clorfeniramina Maleato (102.593%), Dextrometorfano Bromohidrato (102.297%) y

66
Guaifenesina (102.169%), estos valores al aproximarlos estn dentro del criterio de
aceptacin, el cual debe ser de 98-102%.
Al evaluar las muestras observadas en la tabla No. 5, Clorfeniramina Maleato,
Dextrometorfano Bromohidrato y Fenilefrina Clorhidrato del Jarabe A, mostraron un
porcentaje de recuperacin y coeficiente de variacin dentro de los criterios establecidos
para este parmetro, lo que indica que al analizar varias veces la misma muestra por un
mismo analista, en el mismo da y equipo cromatogrfico se obtienen datos con error
relativo menor al 2%, el cual es debido a los errores en la preparacin de la muestra
inherentes al analista y tambin el error probable al momento de la inyeccin en el equipo
automuestreador, el cual tiene una desviacin estndar menor al 2% al momento de
inyectar cualquier muestra. Los resultados de cuantificacin de los analitos estn alrededor
del 98 al 102%, lo que indica que el mtodo de anlisis da resultados confiables con un 2%
de variacin, alrededor de la concentracin al 100%.
Para el Jarabe B los resultados descritos en la tabla No.6, indican que fueron analizadas
las muestras de Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromhidrato y Guaifenesina, las
cuales presentaron un valor promedio que est fuera del rango del porcentaje de
recuperacin establecido, debido posiblemente a que durante el procedimiento de
fabricacin de las muestras se les adicion un pequeo porcentaje de exceso de principios
activos para evitar prdidas durante el proceso de fabricacin, lo cual pudo provocar
obtener valores de cuantificacin fuera del rango del 98 102%.
Al realizar el ensayo de precisin intermedia se evalu como afectan al mtodo analtico
la variacin de circunstancias ajenas a la metodologa analtica como la influencia de la
preparacin de muestras por otro analista tomando en cuenta que cada persona trabaja de
forma diferente adicionando errores inherentes a la preparacin de las muestras o
estndares y la influencia de la variacin del da de anlisis. Al examinar las muestras de
la materia prima segn la tabla No. 7, indica que los resultados del coeficiente de variacin
estn dentro del criterio de aceptacin menor o igual a 2%; el Jarabe A en la tabla No. 8 y
el Jarabe B en la tabla No. 9, tambin cumplen con este criterio al mantener todos los

67
resultados en este rango. Por lo que indica que el mtodo de anlisis de estos principios
activos no se ve afectado por la variacin de analistas y el da en que se analice.

PARMETRO DE LINEALIDAD DEL SISTEMA
La respuesta del equipo cromatgrafo lquido de alta resolucin (en absorbancia) ante las
diferentes concentraciones (mg/mL) demostr un coeficiente de correlacin (r) de 0.999 lo
que muestra que hay relacin entre las mediciones y las concentraciones de los analitos. El
coeficiente de determinacin (r
2
) obtenido 0.998 demuestra que la curva de regresin se
ajusta a los valores experimentales de las mediciones evaluadas. Entonces, la respuesta del
equipo demostr ser directamente proporcional a las distintas concentraciones y por ello
lineal en este rango de concentraciones, para todos los principios activos analizados.

PARMETRO DE LINEALIDAD DEL MTODO
El ensayo de cuantificacin para las materias primas analizadas en la tabla No.11, mostr
un coeficiente de correlacin r y un coeficiente de determinacin r
2
aproximado a 1.000.
En la tabla No.12, con respecto para la Fenilefrina en el Jarabe A es 0.999 en el coeficiente
de correlacin r y 0.998 para el coeficiente de determinacin r
2
. Si los resultados son
proporcionales entre las concentraciones del analito y respuesta, se considera que el mtodo
es satisfactorio como sucede para la Guaifenesina en el Jarabe B de la tabla No. 13, que se
obtuvo 1.000 para el coeficiente de correlacin r y para el coeficiente de determinacin r
2
.
Al trabajar a las diferentes concentraciones indicadas tanto en las materias primas como en
los Jarabes A y B, el coeficiente de correlacin refleja un grado de relacin lineal entre la
respuesta del equipo y la variacin proporcional de las concentraciones.

PARMETRO DE ESPECIFICIDAD
Este parmetro evalu si la respuesta del equipo era especfica para los analitos que no
resultan ser afectados por la presencia de impurezas o excipientes. En la prctica se realiz

68
con las materias primas y los productos farmacuticos. Sometiendo para ello los estndares
y muestras del Jarabe A y B a reacciones de oxidacin, reduccin, cidas y alcalinas y
acelerando la cintica de las mismas por medio de calor, esto con el fin de generar
productos de degradacin tanto de los principios activos como de excipientes.
El mtodo es especfico para la cuantificacin de los principios activos en las materias
primas en el Jarabe A, puesto que aunque hubo degradacin de los analitos de inters y se
generaron productos de degradacin ninguno de estos eluy en el mismo tiempo de
retencin que los principios activos, mas sin embargo no demostr ser especfico para la
determinacin de Guaifenesina en el Jarabe B, debido a que se produce un compuesto de
degradacin el cual eluye al mismo tiempo de retencin del principio activo por lo que
interfiere en la cuantificacin exacta del mismo y se suma a la lectura detectada por el
equipo.
Se observ una reduccin en la concentracin de las materias primas y de los analitos en
las muestras debido a la degradacin provocada al someterlos a condiciones de
temperatura, oxidacin, reduccin y pH.

69

10. CONCLUSIONES
1. Se desarroll y valid un mtodo analtico por cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC) que cumpli con los requerimientos y normas ICH y
Farmacopea Estadounidense (USP 2006) para la cuantificacin de tres principios
activos contenidos en dos medicamentos.

2. Se dise un mtodo de anlisis selectivo para la cuantificacin de Maleato de
Clorfeniramina, Bromohidrato de Dextrometorfano y Fenilefrina Clorhidrato
utilizando cromatografa lquida de alta resolucin como tcnica.

3. Se determin y demostr que la metodologa propuesta cumple con los parmetros
de linealidad, exactitud, repetibilidad, precisin intermedia y especificidad segn lo
establece la Farmacopea Estadounidense (USP) y Normas de Validation of
Analitical Procedures ICH.

4. Se proporcion una metodologa validada que se utiliza como gua a la industria
farmacutica para la cuantificacin de estos principios activos y considerando que si
se emplea en otros productos debe ser ensayada y validada nuevamente.

5. El mtodo de anlisis cumple con el parmetro de repetibilidad para el anlisis de
Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromohidrado y Fenilefrina en el Jarabe
A y B, porque se obtuvo un coeficiente de variacin menor al 2% al evaluar
varias muestras con la metodologa analtica a validar.

6. El mtodo utilizado demostr ser lineal cuando se trabaja a concentraciones de
60% al 140% para cada uno de los principios activos analizados, lo que significa
que al trabajar en dicho rango la respuesta del equipo ser directamente
proporcional a las concentraciones del analito.

70
7. El mtodo validado demostr no ser especfico y exacto para la cuantificacin de
Guaifenesina en el Jarabe B, porque los productos de degradacin del mismo
interfieren con su anlisis, no as para la cuantificacin de los analitos en materia
prima y el Jarabe A ya que en los cromatogramas obtenidos para estas muestras,
no se presentan picos de compuestos de degradacin que eluya en el mismo tiempo
de retencin que los analitos de inters.

8. El mtodo de anlisis para la cuantificacin de materia prima y en Jarabes
comerciales A y B, por cromatografa lquida de alta resolucin, cumple con
los parmetros de precisin intermedia, linealidad del sistema y linealidad del
mtodo.

9. El mtodo de anlisis para la cuantificacin de los principios activos y de los
productos terminados Jarabe A y B, demostraron ser precisos cuando existan
variaciones dentro del laboratorio como la preparacin de muestras por diferentes
analistas y el desarrollo del anlisis en diferentes das.

10. La linealidad del sistema es aceptable en el mtodo de anlisis aplicado ya que los
resultados presentan concordancia entre las concentraciones y las absorbancias por
lo que se considera lineal.

71

11. RECOMENDACIONES
1. Utilizar en todo el anlisis del ensayo septas en los viales de los estndares y
muestras, de la misma clase para evitar la evaporacin de los solventes y que
existan variaciones por problemas con la inyeccin de las muestras al no ser
perforadas por la jeringa de la manera adecuada.

2. Colocar un estndar al principio, cada 6 muestras y al final de la cuantificacin de
los principios activos y del producto terminado.

3. Desgasificar los solventes y el agua HPLC cada vez que se analiza y se utiliza el
equipo.

4. Establecer la tcnica correcta de emplear las pipetas volumtricas al liberar el
solvente, es decir sin soplar ni dar golpes.

5. Antes de iniciar el anlisis cuantitativo de los compuestos o de los jarabes realizar
los clculos respectivos de la cantidad de fase mvil necesaria para el anlisis y las
diluciones.

6. Buscar un mtodo alternativo para la cuantificacin de la Guaifenesina en el Jarabe
B en el cual no interfieran los productos de degradacin o la matriz de dicho jarabe.

7. Si este mtodo pretenden utilizarlo otras empresas para cuantificacin de jarabes
expectorantes es necesario tomar en cuenta que los parmetros de exactitud,
especificidad y linealidad del mtodo se deben evaluar para el jarabe que se desea
cuantificar debido a los posibles interferentes de los excipientes empleados.

72
p

12. REFERENCIAS
1. Romero Gomero, Miguel. Desarrollo de Nuevas Metodologas Analticas en el
Control de Calidad de la Industria Farmacutica. Disponible:
www.tdx.cesca.es/tesis_uab/available/TDX-0712102-102928//marg1de9.pdf.

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Lquida de Alta Resolucin para la Cuantificacin de Ibuprofeno en Suspensin. Pp.
52. Tesis Licenciada Qumico Farmacutico. Universidad de San Carlos de
Guatemala. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia. Escuela de Qumica
Farmacutica.

3. Farmacia Prctica de Remington. 1998. 19 ed. Buenos Aires, Argentina. Mdica
Panamericana. Tomo 2. Pp 627, 630, 632.

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th
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Disponible en: www.segulab.com/fenilefrina.htm - 17k

73
9. Cromatografa Lquida de Alta Resolucin. Consultado el 10 de mayo de 2006.
Disponible en: www.ua.es/es/investigacion/sti/hpcl.htm

10. Cromatografa Lquida de Alta Resolucin. Consultado el 10 de mayo de 2006.
Disponible en: www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo050405.doc

11. Skoog D. A. 2001. Principios de Anlisis Instrumental. 5 ed. Barcelona, Espaa.
McGrawHill. Pp 751-753, 785-788.

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29/NF Edicin Anual en Espaol. Estados Unidos. Convencin de Farmacopeica
Estados Unidos. Pp. 3328-3331.

13. Normativa de Validacin de Metodologa Analtica. 2da revisin. Departamento
de Regulacin de Medicamentos y Productos Afines. Guatemala. 2006.

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Manufactura y Mtodo de Anlisis de Cpsulas de Diclofenaco Sdico 50 mg. Pp. 2,
46-47. Licenciado Qumico Farmacutico. Universidad del Valle de Guatemala.
Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia. Departamento de Qumica
Farmacutica.

15. Pinzn Meza, Mario Ren. 2003. Implementacin de Metodologa para Acido
Valproico por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin y Validacin por
Cromatografa de Gases con Detector Selectivo de Masas en Muestras Sricas. Pp.
55. Tesis Licenciado Qumico Farmacutico. Universidad de San Carlos de
Farmacutica.

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16. Franco Flores, Anabelly Carolina. 2002. Gua Para Validar Mtodos Analticos
Nuevos o Modificados Para Productos Farmacuticos. Tesis Licenciado Qumico
Farmacutico. Universidad de San Carlos de Guatemala. Facultad de Ciencias
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17. De Len Barrientos, Sandra. 1998. Validacin del Mtodo de Cromatografa
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Multivitamnicas Masticables. Tesis Licenciado Qumico Farmacutico.
Universidad de San Carlos de Guatemala. Facultad de Ciencias Qumicas y
Farmacia. Escuela de Qumica Farmacutica.

18. Introduccin a la Qumica Farmacutica. 2001. 2 ed. Espaa.
McGrawHill/Interamericana de Espaa, S.A.V. Pp. 175, 194, 801.

19. Escobar Ortiz. 2001. Validacin de un Mtodo para la Cuantificacin de Penicilina
G Sdica en Aguas Residuales de una Industria Farmacutica. Pp. 60. Tesis
Licenciado Qumico Farmacutico. Universidad del Valle de Guatemala. Facultad
de Ciencias Qumicas y Farmacia. Departamento de Qumica Farmacutica.

20. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 2000. 7ma edicin. Tomo 1, 2.
Introduccin a la Qumica Farmacutica. 2001. 2 ed. Espaa.
McGrawHill/Interamericana de Espaa, S.A.V. Pp. 175, 194, 702-703, 728, 775 -
777, 801. Mxico.

21. Farmacopea Britnica. 2004. Volumen I. Mxico. Pp. 614 -615, 938 -939.

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recomendado por la USP 25, FDA e ICH con la implementacin de algoritmos y
estadgrafos.

75
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th
edition. Japan. Society of Japanese
Pharmacopoeia. Pp. 1357.

24. Martindale. 2003. Gua Completa de Consulta Farmacoteraputica. 1 edicin en
espaol. Estados Unidos. Pharmaceutical Press. Pp. 543, 790-791, 795-796, 797-
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Estados Unidos. Marcel Dekker, Inc. Pp. 601.

26. Samol Sayes, ngela Teresa. 2007. Estandarizacin del Mtodo Utilizado en el
Laboratorio Nacional de Salud para la Identificacin y Cuantificacin de
Clotrimazol en vulos Slidos por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin. Pp.
69. Tesis Licenciado Qumico Farmacutico. Universidad de San Carlos de
Farmacutica.

76

13. ANEXOS

13.1 GLOSARIO

Mtodo analtico: Adaptacin especfica de una tcnica analtica para un propsito de
medicin seleccionado.

Procedimiento analtico: Forma en que se realiza el anlisis. Debe describir en detalle los
pasos necesarios para realizar cada prueba analtica.

Validacin de un mtodo analtico: Proceso que establece, mediante estudios en
laboratorio, que las caractersticas de desempeo del mtodo, cumplen los requisitos para
las aplicaciones analticas previstas.

Parmetros de desempeo analtico: Caractersticas de validacin que necesitan ser
evaluadas y que tpicamente corresponden a la siguiente lista: exactitud, precisin,
especificidad, linealidad e intervalo de linealidad.

Exactitud del mtodo: Es la capacidad del mtodo analtico para dar resultados lo ms
prximos posibles al valor verdadero. Si la diferencia entre el valor hallado y el valor
verdadero es pequea, la exactitud es buena. Una diferencia grande significa que la
exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores determinados que deberan
corregirse. La exactitud se expresa como un porcentaje de recuperacin de la cantidad de
analito presente en la muestra o bien en la forma de diferencia entre el valor hallado y el
valor verdadero.

Linealidad: Es la capacidad de un mtodo analtico de obtener resultados linealmente
proporcionales a la concentracin de analito en la muestra, dentro de un intervalo
determinado.

77
Intervalo de linealidad: mbito o rango entre la menor y la mayor concentracin de
analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las cuales se ha demostrado
que el procedimiento analtico tiene el nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad.

Precisin del mtodo: Es el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida
de ensayos analticos efectuados sobre una muestra homognea o expresado de otra forma,
la distribucin de los valores analticos alrededor de su media.

Precisin intermedia: Es un trmino introducido recientemente y expresa la precisin
dentro de un laboratorio cuando se emplea una muestra homognea y se analiza con una o
ms condiciones diferentes, es decir diferentes analistas, o en das diferentes, o en equipos
diferentes, etc. La precisin intermedia refleja las condiciones reales de un laboratorio.

Repetibilidad: Es la medida de la precisin de un mtodo efectuado en las mismas
condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con
los mismos aparatos y reactivos, y en el curso de la misma serie de anlisis efectuados,
generalmente en un corto intervalo de tiempo.

Especificidad: Es la capacidad de evaluar sin equivocarse el analito en la presencia de los
componentes que pueden suponerse se encuentren presentes, como impurezas, productos de
degradacin y componentes de la matriz.

13.2 DESCRIPCIN DE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA
RESOLUCIN (HPLC)

Las razones de la popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin
a las determinaciones cuantitativas exactas y su idoneidad para la separacin de especies no
voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de
primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad.

78
Algunos ejemplos para su utilizacin incluyen: aminocidos, protenas, cidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides,
especies organometlicas y una variedad de sustancias inorgnicas.
Para evaluar la importancia de la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC),
es necesario distinguir entre los dos papeles que desempea la tcnica. El primer papel
consiste en separar y el segundo en determinar los componentes separados. Los datos
proporcionados por la seal del detector se utilizan generalmente para el anlisis
cuantitativo y semicualitativo:

1. Alturas de los picos o sus reas dan informacin cuantitativa. Se comparan las reas de
los estndares en las calibraciones.
2. Tiempos de retencin para la identificacin semicualitativa. No es cualitativo debido a
que el tiempo de retencin puede coincidir con otro compuesto diferente en las mismas
condiciones de anlisis cromatogrfico.

Para la eleccin de la fase mvil se requiere el uso de fases mviles de dos o ms
componentes. El tipo de cromatografa elegida y los detectores disponibles afectan en la
eleccin de los lquidos que se utilizan en la composicin de la fase mvil. Generalmente
la eleccin de la fase mvil depende de la solubilidad y estabilidad de la muestra, la
cantidad de muestra, tipo de separacin que se requiere y pureza de la muestra.
Las columnas (fase estacionaria) para cromatografa de lquidos se construyen de
ordinario con tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Las ms comunes se
encuentran empacadas con esferas de resina. La eleccin de la fase estacionaria depende de
diversos factores, como las caractersticas y la complejidad de la muestra y del tipo de
separacin elegido.
El detector de uso ms corriente es esencialmente el espectrofotmetro UV que puede
trabajar a una longitud de onda fija o bien permitir la seleccin de la longitud de onda
dentro de un intervalo determinado. Si se conocen las propiedades de los compuestos a
separar es fcil de seleccionar el detector y la longitud de onda. Si los compuestos
absorben dentro del intervalo del detector, se escoge esta longitud de onda. Aunque lo

79
mejor es conocer el espectro UV de los componentes de la muestra. Tambin es
conveniente usar informacin bibliogrfica pues es posible elegir la longitud de onda
apropiada basndose en el trabajo efectuado por otros analistas con compuestos similares.
Un detector ideal para HPLC debe poseer todas las propiedades listadas a continuacin:
1. Adecuada sensibilidad.
2. Buena estabilidad y reproducibilidad del detector al inyectar la misma muestra.
3. Respuesta lineal.
4. Tiempo de respuesta corto.
5. Alta fiabilidad y manejo sencillo.
6. Respuesta semejante para todos los analitos, o una respuesta selectiva y
altamente predecible para una o ms clases de analitos.
7. No destructivo de la muestra
(18).

80

HPLC

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